前列腺特異膜抗原的人類單克隆抗體的製作方法

2023-06-13 21:40:01

專利名稱：前列腺特異膜抗原的人類單克隆抗體的製作方法
背景技術：
前列腺癌是一種男性中非常普遍的癌，也是一種主要的致死性疾病。前列腺癌的主要治療方法包括手術、激素、放療和化療，對於已轉移的前列腺癌，幾乎沒有有效的治療手段，因此必需鑑定某基因和/或基因產物，使它們能夠作為診斷和預後的準確標誌，以及治療的靶點。前列腺特異的抗原(PSA)就是這類癌標誌物，它們能夠用於臨床診斷和判定前列腺癌的時期。然而，PSA不能在4-10ng/ml範圍內區分良性前列腺肥大(BPH)和前列腺癌，因此必需細胞學和/或組織學的檢測來驗證診斷的正確性(9)。
前列腺特異的膜抗原(PSMA)含有750個胺基酸，是類型II的跨膜糖蛋白，約110kD，與運鐵蛋白受體有54％的同源性。PSM′是PSMA的另外一種剪切形式，它位於細胞質中。PSMA具有3個結構域，包括含有19個胺基酸的細胞內結構域，含有24個胺基酸的跨膜結構域和含有707個胺基酸的細胞外結構域。PSMA顯示出神經羧肽酶和葉酸水解酶活性，因而它可能參與前列腺生長和分化的神經內分泌調控(7)。
研究PSMA表達狀況表明它是一種新的標誌物，主要由前列腺上皮細胞表達。而且，在前列腺癌，尤其是低分化轉移和激素耐受的癌中，PSMA表達增加(8，11)，所以，PSMA是有價值的前列腺癌診斷、預後和治療靶點。PSMA的低水平表達在非前列腺組織中也有發現，如小腸、唾液腺、十二指腸黏膜、腎小管近側區和大腦(11)。
PSMA在大腦中參與神經遞質NAAG向HAA和游離穀氨酸的轉變，這可能是神經紊亂的重要致病原因，如多發性硬化，肌萎縮性外側硬化，Alzheimer氏疾病和精神分裂症(12)。在某些惡性腫瘤的周圍和內部區域的毛細血管內皮細胞中也發現有PSMA的表達，這類腫瘤包括腎細胞癌和結腸癌，但在正常組織的血管中卻未發現PSMA表達。這表明PSMA的表達也可能與腫瘤的血管產生有關(11)。
發明概述該發明提供分離的人類單克隆抗體，此抗體特異性與前列腺特異的膜抗原(PSMA)相結合，同時也提供包括一種抗體或幾種此類抗體組合的組合物。在一項實施方案中，此人類抗體的特徵在於以高親和力與PSMA相結合，以及，在人類效應細胞(如，多形核細胞，單核細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞)存在下(體內或體外)，抑制表達PSMA的細胞的生長和/或介導殺傷此類細胞(如，裂解或吞噬作用)。據此，發明中的人類單克隆抗體能夠用作體內和體外的診斷和治療試劑。
發明中所分離的人類抗體包括不同的抗體同種型，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD和IgE。尤其是它們包括IgG1(如IgG1k)和IgM同種型。這些抗體有的是全長(如IgG1或IgG4抗體)，有的只包括抗原結合部分(如，Fab，F(ab′)2，Fv或單鏈Fv片段)。在一項實施方案中，人類抗體是重組人類抗體。在另一項實施方案中，人類抗體由一雜交瘤產生，該雜交瘤由B細胞和一永生化細胞融合而得，其中B細胞來自轉基因非人動物，如轉基因小鼠，它具有含有人類重鏈和輕鏈轉基因的基因組。在特定的實施方案中，抗體由雜交瘤產生，這些雜交瘤被命名為4A3，7F12，8A11，16F9和8C12。
在另一項實施方案中，該發明的人類抗PSMA抗體具有以下特徵中的一項或多項a)對PSMA的特異性；b)與PSMA的結合親和力，其親和力常數至少約107M-1，優選約109M-1，更優選約1010M-1到1011M-1或更高；c)與PSMA締合常數(Kassoc)至少約103，更優選約104，最優選約105M-1S-1；d)從PSMA上解離的解離常數(Kdis)約10-3s-1，優選約10-4s-1，更優選約10-5s-1，最優選10-6s-1；e)能夠調理表達PSMA的細胞；或f)在約10μg/ml或更少(如，體外條件下)的濃度時，在有人類效應細胞存在條件下，能夠抑制表達PSMA的細胞(如腫瘤細胞)生長和/或介導吞噬和殺傷此類細胞。
能夠被此發明中的人類抗體靶向的腫瘤細胞包括前列腺癌、腎癌和結腸癌細胞，但並不僅局限於這些細胞。
在一項實施方案中，發明中所分離的人類抗體與PSMA抗原相結合，其親和力常數至少約107M-1，優選約108M-1，更優選約109M-1，最優選約1010至1011M-1或更高，該抗體能夠通過人類效應細胞體外抑制表達PSMA的細胞的生長和/或介導吞噬和殺傷這些細胞，人類效應細胞如多形核細胞(PMNs)，單核細胞和巨噬細胞，其IC50約10-7M或更少，或抗體濃度約10μg/ml或更低。
另一方面，該發明提供了核酸分子，它們編碼抗體或抗原結合部分，相應地，發明還包括重組表達載體和轉染了此類載體的宿主細胞以及通過培養宿主細胞而製備抗體的方法，其中，表達載體包括編碼抗體的核酸分子。
再一方面，該發明提供了B細胞，它從轉基因非人動物，如轉基因小鼠中分離得到，能夠表達與PSMA特異結合的人類單克隆抗體的多種同種型(如IgG，IgA和/或IgM)。優選地，這些B細胞來自轉基因非人動物，如轉基因小鼠，這類動物已被免疫了純化的或富集的PSMA抗原和/或表達PSMA的細胞。優選地，轉基因非人動物，如轉基因小鼠含有包含人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。然後這類B細胞被永生化以作為產生PSMA的人類單克隆抗體的來源(如雜交瘤)。
相應地，該發明也提供一種雜交瘤，它能夠產生與PSMA特異結合的人類單克隆抗體。在一項實施方案中，雜交瘤包括一種與永生化細胞相融合的B細胞，該B細胞來自轉基因非人動物，如轉基因小鼠，該動物具有包含人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。這類轉基因非人動物被免疫了純化的或富集的PSMA抗原和/或表達PSMA的細胞，以製備產生抗體的雜交瘤。發明中的雜交瘤包括4A3，7F12，8A11，16F9和8C12，ATCC保藏號(Accession Numbers＿＿)。
再一方面，該發明提供轉基因非人動物，如轉基因小鼠(也被稱為「HuMab」)，該動物表達與PSMA特異結合的人類單克隆抗體。在一項特定的實施方案中，轉基因非人動物是一轉基因小鼠，它具有包含人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。轉基因非人動物被免疫了純化的或富集的PSMA抗原和/或表達PSMA的細胞，優選地，轉基因非人動物，如轉基因小鼠，能夠產生特異於PSMA的人類單克隆抗體的多種同種型(如IgG，IgA和/或IgM)，這些同種型通過V-D-J重組和同種型轉換而相互轉變。同種型轉換可以通過經典同種型轉換成非經典同種型轉換而進行。
另一方面，該發明提供產生與PSMA特異反應的人類單克隆抗體的方法。在一項實施方案中，該方法包括用純化的或富集的PSMA抗原和/或表達PSMA的細胞免疫轉基因非人動物，如轉基因小鼠，該動物具有包含人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。然後得到動物的B細胞(如脾臟B細胞)，並與骨髓瘤細胞相融合，以形成永生化雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞分泌特異於PSMA的人類單克隆抗體。
發明中所分離的抗PSMA人類單克隆抗體或其抗原結合部分能夠被偶聯到另一功能分子上，如另外的多肽或蛋白(如Fab′片段)。例如，發明中的一種抗體或抗原結合部分被功能性偶聯(如化學偶聯，基因融合，非共價結合或其它方法)到一個或多個其它分子上，如另外的抗體(如雙特異性或多特異性抗體)。相應地，另一方面，該發明的特徵在於雙特異或多特異性分子，它至少包括對PSMA的第一結合特異性和Fc受體的第二結合特異性，如人類FcγRI或人類Fcα受體。
發明中的多特異性分子也包括三特異性，四特異性和其它多特異性分子。在一項實施方案中，多特異性分子包括抗增強因子(EF)部位，如與參與細胞毒性活性的表面蛋白相結合的分子。
在特定的實施方案中，發明中的雙特異性和多特異性分子至少包括一種抗體或其片段(如Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv或單鏈Fv)。在特定的實施方案中，該抗體或其片段是一完整的人類抗體或其部分，或是「嵌合」或「人源化」抗體或其部分(如具有一可變區或至少一互補決定區(CDR)，該區域一部分來自非人類抗體(如小鼠)，剩下部分來自人類)。
在一項實施方案中，雙特異性或多特異性分子中的至少一種抗體或其片段與Fc受體相結合，如人類IgG受體，如Fc-γ受體(FcγR)，如FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。一優選Fcγ受體是高親和性Fcγ受體，FcγRI。然而，其它Fc受體，如人類IgA受體(如FcαRI)也能被結合，Fc受體優選位於效應細胞表面，如單核細胞，巨噬細胞或活化的多形核細胞。在一優選實施方案中，雙特異性或多特異性分子與Fc受體相結合，該結合位點不同於此受體的免疫球蛋白Fc(如IgG或IgA)結合位點，因此，雙特異性或多特異性分子的結合不會被生理水平的免疫球蛋白封閉。
另一方面，該發明的特徵是人類抗PSMA抗體或其片段與一治療性部分相連接，如細胞毒性藥物，酶活性毒素或其片段，放射性同位素，或小分子抗癌藥物。
另一方面，該發明提供靶特異性效應細胞和雙特異性或多特異性分子，其中效應細胞包括表達Fc受體的效應細胞，如巨噬細胞或活化的PMN細胞。
另一方面，該發明提供組合物，如藥用或診斷組合物，它包括藥理上可接受的載體和至少一種與PSMA特異結合的人類單克隆抗體或其抗原結合部分。在一項實施方案中，組合物包括多種人類抗體或其抗原結合部分的一種組合，優選地，不同抗體結合不同的抗原表位，例如，一種藥用組合物包括一種人類單克隆抗體，在效應細胞存在下介導高效率殺傷靶細胞，它與另一種抑制表達PSMA的細胞的生長的人單克隆抗體組合。因此，這種組合提供了多種治療途徑以達到最好的治療效益。組合物，如藥用組合物，也在發明範圍內，它包括至少發明中的一種人類單克隆抗體或其抗原結合部分和至少發明中的一種雙特異性或多特異性分子。
再一方面，該發明提供一種利用本發明的抗體或其抗原結合部分(或雙特異性或多特異性抗體)來抑制表達PSMA的細胞增殖和/或分化的方法，這是通過人類效應細胞抑制靶細胞生長和/或誘導吞噬和/或殺傷靶細胞而實現，人類效應細胞如人類多形核細胞(PMNs)，單核細胞和巨噬細胞。在一項實施方案中，該方法包括體外或體內在人類效應細胞存在條件下讓表達PSMA的細胞與發明的一種單克隆抗體或多種單克隆抗體的組合，或其抗原結合部分相接觸。該方法可在培養物中進行，如體外(如包含表達PSMA的細胞和效應細胞的培養物)。例如，包含表達PSMA的細胞和效應細胞的樣品在體外培養，並且與發明的抗體或其抗原結合部分(或發明的雙特異性或多特異性分子)相混合，或者，該方法在一受試者上進行，如作為體內過程(如治療或預防)的一部分。
對於體內方法，抗體或其抗原結合部分(或發明的雙特異性或多特異性分子)被給藥到受試者體內，該受試者患PSMA相關性疾病，如前列腺癌，腎癌或結腸癌，因此誘導了表達PSMA的細胞的生長抑制被吞噬和/或被殺傷。在一項實施方案中，受試者可以被一種試劑治療，該試劑調節如增強或抑制Fc受體的表達或活性，如Fcα受體或Fcγ受體，例如，用一種細胞因子治療受試者，在用雙特異性或多特異性分子治療過程中，注射的優選細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，γ-幹擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。
分離的人類單克隆抗體組合物也可以與其它已知的療法結合使用，如抗癌療法。
能夠用該發明的方法，和組合物治療(如改善)或預防的典型疾病包括致腫瘤性疾病，但也不僅僅局限於此，這些致瘤性疾病包括前列腺癌，腎癌和結腸癌。
再一方面，該發明提供了一種體外或體內檢測樣品中PSMA抗原是否存在的方法，如診斷PSMA相關性疾病。在一項實施方案中，該方法由以下方式進行在允許抗體和PSMA形成複合物的條件下，使待測樣品和對照樣品與發明的人類單克隆抗體或其抗原結合部分(或雙特異性或多特異性分子)相接觸，然後測定(如利用ELISA)兩樣品中所形成的複合物，如果兩樣品的複合物存在顯著差異，就表示待測樣品中存在PSMA抗原。
該發明的其它特徵和優點見以下的詳述和實施方案部分。
附圖簡述


圖1是將neo DNA序列定向插入到μl外顯子的SmaI位點的圖解式圖。A表示μ基因座的基因組結構，其中實框表示μ外顯子。B是CmD靶向載體的圖解式圖。C表示已被定向的μ基因座，其中neo DNA序列已被插入到μl中。
圖2是產生IgG1K人類單克隆抗體(HuMabs)的圖解說明，其中此抗體特異於PSMA，HER2/neu和CD90(FcαR)，它通過免疫轉基因小鼠產生。
圖3表示完整的人類雙特異性分子14.1×8C12，它與CD89(FcαR)和PSMA相結合。該分子含有一個抗CD89的Fab′抗體片段(來自於人類抗CD89單克隆抗體，14.1)，該片段通過二硫鍵與抗PSMA的抗體Fab′片段(來自於人類抗PSMA單克隆抗體，8C12)化學交聯。
圖4顯示人類抗PSMA單克隆抗體與膜組份的反應性，其中膜組份來自人類前列腺的腺癌細胞LNCaP和PC3，該反應性通過ELISA測得，405nm背景吸收值是0.05。
圖5顯示由流式細胞分析所得的人類抗PSMA抗體與LNCaP和PC3腫瘤細胞之間的結合。綠色直方圖表示與LNCaP細胞的結合；粉色直方圖表示與PC3細胞的結合；紫色直方圖表示不相關的人類IgG1的結合。A，抗體4A3；B，抗體7F12；C，抗體8A11；D，抗體8C12；E，抗體16F9。
圖6是圖3中所示的雙特異性分子14.1×8C12與表達PSMA的LNCaP細胞的結合與雙特異性分子濃度的關係圖，其結合由平均螢光強度測定。
圖7是圖3所示的雙特異性分子14.1×8C12與表達CD89的U937細胞的結合與雙特異性分子濃度的關係圖，其結合由平均螢光強度測定。
圖8顯示了利用人類抗PSMA特異抗體從LNCaP細胞的去汙劑裂解物中免疫共沉澱PSMA。泳道1是LNCaP細胞裂解物；泳道2到7分別是利用不相關人類IgG1，4A3，7F12，8A11，8C12和16F9抗體的免疫共沉澱物。免疫複合物由SDS凝膠電泳和免疫印跡法分析，其中免疫印跡是利用小鼠抗PSMA抗體4D8。
圖9顯示分離的PSMA的熱變性對人類抗PSMA抗體結合的影響。
圖10顯示人類抗PSMA抗體的競爭性結合分析，此分析由流式細胞儀測得。用下列抗體進行預處理不相關的人類IgG1(紫色實直方圖)；4A3(黃色直方圖)；7F12(綠色直方圖)；8A11(藍色直方圖)；8C12(粉色直方圖)；16F9(橙色直方圖)。A，FITC 4A3；B，FITC7F12；C，FITC 8A11；D，FITC 8C12。
圖11顯示人類抗PSMA抗體與小鼠抗PSMA的構象性抗體的競爭結合分析，此分析由流式細胞儀測得，用以下抗體進行預處理不相關人類IgG1(紫色實直方圖)；4A3(黃色直方圖)；7F12(綠色直方圖)；8A11(藍色直方圖)；8C12(粉色直方圖)；16F9(橙色直方圖)。A，FITC1G9；B，FITC3C6；C，FITC4D4。
圖12，A圖是單核細胞介導的對表達PSMA的細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)與雙特異性分子濃度的關係圖，其中此毒性是在圖3所示的雙特異性分子14.1×8C12作用下。結果是在不加抑制劑，50μg/ml游離抗FcRαR(14.1)F(ab′)2和50μg/ml游離的抗FcγRI(H22)F(ab′)2條件下，細胞特異性裂解的百分比。B圖是顯示在雙特異性分子14A8×8C12和單克隆抗體8C12作用下，單核細胞介導的對LNCaP細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，其中效應細胞∶靶細胞為100∶1。C圖顯示雙特異性分子14A8×8C12在無抑制劑，過量14A8 F(ab′)2或H22 F(ab′)2條件下，對單核細胞介導的對LNCaP細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的作用，其中效應細胞∶靶細胞為100∶1。
圖13，A圖是嗜中性白細胞介導的對表達PSMA的細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)與雙特異性分子濃度的關係圖，其中此毒性是在圖3所示的雙特異性分子14.1×8C12作用下。結果是在無抑制劑，25μg/ml游離抗FcRαR(14.1)F(ab′)2和25μg/ml游離抗FcγRI(H22)F(ab′)2條件下，細胞特異性裂解的百分比。B圖顯示雙特異性分子14A8×8C12在無抑制劑，過量14A8 F(ab′)2或H22 F(ab′)2條件下，對嗜中性白細胞介導的對LNCaP細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的作用，其中效應細胞∶靶細胞為200∶1。
圖14，A圖是全血介導的對表達PSMA的細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)與雙特異性分子濃度的關係圖，其中此毒性是在圖3所示的雙特異性分子14.1×8C12作用下。結果是在無抑制劑，25μg/ml游離抗FcRαR(14.1)F(ab′)2和25μg/ml游離抗FcγRI(H22)F(ab′)2條件下，細胞特異性裂解的百分比。圖B顯示雙特異性分子14A8×8C12在無抑制劑、過量14A8 F(ab′)2或H22 F(ab′)2條件下，對全血介導的對LNCaP細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的作用。
圖15顯示單核細胞衍生的巨噬細胞(MDM)(圓圈)在雙特異性分子(14.1×8C12)介導下，對表達PSMA的細胞(LnCAP)的吞噬作用。結果是在抑制劑14.1抗體(方塊)的存在和不存在及對照抗體H22(菱形)的存在和不存在條件下的吞噬百分比。
圖16顯示單核細胞衍生的巨噬細胞(MDM)在雙特異性分子(14A8×8C12)介導和抗體(8C12)介導下對LnCAP腫瘤細胞的吞噬作用。
圖17顯示單核細胞衍生的巨噬細胞(MDM)(圓圈)在雙特異性分子(14A8×8C12)介導下，對LnCAP腫瘤細胞的吞噬作用。插入圖顯示在過量14A8 F(ab′)2或H22 F(ab′)2存在下，雙特異性分子14A8×8C12(1μg/ml)所介導的吞噬作用。
發明詳述該發明提供了基於抗體基礎上的治療和診斷一類疾病的新方法，這類疾病的特徵是表達，尤其是過量表達前列腺特異的膜抗原(在這裡表示為「PSMA」)和/或相關分子。該發明的治療方法應用分離的人類單克隆抗體或其抗原結合部分，它們與PSMA上的抗原表位相結合，在一項實施方案中，人類單克隆抗體由非人轉基因動物，如轉基因小鼠，產生，這類動物能夠通過V-D-J重組和同種型轉變而產生特異於PSMA的人類單克隆抗體的多種同種型(如IgG，IgA和/或IgE)。相應地，發明的不同方面包括抗體和抗體片段和其藥物組合物，以及非人轉基因動物和用於產生單克隆抗體的B細胞和雜交瘤。該發明還包括體外或體內利用抗體來檢測表達PSMA的細胞或相關的交叉反應性生長因子受體，及來抑制表達PSMA的細胞的生長、分化和/或遊動性的方法。
為了使該發明更容易理解，首先定義了某些術語，另外的定義貫穿此詳述部分。
術語「前列腺特異膜抗原」，「PSMA」和「PSMA抗原」在這裡互用，並且包括變異體、同種型和人類PSMA的物種同源物。在優選的實施方案中，PSMA抗原與發明的抗體的結合能抑制表達PSMA的細胞(如腫瘤細胞)的生長。在另一項優選實施方案中，PSMA抗原與發明的抗體的結合介導效應細胞對表達PSMA的細胞的吞噬作用和/或殺傷作用。
正如這裡所應用的，術語「抗體」指一種糖蛋白，它至少包括兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)，它們由二硫鍵相互連接。每一條重鏈包括一個重鏈可變區(這裡簡稱為HCVR或VH)和一個重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個結構域，CH1，CH2和CH3。每一條輕鏈包括一個輕鏈可變區(在這裡簡稱為LCVR或VL)和一個輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個結構域，CL。VH或VL區可以被進一步分為超變區，所謂的補體決定區(CDR)，散在於其它區域的比較保守的構架區(FR)。每一個VH和VL由三個CDRs和4個FR組成，它們從氨基末端到羧基末端的排列順序如下FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有一個與抗原相作用的結合結構域。抗體的恆定區可能介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，這類組織或因子包括免疫系統的不同細胞(如效應細胞)和經典補體系統的第一組份(C1q)。
在此所用的術語抗體的「抗原結合部分」或僅僅「抗體部分」，指保留與抗原(如PSMA)特異性結合能力的一個或多個抗體片段。已經表明抗體的抗原結合功能可以通過全長抗體的片段發揮。術語抗體的「抗原結合部分」中所包括的結合片段例子有(i)Fab片段，由VL，VH，CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，包括2個Fab片段的雙價片段，該2個Fab片段在鉸鏈區通過二硫鍵橋相連；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂VL和VH結構域組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward et al，(1989)Nature341544-546)，它由VH結構域組成；和(vi)分離的補體決定區(CDR)。而且，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH被獨立的基因編碼，但它們可以利用重組方法連在一起，這通過合成一段接頭，使得它們能夠被作為一個單鏈蛋白表達，該單鏈蛋白中，VL和VH區配對而形成單價分子(被看作單鏈Fv(scFv)；如見Bird et al.(1988).Scoemce242423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這種單鏈抗體也將包括在術語抗體的「抗原結合部分」中。這些抗體片段可利用該領域中的技術人員所知的便利技術獲得，同樣這些片段可利用與完整抗體相同的方法根據用途來篩選。
術語「雙特異性分子」包括任何具有二種不同的結合特異性的試劑，如蛋白質，多肽，蛋白質複合物或多肽複合物，它們與(a)細胞表面抗原和(b)效應細胞表面的Fc受體相結合或作用。術語「多特異性分子」或「異特異性分子」包括任何具有多於二個不同結合特異性的試劑，如蛋白質，多肽，蛋白質複合物或多肽複合物，它們與(a)細胞表面抗原，(b)效應細胞表面的Fc受體，和(c)至少一個其它組份相結合或作用，相應地，該發明包括雙特異性、三特異性、四特異性和其它的特異性分子，但並不局限此，它們與細胞表面抗原，如PSMA和效應細胞表面的Fc受體相關。術語「雙特異性抗體」還包括雙抗體(diabodies)，它是雙價、雙特異性抗體，其中VH和VL結構域通過接頭而表達在一條多肽鏈上，接頭太短而不能使這兩個結構域在同一條鏈上配對，因而迫使這兩個結構域與另外肽鏈上的互補結構域配對從而產生兩個抗原結合位點(如見Holliger，P.，et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；Poljak，P.J.，et al.(1994)Structure21121-1123)。
如這裡所見，術語「異種抗體」指兩種或多種抗體、抗體結合片段(如Fab)、其衍生物、或連在一起的抗原結合區，其中至少兩種具有不同的特異性。這些不同的特異性包括與效應細胞表面Fc受體的結合特異性和靶細胞，如腫瘤細胞，抗原或抗原表位的結合特異性。如這裡所用，術語「人類抗體」包括具有可變區和恆定區的抗體，它們由人類種系免疫球蛋白序列衍生而來。發明的人類抗體可含有不被人類種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如，通過體外隨機或位點特異性突變或體內體細胞突變而引入的突變)。然而，這裡所用的術語「人類抗體」不包括CDR序列來自於其它哺乳動物種系如小鼠的抗體，這些CDR序列已經移植到人類構架序列中。
這裡所用的術語「單克隆抗體」或「單克隆抗體組合物」指單一分子組成的抗體分子製備物。單克隆抗體組合物代表對一個特定抗原表位的單一的結合特異性和親和性。相應地，術語「人類單克隆抗體」指顯示單一的結合特異性的抗體，它具有來自於人類種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。在一項實施方案中，人類單克隆抗體由雜交瘤產生，該雜交瘤包括與一永生化細胞相融合的B細胞，其中B細胞來自轉基因非人動物，如轉基因小鼠，它具有包括人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。
這裡所用的術語「重組人類抗體」包括所有通過重組方式製備、表達、創造或分離的人類抗體，例如，從轉入人類免疫球蛋白基因的轉基因動物(如小鼠)中分離的抗體(在下面的部分I中進一步描述)；利用重組表達載體轉入宿主細胞而表達的抗體，從重組的聯合人類抗體庫中分離的抗體，或通過涉及到將人類免疫球蛋白基因序列剪切到其它DNA序列上的任何其它方法而製備、表達、創造或分離的抗體。這些重組人類抗體具有衍生於人類種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。然而，在某項實施方案中，這些重組人類抗體來自於體外突變(或當利用人類Ig序列的轉基因動物時，來自於體內體細胞突變)，因而重組抗體的VH和VL區域的胺基酸序列雖然來自於人類種系VH和VL序列並與其相關，但不在體內人類抗體種系全體中自然存在。
這裡所用的「異種抗體」的定義與產生此種抗體的轉基因非人生物相關，該術語指通常來自轉基因非人動物以外的物種的抗體，它的胺基酸序列或編碼核酸序列相應於轉基因非人動物以外的生物中所發現的相關序列。
這裡所用的「異種雜交抗體」指具有不同物種起源的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有人類重鏈和小鼠輕鏈的抗體是異種雜交抗體，異種雜交抗體的例子包括以上討論的嵌合和人源化抗體。
這裡所用的「分離的抗體」指基本上不含有具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(如，與PSMA特異結合的分離的抗體基本上不含有與非PSMA抗原特異結合的抗體)。然而，與人類PSMA的抗原表位、同種型或突變體特異結合的分離的抗體可能與其它相關抗原，如來自其它物種(如PSMA的種間同源物)交叉反應。而且，分離的抗體基本上不含有其它細胞物質和/或化學物質。在該發明的一項實施方案中，具有不同特異性的「分離的」單克隆抗體的組合以確定的組成進行組合。
這裡所用的「特異結合」指抗體與預先確定的抗原之間的結合。典型地，抗體以至少約1×107M-1的親和力結合，以比非特異性抗原(如BSA，酪蛋白)至少高兩倍的親和力與預先確定抗原結合，其中非特異性抗原是除了預先確定抗原或緊密相關抗原之外的抗原。「抗體識別抗原」和「抗體特異於抗原」的說法在這裡與術語「與抗原特異性結合的抗體」互用。
這裡所用的對IgG抗體的「高親和性」指結合親和力至少約107M-1，優選地至少約109M-1，更優選地至少約1010M-1，1011M-1，1012M-1或更大，如高達1013M-1或更大。然而，「高親和力」結合對其它的抗體同種型可能不同。例如，對IgM同種型的「高親和力」結合指結合親和力至少約1×107M-1。
這裡所用的術語「Kassoc」指一特定的抗體-抗原相互作用的結合常數。
這裡所用的術語「Kdis」指一特定的抗體-抗原相互作用的解離常數。
這裡所用的「同種型」指由重鏈恆定區基因編碼的抗體類型(如IgM或IgG1)。
這裡所用的「同種型轉變」指抗體的類型或同種型從一種Ig類型變為另外一種Ig類型的現象。
這裡所用的「非轉變同種型」指重鏈的同種型類型，它是在沒有同種型轉變發生時產生的；典型的編碼非轉變同種型的CH基因是第一個CH基因，它位於功能重排的VDJ基因的下遊最前端。同種型轉變分為經典和非經典同種型轉變，經典同種型轉變通過重組事件發生，這在轉基因中涉及到至少一個轉變序列區。非經典同種型轉變可以通過如人類σμ和人類∑μ(δ相關性缺失)之間的同源重組而發生。另外的非經典轉變機制，如轉基因內和/或染色體內重組也可能發生，並影響同種型轉變。
這裡所用的術語「開關序列」指負責轉變重組的DNA序列。「轉變供體」序列，典型地是μ轉變區，位於轉變重組過程中將被刪除的構成區域的5′(如上遊)，「轉變受體」區位於將被刪除和取代的恆定區的構成區域之間(如γ，ε，等)。由於重組不是總在特定的位點發生，所以最終基因序列不能從構成物中明顯地預測出。
這裡所用的「糖基化模式」定義為碳水化合物單位共價地附著到蛋白質，尤其特異地附著到免疫球蛋白上的模式。異種抗體的糖基化模式的特徵可以是基本上與在非人轉基因動物物種所產生的抗體所發生的糖基化模式相似，此時，該領域中的一種普通技術可將異種抗體的糖基化模式與非人轉基因動物物種中的所述的糖基化模式之間相似性識別為比轉基因的CH基因衍生的物種中的更高。
這裡所用於某對象的術語「天然存在」指能在自然界中找到該對象的現象。例如，存在於生物體(包括病毒)中的多肽或多聚核苷酸序列就是天然存在的，其中此生物體能夠從自然界中的資源中分離到並沒有被人類在實驗中有意識地修飾過。
這裡所用的術語「重排的」指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構型，其中V片段恰好在構象上與D-J或J片段毗鄰，分別編碼完整的VH或VL結構域。重排的免疫球蛋白基因座可以通過與種系DNA相比較而鑑定；重排基因座含有至少一個重組的七鹼基/九鹼基同源片段。
相關於V片段，這裡所用的術語「未重排的」或「種系構象」指V片段未被重組到恰好與D或J片段毗鄰的位置。
這裡所用的術語「核酸分子」包括DNA分子和RNA分子。一個核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選為雙鏈DNA。
涉及編碼與PSMA結合的抗體或抗體部分(如VH，VL，CDR3)的核酸時，這裡所用的術語「分離的核酸分子」是指編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不包含編碼與非PSMA抗原結合的抗體或抗體部分，其中在人類基因組DNA中其它序列可能自發地位於該核酸分子的兩側。SEQ ID NOS1-12包括含有發明的人類抗PSMA單克隆抗體3.F2，1.D2和2.E8的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區的核苷酸和胺基酸序列。
對於核酸，術語「基本同源」表示，兩核酸或其指定序列當以最佳方式排列和比較時，在有適當的核苷酸插入或刪除情況下，至少有約80％的核苷酸相同，通常至少為約90％至95％，更優選地，至少約為98％到99.5％。或者，當片段在選擇性雜交條件下與其互補鏈雜交時，基本同源存在。
兩序列之間的等同百分比是兩序列所共同的位置的數目的函數(即同源％＝等同位置數/總位置數×100)，這需考慮進缺口數和每一缺口的長度，其中缺口的引入是為了兩序列的最佳比較，序列的比較和兩序列等同百分比的確定可以利用數學算法獲得，如下面所描述的非局限例子。
確定兩核苷酸序列的等同百分比可以利用GCG軟體包中的GAP程序(在http∥www.gcg.com獲得)，其中運用NWSgapdna.CMP matrix和40，50，60，70或80的缺口權重及1，2，3，4，5或6的長度權重，確定兩核苷酸或胺基酸序列的等同百分比也可利用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))，該算法已被加入到ALIGN程序(版本2.0)，其中適用PAM120重量殘基表口的缺口長度罰分和4的缺口罰分。另外，確定兩胺基酸序列的等同百分比可利用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))算法，該算法已被加入到GCG軟體包(在http∥www.gcg.com獲得)中的GAP程序中，它運用或者Blossum 62 matrix或者PAM 250 matrix及16，14，12，10，8，6或4的缺口權重和1，2，3，4，5或6的長度權重。
該發明中的核酸和蛋白序列可進一步用作「搜索序列」來在公共資料庫中搜索，例如，鑑定相關序列。這類搜索可以利用如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10所述的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)進行。BLAST核苷酸搜索可以利用NBLAST程序，分值＝100，字母長度＝12來獲得與發明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以利用XBLAST程序，分值＝50，字母長度＝3來獲得與發明的蛋白分子同源的胺基酸序列。為了比較而獲得有缺口的排列，可以利用如在Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中所述的缺口BLAST。當利用BLAST和缺口BLAST程序時，可以利用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的預設參數。見httpwww.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可以存在於完整細胞中，細胞裂解物中或以部分純化或基本純化的形式存在。當核酸與其它細胞組份或其它汙染物，如其它細胞的核酸或蛋白，分離開時，就是「分離的」或「變為基本純淨的」，其中這是利用標準技術，包括鹼/DSD處理，CsCl分帶，柱層析，瓊脂糖凝膠電泳和該領域中其它已知技術。見F.Ausubel等。Current Protocols inMolecular Biology，Greene出版社，Wiley Interscience，New York(1987)。
該發明的核酸組合物，來自cDNA，基因組成其混合物，它儘管通常是天然序列(除了修飾的限制性位點和相似位點)，但可以根據標準技術被突變以提供基因序列。對於編碼序列，這些突變可能影響預期的胺基酸序列。尤其地，與天然V，D，J，恆定區，開關序列和其它這裡所描述的此類序列基本同源或衍生於這些序列的DNA序列也為本發明所考慮(這裡的「衍生」表示一序列與另一序列相同或由另一序列修飾而來)。
當一核酸與另一核酸序列發生功能關係時，它們就「被操作性相連」。例如，如果一啟動子或增強子影響編碼序列轉錄，它就與該序列操作性相連。當考慮到轉錄調控序列時，操作性相連是指被連接的DNA序列是連續的，及當需要時在閱讀框中連接兩個連續的蛋白編碼區。對於開關序列，操作性相連顯示，這些序列能夠影響轉變重組。
這裡所用的術語「載體」指能夠轉運與它相連的另外核酸分子的核酸分子。一類載體是「質粒」，它指環狀的雙鏈DNA環，可以在它的上面連接其它的DNA片段。另一類載體是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接到病毒基因組中，一些載體能夠在它們所引入的宿主細胞中自主複製(如，具有細菌複製起點的細菌載體和游離的哺乳動物載體)。其它載體(如非游離的哺乳動物載體)能夠在引入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組上，因而隨著宿主基因組複製。而且，某些載體能夠指導與其操作性相連的基因的表達，這裡這類載體定義為「重組表達載體」(或簡單地，「表達載體」)。一般地，用於重組DNA技術的表達載體通常是質粒形式。在該特殊情況下，「質粒」和「載體」可以互用，這是因為質粒是最常用的載體形式。然而，該發明將包括其它形式的表達載體，如病毒載體(如，複製缺陷的逆轉錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)，它們發揮相同的功能。
這裡所用的術語「重組宿主細胞」(或簡單地「宿主細胞」)指引入了重組表達載體的細胞。應該理解的是，這類術語不僅指特定對象細胞，也指該細胞的前體。由於突變或環境影響，這種前體細胞在相繼的傳代過程中可能發生某種變異，所以實際上它不可能與親本細胞等同，但它仍然被包括在這裡所用的術語「宿主細胞」的範圍之內。
該發明的不同方面在以下部分中進一步詳細描述。I.PSMA的人類抗體的製備發明的單克隆抗體(mAbs)可用不同技術製備，這些技術包括常規的單克隆抗體製備方法，如標準的體細胞雜交技術，Kohler和Milstein，Nature 256495(1975)。儘管一般情況下優選體細胞雜交方法，但也可利用其它製備單克隆抗體的技術，如B淋巴細胞的病毒或癌基因轉化。
產生雜交瘤的優選動物系統是小鼠系統。在小鼠中產生雜交瘤的方法非常成熟。免疫程序及分離用於融合的免疫脾細胞的技術在此領域中也已知，融合的配對細胞(如鼠的骨髓細胞)和融合程序也已知。
在一優選的實施方案中，針對PSMA的人類單克隆抗體可以利用轉基因小鼠產生，該小鼠含有人類免疫系統而非小鼠免疫系統的組份。這類轉基因小鼠，在這裡定義為「HuMAb」小鼠，含有人類免疫球蛋白基因的小區，它編碼未重排的人類重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列，HuMAb小鼠還含有使內源μ和κ鏈區失活的靶向突變(Lonberg，N.等，(1994)Nature 368(6474)856-859)。相應地，小鼠的鼠源IgM orκ表達下降，並且應答於免疫處理，引入的人類重鏈和輕鏈轉基因進行類型轉變和體細胞突變以產生高親和力的人類IgGκ單克隆(Lonberg，N.等(1994)，supra；Lonber；總述N(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 11349-101，Lonberg，N.和Huszar.D(1995)Intern.ReV.Immunol.Vol.1365-93，和Harding，F和Lonberg，N(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764536-546)。HuMab小鼠的製備在部分II及見Taylor，L.等(1992)Mucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4117-123；Chem，J.等(1993)ENBO J.12821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.1522912-2920；Lonberg等(1994)Nature 368(6474)856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology11349-101；Taylor，L等(1994)International Innunology 6579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93；Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14845-851中詳述，以上文獻的內容都引入文獻。進一步見，U.S.專利Nos.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；以上都屬於Lonberg和Kay，和GenPharm International；U.S.專利5,545,807，屬於Surani等；國際公開Nos.WO 98/24884，1998，1月11日出版；WO 94/25585，1994，9月10日出版；WO 93/1227，1993，1月24日出版；WO 92/22645，1992年12月23日出版；WO 92/03918，1992年3月19日出版，以上專利的公開內容引入文獻。或者，例2中所描述的HCO12轉基因鼠能用於產生人類抗PSMA抗體。HuMab免疫為了完全產生抗PSMA的人類單克隆抗體，可用純化的或富集的PSMA抗原製備物和/或表達PSMA的細胞免疫HuMab小鼠，如在Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14845-851和WO 98/24884中所描述的。優選地，在初次注射時，小鼠年齡為6-16周。例如，用純化的或富集的PSMA抗原製備物(5-20μg)(如從表達PSMA的LNCaP細胞中純化)腹腔注射免疫HuMab小鼠。當用純化的或富集的PSMA抗原製備物免疫小鼠不產生抗體時，也可用表達PSMA的細胞免疫小鼠以啟動免疫應答，如腫瘤細胞系。
不同抗原免疫所積累的經驗表明，當以下列方式免疫HuMAb轉基因小鼠時，其應答最好。免疫方式為初次利用弗氏完全佐劑腹腔(IP)注射抗原，然後用弗氏不完全佐劑每隔一周腹腔免疫(直到總數為6)。可以在免疫過程中眼眶取血來測定免疫應答。血漿可以利用ELISA(見下述)來篩選，具有足夠效價的抗PSMA人類免疫球蛋白的小鼠可用作融合，可在處死小鼠及取脾之前3天靜脈注射抗原給小鼠以強化免疫。可預期對每一抗原需要進行2-3次融合，對每一種抗原需免疫幾隻小鼠。例如，可以免疫12隻HCO7和HCO12系的HuMAb小鼠。產生抗PSMA的人類單克隆抗體的雜交瘤的生成根據標準方法(8，13)，能夠分離小鼠脾細胞，並利用PEG將其與小鼠的骨髓瘤細胞系相融合，然後篩選產生抗原特異性抗體的雜交瘤。例如，利用50％PEG，將來自免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸液與其數目1/6分之一的非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1580)P3X63-Ag8.653融合。約2×105個細胞鋪到平底微量滴定板上，接著在選擇性培養基中培養二周，其中選擇性培養基含有20％胎兒克隆血清，18％「653」條件培養基，5％(IGEN)，4mM L-穀氨醯胺，1mM L～穀氨醯胺，1mM丙酮酸鈉，5mM HEPES，0.055mM 2-巰基乙醇，50單位/ml青黴素，50mg/ml鏈黴素，50mg/ml慶大黴素和1×HAT(Sigma；HAT在融合後24小時加入)。兩周之後，細胞培養在HT取代了HAT的培養基中。然後利用ELISA來篩選能產生人類抗PSMA單克隆IgM和IgG抗體的孔。一旦發生雜交瘤生長過盛情況，通常在10-14天之後，檢測培養基。分泌抗體的雜交瘤重新鋪到板上並重新篩選，如果仍然是人類IgG抗PSMA單克隆抗體陽性，就可通過有限稀釋法將其至少亞克隆二倍，這樣體外培養穩定的亞克隆以在組織培養基中產生用於鑑定的少量抗體。人類單克隆抗體與PSMA結合的鑑定為了鑑定發明的人類PSMA單克隆抗體的結合作用，測定來自免疫小鼠的血清，例如利用ELISA。簡單地，微量滴定板用純化的PSMA包被，PSMA溶於PBS中，濃度為0.25μg/ml，然後用5％溶於PBS中的牛血清白蛋白封閉，將來自PSMA免疫小鼠的血漿的稀釋液加入到每孔中，並在37℃保溫1-2小時，用PBS/Tween洗板，然後加入偶聯了鹼性磷酸酶的山羊抗人IgG Fc特異的多克隆試劑，並在37℃保溫1小時，洗滌之後，加入pNPP底物(1mg/ml)，在OD405-650分析。優選地，達到最高效價的小鼠將用於融合。
如上所述的ELISA分析也可用於篩選與PSMA免疫原反應顯示陽性的雜交瘤。與PSMA結合具有高親和性的雜交瘤將被克隆和進一步鑑定。來自每個雜交瘤的一個克隆，它如果保持親本細胞的反應性(通過ELISA)，就可被選擇用於製備5-10活細胞庫，保存在-140℃，以及用於抗體純化。
為了純化人類抗PSMA抗體，選中的雜交瘤生長在用於單克隆抗體純化的兩升旋轉培養瓶中。在蛋白A瓊脂糖(protein A-sepharose)(Pharmacia，Piscataway，NJ)親和層析柱之前過濾及濃縮上清(洗脫下的IgG可以通過凝膠電泳和高效液相色譜來核實其純度)，緩衝液可被換成PBS，其濃度可以用OD280測定，其消光係數為1.43，將單克隆抗體等分並保存於-80℃。
為了測定是否所選的人類抗PSMA單克隆抗體與特定的抗原表位相結合，可以利用可購買的試劑(Pierce，Rockford，IL)來生物素標記每一抗體。利用如上所述的PSMA包被的ELISA板來進行未標記的和生物素標記的單克隆抗體的競爭性研究。生物素標記的單克隆抗體的結合能夠用鏈親和素鹼性磷酸酶探針檢測到。
為了測定分離的抗體的同種型，可以進行同種型ELISA。微量滴定板的孔用10μg/ml的抗人類Ig 4℃包被過夜。用5％BSA封閉之後，與10μg/ml的單克隆抗體或純化的同種型對照在環境溫度下反應2小時，然後再與或者人類IgG1或人類IgM特異的鹼性磷酸酶偶聯的探針反應，如以上所述分析反應板。
為了證明單克隆抗體與表達PSMA的活細胞結合，可用流式細胞儀。簡單地，表達PSMA的細胞系(在標準生長條件下生長)與不同濃度的單克隆抗體混合，37℃保溫1小時，其中單克隆抗體溶於含有0.1％Tween 80和20％小鼠血清的PBS中。洗滌之後，細胞在與初始抗體染色相同的條件下與螢光標記的抗人類IgG抗體反應，利用FACScan設備來分析樣品，FACScan是利用光散射和衍射特性使單個細胞通過門。另一種分析方法可利用螢光顯微鏡(補充或取代)流式細胞儀分析。細胞正如上所述染色，然後用螢光顯微鏡檢測。這種方法能夠觀察到單個細胞，但靈敏度可能降低，這依賴於抗原的密度。
抗PSMA人類IgG與PSMA抗原的反應性可用免疫雜交進一步測定。簡單地，從表達PSMA的細胞中製備細胞提取物，並走十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳。電泳之後，將被分開的抗原轉移到硝酸纖維素膜上，用20％小鼠血清封閉，並用待測單克隆抗體雜交。人類IgG結合可以用抗人IgG鹼性磷酸酶及其底物BCIP/NBT片段(SigmaChem.Co.，St.Louis，MO)檢測到。抗PSMA的人類單克隆抗體的吞噬和細胞殺傷活性除了測定人類單克隆抗PSMA抗體與PSMA的特異性結合之外，還可測定其介導吞噬和殺傷表達PSMA的細胞的能力。體外測定單克隆抗體活性將在體內模型中測定之前提供初始篩選。簡單地，利用FicollHypaque密度離心從健康供體中分離多形核細胞(PMN)或其它效應細胞，然後裂解汙染的紅細胞。PMNs被洗滌之後，懸浮於含有10％熱失活胎牛血清的RPMI中，並以不同的效應細胞與腫瘤細胞之比(效應細胞腫瘤細胞)與表達PSMA的51Cr標記細胞混合，接著加入不同濃度的人類抗PSMA IgG，不相關的人類IgG用作負對照，該測定可在37℃進行0～120分鐘。通過測定釋放到培養上清的51Cr來分析樣品的細胞裂解作用，抗PSMA單克隆也可以互相組合的形式來測定，以分析細胞裂解作用是否在多種單克隆抗體作用下增強。
與PSMA結合的人類單克隆抗體也可在體內模型中(如小鼠中)檢測其介導吞噬和殺傷表達PSMA的細胞的效應，如腫瘤細胞。例如，這些抗體可以基於以下標準來選擇，這些標準也不是唯一的1)與表達PSMA的活細胞的結合；2)與PSMA結合的高親和力；3)與PSMA的獨特的抗原表位的結合(減少當以組合形式使用時，具有互補活性的單克隆抗體競爭性結合同一抗原表位的可能性)；4)表達PSMA的細胞的調理作用；5)在人類效應細胞的存在下，生長抑制、吞噬和/或殺傷表達PSMA的細胞的介導作用。
該發明中的優選人類單克隆抗體都符合這些標準中的一條或多條，優選地是符合所有各條。在一項特定的實施方案中，人類單克隆抗體以組合形式使用，如，作為一種藥物組合物，它包含兩種或多種抗PSMA單克隆抗體或其片段。例如，具有不同的但互補的活性的人類抗PSMA抗體可以在一種療法中組合起來以獲得理想的治療或診斷效果。其中一例是這樣的一種組合物，它含有在效應細胞存在下能夠介導高效殺傷靶細胞的抗PSMA人類單克隆抗體和能夠抑制表達PSMA的細胞生長的另一種人類抗PSMA單克隆抗體。II.能夠產生人類單克隆抗PSMA抗體的轉基因非人動物的生成另一方面，該發明提供轉基因非人動物，如轉基因小鼠，它能夠表達與PSMA特異性結合的人類單克隆抗體，尤其是具有高親和性的抗體。在一項優選的實施方案中，轉基因非人動物，如轉基因小鼠(HuMab小鼠)具有包含人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。在一項實施方案中，轉基因非人動物，如轉基因小鼠，被純化的或富集的PSMA抗原製備物和/或表達PSMA的細胞免疫。優選地，轉基因非人動物，如轉基因小鼠，能夠通過V-D-J重組和同種型轉變而產生抗PSMA的人類單克隆抗體的多種同種型(如IgG，IgA和/或IgE)。同種型轉變可以通過經典或非經典同種型轉變而發生。
設計以異源性抗體所有組份形式對應答於外源抗原刺激的轉基因非人動物，需要轉基因動物在B細胞發育過程中含有功能正確的異源免疫球蛋白基因。在一項優選的實施方案中，異源重鏈轉基因的正確功能包括同種型轉變。相應地，發明的轉基因按產生同種型轉變和以下的一項或多項目的構建(1)高水平和細胞型特異表達，(2)有功能的基因重排，(3)等位排斥的活化和應答，(4)足夠的初始全部組份的表達，(5)信號轉導，(6)體細胞超突變，和(7)在免疫應答過程中轉基因抗體基因座的顯性化。
並不是以上所有標準都需要滿足。例如，在一些實施方案中，當轉基因動物的內源性免疫球蛋白基因座被功能性破壞，轉基因就不需要活化等位排斥。而且，在一些實施方案中，當轉基因含有功能性重排的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因時，第二條標準中的功能基因重排就不需要了，至少對已經重排的轉基因而言。對於分子免疫學背景，見基本免疫學(Fundamental Immunology)，第二次出版(1989)，Paul William E.著，Raven出版，N.Y.，它在此引入參考文獻。
在某實施方案中，用於產生發明的人類單克隆抗體的轉基因非人動物在某種系中含有重排的，未重排的或兩者組合的異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因。每一重鏈轉基因包括至少一個CH基因。另外，重鏈轉基因可能含有同種型轉變的功能序列，該序列能夠在轉基因動物的B細胞中支持編碼多個CH基因的異源轉基因的同種型轉變。這些開關序列可以是自發存在於生物種系免疫球蛋白基因座上的序列，其中該物種是轉基因CH基因來源的物種或這些開關序列可以來自存在於轉基因受體(轉基因動物)的序列，例如，如果用於產生轉基因小鼠，人類轉基因結構摻入與小鼠重鏈轉基因座中自然存在的開關序列相似的序列，它就可以產生更高頻率的同種型轉變，這是因為小鼠開關序列與小鼠轉變重組酶系統之間以最佳狀態發揮作用，而人類開關序列則不同。開關序列可以利用常規的克隆方法進行分離和克隆，或者在已發表的相關於免疫球蛋白轉變區序列(Mills等，Nucl.Acids Res.157305-7316(1991)；Sideras等，Intl.Immunol.1631-642(1989)，這裡它們以文獻形式引入)基礎上。設計重疊合成的寡聚核苷酸，來體外合成。對於以上的每種轉基因動物，功能性重排的異源性重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因都在轉基因動物的B細胞中存在著明顯的比例(至少10％)。
發明中的用於產生轉基因動物的基因包括重鏈轉基因，該基因所包括的DNA編碼至少一個可變基因片段，一個多樣基因片段，一個連接基因片段和至少一個恆定區基因片段。免疫球蛋白輕鏈轉基因包括的DNA編碼至少一個可變基因片段，一個連接基因片段和至少一個恆定區基因片段。這些編碼重鏈和輕鏈片段的基因片段對於轉基因非人動物是異源性的，因為它們來自或相應於不屬於轉基因非人動物物種的編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈片段的DNA。該發明的一方面，轉基因被構建結果使得單獨的基因片段不重排，即不重排以編碼有功能的免疫球蛋白的輕鏈或重鏈。這種不重排的轉基因支持V，D和J基因片段的重組(功能性重排)，並且尤其支持在有PSMA抗原時D區基因片段的全部或部分插入到轉基因非人動物中的重排的免疫球蛋白重鏈中。
在一項可替代的實施方案中，轉基因包括未重排的「小基因座」。這種轉基因典型地包括C，D和J片段的基本部分以及V基因片段的一亞套。在這種轉基因結構中，不同的調控序列，加啟動子，增強子，類型轉變區，用於RNA加工的剪切供體和剪切受體，重組信號等，包括來自異源DNA的相應序列，這種調控序列可以摻入到轉基因中，該轉基因來自與發明中所用的非人動物相同或相似的物種。例如，人類免疫球蛋白基因片段可以在轉基因中與嚙齒類的免疫球蛋白增強子序列相結合以用於轉基因動物。或者，合成的調控序列可摻入到轉基因中，這裡這種合成的調控序列與哺乳動物基因組中自然存在的已知的功能DNA序列不同源。合成的調控序列根據保守性原則設計，例如規定剪切受體位點或啟動子/增強子基序的允許序列的原則。例如，一個小基因座包括，與自然存在的種系Ig基因座相比至少有一個內部(即不在部分的末端)刪除非必需DNA序列(如間插DNA，內含子或其部分)的基因組免疫球蛋白基因座的一部分。
在發明的一項優選實施方案中，用於產生抗PSMA的人類抗體的轉基因動物含有至少一個，典型2-10，有時25-50或更多拷貝的轉基因，如WO 98/24884中的例子12所述的(如pHC1或pHC2)，或該轉基因動物與含有單個拷貝輕鏈轉基因的動物，如WO 98/24884中的例5，6，8或14所述，交配，後代與JH缺失動物，如WO 98/24884中的例10所述，交配。WO 98/24884的內容引入文獻。對於這三種特徵的每一種，動物都被培育成純合。這種動物具有以下基因型人類重鏈未重排的小基因座(WO 98/24884的例12中所述)的單個拷貝(每套單倍體染色體)，重排的人類K輕鏈結構(WO 98/24884中的例14所述)的單個拷貝(每套單倍體染色體)，和在每一個內源性小鼠重鏈轉基因座上除去所有功能性JH片段的刪除(WO 98/24884中的例10所述)。這種動物與JH片段刪除結合的小鼠(WO 98/24884的例10)交配，以產生JH刪除結合和人類重鏈和輕鏈構建物雜合的後代。注射抗原給此後代動物，以用於產生抗此抗原的人類單克隆抗體。
從這種動物中分離的B細胞在人類重鏈和輕鏈方面是單特異性的，這是因為它們只含有每個基因的單拷貝。而且，它們在人或鼠重鏈方面也將是單特異性的，這是因為鼠的兩個內源性重鏈轉基因拷貝由於引入了跨越JH區域的刪除而是無功能的，如WO 98/24884中的例9和12所述。再者，B細胞的基本部分在人類或鼠輕鏈方面是單特異性的，這是由於重排的人類κ輕鏈轉基因的表達會在B細胞的相當部分中等位或同種型排斥內源性的小鼠κ和入鏈基因的重排。
優選實施方案中的轉基因小鼠產生免疫球蛋白的所有組成成分，理想狀況下，基本上與自然小鼠相似。因而，例如，在內源性Ig基因失活狀況下，總的免疫球蛋白水平的範圍在血清中是0.1到10mg/ml。優選地2.5到5mg/ml，理想是至少約1.0mg/ml。當能夠影響IgM轉變為IgG的轉基因引入到轉基因小鼠中時，成年鼠中的血清IgG與IgM之比傾向於約10∶1。IgG與IgM之比在不成熟鼠中將低得多。一般地，超過約10％，尤其40％到80％的脾和淋巴結B細胞專一地表達人類IgG蛋白。
所有組成成分將理想地以通常至少10％，優選25％到50％或更高的百分比相似於非轉基因小鼠中。一般地，將產生至少約1000種不同的免疫球蛋白(理想的是IgG)，優選的為104到106或更多，這主要依賴於引入小鼠基因組中的不同的V，J和D區域的數目。這些免疫球蛋白典型地將識別高抗原性蛋白的一半或更多，如鏈球菌蛋白A。典型地，免疫球蛋白對預選的抗原顯示出的親和力至少約107M-1，優選的至少約109M-1，更加優選的至少約1010M-1，1011M-1，1012M-1或更大，如高達1013M-1或更大。
在一些實施方案中，可能傾向於產生具有預先確定的所有組成成分的小鼠，以限制代表對預先確定的抗原類型的抗體應答的V基因的選擇。例如，具有預先確定的所有組成成分的重鏈轉基因可包括人類VH基因，該基因在人類中優選用於對預先確定的抗原類型的抗體應答。或者，一些VH基因由於不同的原因(如，對預先確定的抗原，其所編碼高親和力V區的可能性小，發生體細胞突變的傾向性弱和親和性減小，或對某些人具有免疫原性)而被從確定的所有組成成分中排除。因而，具有不同重鏈和輕鏈轉基因片段的轉基因在重排之前，可以被預先鑑定是否來自非轉基因動物的生物物種，如通過雜交或DNA測序。
如前所述，該發明的轉基因小鼠可以免疫純化的或富集的PSMA抗原製備物和/或表達PSMA的細胞。小鼠將產生B細胞，該B細胞通過轉基因內的轉變重組(順式轉變)進行類型轉變以及表達與PSMA反應的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以是人類序列抗體，其中重鏈和輕鏈多肽由人類轉基因序列編碼，該轉基因序列包括來自體細胞突變和V區重組或連接所產生的序列以及種系編碼的序列；雖然對於體細胞突變和不同的V-J和V-D-J重組連接而存在其它的非種系序列，這些人序列免疫球蛋白可以看作基本上等同於由人類VL或VH基因片段和人類JL或JL片段編碼的多肽序列。考慮到這些人類序列抗體，每條鏈的可變區至少80％由人類種系V，J及對於重鏈還有D基因片段編碼；經常至少85％的可變區由存在於轉基因上的人類種系序列編碼；常常90％或95％或更多的可變區序列由存在於轉基因上的人類種系序列編碼。然而，由於非種系序列因體細胞突變和VJ及VDJ連接而引入，人類序列抗體經常具有一些可變區序列(不經常的為恆定區序列)，這些序列不是由存在於小鼠種系中的人類轉基因的V，D或J基因片段編碼。典型地，這種非種系序列(或單獨的核苷酸位置)將聚集在CDR內或其附近，或者聚集在已知的體細胞突變聚集的區域。
與預先確定抗原結合的人類序列抗體可來自同種型轉變，因而產生了包括一人類序列γ鏈(如γ1，γ2a，γ2B或γ3)和一人類序列輕鏈(如K)的人類抗體。這種同種型轉變的人類序列抗體常常包含一個或多個體細胞突變，典型地位於可變區，並且常常在CDR的約10個殘基內，這是由於親和的飽和和抗原對B細胞的選擇，尤其是由於接著的第二次抗原刺激。這些高親和人類序列抗體具有的結合親和性至少1×109M-1，典型地至少5×109M-1，經常超過1×1010M-1，有時5×1010M-1至1×1011M-1或更大。
發明的另一方面屬於來自這類小鼠的B細胞，這種B細胞被用於產生表達人類單克隆抗體的雜交瘤，其中此抗體以高親和力與PSMA結合(如大於2×109M-1)。因而，在發明的另一項實施方案中，這些雜交瘤用於產生包括免疫球蛋白的組合物，其中免疫球蛋白與PSMA結合的親和常數(Ka)至少2×109M-1，這裡所說的免疫球蛋白包括人類序列輕鏈，由以下部分組成(1)具有一個多肽序列的輕鏈可變區，此多肽序列基本等同於由人類VL基因片段和人類JL基因片段的多肽序列，和(2)具有一個多肽序列的輕鏈恆定區，該多肽序列基本等同於由人類CL基因片段編碼的多肽序列；和人類序列重鏈，由以下部分組成(1)具有一個多肽序列的重鏈可變區，該多肽序列基本上等同於由人類VH基因片段，具可選擇性的D區，和人類JH片段編碼的多肽序列，和(2)具有一多肽序列的恆定區，此多肽序列基本等同於由人類CH基因片段編碼的多肽序列。
抗PSMA的高親和人類單克隆抗體的發展得益於用於在轉基因小鼠中擴增人類可變區基因片段的所有組成成分的方法，該轉基因小鼠具有含有一整合的人類免疫球蛋白轉基因的基因組，此所說的方法包括將包含V區基因片段的V基因引入基因組，其中該V基因片段不存在於所說的整合人類免疫球蛋白轉基因中。通常地，V區轉基因是一酵母人工染色體，它包括人類VH或VL(VK)基因片段排列的一部分，正如在人類基因組中可能自然出現的或可以通過重組方法分別地剪切到一起，V區轉基因可包括亂序或省去的V基因片段。通常至少五個或更多個功能V基因片段包含在YAC中。在這變化中，通過V所有組成成分擴增方法來產生轉基因小鼠是可能的，其中該小鼠表達免疫球蛋白鏈，它包括由位於V區轉基因上的V區基因片段編碼的可變區序列和由人類Ig轉基因編碼的C區。通過V所有組成成分擴增的方法，可以生成具有至少5個不同的V基因的轉基因小鼠，這是由於小鼠至少含有約24個V基因或更多。一些V基因片段可能是無功能的(如假基因等)，如果需要，這些片段可以利用技術人員所用的重組方法來保留或選擇性刪除。
一旦小鼠種系被改造成含有具有擴增的V片段所有組成成分的功能YAC，其中這些V片段基本上在含有J和C基因片段的人類Ig轉基因中不存在，這種性狀就會被繁殖並且培育進其它的遺傳背景，包括具有擴增的V片段所有組成成分的功能YAC被具有不同的人類Ig轉基因的小鼠種系所獲得。具有擴增的V片段所有組成成分的多功能YAC可以被一種系獲得以與一人類Ig轉基因(或多個人類Ig轉基因)一起作用。儘管這裡將其定義為YAC轉基因，這種轉基因當整合到基因組中時將基本上缺少酵母序列，例如在酵母中自主複製所需的序列；在酵母中複製不再需要後(即在引入到小鼠ES細胞或小鼠前合子之前)，這種序列可以被選擇的通過基因工程(如限制性消化和脈衝場凝膠電泳或其它合適的方法)去除。增殖人類序列免疫球蛋白表達的性狀的方法包括養殖一種轉基因小鼠，它具有人類Ig轉基因，並且最好還具有含有增殖的V片段所有組成成分的功能YAC。VH和VL基因片段都可存在於YAC。轉基因小鼠可以被職業人員養殖進所需的任何遺傳背景，包括人類Ig轉基因和/或編碼其它人類淋巴細胞蛋白的轉基因。該發明還提供由轉基因小鼠所產生的高親和性人類序列免疫球蛋白，該轉基因小鼠具有擴增的V區所有組成成分YAC轉基因。雖然以上描述了發明的轉基因動物的優選實施方案，其它實施方案也詳細考慮到，它們分為四類I.含有未重排的重鏈和重排的輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；II.含有未重排的重鏈和未重排的輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；III.含有重排的重鏈和未重排的輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；和IV.含有重排的重鏈和重排的輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物。
在這幾類轉基因動物中，優選順序如下II＞I＞III＞IV，其中內源性輕鏈轉基因(或至少K基因)已被通過同源重組(或其它方法)敲除；和I＞II＞III＞IV，其中內源性輕鏈轉基因未被敲除而且通過等位排除而呈顯性。III.與PSMA結合的雙特異性/多特異性分子在發明的另外實施方案中，PSMA的人類單克隆抗體或其抗原結合部分可與其它功能分子偶聯，如其它的多肽或蛋白(如Fab′片段)，以產生與多結合位點或靶抗原表位結合的雙特異性或多特異性分子。例如，發明的抗體或抗原結合部分與一個或多個其它結合分子，如其它抗體，抗體片段，多肽或結合模擬物，功能偶聯(如通過化學偶聯，基因融合，非共價結合或其它)。
相應地，該發明包括雙特異性和多特異性分子，它們包含至少一個對PSMA的第一結合特異性和一個對靶抗原表位的第二結合特異性。在發明的一項特定實施方案中，第二個靶抗原表位是Fc受體，如人類FcγRI(CD64)或人類Fcα受體(CD89)。因此，發明包括能夠與表達FcγR，FcαR或FcεR的效應細胞(如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMNs))結合和表達PSMA靶細胞結合的雙特異性和多特異性分子。該雙特異性和多特異性分子靶向於PSMA表達細胞和效應細胞，並且類似於發明的人類單克隆抗體，激活Fc受體介導的效應細胞活性，如吞噬PSMA表達細胞，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)，細胞因子釋放或超氧陰離子的生成。
發明的雙特異性和多特異性分子可進一步包括除了抗Fc結合特異性和抗PSMA結合特異性之外的第三結合特異性。在一項實施方案中，這第三個結合特異性是抗增強因子(EF)部分，如與一表面蛋白結合的分子，該表面蛋白參與細胞毒活性並能增強對靶細胞的免疫應答。「抗增強因子部分」可以是一抗體，功能抗體片段或與一給定分子結合的配基，給定分子如抗原或受體，這樣就會使得Fc受體或靶細胞抗體的結合決定子的效應增強。或者，抗增強因子部分能夠與不同於第一和第二結合特異性所結合的單位結合。例如，抗增強因子部分能夠結合細胞毒性T細胞(如通過CD2，CD3，CD8，CD28，CD4，CD40，ICAM-1或其它能增強對靶細胞的免疫應答的免疫細胞)。
在一項實施方案中，發明的雙特異性和多特異性分子對於結合特異性包括至少一個抗體或其抗體片段，包括如Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv或單鏈Fv。抗體也可是輕鏈或重鏈二聚體，或其任意的最小片段，如Fv或其單鏈組合物，這如Ladner等U.S.專利No.4,946,778，1990年8月7日所述，該專利的內容引入文獻。
在一項實施方案中，發明的雙特異性和多特異性分子包含對位於效應細胞表面的FcγR或FcαR的結合特異性和對靶細胞抗原，如PSMA的第二結合特異性。
在一項實施方案中，對Fc受體的結合特異性由人類單克隆抗體提供，其結合不能被人類免疫球蛋白G(IgG)所封閉。如這裡所用，術語「IgG受體」位於染色體1上的八個γ鏈基因中的任何一個。這些基因總共編碼12個跨膜或可溶的受體同種型，它們被分為三類Fcγ受體FcγRI(CD)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一項優選實施方案中，Fcγ受體是人類高親和性FcγRI。人類FcγRI是72kDa分子，它對單體IgG顯高親和性(108-109M-1)。
這些優選的單克隆抗體的生產和鑑定由Fanger等在PCT申請WO88/00052和U.S.專利No.4,954,617描述，這裡它被以文獻形式全部引入。這些抗體與FcγRI，FcγRII或FcγRIII的抗原表位結合，其結合位點不同於受體Fcγ結合位點，因此它們的結合基本上不被生理水平的IgG所封閉。該發明的有用的特異性抗FcγRI抗體是mAb 22，mAb 32，mAb44，mAb 62和mAb 197。產生mAb 32的雜交瘤可由美國典型培養物保藏中心取得，ATCC保藏號HB9469。抗FcrRI mAb22，mAb22的F(ab』)2片段可由Medarax，lnc(Annandale，N.J.)獲取。在其它實施方案中，抗Fc受體的抗體是單克隆抗體22(H22)的人源化形式。H22抗體的產生和鑑定在Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol 155(10)4996-5002和PCT/US 93/10384中描述。H22抗體產生細胞系以HA022CL1名稱在1992年11月4日保藏在美國典型培養物保藏中心，其保藏號是CRL 11177。
在另一項優選實施方案中，對Fc受體的結合特異性由與人類IgA受體結合的抗體提供，如Fc-α受體(FcαRI(CD89))，該結合優選地不被人類免疫球蛋白A(IgA)所封閉。術語「IgA受體」將包括位於染色體19上的一個α基因(FcαRI)的基因產物。已知這個基因編碼幾種交替剪切的跨膜同種型，分子量為55到110kDa。FcαRI(CD89)組成性表達在單核細胞/巨噬細胞、嗜酸性和嗜中性粒細胞中，但不在非效應細胞類群中表達。FcαRI對IgA1和IgA2具有中等親和性(≈5×107M-1)，該親和性在遇到細胞因子如G-CSF或GM-CSF時增強(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology 16423-440)。已經描述了四種FcαRI特異的單克隆抗體，它們被鑑定為A3，A59，A62和A77，它們與FcαRI的IgA配基結合結構域以外的區域結合(Monteiro，R.C.等，1992，J.Immunol.1481764)。
在發明中，優選使用FcαRI和FcγRI作為激活受體，這是因為它們(1)主要由效應細胞表達，如單核細胞，PMNs，巨噬細胞和樹突狀細胞；(2)以高水平表達(如每個細胞5000-100000)；(3)是細胞毒活性的介導因子(如ADCC，吞噬作用)；(4)介導靶向於自己的抗原的抗原呈遞增強作用，包括自身抗原。
在其它實施方案中，發明的雙特異性和多特異性分子進一步包括識別，如結合，靶細胞抗原，如PSMA的結合特異性。在一項優選實施方案中，此結合特異性由該發明的一種人類單克隆抗體提供。
這裡所用的「效應細胞特異的抗體」指與效應細胞的Fc受體結合的抗體或功能抗體片段。在本發明中所用的優選抗體與效應細胞的Fc受體結合，其結合位點不與內源性免疫球蛋白近鄰。
如這裡所用，術語「效應細胞」指參與免疫應答的效應時期而相反於免疫應答的認知時期和活化時期的免疫細胞。典型的免疫細胞包括骨髓或淋巴起源的細胞，如淋巴細胞(如B細胞和包括細胞毒性T細胞(CTLs)的T細胞)，殺傷細胞，自然殺傷細胞，巨噬細胞，單核細胞，嗜酸性細胞，嗜中性細胞，多形核細胞，粒細胞，肥大細胞和嗜鹼性細胞。一些效應細胞表達特異的Fc受體及發揮特異的免疫功能。在一優選實施方案中，效應細胞能夠誘導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)，如嗜中性細胞能夠誘導ADCC。例如，表達FcR的單核細胞、巨噬細胞參與特異殺傷靶細胞和呈遞抗原給免疫系統的其它組分，或結合呈遞抗原的細胞。在另外的實施方案中，效應細胞能夠吞噬靶抗原，靶細胞或微生物。效應細胞的特定FcR的表達受控於體液因子，如細胞因子。例如，已經發現幹擾素γ(IFN-γ)增強FcγRI的表達，這種增強的表達提高了FcγRI表達細胞對靶的細胞毒活性，效應細胞能夠吞噬或裂解靶抗原或靶細胞。
「靶細胞」指對象(如人或動物)中的任何不需要細胞，它能被發明的組合物(如，人類單克隆抗體，雙特異性或多特異性分子)所靶向。在一項優選實施方案中，靶細胞是表達過量表達PSMA的細胞。表達PSMA的細胞典型包括腫瘤細胞，如前列腺、腎臟和結腸腫瘤細胞。
雖然人類單克隆抗體是優選的，其它抗體也可用於發明的雙特異性或多特異性分子，它們是小鼠，嵌合和人源化單克隆抗體。
小鼠-人類嵌合的單克隆抗體(即嵌合抗體)可以通過該領域中已知的重組DNA技術產生，例如，編碼小鼠(或其它物種)單克隆抗體分子的Fc恆定區的基因用限制性酶消化以除去編碼小鼠Fc的區域，並用編碼人類Fc恆定區的等價部分取代(見Robinson等，國際專利出版PCT/US 86/02269；Akira等，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等，歐洲專利申請173,494；Neuberger等，國際申請WO 86/01533；Cabilly等，U.S專利No.4,816,567；Cabilly等，歐洲專利申請125,023；Better等(1988 Science 2401041-1043)；Liu等(1987)PNAS 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；和Shaw等，1988，J.Natl Cancer Inst.801553-1559)。
嵌合抗體可以進一步被人源化，這通過用來自人類Fv可變區的等價序列取代不直接參與抗原結合的Fv可變區序列。人源化嵌合抗體的一般綜述見Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207和Oi等，1986，BioTechniques 4214。方法包括從至少一條重鏈或輕鏈中的之一中分離、操作和表達編碼免疫球蛋白Fv可變區的所有或部分核酸序列。這種核酸的材料對此領域的技術人員是很熟悉的，例如，可以從一種產生抗GPIIbIIIa抗體的雜交瘤7E3中獲得。接著就可把編碼嵌合抗體的重組DNA或其片段克隆到合適的表達載體上。合適的人源化抗體還可通過CDR取代產生，U.S專利5,225,539；Jones等，1986 Nature 321552-525；Verhoeyan等，1988 Science 2391534和Beidler等，1988 J.Immunol.1414053-4060。
一特定的人類抗體的CDRs的全部可以被至少非人CDR的一部分取代，或者只有CDRs的一部分被非人CDRs取代。僅取代人源化抗體結合Fc受體所需數目的CDRs就可以了。
抗體可以通過任何方法人源化，其中此方法能夠用來自非人抗體的CDR取代至少人類抗體CDR的一部分。Winter描述一種方法，該方法可用於製備發明的人源化抗體(UK專利申請GB 2188638A，1987.3.26成文件)，該專利的內容在文獻中以表述引入。人類CDRs被非人CDRs取代可用寡聚核苷酸定點突變法，如在國際申請WO 94/10332註冊，Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on HumanMononuclear Phagocyles中所描述的。
特定的胺基酸被取代，刪除或增加的嵌合和人源化抗體也在發明的範圍之內。尤其是，優選的人源化抗體在構架區具有胺基酸取代，以增強對抗原的結合。例如，在具有小鼠CDRs的人源化抗體中，位於人類構架區的胺基酸可以被位於小鼠抗體的相應位置的胺基酸取代。已知這種取代在一些情況下是為了提高人源化抗體與抗原的結合。胺基酸被增加、刪除或取代的抗體在這裡被稱為修飾的抗體或改變的抗體。
術語「修飾的抗體」也將包括如單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體，它們已經被通過刪除、增加或取代抗體的部分而修飾過。例如，抗體可以被通過刪除恆定區和用恆定區取代它而被修飾，這意味著提高半衰期，如血清中的半衰期，穩定性或抗體的親和性。只要雙特異性和多特異性分子具有至少一個特異於FcγR的抗原結合區和激發至少一種效應細胞功能，任何修飾都在發明的範圍內。
製備此發明的雙特異性和多特異性分子可以利用化學技術(見如D.M.Kranz等(1981)Proc.Nacd.Acad.Sci.USA 785807)，「Polydoma」技術(見U.S.專利4,474,893，待閱)，或重組DNA技術。
尤其地，此發明的雙特異性和多特異性分子可以通過偶聯組分結合特異性，如抗FcR，和抗PSMA結合特異性而製備，這可利用此領域中已知的方法和這裡所提供的例子中所描述的方法，例如，可以分別產生雙特異性分子和多特異性分子的每一結合特異性，然後將其彼此相連。當結合特異性是蛋白質或多肽時，多種偶聯或交叉連接試劑可用於共價連接。交叉連接試劑包括蛋白A，碳二亞胺，N-琥珀醯-S-乙醯基-巰基乙酸(SATA)，5，5′-二硫叉(2-硝基苯酸)(DTNB)，鄰苯基二馬來醯亞胺(oPDM)，N-琥珀醯-3-(2-二硫吡啶基)丙酸(SPDP)和硫代琥珀醯4-(N-馬來醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸(硫代-SMCC)(見，如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 828648)。其它方法包括以下所述的Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等(Science(1985)22981-83)和Glennie等(J.Immunol.(1987)1392367-2375)。優選的偶聯試劑是SATA和硫代SMCC，兩者都可從Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)購得。
當結合特異性是抗體時(如兩人源化抗體)，它們可以通過兩重鏈的C末端鉸鏈區的巰基成鍵而連接。在一項特殊優選的實施方案中，在連接之前，鉸鏈區被修飾而含有奇數的巰基殘基，優選為1個。
或者，兩個結合特異性由同一載體編碼並在同一宿主細胞中表達及組裝。當雙特異性或多特異性分子是mAb×mAb，mAb×Fab，Fab×F(ab′)2或配基×Fab融合蛋白時，這種方法尤其有用。發明的雙特異性和多特異性分子，如雙特異性分子，可以是單鏈分子，如單鏈雙特異性抗體，包括一個單鏈抗體和一個結合決定子的單鏈雙特異性分子，或者包括兩個結合決定子的單鏈雙特異性分子。雙特異性和多特異性分子也可是單鏈分子或含有至少兩個單鏈分子。製備雙特異性和多特異性分子的方法已被描述，如U.S.專利號5,260,203；U.S.專利號5,455,030；U.S.專利號4,881,175；U.S.專利號5,132,405；U.S.專利號5,091,513；U.S.專利號5,476,786；U.S.專利號5,013,653；U.S.專利號5,258,498和U.S.專利號5,482,858。
雙特異性和多特異性分子與其特異的靶結合可以用以下方法確定酶聯免疫分析(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，FACS分析，生物測定(如生長抑制)，或免疫雜交分析。這些分析通常都檢測感興趣的特定的蛋白質-抗體複合物的存在，這通過使用特異於感興趣複合物的標記試劑(如抗體)，例如，FcR-抗體複合物可以利用識別並特異性與此複合物結合的酶聯抗體或抗體片段而檢測。或者，此複合物可用其它免疫分析的任何一種測定，例如，抗體被放射性標記而用於放射免疫分析(RIA)(見，例如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，TheEndocrine Society，March.1986，3，此書在這裡被引入文獻)。放射性同位素可以利用γ計數器或液閃計數器或通過放射自顯影而檢測到。IV.抗體偶聯物/免疫毒素在另一方面，該發明的特徵是人類抗PSMA單克隆抗體或其片段與一治療性部分相連，如細胞毒素，藥物或放射性同位素。當與細胞毒素相連時，這種抗體偶聯物稱作「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性試劑包括對細胞有害的(如殺傷)的任何試劑，例子包括紫杉醇，松胞菌素B，短桿菌肽D，溴化乙錠，吐根鹼，絲裂毒素，鬼臼亞乙苷，表鬼臼毒噻吩糖苷，長春花新鹼，長春花鹼，秋水仙素，阿黴素，道諾紅菌素，二羥基炭疽菌素，半託蒽醌，光神黴素，放線菌素D，1-脫氫睪丸素，糖皮質激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛爾和嘌呤黴素及其相似物或同源物。治療試劑包括抗代謝物(如氨甲喋呤，6-巰基嘌呤，6-硫代鳥嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化劑(如氮芥，thioepa苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，亞硝基脲氮芥(BSNU)和環己亞硝脲(CCNU)，cyclothosphamide，白消安，二溴甘露醇，鏈脲菌素，絲裂黴素C和順式二氮二胺鉑(II)(DDP)順鉑)，炭疽環素(如道諾紅菌素(前體為放線菌素)和阿黴素)，抗生素(如放線菌素D(前體是放線菌素)，博來黴素，光神黴素和思黴素(AMC))和抗有絲分裂劑(如長春花新鹼和長春花鹼)，該發明的抗體可與放射性同位素連接，如放射性碘，以產生細胞毒性的放射性藥物，用於治療PSMA相關性紊亂，如癌。
發明的抗體偶聯物可用於修飾一給定的生物應答，而且藥物部分不局限於經典的化學治療試劑。例如，藥物部分可以是具有所需的生物活性的蛋白質或多肽。這種蛋白質可包括，例如酶活性毒性或其活性片段，如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假單胞桿菌外毒素，或白喉毒素；如腫瘤壞死因子或幹擾素-γ的蛋白；或生物應答修飾因子，如淋巴因子，白介素-1(「IL-1」)，白介素-2(「IL-2」)，白介素-6(「IL-6」)，粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子(「GM-CSF」)，粒細胞集落刺激因子(「G-CSF」)或其它生長因子。
偶聯這種治療部分和抗體的技術已很成熟，如見Arnon等「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In CancerTherapy」，出自Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中，Reisfeld等(編輯)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，「Antibodies For Drug Delivery」，出自Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(編輯)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe「Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyAReview」，出自Monoclonal Antibodies 84Biological And ClinicalApplications，Pinchera等(編輯)，pp.475-506(1985)；「Analysis，Results，And Future Prospective of The Therapeutic Use of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy」，出自Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等(編輯)，pp.303-16(Academic Press1985)；和Thorpe等，「The Preparation And Cytotoxic Properties ofAntibody-Toxin Conjugates」，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。V.藥物組合物另一方面，該發明提供一組合物，如藥物組合物，它含有該發明的人類單克隆抗體或其抗原結合部分的一種或其組合，其中的抗體與藥學上可接受的載體結合在一起，在一項優選實施方案中，組合物包括發明的多種(如兩種或更多種)分離的人類抗體或其抗原結合部分的組合。優選地，組合物中的每種抗體或其抗原結合部分結合PSMA的不同的預選抗原表位。
在一項實施方案中，具有互補活性的人類抗PSMA單克隆抗體用於互相組合，如，包含兩種或多種人類抗PSMA單克隆抗體的藥物組合物。例如，能在效應細胞存在下介導高效殺傷靶細胞的人類單克隆抗體可以與能夠抑制表達PSMA的細胞生長的其它人類單克隆抗體相結合。
在另外的實施方案中，組合物包括發明的雙特異性或多特異性分子(如它含有至少一個對Fc受體的結合特異性和至少一個對PSMA的結合特異性)的一種或其組合。
發明的藥物組合物也可在組合治療中給藥，即與其它藥劑相結合。例如，組合治療可包括發明的具有至少一種抗腫瘤藥劑的組合物或其它常規療法。
如這裡所用，「藥理上可接受載體」包括任何和所有溶劑，分散劑，包被物，抗細菌和抗真菌試劑，等滲和吸收延伸試劑，以及其它生理可容的試劑。優選地，載體適合於靜脈、肌肉、皮下、腸胃外、脊髓或表皮給藥(如通過注射或灌注)。依賴於注射途徑，活性複合物，即抗體，雙特異性和多特異性分子，可被一種材料包被以保護其遠離可能使其失活的酸性和其它自然環境。
「藥理上可接受鹽」指保留其母體化合物的理想生物活性並且不引入任何不需要的毒性效應的鹽(如見Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這種鹽包括酸加成鹽和鹼加成鹽。酸加成鹽包括來自無毒無機酸的鹽，如鹽酸，硝基，磷酸，硫酸，氫溴酸，氫碘酸，磷及其它，以及來自無毒有機酸的鹽，如單羧基和二羧基脂肪酸，苯取代的鏈烷酸，羥基鏈烷酸，芳香酸，脂肪酸和芳香硫酸以及其它。鹼加成鹽包括來自鹼土金屬的鹽，如鈉，鎂，鈣及其它，以及來自無毒有機胺的鹽，如N，N′-二苯聯苯胺，N-甲基穀氨醯胺，氯代普魯卡因(chloroprocaine)，膽鹼，二乙醇胺，乙基聯二胺，普魯卡因及其它。
該發明的組合物可以利用該領域的許多方法給藥。正如技術人員所熟知的，給藥的途徑和/或方式隨所需的結果而變。活性化合物在製備時加入載體，以保護它不迅速釋放，如受控釋放的形成，這包括移植、經皮膜片和微囊釋放系統。可以利用生物降解的和生物相容的多聚體，如多聚乙烯基乙酸，多聚氫離子，多聚甘油酸，膠原，多聚鄰乙酯和多聚乙酸。製備這種形式的製劑的許多方法已申請專利或者對此領域的技術人員一般是熟悉的，見如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker.Inc.，New York，1978。
在以一定的給藥途徑給藥發明的化合物時，有必要將化合物用一種防止其失活的材料包被或共給藥。例如，化合物可以在合適的載體中給藥一對象，如脂質體，或稀釋劑。藥理可接受的稀釋劑包括鹽水和水緩衝溶液。脂質體包括水包油包水CGF乳劑和常規的脂質體(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.727)。
藥理可接受的載體包括無菌水溶液或分散體及為了臨時製備無菌注射溶液或分散體的無菌粉狀劑。利用這種介質和試劑作為藥理上活性物在該領域中是熟知的。目前為此除了一些常規介質或試劑與活性化合物不相容外，在發明的藥物組合物中，其使用是經詳細考慮的。其它活性化合物也可加入到組合物中。
治療組合物必須在操作和貯存條件下是無菌和穩定的。這種組合物可以以溶液、微乳劑、脂質體、或其它適於高濃度藥的有序結構形式形成。載體可以是溶劑成分散介質，它們含有，如水、乙醇、多元醇(如甘油、預防烯甘醇和液相聚乙烯甘醇及其它)，和其合適的混合物。應該保持合適的流動性，例如，通過利用如卵磷脂的包被劑，在分散劑狀況下保持所需的顆粒大小和利用表面劑。在許多狀況下，組合物中優選包括等滲劑，如糖，如甘露醇的多元醇，山梨糖醇，或氯化鈉。給藥的組合物的長期吸收的實現可以通過在組合物中包含能夠延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鹽和明膠。
無菌注射溶液可通過以下方式製備將活性化合物溶於適當的溶劑中，以所需的量與以上所列成分的一種或幾種組合一起引入，然後進行無菌微濾。一般地，分散劑以以下方式製備將活性化合物引入無菌載體中，其中無菌載體含有基本的分散介質和所需的來自以上所列的其它成分。對於用於製備無菌注射溶液的無菌粉劑，製備的優選方法是真空乾燥和冷凍乾燥(凍幹)，這種方法產生了活性成分加上任何另外所需的來自預先無菌過濾溶液的成分的粉劑。
調整劑量以產生所需的最佳應答(如治療應答)。例如，可以給藥一大團丸劑，幾個不同劑量在不同時間給藥或劑量成比例減小或增大，這隨治療狀況而定。為了易於給藥及劑量的統一性，尤其有利的是以劑量單位形式形成腸胃外組合物。這裡所用的劑量單位形式指為了治療對象而不同於生理單位的劑量；每個單位含有為產生所需的治療效應而計算的預定量的活性化合物，該化合物並與所需的藥物載體相結合。發明的劑量單位形式的特異之處敘述並直接依賴於以下(a)活性化合物的獨特牲徵和將獲得的特定治療效應，和(b)為了治療個體的敏感性而偶合此活性化合物的技術的局限性。
藥理上可接受的抗氧化劑包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸，半胱氨酸氯化氫，硫酸氫鈉，偏亞硫酸氫鈉，亞硫酸鈉和其它；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸基棕櫚酸，丁化羥基苯甲醚(BHA)，丁化羥基甲苯(BHT)，卵磷脂，丙基沒食子酸，α-生育醇和其它；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸及其它。
對於治療組合物，該發明的製劑包括那些適於口腔、鼻、局部(包括口和舌下)、直腸、陰道和/或腸胃外給藥的形式。該製劑可以便利地以單位劑量形式表示及通過治藥領域中任何已知的方法製備。可與載體材料結合以產生單位劑量形式的活性成分的量將隨治療對象、和給藥的特定方式而變。可與載體材料結合以產生單位劑量形式的活性成分的量一般是產生治療效應的組合物的量。一般地，除了百分之百，該量的範圍是活性成分為0.01％至約99％，優選的是0.1％到約70％，最優選的是1％至約30％。
該發明的適於陰道給藥的製備物也包括陰道環，棉條，凝膠，膏狀物，泡沫或含有此領域中合適的載體的噴塗製劑。局部或經皮給藥發明的組合物的劑量形式包括粉劑，噴劑，油膏，糊劑，乳膏，洗劑，凝膠，溶液，貼片劑，和吸入劑。活性化合物可以在無菌條件下與下列物質混合藥理上可接受的載體，任何防腐劑，緩衝劑或可能所需的推進劑。
這裡所有的說法「腸胃外給藥」和「給藥腸胃外」指腸道和局部給藥之外的方式，通常是通過注射，它包括但不局限於皮內、肌肉、動脈、壁內、囊內、眶內、心臟內、皮內、腹腔、跨氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊髓內、硬膜和胸骨內注射和灌注。
在發明的藥物組合物中可能使用的水和非水載體包括水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇和其它)，和其合適的混合物，植物油，如橄欖油，和注射性有機酯，如乙基油酸酯。其應保持合適的流動性，例如通過利用包被材料，如卵磷脂，通過在分散劑狀況下保持所需的顆粒大小和通過利用表面活性劑。
這些組合物也可含有佐劑，如防腐劑，保溼劑，乳化劑和分散劑。確保防止微生物出現的方法有滅菌措施，如上所述，和加入不同的抗細菌和抗真菌試劑，例如食品防腐劑，氯代丁醇，苯酚山梨酸和其它。組合物也可包括等滲試劑，如糖，氯化鈉，和其它。另外，注射的藥物形式的延長吸收可通過加入延遲吸收的試劑來實現，如單硬脂酸鋁和白明膠。
當該發明化合物以藥物形式給藥人類和動物時，它們可以單獨給藥或以藥物組合物形式給藥。它含有，例如與藥理上可接受的載體相結合的0.01％至99.5％(更優選的0.1％到90％)活性成分。
不考慮所選的給藥途徑，該發明的複合物通過該領域的技術人員所熟悉的常規方法形成藥理上可接受的劑量形式，其中複合物以水合形式和/或該發明的藥物組合物形式使用。
該發明的藥物組合物活性成分的實際劑量水平可變以獲得活性成分的量，使得該量對於特定的病人，組合物和給藥方式能有效達到期望的治療應答，而且對病人無毒。所選的劑量水平依賴於不同的藥物動力學因子，它包括所使用的該發明的特定組合物的活性，或其酯、鹽或胺，給藥途徑，給藥時間，所用特定複合物的排洩速度，治療過程，與所用的特定組合物結合使用的其它藥、複合物和/或材料，年齡，性別，體重，狀態，治療病人的健康狀況和前醫療史，和醫療領域所熟知的相似因子。
具有此領域中一般技術的醫生或獸醫就易於指出和確定所需的藥物組合物的有效量。例如，醫生或獸醫開始時使得藥物組合物中所用的發明化合物的劑量低於所需的量，以獲得所期望的治療效應，並且緩慢增加劑量，直到獲得所期望的效果。一般地，發明的化合物的合適的日劑量是有效產生治療效果的最低劑量時化合物的量。這種有效劑量一般依賴於以上所述的因素。優選的給藥方式是靜脈、肌肉、腹腔，或皮下給藥，優選給藥位點是靠近靶位點處。如果需要，治療組合物的有效日劑量可以在一天內間隔適當時間分別以二、三、四、五、六或更多次亞給藥方式給藥，最好是以單位劑量形式。雖然可以單獨給藥該發明的化合物，但優選的是以治療製劑(組合物)形式給藥複合物。
治療組合物可以用此領域中已知的醫療設備給藥。例如，在優選的實施方案中，發明的治療組合物用無針頭皮下注射設備給藥，如在U.S.專利Nos.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中所公開的設備。該發明中有用的熟知的移植物和組件包括U.S.專利No.4,487,603，它公開了用於分散藥療法的可控制速度的移植微灌注泵；U.S.專利No.4,486,194，它公開了用於通過皮膚給藥藥的治療設備；U.S.專利No.4,447,233，它公開了用於以確定的灌注速度釋放藥療物的藥療灌注泵；U.S.專利No.4,447,224，它公開了用於連續性藥物釋放的可變流動移植灌注裝置；U.S.專利No.4,439,196，它公開了具有多室空間的滲透藥物釋放系統；和U.S.專利No.4,475,196，它公開了滲透藥物釋放系統。這些專利在這裡引入文獻。許多其它的這種移植物、釋放系統和組件是該領域的技術人員所已知的。
在一些實施方案中，發明的人類單克隆抗體能夠確保在體內的適當分布。例如，血腦屏障(BBB)排除許多高度親水性複合物。為了確保發明的治療複合物越過BBB(如果期望)，它們可以以下列形式產生，如脂質體。操縱脂質體的方法，見如U.S.專利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂質體可以含有一個或多個能夠被選擇性轉運到特異細胞或器官的部分，因而增強了靶藥物的釋放(見，如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。靶向部分包括葉酸或生物素(見，如U.S.專利5,416,016，Low等)；乳糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357140；M.Owais等，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233134)，其中表面蛋白A的不同種類可包括發明的製備物以及發明的分子的組分；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也見K.Keinanen；M.L.Laukanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。在發明的一項實施方案中，發明的治療化合物是在脂質體中形成；在一項更優選的實施方案中，脂質體包括靶向部分。在一項最優選的實施方案中，脂質體中的治療化合物以團注射到靠近腫瘤或感染位點的方式釋放。組合物必須以易於注射的程度流動，它必須在操作和保存條件下穩定而且必須保持無細菌和真菌等微生物的汙染。
相對未治療對象「治療有效劑量」優選地抑制腫瘤生長至少約20％，更優選地至少約40％，還優選的至少約60％，及再優選的至少約80％。化合物抑制癌的能力可以在動物模型系統中測定，其中動物模型系統能夠預示人類腫瘤中的效應。或者，組合物的特徵可以通過測定化合物的抑制能力來測量，這種體外分析的抑制作用是技術人員所知道的。治療化合物的治療有效量能夠減小腫瘤大小，或者在對象中減輕症狀。此領域的一項通常技術能夠確定該量，它基於以下因子對象大小，對象症狀的嚴重性和所選的特定組合物或給藥途徑。
組合物必須無菌及流動，其流動程度要使得組合物能用注射器釋放。除了水，載體可以是等滲緩衝鹽溶液，乙醇，多元醇(例如甘油，丙烯醇，和液相聚乙二醇，及其它)，和其合適的混合物。恰當的流動性可通過以下方式保持，如，利用如卵磷脂等包被，在分散狀況下保持所需的顆粒大小和利用表面劑。在許多情況下，在組合物中優選包括等滲試劑，例如糖，多元醇，如甘露醇或山梨糖醇，和氯化鈉。注射組合物的長期吸收可以通過在組合物中包含延遲吸收的試劑來實現，例如單硬脂酸鋁或白明膠。
當活性化合物如上所述被恰當保護時，例如化合物可以口服，利用惰性稀釋劑或可同化改造的載體。VI.發明的用途和方法該發明的組合物(如PSMA的人類單克隆抗體和其衍生物/偶聯物)具有體外和體內治療和診斷的用途。例如，這些分子可以給藥到培養的細胞中，如體外，或給藥到一對象中，如體內，以治療，防止或診斷不同的病症。如這裡所用，「對象」包括人和非人動物。優選的人類動物包括具有紊亂症的人類病人，其特徵在於PSMA的表達，尤其是異常表達(如過量表達)。例如，該發明的方法和組合物能用於治療具有腫瘤性紊亂的對象，如特徵是出現表達PSMA腫瘤細胞的紊亂，這種腫瘤細胞包括，如前列腺、結腸和腎腫瘤細胞。發明中的術語「非人動物」包括所有脊椎動物，如哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類，綿羊，狗，牛，雞，兩棲類動物，爬行動物，等。
發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)可結合體外治療或診斷用來在初始時測定其結合活性。例如，發明的組合物可以利用下述例子中所描述的ELISA和流式細胞分析來測定。而且，這些分子在啟動至少一種效應者介導的效應細胞活性，包括對表達PSMA的細胞裂解作用，中的活性也可被分析。分析效應細胞介導的吞噬作用的步驟在下面的例子描述。
發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)在治療和診斷PSMA相關的疾病方面具有另外的用處。例如，人類單克隆抗體，多特異性或雙特異性分子可用於，如，體內或體外引發下列生物活性的一種或多種調理細胞表達PSMA；在人類效應細胞存在下，介導吞噬或裂解表達PSMA的細胞，或抑制表達PSMA的細胞的生長。
在一特定的實施方案中，人類抗體和其衍生物體外用於治療、防止或診斷不同的PSMA相關疾病。PSMA相關疾病包括不同的癌，例如前列腺、腎和結腸癌。
給藥發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)的方法是此領域中已知的。所用分子的合適劑量依賴於對象的年齡和體重以及所用的特定藥物。分子可以與放射性核素偶聯，如131I，90Y，105Rh等，如在Goldenberg，D.M等(1981)Cancer Res.414354-4360和在EP 0365997中所描述的。發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)也可與抗感染試劑偶聯。
靶特異性效應細胞，如與發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)偶聯的效應細胞，也可被用作治療試劑。用於靶向的效應細胞可以是人類白細胞，如巨噬細胞，嗜中性細胞或單核細胞。其它細胞包括嗜酸性細胞，自然殺傷細胞和其它具有IgG或IgA受體細胞。如果需要，效應細胞可以從被治療的對象中獲取。靶特異性效應細胞可以懸浮於生理上接受溶液形式給藥。給藥的細胞數在108-109之間，但將隨治療目的而異。一般地，其量將足夠定位於靶細胞，如表達PSMA的腫瘤細胞，及足夠影響細胞殺傷作用，如通過吞噬作用，給藥途徑也可改變。
利用靶特異性效應細胞的治療可以結合其它技術，以除去靶向的細胞。例如，利用該發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)和/或具有這些組合物臂的效應細胞的抗腫瘤治療可與化療結合。另外，結合免疫治療可用於指導不同的細胞毒性效應種群靶向消除腫瘤細胞。例如，與抗Fc-γRI或抗CD3偶聯的抗PSMA抗體可以與IgG或IgA受體特異的結合試劑結合使用。
發明的雙特異性和多特異性分子也可用於調控效應細胞的FcγR或FcαR水平，例如通過蓋住或減少細胞表面的受體，抗Fc受體的混合物也可用於這一目的。
具有補體結合位點的發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)，也可用於在補體存在的狀況下，其中補體結合位點如來自與補體結合的IgG1，-2，或-3或IgM的部分。在一項實施方案中，利用發明的結合試劑和適當的效應細胞體外治療包括靶細胞的細胞群體時，可附加加入補體或含有補體的血清。對包被著發明的結合試劑的靶細胞的吞噬作用可以通過補體蛋白的結合而增強。在另一項實施方案中，包被著發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)的靶細胞也可被補體裂解。
發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)也可與補體一起給藥。相應的，包含人類抗體，多特異性或雙特異性分子和血清或補體的組合物也在發明的範圍之內。這些組合物的優勢在於補體與人類抗體多特異性或雙特異性分子位置很靠近。或者，發明的人類抗體，多特異性或雙特異性分子和補體或血清可分別給藥。
包含發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)和使用說明的試劑盒也在發明的範圍之內。試劑盒可進一步包括至少一種另外的試劑，如補體，或一種或多種發明的另外人類抗體(如具有補體活性的人類抗體，該抗體與不同於第一人類抗體的PSMA抗原的一個抗原表位結合)。
在其它實施方案中，對象可用能夠調控，如增強或抑制，Fcγ或Fcα受體的表達或活性的一種試劑治療，例如，通過用細胞因子治療對象。在治療過程中，與多特異性分子一起給藥的優選細胞子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，幹擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。
發明的組合物(如人類抗體，多特異性和雙特異性分子)也可用於靶向表達FcγR或PSMA的細胞，例如，標記這類細胞。為此，結合試劑可與能被檢測的分子相連。因而該發明提供了體外定位表達Fc受體細胞的方法，如FcγR或PSMA。可檢測的標記可以是，如放射性同位素，螢光化合物，酶或酶輔助因子。
在一項實施方案中，該發明提供檢測樣品中PSMA抗原的存在，或測定PSMA的量的方法，包括使人類單克隆抗體或其抗原結合部位接觸樣品和對照樣品，該抗體與PSMA特異結合，其中測定是在允許抗體或其它部分與PSMA形成複合物的條件下。接著檢測複合物，其中與對照樣品相比，複合物的形成的差異顯示樣品中PSMA抗原的存在。
在另一項實施方案中，該發明提供了用於體內或體外檢測Fc表達細胞的存在及其定量的方法。該方法包括i)與可檢測的標記物相連的發明的組合物(如多特異性或雙特異性分子)給藥到對象中；ii)以一種方式展示對象以檢測所述的可檢測標記物，從而鑑定含有Fc表達細胞的區域。以下的例子將進一步闡釋該發明，這些例子不應被理解為進一步限制。申請中所引用的所用圖、所有文獻、專利和公開的專利申請的內容在這裡引入作為參考。
實施例例1 用於產生抗-PSMA人類抗體的Cmu靶向小鼠的生長CMD靶向載體的構建質粒pICEmu含有小鼠Ig重鏈轉基因座的EcoRI/XhoI片段，跨越mu基因，其中mu基因來自Balb/C基因組λ噬菌體庫(Marcu等，Cell22187，1980)。該基因組片段亞克隆到質粒pICEMI9H的XhoI/EcoRI位點(Marsh等，Gene 32，481-485，1984)。包含在pICEmu的重鏈序列延伸到恰位於mu基因內增強子3′端的EcoRI位點的下遊，並延伸到XhoI位點，其中XhoI位點位於mu基因的最後跨膜外顯子的下遊約1kb；然而，許多mu轉變重複區已經在大腸桿菌中通過傳代而被刪除。
靶載體的構建如下(見
圖1)。從pICEmu中除去1.3kb的HindIII/SmaI片段，並亞克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，LaJolla，CA)。該pICEmu片段從位於Cmnl 5′約1kb處的HindIII位點延伸到位於Cmul內的SmaI位點。所產生的質粒用SmaI/SpeI消化，並插入來自pICEmu的約4kb的SmaI/XabI片段，其中該片段從Cmul 3′中的SmaI位點延伸到恰位於最後的Cmu外顯子的下遊的XbaI位點。所形成的質粒pTAR1在SmaI位點線性化，並插入neo表達DNA序列組件。該DNA序列組件由neo基因構成，其中neo基因在小鼠的磷酸甘油酸激酶(pgk)啟動子(XbaI/TaqI片段，Adra等(1987)Gene 6065-74)轉錄調控下，並且含有pgk的聚腺苷酸化位點(PvuII/HindIII片段，Boer等(1990)Biochemical Genetics 28299-308)。該DNA序列組件來自質粒pKJ1(由Tybulewiz等(1991)Cell 651153-1163描述)，neo DNA序列組件從該質粒中以EcoRI/HindIII片段形式切下並亞克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)以產生pGEM-7(KJ1)。neo DNA序列組件通過EcoRI/SalI消化從pGEM-7(KJ1)中切下，平末端化並亞克隆到質粒pTAR1的SmaI位點，其中方向與基因組Cmu序列相反。所產生的質粒用NotI線性化，並插入單純皰疹病毒的胸苷激酶(tk)的DNA序列組件以允許富集含有同源重組體的ES克隆，這如在Mansour等(1988)Nature 336348-352中所描述的。該DNA序列組件由tk基因的編碼序列組成，其中tk基因兩側分別是小鼠pgk啟動子和多聚腺苷酸化位點，這如Tybulewicz等(1991)Cell 651153-1163中所述。所產生的CMD靶載體含有約5.3kb的重鏈轉基因座的同源序列，並被設計產生突變的mu基因，在該基因中，插入了位於第一個Cmu外顯子中的唯一的SmaI位點處的neo表達DNA序列組件。靶載體在電轉入ES細胞中之前用PvuI線性化，該酶從質粒序列內部將其切斷。靶向ES細胞的產生和分析AB-1 ES細胞(McMahon，A.P.和Bradley，A.(1990)Cell 621073-1085)生長在有絲分裂失活的SNL 76/7細胞飼養層(ibid)，這基本上如已經描述的(Robertson，E.J.(1987)Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cellsa Practical Approach(E.J.Robertson編輯)OxfordIRL Press，p.71-112)。線性化的CMD靶向載體利用Hasty等(Hasty，P.R.等(1991)Nature 350243-246)所描述的方法電轉入到AB-1細胞中。電轉化的細胞以1-2×106細胞/培養皿的密度平鋪到100mm培養皿中。24小時之後，G418(200微克/ml活性組分)和FIAU(5×10-7M)加入到培養基中，藥物耐受性細胞能夠生長超過8-9天。挑選克隆，胰酶消化，分成兩部分並進一步擴增。來自每一克隆的細胞的一半凍存，另一半則用於分析載體和靶序列的重組。
DNA分析利用Southern雜交進行。DNA用如Laird等(Laird.P.W.等(1991)Nucleic Acids Res.194293)所描述的從克隆中分離。分離的基因組DNA用SpeI消化，用915bp的SacI片段，探針A(見
圖1)雜交，該探針與mu基因內增強子和mu轉變區之間的一序列雜交，探針能檢測來自野生型基因座的9.9kb SpeI片段和來自mu基因座的診斷性7.6kb泳道，其中該mu基因座已與CMD靶向載體(neo表達DNA序列組件含有SpeI位點)同源重組。利用Southern雜交分析在對1132個G418和FIAU耐受性克隆的篩選中，3個顯示出表示在mu基因座發生同源重組的7.6kb SpeI泳道。這3個克隆進一步用酶BglI，BstXI和EcoRI消化，以確證載體同源性整合到mu基因中。當用探針A雜交時，用BglI，BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的Southern雜交分別產生15.7、7.3和12.5kb的片段，而靶mu等位基因的存在則分別由7.7、6.6和14.3kb的片段表示。由SpeI消化所檢測到的所有3個陽性克隆顯示出所期望的BglI，BstXI和EcoRI限制性片段能夠預測neo DNA序列元件插入到Cmul外顯子。含有突變的mu基因的小鼠的產生分別記為264，272和408的三個靶向ES克隆融化並如Bradley(Bradley，A.(1987)Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsaPractical Approach(E.J.Robertson編輯)OxfordIRL出版，p.113-151)所描述的注射到C57BL/6J胚胞中。注射過的胚泡轉入到假孕雌性小鼠的子宮中以產生含有來自所轉入的ES細胞的細胞和宿主胚泡的混合物的嵌合小鼠。嵌合體中ES細胞所佔的比例可以直觀的估計，這是利用位於黑色C57BL/6J後部的野灰色斑的數量，其中這是衍生於ES細胞系。克隆272和408僅產生低百分比的嵌合體(即低百分比的野灰色色斑)，但克隆克隆267則產生高百分比的雄性嵌合體。這些嵌合體與C57BL/6J雄性交配，而產生了野灰色後代，這顯示ES細胞基因組的種系傳遞。靶mu基因的篩選是通過對來自尾巴生物樣本的BgII消化DNA的Sonthern雜交分析(如上所述的ES細胞DNA分析)而進行，約50％的野灰色後代顯示出除了15.7kb的野生型泳道外的7.7kb的BglI雜交泳道，這證明靶mu基因的種系傳遞。對轉基因小鼠mu基因功能失活的分析為了確定是否neo DNA序列組件插入到Cmul中能使Ig重鏈轉基因失活，克隆264嵌合體與一JHD突變的純合體小鼠交配，其中該JHD突變是由於刪除了JH基因片段而使重鍊表達失活(Chen等，(1993)，Immunol.5647-656)，產生了4個野灰色後代。在這些動物1個月時從中獲得血清，並用ELISA分析小鼠IgM的存在。四隻小鼠的兩隻完全缺失IgM(見表1)，利用Southern雜交分析來自尾巴生物樣本的DNA，來對四隻動物進行基因型鑑定，其方法如下BglI消化並用探針A雜交(見
圖1)，和StuI消化並用475bp的EcoRI/StuI片段(ibid)雜交，結果證明在不能表達血清IgM的動物中，重鏈轉基因座的一個等位基因含有JHD突變，另一基因座則含有Cmul突變。JHD突變雜合的小鼠顯示出野生型水平的Ig。這些數據證明Cmul突變失活mu基因的表達。表1
表1顯示了由ELISA檢測所得到的血清IgM水平，其中它們分別來自以下小鼠含有CMD和JHD突變的小鼠(CMD/JHD)，JHD突變雜合的小鼠(+/JHD)，野生型(129Sv×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)，和JHD突變純合的B細胞缺陷小鼠(JHD/JHD)。例2 用於產生抗PSMA人類抗體的HCO12轉基因小鼠的生成HCO12人類重鏈轉基因HCO12轉基因是通過共注射80kb的pHC2插入物(Taylor等，1994，Int.Immunol.6579-591)和25kb的pVx6插入物而產生的。質粒pVx6按以下所述構建。
8.5kb HindIII/Sall DNA片段含有種系人類VH1-18(DP-14)基因，該基因具有5′端2.5kb和3′端5kb的基因組序列，該HindIII/SalIDNA片段亞克隆到質粒載體pSP72(Promega，Magison，WI)中以產生質粒p343.7.16。7kb BamHI/HindIII DNA片段含有種系人類VH5-51(DP-73)基因，該基因具有5′5kb和3′1kb的基因組序列，此BamHI/HindIII DNA片段克隆到基於pBR322的質粒克隆載體pGP1f(Taylor等，1992，Nucleic Acids Res.206287-6295)以產生質粒p251f。來自pGP1f的新的克隆載體pGP1k(SEQ ID NO13)用EcoRV/BamHI消化，並與10kb的EcoRV/BamHI DNA片段連接，該EcoRV/BamHI DNA片段含有5′端有4kb，3′端有5kb基因組序列的種系人類VH3-23(DP47)基因。所產生的質粒，p112.2RR.7用BamHI/SalI消化，並與7kb的純化的p251f BamHI/SalI插入物相連接。所產生的質粒pVx4用XhoI消化，並與p343.7.16的8.5kb XhoI/SalI插入物連接。
獲得了具有VH1-18基因並與其它兩個V基因同向的克隆。這一克隆被記為pVx6，然後用NotI消化，分離的26 kb插入物與pHC2的分離的80kb NotI插入物以1∶1摩爾比共注射到半天時間的F2胚胎(C57BL/6J×DBA/2J)的前核中，這如Hogan等所描述的(B.Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，第二版，1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press.Plainview NY)。包括來自Vx6和HC2序列的轉基因小鼠的三個獨立的種系從注射的胚胎發育而來的小鼠中建立。這些種系記為(HCO12)14881，(HCO12)15083和(HCO12)15087。這三種系的每一個然後與含有CMD突變的小鼠交配，如在例1中的JKD突變(Chen等，19933，EMBO J.12811-820)和(KCo5)9272轉基因(Fishwild等，1996，Nature Biotechnology 14845-851)中所描述的。所產生的小鼠在背景純合體中表達人類免疫球蛋白的重鏈和Kappa輕鏈轉基因，以破壞內源性的小鼠重鏈和Kappa輕鏈轉基因座。例3 PSMA的人類單克隆抗體和雙特異性分子的產生人類抗PSMA的單克隆抗體是通過用從表達PSMA的LNCaP細胞中純化的PSMA抗原和/或LNCaP細胞的粗製膜製備物免疫HuMAb小鼠的HCO7和HCO12株系而產生的。
HCO7 HuMAb小鼠的產生如在U.S.專利Nos.5,770,429和5,545,806中所描述的，此專利的全部公開部分引入文獻。
尤其，HCO7和HCO12小鼠最初用被完全弗氏佐劑乳化的抗原免疫。在以下的免疫中，抗原與不完全弗氏佐劑混合。最後，在取脾之前靜脈給藥不加佐劑的純化的抗原。小鼠每2-3周免疫一次。第三次和以後的免疫之後，人類抗PSMA的IgG效價通過ELISA確定(如以下所述)。產生了抗PSMA IgG應答的小鼠在取脾之前靜脈給藥純化的抗原三天或三和四天，從應答小鼠中收穫脾臟並且分散成單個細胞。
為了生產產生抗PSMA抗體的雜交瘤，來自血漿中含有抗PSMA抗體的小鼠的脾細胞與P3X63-Ag8.653細胞(收藏在ATCC，記為ATCC CRL 1580非分泌小鼠骨髓瘤細胞)和PEG融合。雜交瘤長出之後(約10-14天)，含有雜交瘤的每一孔用抗人類IgG ELISA篩選人類IgG的產生。
陽性雜交瘤基於以下特性篩選和選擇(1)人類IgG1κ抗體的產生，(2)與純化的PSMA的結合，和(3)與PSMA表達腫瘤細胞的結合。DNA序列分析確證抗PSMA抗體由人類免疫球蛋白轉基因的V(D)J重排編碼。
簡單的說，以固相ELISA為基礎的分析用於人類抗PSMA抗體的分析。從LNCaP細胞中免疫親和純化的PSMA包被到Maxi-SorP 96孔微量滴定板上(Nunc，Rochester，NY)，並且4℃保溫過夜。接著用PBS-0.2％Tween-20洗板，用溶於PBS中的5％牛血清白蛋白室溫下封閉1小時。來自抗PSMA產生雜交瘤的上清(50μl)或純化的抗體(1-5μg/ml，溶於PBS中)加入到孔中，並室溫下保溫2小時。如以上方法用PBS/Tween洗板，然後與50μl HRP偶聯的兔抗人類IgG(1∶5000；Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)室溫下保溫1小時。洗滌之後，100μl ABTS(150mg 2，2′-連氮-雙-(3-乙基苯並噻唑啉磺酸溶於500ml 0.1M檸檬酸，pH 4.35)/H2O2(每10ml ABTS溶液10μl30％H2O2)生色物/底物溶液加入到每個孔中，並用酶標儀在405nm波長處讀取光吸收值。
產生人類IgG的雜交瘤通過ELISA方法與PSMA結合，該雜交瘤利用ELISA和流式細胞儀進一步鑑定同種型及與表達PSMA腫瘤細胞的結合和PSMA陰性細胞的不結合，這如以下所述。具有這些特性上清的雜交瘤被亞克隆，它們的抗體在純化後進一步鑑定。
根據廠商說明(KPL，Gaithersburg，MD)，單克隆抗體從利用含有1％到5％胎牛克隆(Hyclone，Logan，UT)的HyQ-CCM1培養基的Cellmax生物反應器(Cellco.Laguna Hills，CA)中分離，並利用蛋白G-瓊脂糖柱色譜純化。
純化的單克隆抗體在0.1M碳酸鈉緩衝液，pH 9.5中充分透析，以標記異硫氰酸螢光素(FITC)。FITC貯存液是通過將1mg固體FITC溶於1ml DMSO中而製得。在恆定混合條件下，逐滴加入FITC貯存液，其量為使得每mg抗體蛋白中有50μg FITC。加入FITC之後，溶液在室溫下暗處保溫1-3小時。FITC標記的抗體利用凝膠過濾在葡聚糖G-10柱上分離，其中葡聚糖G-10柱用PBS平衡。
篩選的幾個雜交瘤產生人類IgG1κ抗體，該抗體經ELISA和流式細胞儀分析特異性結合PSMA(如4A3，7F12，8A11，8C12和16F9)。從雜交瘤8C12上清中純化的單克隆抗體具有＞10-9的特異結合親和性，其中此上清如ELISA所檢測的顯示與PSMA的明顯結合。
記為14.1×8C12(圖3中所示)和14A8×8C12的雙特異性分子是利用經典的交叉連接方法通過二硫鍵來化學連接Fab′2片段和人類抗PSMA抗體，8C12，其中Fab′2片段分別來自人類抗CD89抗體14.1或記為14A8的14.1抗體的亞克隆。例4 抗PSMA的人類單克隆抗體的鑑定I.人類抗PSMA抗體與腫瘤細胞的結合通過ELISA檢測而顯示與PSMA明顯結合的單克隆抗體(如4A3，7F12，8A11，8C12和16F9)被進一步測定其與高水平表達PSMA的腫瘤細胞的結合能力，其中單克隆抗體從雜交瘤上清中純化。
人類抗PSMA的特異抗體的結合特性通過固相ELISA來研究，其中該ELISA利用衍生於LNCaP和PC3細胞的質膜部分。為了製備來自LNCaP和PC3細胞的細胞膜部分，從塑料培養皿中刮下細胞，用PBS充分洗滌，重懸於10體積的去離子水中，並用Dounce勻漿器通過三次每搏輸出而勻漿細胞。通過在15000g離心45分鐘來分離膜部分，沉澱部分重懸於PBS中。膜沉澱的蛋白濃度利用Pierce(Rockford，IL)BSA試劑盒來測定。
在96孔板中梯度稀釋並風乾LNCaP和PC3的膜部分。該板在利用如上所述ELISA方法測定之前，用5％BSA封閉，並用溶於PBS中的5μg/ml人類抗PSMA抗體處理1小時。圖4中的結果顯示了不同的人類單克隆抗體的結果。這些抗體在一定抗原濃度範圍內顯示出與LNCaP細胞膜的高特異性，然而相對於背景，與PC3細胞膜的結合很小或沒有。
另外，人類抗PSMA抗體與活LNCaP和PC3腫瘤細胞的結合通過流式細胞儀研究。簡單的，從組織培養中收穫腫瘤細胞並製備單細胞懸液。約1百萬的細胞重懸於含有0.5％BSA的PBS中，並與50-200μg/ml的FITC標記的人類抗PSMA抗體冰上保溫30分鐘。細胞用含有0.1％BSA，0.01％NaN3的PBS洗兩次，然後在FACSCalibur細胞儀(Becton-Dickinson，San Jose，CA)上用CellQuest獲得性軟體分析螢光染色。如圖5所示，人類抗-PSMA抗體4A3，7F12，8A11，8C12和16F9顯示出與表達PSMA的活LNCaP細胞的強的特異結合性。相反的，PC3細胞染色陰性，或當與不相關的人類抗體匹配的同種型用於LNCaP時，染色陰性。
利用相似的分析，也檢測雙特異性分子14.1×8C12與表達PSMA的LNCaP細胞(圖6)和表達CD89的U937細胞(圖7)的結合能力。如在圖6和7所示，雙特異性分子以劑量依賴性方式與LNCaP和U937細胞結合。
II.人類抗PSMA抗體的結合特異性抗PSMA抗體4A3，7F12，8A11，8C12和16F9的結合特異性通過來自LNCaP細胞的蛋白裂解物的免疫沉澱進一步研究。簡單地，LNCaP細胞的去汙劑裂解物製備如下加入含1％NP-40的PBS到LNCaP細胞中，保溫1小時，然後離心以除去特定的物質。通過在每毫升加入150μg不相關人類IgG1和室溫下保溫1小時來預處理裂解物，然後在每毫升裂解物中加入150μl填充的蛋白G-Sepharose珠。離心除去這些珠之後，使用上清部分。
預處理的LNCaP細胞裂解物的每等份(100μl)與5μg各種人類抗PSMA抗體混合，4℃保溫過夜。珠用PBS充分洗滌，然後加入SDS樣品緩衝液。相結合的免疫複合物進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，並轉移到PVDF膜上以作Western雜交分析。膜用TBS/5％脫脂奶粉封閉過夜，與溶於TBS中的5μg/ml的小鼠線性PSMA序列抗原表位特異性抗體4D8保溫1小時，用含有0.5％Tween-20(TBS-T)的TBS洗雜交膜5次，並與HRP偶聯的羊抗小鼠IgG(1∶5000)保溫。用TBS-T洗5次之後，利用LumiGLO化學發光底物試劑盒(KPL，Gaithersburg，MD)顯示雜交帶並通過暴露給X衍射底片而觀測。
結果顯示在圖8中。PSMA和PSM′如箭頭所示，其中PSM′是從N末端缺少最前面的57個胺基酸的另外一種剪切形式。泳道1顯示用位於LNCaP細胞裂解物中的BSMA和PSM′的Western雜交反應性。泳道2顯示不相關人類抗體相符的同種型(IgG1)的免疫沉澱結果。泳道3到7分別顯示抗體4A3，7F12，8A11，8C12和16F9的免疫沉澱結果。在每種狀況下，都觀察到了相應於PSMA和PSM′的深的泳道，這表明這些抗體與位於該蛋白的胞外結構域的抗原表位相結合，該結構域是跨越44-750胺基酸的區域。
測定抗體與天然PSMA和熱變性PSMA的結合以確定蛋白質的構象對結合特異性的重要性。從LNCaP細胞中免疫親和純化的PSMA的一等份(40μg/ml溶於PBS中)通過煮沸10分鐘而被熱變性，然後冰上降溫。熱變性的PSMA和非變性PSMA的相同等份用PBS 1∶4稀釋，加入到96孔Maxi-Sorp板(Nune)的孔中，4℃保溫過夜。包被之後，板用溶於PBS中的5％BSA封閉1小時，用PBS洗滌，並利用人類抗PSMA抗體進行夾心ELISA。小鼠抗PSMA的單克隆抗體7E11用作陽性對照，其中7E11特異的抗原表位包括蛋白N末端的最前面的6個胺基酸。如圖9所示，熱變性對7E11抗體結合無影響，這與其識別線性序列的抗原表位相一致。與這些結果相反，人類抗PSMA抗體4A3，7F12，8A11，8C12和16F9都與天然純化的PSMA牢固結合，而PSMA的熱變性則徹底阻止了抗體的結合。這些結果表明天然蛋白的構象是人類抗PSMA抗體結合所需要的。與這一結果相一致，抗體4A3，7F12，8A11，8C12和16F9在檢測PSMA的Western雜交分析中是無效的。
III.抗體結合競爭性研究抗體結合競爭性研究是利用流式細胞分析來測定是否個別的人類抗PSMA抗體與PSMA上的相似或不同的抗原表位結合。在這些實驗中，未標記的抗PSMA抗體封閉FITC標記的抗體PSMA抗體與LNCaP細胞結合的能力被測定。LNCaP細胞被FITC標記的強度通過流式細胞儀測定。
約1百萬LNCaP細胞的等份用溶於PBS中的200μg/ml純化的人類抗PSMA抗體或不相關的人類IgG1抗體冰上預處理1小時。細胞被充分洗滌，並進一步與50μg/ml FITC偶聯的人類抗PSMA抗體(或在一些實驗中是FITC偶聯的小鼠PSMA特異性抗體，如1G9，3C6和4D4)冰上保溫1小時。洗滌之後，細胞用10μg/ml的碘化丙錠染色，並利用CellQuest軟體在FACSCalibur上利用流式細胞儀分析。
如
圖10所示，在LNCaP細胞用不相關的人類IgG1預處理的每一種狀況下都觀察到了FITC標記的人類抗PSMA抗體的很強結合。相反，用個別的人類抗PSMA抗體預處理時則導致了以後的FITC標記的人類抗PSMA抗體結合的基本抑制。不同的抗體配對，其結合抑制的程度有輕微的區別。例如，8C12有效抑制4A3，8A11和8C12結合，但對7F12結合的影響卻弱得多。總的來看，這些數據表明7F12和16F9與其它人類抗抗PSMA抗體的競爭性結合行為是很相似的。總之個別的人類抗PSMA抗體識別PSMA上的輕微不同卻分布相近的構象抗原表位。
抗體競爭性研究也可利用一小系列小鼠的PSMA特異性抗體來確定是否人類抗PSMA抗體識別與小鼠抗體相同的抗原表位。它們記為1G9，3C6和4D4，也指向蛋白的構象抗原表位。如
圖11所示，用個別的人類抗PSMA抗體預處理LNCaP細胞，然後用FITC-小鼠4D4和1G9標記，結果很弱或沒有明顯的抑制作用。相反，人類抗PSMA抗體7F12，8A11，8C12和16F9則明顯抑制FITC小鼠3C6的結合，這顯示這些抗體的每一種所結合的抗原表位都與3C6所識別的相似或分布相近。人類抗PSMA抗體4A3則對FITC標記的小鼠構象抗體沒有抑制作用，這提示它與不同於小鼠1G9，3C6或4D4所結合的抗原表位結合。例5 人類抗PSMA抗體的活性I.利用人類抗PSMA抗體和雙特異性分子抑制腫瘤細胞生長如上所闡釋，可以測定對PSMA顯示特異性結合的抗PSMA抗體和雙特異性分子抑制表達PSMA腫瘤細胞生長的能力。簡單的，在正常生長條件下，將腫瘤細胞與純化的抗體保溫，細胞密度通過結晶紫染色測定。
II.人類抗PSMA抗體和雙特異性分子的抗體依賴性細胞介導的細胞毒(ADCC)活性測定了雙特異性分子14.1×8C12(圖3所示)和14A8×8C12，以及單克隆抗體8C12對標記的PSMA表達細胞的多形核細胞介導的ADCC殺滅。
尤其是，單個核細胞(單核細胞和嗜中性細胞)以及全血從健康者中分離，並在雙特異性分子14.1×8C12存在的條件下與51Cr標記的PSMA表達細胞保溫。約4小時之後，收集培養孔中的上清並利用γ計數器測定51Cr的釋放。特異性裂解的百分比根據以下公式計算(實驗CPM-無靶CPM)/(去汙劑裂解CPM-無靶CPM)×100％。
圖12A，13A和14A中所顯示的結果表明與對照抗體相比，14.1×8C12分別介導單核細胞和嗜中性細胞和全血對腫瘤細胞的劑量依賴性裂解作用。
在或者雙特異性分子14A8×8C12或者單克隆抗體8C12存在下，單個核細胞和全血也與51Cr標記的LNCaP腫瘤細胞保溫(
圖12B，12C，13B和14B)，在與單個核細胞和全血及不同濃度的雙特異性分子或單克隆抗體保溫之前，LNCaP細胞用100μCi51Cr在37℃(5％CO2)標記1小時。保溫16小時之後，收集上清並如上所述分析放射性活性。
單核細胞誘導的ADCC如
圖12A所示，雙特異性分子14.1×8C12以劑量依賴方式介導單核細胞對表達PSMA腫瘤細胞的殺傷作用。加入50μg/ml的14.1 Fab′2完全封閉了1μg/ml的雙特異性分子14.1×8C12對腫瘤細胞的ADCC，這證明靶向細胞殺傷作用只由效應細胞上的CD89介導。如
圖12B所示，雙特異性分子14A8×8C12和單克隆抗體8C12也介導單核細胞對LNCaP腫瘤細胞的劑量依賴性裂解作用。而且，與H22 F(ab)′2(人源化抗FcγRI)相比，加入過量的14A8 F(ab)′2完全抑制了雙特異性分子14A8×8C12對腫瘤細胞的ADCC，這顯示靶向細胞殺傷作用由CD89介導(見
圖12C)。
嗜中性細胞誘導的ADCC如
圖13A所示，以特異性分子14.1×8C12以劑量依賴方式介導嗜中性細胞對表達PSMA腫瘤細胞的殺傷作用。加入25μg/ml的14.1 Fab′2明顯封閉雙特異性分子對腫瘤細胞的ADCC，這證明靶向細胞殺傷作用特異地由與效應細胞結合的CD89介導。如
圖13B所示，雙特異性分子14A8×8C12也介導嗜中性細胞對LNCaP腫瘤細胞的劑量依賴性裂解。與H22 F(ab)′2(人源化抗FcγRI)相比，加入過量的14A8 F(ab)′2完全抑制了14A8×8C12對腫瘤細胞的ADCC，這顯示靶向細胞殺傷作用通過CD89介導。
全血誘導的ADCC如
圖14A所示，雙特異性分子14.1×8C12以劑量依賴方式介導全血對表達PSMA腫瘤細胞的殺傷作用。加入25μg/ml的14.1 Fab′2明顯地封閉了雙特異性分子對腫瘤細胞的ADCC，這又一次證明靶向的細胞殺傷作用特異地由與效應細胞結合的CD89介導。相似地，如
圖14B所示，雙特異性分子14A8×8C12也介導全血對LNCaP腫瘤細胞的劑量依賴性裂解作用。與H22 F(ab)′2(人源化抗FcγRI)相比，加入過量的14A8F(ab)′2完全抑制了14A8×8C12對腫瘤細胞的ADCC，這表明靶向細胞殺傷作用由CD89介導。
III.在人類效應細胞的存在下，人類抗PSMA抗體和雙特異性分子介導對表達PSMA腫瘤細胞的吞噬和殺傷作用在單獨存在下，以及在作為對照的過量的14.1(人類抗FcγR)Fab′2抗體或過量的H22(人源化抗FcγRI)Fab′2抗體存在下，測定雙特異性分子14.1×8C12和14A8×8C12以及單克隆抗體8C12介導對標記的PSMA表達腫瘤細胞(LnCAP細胞)的吞噬作用的能力。
簡單的，雙特異性分子介導的單核細胞衍生的巨噬細胞(MDM)對LnCAP細胞的吞噬作用的測定是通過對Munn等(1990)J.Exp.Med.172231-237中所描述的方法加以修飾而實現的。從正常人來源的白細胞(ABI)中分離的單核細胞在在24孔板(1×106/ml)中分化7-12天，培養基是含有10％FBS和10ng/ml M-CSF的不含巨噬細胞血清的培養基(Gibco，Grand Island，NY)。LnCAP細胞用親脂性紅色螢光染色劑，PKH26(Sigma，St.Louis，MO)標記。在不存或存在雙特異性抗體(或對照抗體)時，將標記的LnCAP細胞加入到含有MDM的孔中，並在37℃(5％CO2)保溫5-24小時。MDM和未被吞噬的LnCAP細胞用胰酶回收，並用FITC標記的抗CD33 mAb(251)和抗CD14 mAb(AML-2-3)冰上染色1小時。洗滌細胞並利用FACScan通過雙色螢光分析。吞噬作用的百分比按以下計算雙陽性靶細胞數(被MDM吞入)/總的靶細胞數×100％。
如
圖15所示，雙特異性分子14.1×8C12以劑量依賴方式介導增強的特異性腫瘤細胞的吞噬作用。加入14.1 Fab′2則明顯地封閉了雙特異性分子對腫瘤細胞的吞噬作用，再一次證明靶向吞噬作用由與效應細胞結合的CD89特異性介導。相似地，如
圖16所示，雙特異性分子14A8×8C12和單克隆抗體8C12也以劑量依賴方式介導對LNCaP細胞的吞噬作用。
圖17顯示14A8×8C12介導的對LNCaP腫瘤細胞的吞噬作用由CD89介導，這是因為與H22 F(ab)′2(人源化抗FcγRI)相比，過量14A8F(ab)′2的加入抑制了此吞噬作用(見插入圖，
圖17)。
以上例子證明產生了以高親和性與PSMA特異性反應的人類單克隆抗體和雙特異性分子。這些抗體和雙特異性分子看起來識別位於分子的胞外結構域中的天然構象蛋白抗原表位，而不是線性胺基酸序列所確定的抗原表位。另外，在靶向於高水平表達PSMA的人類腫瘤細胞的效應細胞存在下，人類抗PSMA抗體和其雙特異性分子介導細胞殺傷和吞噬作用。這些結果支持下列結論該發明的完整的抗PSMA人類單克隆抗體及其片段和雙特異性分子對於診斷和治療PSMA相關症狀是有用的。等同聲明該領域的技術人員將認識到或僅僅使用常規的實驗技術就可以確定這裡所描述的發明的特異實施方案中的許多等同方案。這種等同方案包括在權利要求中。
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權利要求
1.與PSMA特異性結合的分離的人類單克隆抗體或其抗原結合部分，其中抗體或其抗原結合部分具有以下特徵的一項或多項a)與PSMA的結合親和常數至少約107M-1；b)能夠調理表達PSMA的細胞；或c)體外在人效應細胞存在下，在濃度約10μg/ml或更少時，能夠抑制表達PSMA的細胞的生長或介導細胞裂解作用。
2.權利要求1中的分離的人類抗體或其抗原結合部分，具有從下列一組抗原中選擇的同種型IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD和IgE。
3.權利要求1中的分離的人類抗體或其抗原結合部分，是IgG1κ。
4.權利要求1中的分離的人類抗體或其抗原結合部分，其中表達PSMA的細胞是腫瘤細胞。
5.權利要求4中的分離的人類抗體或其抗原結合部分，其中表達PSMA的細胞是前列腺細胞。
6.權利要求1中的分離的人類抗體或其抗原結合部分，由雜交瘤產生，其中雜交瘤包括與永生化細胞融合的來自轉基團非人動物的B細胞，該動物具有包括人類重鏈轉基因和人類輕鏈轉基因的基因組。
7.權利要求1的分離的人類抗體或其抗原結合部分，由雜交瘤產生，雜交瘤選自4A3，7F12，8A11，16F9和8C12，它們保藏於ATCC，保藏號＿＿。
8.分離的人類單克隆抗體或其抗原結合部分，它在人類效應細胞存在下，介導表達PSMA的細胞的細胞裂解作用。
9.權利要求8中的分離的人類抗體或其抗原結合部分，它在人類效應細胞存在下，能夠體外在IC501×10-7M或更低時介導表達PSMA的細胞的細胞裂解作用。
10.分離的人類單克隆抗體或其抗原結合部分，它抑制表達PSMA的細胞的生長。
11.權利要求10中的分離的人類抗體或其抗原結合部分，它能夠在體外IC501×10-7M或更低時抑制表達PSMA的細胞的生長。
12.包括與永生化細胞融合的B細胞的雜交瘤，其中B細胞來自轉基因非人動物，該轉基因非人動物含有包括人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組，雜交瘤產生可檢測量的與PSMA特異性結合的人類單克隆抗體。
13.權利要求12中的雜交瘤，其中人類單克隆抗體具有下列特徵的一項或多項a)與PSMA的結合親和常數至少約107M-1；b)能夠調理表達PSMA的細胞；或c)在人類效應細胞存在下，體外在濃度約10μg/ml或更少時，能夠抑制表達PSMA的細胞生長或介導其細胞裂解作用。
14.權利要求13中的雜交瘤，它是8C12，保藏於ATCC，保藏號＿＿。
15.表達與PSMA特異結合的人類單克隆抗體的轉基因非人動物，其中轉基因非人動物具有包含人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。
16.產生與PSMA特異性結合的人類單克隆抗體的一種方法，包括用PSMA或表達PSMA的細胞免疫轉基因非人動物，其中該動物含有包括人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組，這樣動物的B細胞產生了抗體；分離動物的B細胞；和融合B細胞和骨髓瘤細胞以形成永生化的雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞分泌特異於PSMA的人類單克隆抗體。
17.具有至少一個對PSMA的第一結合特異性和對Fc受體的第二結合特異性的雙特異性分子。
18.權利要求17中的雙特異性分子，其中Fc受體是人類FcγRI或人類Fcα受體。
19.權利要求17中的雙特異性分子，它與Fc受體的結合位點不同於免疫球蛋白與受體的結合位點。
20.一種包括權利要求1中的分離的人類單克隆抗體或其抗原結合部分和藥理上可接受的載體的組合物。
21.一種包括權利要求1的兩種或多種分離的人類抗體或其抗原結合部分的組合的組合物，其中所說的抗體或其抗原結合部分的每一種都與PSMA的不同抗原表位結合。
22.抑制表達PSMA的細胞生長的方法，包括使表達PSMA的細胞與特異性結合PSMA的分離的人類單克隆抗體或其抗原結合部分接觸，這樣表達PSMA的細胞的生長被抑制。
23.誘導表達PSMA的細胞的細胞裂解作用的方法，包括在效應細胞存在下，使表達PSMA的細胞與特異性結合PSMA的分離的人類單克隆抗體或其抗原結合部分接觸，這樣產生了表達PSMA的細胞的細胞裂解作用。
24.治療或預防特徵為異常表達PSMA的疾病的方法，包括將與PSMA特異性結合的分離的人類單克隆抗體或其抗原結合部分給藥到對象中，其中所給藥的量能夠有效治療或預防PSMA介導的疾病。
25.權利要求24中的方法，其中人類單克隆抗體與Fc受體的結合特異性偶聯。
26.權利要求24中的方法，其中人類單克隆抗體與細胞毒素偶聯。
27.權利要求24中的方法，其中疾病是癌。
28.權利要求27中的方法，其中癌是前列腺癌。
29.檢測樣品中PSMA抗原或表達PSMA的細胞的存在的方法，包括在允許抗體或其部分與PSMA形成複合物的條件下，使樣品和對照樣品與特異性結合PSMA的人類單克隆抗體或其抗原結合部分接觸；和檢測複合物的形成，其中與對照樣品相比較，樣品的複合物形成的差異表明樣品中存在PSMA。
30.表達載體，它包括特異性結合PSMA的人類單克隆抗體或其抗原結合部分的重鏈和輕鏈可變區和恆定區的編碼核苷酸序列，其中抗體或其抗原結合部分具有下列特徵的一項或多項a)與PSMA的結合親和常數至少約107M-1；b)能夠調理表達PSMA的細胞；或c)在人類效應細胞存在下，體外在濃度約10μg/ml或更少時，能夠抑制表達PSMA的細胞的生長或介導其細胞裂解作用。
31.權利要求30中的表達載體，其中抗體或其抗原結合部分由雜交瘤8C12產生，該雜交瘤保藏於ATCC，保藏號＿＿。
32.權利要求1的分離的人類抗體，其中抗體或其抗原結合部分與PSMA分子的胞外結構域上的蛋白質抗原表位結合。
全文摘要
分離的與PSMA特異結合的人單克隆抗體及抗原結合部分被公開,包括抗體和抗體部分的雙特異性分子也被公開。人類抗體能夠由非人轉基團動物產生,如轉基團小鼠,它能夠通過V－D－J重組和同種型轉變而產生人類單克隆抗體的各種同種型。另外,還公開了藥物組合物,它包括人類抗體,產生人類抗體的非人轉基因動物,雜交瘤和利用人類抗體的治療和診斷方法。
文檔編號A01K67/027GK1387539SQ00813165
公開日2002年12月25日 申請日期2000年7月26日 優先權日1999年7月29日
發明者Y·德奧, R·格拉茲爾諾, D·胡德森, E·H·何馬斯, W·T·蒂諾 申請人:米德列斯公司, 西北生物治療公司