穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法
2023-06-13 05:06:16 3
專利名稱：穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法
技術領域：
本發明涉及一種穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。
背景技術：
氮是生物體生長的必需養分之一，包括Ν03 —、ΝΗ4 +以及它們的一些同化產物，用於合成生物體所需的胺基酸和核苷酸及多種不同的含氮化合物。氮元素也是植物需求量最大的礦物質元素，而土壤中可利用的氮源比較少，自然就會成為限制農作物產量最主要的因素之一。由於外源的氮對農作物產量的提高是非常有效的，因此在集中型農業系統中，階段性的施加無機氮肥成為提高農作物產量的重要途徑。許多農作物品種之所以被耕種者選擇，一部分原因就是它們對施用的氮肥有更高的利用性。然而，無機氮肥的應用會造成一系列環境問題，尤其是淡水，進而江河和海水的富營養。正因為如此，如今需要降低氮肥的使用量，並尋找氮利用率更高的植物基因型。更高的氮利用率可以保證在產量不下降的前提下，減少氮肥的使用量。對於生物體的生長和發育而言，氮素的同化是十分重要的生理過程，無機氮必須同化為穀氨醯胺和天冬醯胺等有機氮才能被生物體所吸收和利用。穀氨醯胺合成酶 (glutamine synthetase，GQ是氮同化的路徑上的關鍵酶，它和穀氨酸合成酶聯合作用， 催化氨的同化，在生物體內含氮有機物的生物合成中作為氮供體，而外界的無機氮元素也通過這個途徑進入生物體內的整個氮素循環。因此穀氨醯胺合成酶在生物體氮同化過程中起到了十分重要的作用。鹽藻UMmliella viridis)屬於團藻目、多毛藻科、杜氏藻屬生物，是耐鹽性最強的真核單細胞藻類。不僅可在高鹽海水和鹽湖等生長，也能經受外界環境中鹽濃度0. 5-5. 5 mol/L劇烈變化。在外界高鹽的環境下，鹽藻可利用環境中低濃度(毫摩爾)的N03—和NH4+。 研究鹽藻的氮利用途徑，有利於搞清楚高鹽環境下植物氮利用途徑及調控機制。因此，鹽藻穀氨醯胺合成酶二基因的克隆及功能鑑定對於改善逆境下農作物的性狀有重要的
眉、ο
發明內容
本發明的目的之一在於提供了一種穀氨醯胺合成酶基因。本發明的目的之二在於提供該基因的編碼蛋白。本發明的目的之三在於提供了該基因的顆粒方法。為達以上目的，本發明通過下述方案實現
一種穀氨醯胺合成酶基因，其特徵在於該基因為SEQ ID NO 1所示的鹼基序列。一種上述的基因的編碼蛋白，其特徵在於該蛋白為SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列。一種克隆上述基因的方法，該方法的具體步驟為利用SMART cDNA construction kit構建了 3個鹽藻cDNA文庫，通過對該3個文庫中cDNA的序列的測序，獲得對應的EST文庫；再通過序列比對，分離到了一個穀氨醯胺合成酶基因；挑選cDNA文庫相應克隆進行測序，獲得了含有該基因完整ORF的cDNA序列。一種重組表達載體，該重組載體含有上述的基因。一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述的重組載體。一種上述的穀氨醯胺合成酶基因在低氮環境下提高生物氮利用效率基因工程方面的應用。一種上述的穀氨醯胺合成酶基因編碼的蛋白在低氮環境下提高生物氮利用效率基因工程方面的應用。本發明的互補實驗驗證了在鹽藻中穀氨醯胺合成酶基因OV61S )所編碼的穀氨醯胺合成酶能夠在大腸桿菌中發揮穀氨醯胺合成酶的功能，證明該基因能夠恢復大腸桿菌突變體合成穀氨醯胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。
圖1和圖2為本發明的穀氨醯胺合成酶基因編碼的蛋白亞細胞定位預測圖，表明該編碼蛋白定位在葉綠體的可能性很大；
圖3為本發明的穀氨醯胺合成酶基因編碼的蛋白的進化分析圖，表明該編碼蛋白屬於穀氨醯胺合成酶家族；
圖4為本發明的穀氨醯胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype: F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl 50 (strR), Δ (glnG-glnA)229,ha-10, deoCl)中的功能互補分析圖。培養基中添加穀氨醯胺，轉入DvGS2和未轉入DvGS2的菌株均可以正常生長；
圖5為本發明的穀氨醯胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype: F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl 50(strR), Δ (glnG-glnA)2^，ha-10，deOCl)中的功能互補分析圖。培養基中未添加穀氨醯胺，只有轉入DvGS2的菌株可以正常生長。
具體實施方案下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照製造廠商所建議的條件。實施例一 :/^61 基因全長編碼區的克隆與分析本實驗室利用SMART cDNA construction kit構建了 3個鹽藻cDNA文庫，通過對文庫中cDNA的序列進行大規模測序， 獲得對應的EST文庫(數據未發表)。通過序列比對，分離到了一個鹽藻穀氨醯胺合成酶基因，命名為？。挑選cDNA文庫相應克隆進行測序，獲得了含有該基因完整ORF的cDNA 序列。測序結果表明MS2的cDNA全長1440bp，含有綠藻基因特異的加尾信號TGTAA及 poly(A)結構。Vector NTI9. 1. 0軟體的分析結果顯示該基因編碼一個含385個胺基酸的蛋白，蛋白分子量大小約為42. 2kDa，等電點為5. 78。利用Cell-PLoc網站的Euk-mPLoc 2. 0以及Softberry網站的ProtComp Version 9. O對/VilS^基因編碼的蛋白進行亞細胞定位預測，預測數據顯示該蛋白定位在葉綠體的可能性很大，參見圖1和2，這與其它物種中的穀氨醯胺合成酶的定位信息相符。進化分析表明，本發明的基因編碼的蛋白屬於穀氨醯胺合成酶家族，參見圖3。實施例二 :/^61 在大腸桿菌突變體中的功能分析通過酶切方法，酶切位點為 Sall+Xbal (這兩個酶切位點位於庫質粒上)，將的全長cDNA從庫質粒中切下，獲得包含完整ORF的基因片段。然後將克隆到的目的片段插入到大腸桿菌組成型表達載體pEGFP-Ι中，並轉入大腸桿菌突變體 ET6017(Genotype: F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac) 169，flhD5301, Δ (fruK-yeiR) 725(fruA25)，relAl, rpsL150(strR)，Δ (glnG-glnA)229，ha-10, deoCl) 中°請參見文獻Merida, Α. , Ε. Flores, and F. J. Florencio, Regulation of Anabaena sp. strain PCC 7120 glut amine synthetase activity in a Synechocys tis sp. strain PCC 6803 derivative strain bearing the Anabaena glnA gene and a mutated host glnA gene. J Bacteriol, 1992. 174(2) : p. 650-4.。該突變體由於缺失編碼穀氨醯胺合成酶基因，所以在不添加穀氨醯胺的培養基中無法正常生長。該菌株購買於五coli Genetic Stock Center, Yale University。由圖4和圖5說明DvGS2能夠互補大腸桿菌突變體ET6017的管醯胺合成酶缺失表型。DvGS2的表達，使得大腸桿菌突變體ET6017在不添加穀氨醯胺的培養條件下生長。該互補實驗在大腸桿菌中驗證了基因所編碼的穀氨醯胺合成酶能夠在大腸桿菌中發揮穀氨醯胺合成酶的功能，證明該基因能夠恢復大腸桿菌突變體合成穀氨醯胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。儘管本發明描述了具體的例子，但是有一點對於本領域技術人員來說是明顯的， 即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。
序列表 上海大學
穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法
2
1
1440
DNA
HiDunaliella viridis) 1
AATCGGCACGAGGATCACCATGGCCACGATGATGATGATGAAGCCTGCACAGCTGGCGCA60GCGAGGCGCTTTTGGCCGGGCGGCAGCCCCTGCAGCGGGAGGCCGTGGCCTGTCTGTCAG120GGCCAATGCCGCCCCCAAGCTGGTGCAGAAGGCTGAGTACATCTGGACCGATGGGCAGGA180GGGTGAGCCCCACAAGGGTCTGCTGTTCAATGAGCTGAGGTCTAAGACCAAGACATTCGC240CAAGGAGAACGGCCTGGACGCCTCTGAGTACCCTGACTGGAGCTACGATGGCAGCAGCAC300CAACCAGGCTGAGGGTGACAACTCTGACTGCATCATCAGGCCTGTGCGCGTGGTGCCTGA360CCCCATCCGTGGCGCTCCCCACGTGCTGGTCATGTGCGAGGTCTTCGGCCCTGATGGCCA420ACCTCACCCAAGCAACACTCGTGCCAAGCTGCGTGAGCAGCTGACCCCAAAGGCTCTGGA480
權利要求
1.一種穀氨醯胺合成酶基因，其特徵在於該基因為SEQ ID NO 1所示的鹼基序列。
2.一種根據權利要求1所述的基因的編碼蛋白，其特徵在於該蛋白為SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列。
3.一種克隆根據權利要求1所述的基因的方法，該方法的具體步驟為利用SMART cDNA construction kit構建了 3個鹽藻cDNA文庫，通過對該3個文庫中cDNA的序列的測序，獲得對應的EST文庫；再通過序列比對，分離到了一個穀氨醯胺合成酶基因；挑選cDNA 文庫相應克隆進行測序，獲得了含有該基因完整ORF的cDNA序列。
4.一種重組表達載體，該重組載體含有根據權利要求1所述的基因。
5.一種宿主細胞，該宿主細胞根據權利要求1所述的重組載體。
6.一種根據權利要求1所述的穀氨醯胺合成酶基因在低氮環境下提高生物氮利用效率方面的應用。
7.一種根據權利要求2所述的穀氨醯胺合成酶基因編碼的蛋白在低氮環境下提高生物氮利用效率方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種穀氨醯胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。本發明的基因來源於鹽藻，為SEQIDNO1所示的鹼基序列，該基因具有合成穀氨醯胺合成酶的功能，並且證明了該基因能夠顯著提高模式生物大腸桿菌合成穀氨醯胺的能力。這也預示了所公開的全長基因及胺基酸序列，其在提高生物體的氮利用效率、增加生物體氮元素含量的植物基因工程方面具有應用價值。
文檔編號C12N1/21GK102250925SQ201110148438
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月3日 優先權日2011年6月3日
發明者孫曉亮, 宋任濤, 屈武斐, 朱晨光, 範倩嵐, 許政暟 申請人:上海大學