一種體外分子水平螢光法排除篩選藥物假陽性結果的方法
2023-06-13 05:13:16
專利名稱：一種體外分子水平螢光法排除篩選藥物假陽性結果的方法
技術領域：
本發明涉及藥物篩選領域，具體來講，本發明涉及一種在體外分子水平採用螢光法來排除基於螢光技術的藥物篩選假陽性結果的方法。
背景技術：
藥物高通量篩選(high-throughput screening, HTS)是發現創新藥物的重要技術手段，對大規模化合物庫的高通量篩選是藥物研發領域尋找先導化合物的主要來源，與傳統方法相比，HTS在微量條件下進行，採用自動化作業系統，可以實現大規模的篩選，通過活性數據處理過程確定化合物的藥物活性，為基於信息的藥物發現過程準備準確、豐富的資料，因而篩選過程本身已不再是新藥發現的瓶頸。但是篩選通量的巨大增長並沒有帶來相應的大量新化學實體被鑑定為待開發候選分子，究其原因，除可通過吸收、分布、代謝、排洩、毒性(ADMET)研究解決的藥代動力學及毒理學等相關問題外，篩選過程中化合物的性質及成藥性也是一個重要因素。另一方面，篩選過程本身也存在問題，尤其是採用廣泛用於藥物高通量篩選中的專業化檢測技術，為保證通量，這些技術雖然避免了過多的操作步驟，能夠進行連續操作， 從而降低了消耗時間的步驟，但其缺點在於後續反應產物檢測時待測樣品仍存在於反應體系中，從而導致待測物非目標檢測性質的幹擾問題。這些可通過採用其他獨立檢測技術對所得結果進行反篩選(coimterscreening)以驗證結果，或者將待測物加入已經停止的反應體系以區別假象(artifact)。儘管如此，一些假陽性結果仍然無法排除。由於這些假陽性結果的存在，導致後續藥物研發的巨大投入，造成人力、物力和財力的巨大浪費。螢光檢測方法具有靈敏度高、方法簡便的優點，因此，近年來，基於螢光技術的檢測分析方法被廣泛應用於藥物的高通量篩選(HTS)。目前應用於HTS的螢光技術包括均相時間分辨螢光法(homogeneoustime resolved fluorescence, HTRF)、螢光共振能量轉移法(fluorescence resonance energy transfer, FRET)、焚光關聯光譜法(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)、極化焚光分析法(fluorescence polarization,FP)等。 在這些方法中，HTRF法由於發射光較窄的帶寬與較長的衰減周期、激發光波長與發射光波長間巨大的斯託克斯位移(Stoke』 s shift)從而可以檢測特異性信號，排除短壽命螢光信號造成的假陰性結果，因此，得到越來越多的應用。HTRF的原理是生物活性物質(主要是酶)的底物兩端分別偶聯螢光淬滅基團和螢光發射基團，當反應體系中存在相應生物活性物質(主要是酶)的活性時，底物被切割後螢光淬滅基團和螢光發射基團分離，採用具有一定波長激發光的檢測器進行激發即可檢測到特定波長發射光。將HTRF應用於藥物篩選中時，其操作過程是將待篩選樣品與生物活性物質在一定條件下孵育一定時間後加入生物活性物質的底物，在適宜條件下孵育一定時間，以一定波長激發光激發後檢測特定波長發射光強度，若待測樣品抑制生物活性物質的活性時，其底物切割程度降低，因而所檢測到的發射光強度降低，由此可篩選出具有抑制活性的待測樣品。
HTFR雖然具有可以檢測特異性信號，排除短壽命螢光信號造成假陰性結果等諸多優點，但是卻無法排除化合物對螢光的淬滅作用所造成的假陽性結果。目前，在藥物高通量篩選中用於排除HTRF法篩選結果假陽性驗證的方法主要依賴於質譜法、高效液相色譜法等，這些手段存在通量低、成本高等瓶頸問題，而且對設備依賴程度高，不能滿足藥物研發領域對於低成本與高效率的要求。針對這個問題，本發明開發了一種既簡單，又省時、省力，低成本、高效率的排除HTRF等螢光篩選方法中假陽性結果的方法。綜上所述，針對基於螢光法進行藥物篩選時對於具有螢光淬滅作用的樣品造成的假陽性結果無法排除，而質譜法等排除假陽性的方法無法實現高通量且成本較高，造成目前缺少高通量、高靈敏度且簡單易行的方法的現狀，促使了本發明的研究。
發明內容
為了解決上述問題，排除體外分子水平藥物高通量篩選中的假陽性結果，特別是螢光淬滅作用造成的假陽性結果，本發明公開了一種採用螢光法進行體外分子水平藥物篩選假陽性結果的排除方法。該方法從HTRF法藥物篩選技術改進而來，通過改變生物活性物質、底物和待測目標物質的加樣順序來實現，其基本原理為生物活性物質與底物室溫反應一定時間產生足以檢測到的螢光，加入待測目標物質，檢測螢光強度隨反應時間的變化趨勢，根據螢光強度的變化得出結果。採用該法可區分待測目標物質自身對螢光的淬滅作用與待測目標物質抑制酶的活性從而降低酶水解底物最終致使螢光減弱的作用，適用於基於螢光的方法(如時間分辨螢光、螢光能量共振轉移等)進行藥物篩選時假陽性結果的排除。本發明的一個方面涉及一種用於目標物質篩選的螢光法中螢光測試樣品的製備方法，包括1)向反應板中加入a)生物活性物質，和b)所述生物活性物質的底物，所述底物的兩端分別偶聯有螢光淬滅基團和螢光發射基團；2)將1)中所得樣品在一定條件下孵育一定時間以達到螢光法可檢測的螢光強度；3)向2)中所得樣品中再加入待測目標物質，得到所述螢光法的螢光測試樣品。本發明的另一方面涉及一種按照上述方法製備的螢光測試樣品驗證組。本發明還涉及一種用於目標物質篩選的螢光法中的螢光測試樣品篩選組，其採用如下方法製備1)向反應板中加入a)生物活性物質，和b)待測目標物質，在一定條件下孵育一定時間；2)在1)中加入生物活性物質的底物，所述底物的兩端分別偶聯有螢光淬滅基團和螢光發射基團，由此得到螢光測試樣品篩選組。本發明還涉及一種用於目標物質篩選的螢光法中的螢光測試樣品陰性對照組， 其採用如下方法製備1)向反應板中加入a)生物活性物質，和b)待測目標物質的溶劑，在一定條件下孵育一定時間；2)在1)中加入生物活性物質的底物，所述底物的兩端分別偶聯有螢光淬滅基團和螢光發射基團，由此得到螢光測試樣品陰性對照組。以上所述螢光法選自時間分辨螢光法、螢光共振能量轉移法、均相時間分辨螢光法、螢光關聯光譜法、極化螢光分析法和常規螢光定量法；在本發明的一個實施方案中，所述螢光法為均相時間分辨螢光法。所述生物活性物質是酶，優選為切割酶，特別是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；在本發明的一個實施方案中，所述切割酶為BACE1。所述生物活性物質的底物為選自酶，優選為切割酶，特別是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；在本發明的一個實施方案中，所述底物為APP(澱粉樣前體蛋白)或突變型APP。所述螢光淬滅基團選自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；在本發明的一個實施方案中，所述螢光淬滅基團為QSY7。所述螢光發射基團選自鑭系金屬螯合分子、EDANS(5』 -(2』 -氨乙基氨基奈磺酸))、Mca (甲基香豆素醋酸鹽)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；在本發明的一個實施方案中，所述螢光發射基團為銪螯合分子。所述一定條件是指反應溫度為0 40°C，反應pH值為2 6. 8，所述孵育時間為 0 24hr ；在本發明的一個實施方案中，所述一定條件是指反應溫度為20 25 V，反應pH 值為4. 5，所述孵育時間在驗證組為6hr，在篩選組和陰性對照組為0. 5hr。本發明的再一方面還涉及一種用於目標物質篩選的螢光法中由於螢光淬滅作用引起的假陽性樣品的排除方法，包括1)在一定的激發光和發射光條件下，同時檢測如上所述螢光檢測樣品驗證組篩選組和陰性對照組的螢光強度；其中所述螢光檢測樣品中的生物活性物質、底物和待測目標物質均相同；其中所述螢光檢測樣品中的反應為同步進行，具體地，各螢光檢測樣品中的生物活性物質和底物為同時加入，驗證組所述螢光測試樣品中的待測目標物質隨後加入；2)從加入底物後開始的48hr內，優選為12hr內，分孵育時間段對步驟1)所述螢光檢測樣品的螢光強度進行檢測，具體地，所述分孵育時間段是指在加入待測目標物質前、 加入待測目標物質後即刻、加入待測目標物質後每0. 5-lhr ；3)根據步驟2)中所述螢光檢測樣品驗證組篩選組和陰性對照組的螢光強度檢測結果，判定待測目標物質是否為假陽性樣品。在本發明的一個實施方案中，螢光檢測樣品驗證組篩選組和陰性對照組
的製備方法以及假陽性樣品的排除方法，具體包括以下步驟(1)配製驗證組篩選組和陰性對照組螢光檢測樣品在384孔板上，首先向各組中加入BACE1，其次，向篩選組中加入不同濃度的待測目標物質，向陰性對照組中加入相同體積的待測目標物質溶劑DMS0，驗證組中不加任何物質。將三組共同孵育0. 5hr。最後，向各組中加入底物APP。(4)將各組室溫孵育6hr，以達到可檢測的螢光強度；(5)在ex340nm-em615nm條件下檢測三組反應體系的螢光強度；(6)向驗證組中加入不同濃度的待測目標物質。(7)立即在ex340nm-em615nm條件下檢測三組反應體系的螢光強度。
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(8)在加入待測目標物質後6hr內，繼續分孵育時間段進行三組反應體系的螢光強度檢測，檢測波長為eX340nm-em615nm。(9)根據驗證組篩選組和陰性對照組的螢光強度值，進行相互比較，統計分析以得出結果。其中判定是否為假陽性樣品的方法為在篩選組螢光強度降低的基礎上，若驗證組螢光強度沒有顯著變化，但隨反應時間的增加螢光強度不斷增加，增加幅度低於陰性對照組，該趨勢終止於酶或待測目標物質的耗竭，則待測目標物質發揮抑制劑活性；若驗證組螢光強度立即降低，則待測目標物質發揮螢光淬滅作用。本發明還涉及上述排除方法用於排除螢光法篩選中假陽性結果的用途。所述假陽性結果是指螢光淬滅作用引起的假陽性結果。發明的有益效果與現有的藥物篩選假陽性結果排除手段相比，本發明的螢光方法具有以下優點 (1)通量高可在微量條件下進行，採用自動化作業系統，可以實現大規模驗證；(2)成本低與質譜法等手段相比，無需購置新試劑或新儀器，且試劑與樣品用量少；(3)靈敏度高； (4)均相性好，簡單易行。本發明可用於驗證體外分子水平基於螢光法進行藥物篩選所得陽性結果的驗證，尤其適用於假陽性結果的排除，具有良好的應用前景。
圖IBACEl抑制劑H1712的驗證結果橫坐標孵育時間(incubation time，單位為hr)是指從加入底物後開始計算的時間，第一個檢測點為加入待驗證物後立即檢測的結果(以下各圖與此相同)；縱坐標為相關螢光單位數(RFU)。圖2BACE1抑制劑H0412的驗證結果圖3BACE1抑制劑H0312的驗證結果圖4BACE1抑制劑EGCG的驗證結果圖5BACE1抑制劑L80325的驗證結果圖6BACE1抑制劑013的驗證結果圖7BACE1抑制劑015的驗證結果
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。以下實施例所使用的試劑、材料包括TruPoint Beta-Secretase Assay Kit384 (Cat. #· AD0258, PerkinElmer)(實施例中涉及的底物APP、測試緩衝液均為該試劑盒提供，實施例中涉及溶液的配製方法參見試劑盒說明書)重組人 BACEl[Recombinant Human BACEl(beta—secretase)] (Cat. #·P2947，Invitrogen)Dimethylsulfoxid(DMSO)(127790025，ACR0S)EGCG(Epigallocatechin gallate，表沒食子兒茶素沒食子酸酯)購於成都普瑞法科技開發有限公司，CAS No. =989-51-5 ；L80325( β -Secretase Inhibitor IV)購於Merck 公司 Calbiochem，貨號565788化合物Hl712、H0412、H0312、013、015均由軍事醫學科學院毒物藥物研究所提供。384 孔板(Cat. #· 6007270, PerkinElmer)VICT0R3 多功能酶標儀(PerkinElmer 公司)以下實施例所採用的方法為均相時間分辨螢光法(HTRF)。以下實施例所採用的方法均包括以下幾個步驟(1)實驗分組以下每個實施例均分為3組。第1組為陰性對照組反應體系中只有生物活性物質重組人BACEl與其底物APP，操作過程是重組人BACEl與其底物APP在適宜條件下孵育一定時間後，進行螢光強度檢測，不加待測目標物質(在以下實施例中，待測目標物質是指利用螢光法，以BACEl為靶標，經初步篩選所得的BACEl抑制劑)。第2組為篩選組反應體系中有待測目標物質、重組人BACEl和底物APP，操作過程是重組人BACEl與待測目標物質在適宜條件下孵育一定時間後，加入底物APP在適宜條件下孵育一定時間， 進行螢光強度檢測。第3組是驗證組反應體系中有待測目標物質、重組人BACEl和底物 APP,但是操作過程與篩選組不同，首先是重組人BACEl與其底物APP在適宜條件下孵育一定時間以達到可檢測的螢光強度並進行檢測後(至此過程與陰性對照組相同)，加入待測目標物質，立即檢測後，並繼續分孵育時間段進行檢測。(2)重組人BACEl的底物APP兩端分別標記銪螯合螢光分子和螢光淬滅分子 QSY7 ；(3)配製篩選組、陰性對照組和驗證組反應體系在384孔板上，首先向各組中加入15 μ L 0. 67mU/l·! L重組人BACE1，其次，向篩選組中加入2 μ L不同濃度的待測目標物質， 向陰性對照組中加入相同體積的DMS0，驗證組中不加任何物質。將三組共同孵育0. 5hr。最後，向各組中加入15 μ L 400nmol/L底物APP。(4)將各組室溫孵育6hr，以達到可檢測的螢光強度；(5)採用多功能酶標儀在eX340nm-em615nm條件下檢測三組反應體系的螢光強度；(6)向驗證組中加入以BACEl為靶標篩選得到的待測目標物質。(7)立即在ex340nm-em615nm條件下檢測三組反應體系的螢光強度。(8)在加入待測目標物質後6hr內，繼續分孵育時間段進行三組反應體系的螢光強度檢測，檢測波長為eX340nm-em615nm。(9)根據驗證組、陰性對照組和篩選組的螢光強度值，進行相互比較，統計分析以
得出結果。以下實施例的結果分析所採用的共同方法是採用GraphPad Prism軟體以時間-相關螢光單位數(RFU)作圖，並比較驗證組螢光變化與其陰性對照組、篩選組螢光變化規律。結果判定方法為在篩選組螢光強度降低的基礎上，若驗證組螢光強度沒有顯著變化，但隨反應時間的增加螢光強度不斷增加，增加幅度低於陰性對照組，該趨勢終止於酶或待驗證物的耗竭，則待驗證物發揮抑制劑活性；若驗證組螢光強度立即降低，則待驗證物發揮螢光淬滅作用。實施例IBACEl抑制劑H1712篩選結果驗證在該實施例中，待測目標物質為H1712，其加入濃度為10_4M、10_5M、10_6M。檢測時間點為加入H1712前(即加入APP後6h)、加入H1712後即刻、加入APP後 7h、8h、9h、9. 5h、10h、10. 5h、llh、ll. 5h、12h。驗證結果在加入H1712後，與陰性對照相比，驗證組的螢光強度立即降低，表明化合物H1712具有明顯的螢光淬滅作用(見圖1)。實施例2BACE1抑制劑H0412篩選結果驗證在該實施例中，待測目標物質為H0412，其加入濃度為1 (T4M、ICT5M、10、。檢測時間點為加入H0412前(即加入APP後6h)、加入H0412後即刻、加入APP後 7h、8h、9h、9. 5h、10h、10. 5h、llh、ll. 5h、12h。驗證結果在加入H0412後，與陰性對照相比，驗證組的螢光強度立即降低，表明化合物H0412具有明顯的螢光淬滅作用(見圖2)。實施例3BACE1抑制劑H0312篩選結果驗證在該實施例中，待測目標物質為H0312，其加入濃度為1 (T4M、ICT5M、10、。檢測時間點為加入H0312前(即加入APP後6h)、加入H0312後即刻、加入APP後 7h、8h、9h、9. 5h、10h、10. 5h、llh、ll. 5h、12h。驗證結果在加入H0312後，與陰性對照相比，驗證組的螢光強度立即降低，表明化合物H0312具有明顯的螢光淬滅作用(見圖3)。實施例4 =BACEl抑制劑EGCG篩選結果驗證在該實施例中，待測目標物質為EGCG，其加入濃度為10-4Μ、10-5Μ、1(Γ6Μ。檢測時間點為加入EGCG前(即加入APP後6h)、加入EGCG後即刻、加入APP後 6. 511、711、811、911、1011、1111、1211及加終止液(試劑盒提供，下同)後。驗證結果在加入EGCG後，與陰性對照相比，驗證組的螢光強度立即降低，表明化合物EGCG具有明顯的螢光淬滅作用(見圖4)。早期，有研究表明EGCG可能是BACEl的抑制劑(Jeon SY, Bae K，Seong YH, Song KS :Green Tea Catechins as a BACEl(β-Secretase)Inhibitor. Bioorg Med Chem Lett 2003 ；13 :3905-3908.)，但本發明的研究結果表明EGCG具有明顯的螢光淬滅作用，並不是 BACEl的抑制劑。另外也有研究證明EGCG不是BACEl抑制劑(Rezai-Zadeh K，Shytle D， Sun N,Mori T,Hou H,Jeanniton D et al. :Green teaepigallocatechin-3-gallate(EGC G)modulates amyloid precursor proteincl eavage and reduces cerebral amyloidosis in Alzheimer transgenicmice. J Neurosci 2005 ；25 :8807_8814·)實施例5 =BACEl抑制劑L80325篩選結果驗證在該實施例中，待測目標物質為L80325，其加入濃度為10_5Μ、10_6Μ、10_7Μ、10_8Μ、 1(Γ9Μ。檢測時間點為加入L80325前(即加入APP後6h)、加入L80325後即刻、加入APP 後 6. 5h、7h、8h、9h、10h、llh、12h 及加終止液後。
驗證結果加入L80325後，與陰性對照比較，驗證組螢光強度沒有降低，隨時間增加而逐漸趨於平穩，表明化合物L80325無螢光淬滅作用。同時，篩選組螢光強度顯著降低， 表明化合物L80325對BACEl的活性具有抑制作用(見圖5)。(注在加入L80325後，圖 5中出現的驗證組螢光強度略微降低是由於反應達到平衡或信號值達到儀器檢測上限溢出所致，不影響結果判斷。圖6和圖7與此情況相同。)實施例6 =BACEl抑制劑013篩選結果驗證在該實施例中，待測目標物質為013，其加入濃度為10-5Μ、10-6Μ、1(Γ7Μ。檢測時間點為加入013前(即加入APP後6h)、加入013後即刻、加入APP後6. 5h、 7h、8h、9h、IOh、1 lh、12h 及加終止液後。驗證結果加入013後，與陰性對照比較，驗證組螢光強度沒有降低，隨時間增加而逐漸趨於平穩，表明化合物013無螢光淬滅作用。同時，篩選組螢光強度顯著降低，表明化合物013對BACEl的活性具有抑制作用(見圖6)。實施例7 =BACEl抑制劑015篩選結果驗證在該實施例中，待測目標物質為015，其加入濃度為IO-5M、IO-6M、I(TM。檢測時間點為加入015前(即加入APP後6h)、加入015後即刻、加入APP後6. 5h、7h、8h、9h、10h、 llh、12h及加終止液後。驗證結果加入015後，與陰性對照比較，驗證組螢光強度沒有降低，隨時間增加而逐漸趨於平穩，表明化合物015無螢光淬滅作用。同時，篩選組螢光強度顯著降低，表明化合物015對BACEl的活性具有抑制作用(見圖7)。儘管本發明的具體實施方式
已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的全部範圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
權利要求
1.一種螢光測試樣品的製備方法，所述螢光測試樣品用於螢光法中目標物質的篩選， 所述製備方法包括1)向反應板中加入a)生物活性物質，和b)所述生物活性物質的底物，所述底物的兩端分別偶聯有螢光淬滅基團和螢光發射基團；2)將1)中所得樣品在一定條件下孵育一定時間以達到螢光法可檢測的螢光強度；和3)向2)中所得樣品中再加入待測目標物質，得到所述螢光法的螢光測試樣品。
2.權利要求1所述的方法，其中，所述螢光法選自時間分辨螢光法、螢光共振能量轉移法、均相時間分辨螢光法、螢光關聯光譜法、極化螢光分析法和常規螢光定量法；步驟1)中所述生物活性物質是酶，優選為切割酶，特別是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；所述生物活性物質的底物為選自酶，優選為切割酶，特別是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；所述螢光淬滅基團選自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；螢光發射基團選自鑭系金屬螯合分子、EDANS(5『 -(2』 _氨乙基氨基奈-1-磺酸))、 Mca (甲基香豆素醋酸鹽)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；步驟2)中所述一定條件是指反應溫度為O 40°C，反應pH值為2 6. 8，所述孵育時間為O 24hr ；具體地，所述螢光法為均相時間分辨螢光法，步驟1)中所述生物活性物質為BACE1，所述底物為APP (澱粉樣前體蛋白)或突變型APP，所述螢光淬滅基團為QSY7，所述螢光發射基團為銪螯合分子；步驟2)中所述一定條件是指反應溫度為20 25°C，反應pH值為4. 5， 所述孵育時間為6hr。
3.一種按照權利要求1所述方法製備的螢光測試樣品驗證組，其中，所述螢光法選自時間分辨螢光法、螢光共振能量轉移法、均相時間分辨螢光法、螢光關聯光譜法、極化螢光分析法和常規螢光定量法；步驟1)中所述生物活性物質是酶，優選為切割酶，特別是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；所述生物活性物質的底物為選自酶，優選為切割酶，特別是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；所述螢光淬滅基團選自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；螢光發射基團選自鑭系金屬螯合分子、EDANS(5『 -(2』 _氨乙基氨基奈-1-磺酸))、 Mca (甲基香豆素醋酸鹽)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；步驟2)中所述一定條件是指反應溫度為0 40°C，反應pH值為2 6. 8，所述孵育時間為0 24hr ；具體地，所述螢光法為均相時間分辨螢光法，步驟1)所述生物活性物質為BACEl ；所述生物活性物質的底物為APP (澱粉樣前體蛋白)或突變型APP ；所述螢光淬滅基團為QSY7 ； 螢光發射基團為銪螯合分子；步驟2)中所述一定條件是指反應溫度為20 25°C，反應pH 值為4. 5，所述孵育時間為6hr。
4.一種用於目標物質篩選的螢光法中的螢光測試樣品篩選組，其採用如下方法製備1)向反應板中加入a)生物活性物質，和b)待測目標物質，在一定條件下孵育一定時間；2)在1)中加入生物活性物質的底物，所述底物的兩端分別偶聯有螢光淬滅基團和螢光發射基團，由此得到螢光測試樣品篩選組。
5.權利要求4所述的篩 選組，其中，所述螢光法選自時間分辨螢光法、螢光共振能量轉移法、均相時間分辨螢光法、螢光關聯光譜法、極化螢光分析法和常規螢光定量法；步驟1)中所述生物活性物質是酶，優選為切割酶，特別是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；所述一定條件是指反應溫度為O 40°C，反應pH值為2 6. 8，所述孵育時間為O 24hr ；步驟2)中所述生物活性物質的底物為選自酶，優選為切割酶，特別是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；所述螢光淬滅基團選自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；螢光發射基團選自鑭系金屬螯合分子、EDANS(5『 -(2』 _氨乙基氨基奈-1-磺酸))、 Mca (甲基香豆素醋酸鹽)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；具體地，所述螢光法為均相時間分辨螢光法，步驟1)所述生物活性物質為BACEl ；所述一定條件是指反應溫度為20 25°C，反應pH值為4. 5，所述孵育時間為0. 5hr ；步驟2) 中所述生物活性物質的底物為APP (澱粉樣前體蛋白)或突變型APP ；所述螢光淬滅基團為 QSY7 ；螢光發射基團為銪螯合分子。
6.一種用於目標物質篩選的螢光法中的螢光測試樣品陰性對照組，其採用如下方法製備1)向反應板中加入a)生物活性物質，和b)待測目標物質的溶劑，在一定條件下孵育一定時間；2)在1)中加入生物活性物質的底物，所述底物的兩端分別偶聯有螢光淬滅基團和螢光發射基團，由此得到螢光測試樣品陰性對照組。
7.權利要求6所述的陰性對照組，其中，所述螢光法選自時間分辨螢光法、螢光共振能量轉移法、均相時間分辨螢光法、螢光關聯光譜法、極化螢光分析法和常規螢光定量法；步驟1)中所述生物活性物質是酶，優選為切割酶，特別是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶；所述一定條件是指反應溫度為0 40°C，反應pH值為2 6. 8，所述孵育時間為0 24hr ；步驟2)中所述生物活性物質的底物為選自酶，優選為切割酶，特別是天冬氨酸蛋白酶家族和半胱氨酸蛋白酶家族的切割酶的底物；所述螢光淬滅基團選自QSY7、DABCYL、Ac、Dnp ；螢光發射基團選自鑭系金屬螯合分子、EDANS (5』 -(2』 -氨乙基氨基奈-1-磺酸))、 Mca (甲基香豆素醋酸鹽)和AFC (7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；具體地，所述螢光法為均相時間分辨螢光法，步驟1)所述生物活性物質為BACEl ；所述一定條件是指反應溫度為20 25°C，反應pH值為4. 5，所述孵育時間為0. 5hr ；步驟2) 中所述生物活性物質的底物為APP (澱粉樣前體蛋白)或突變型APP ；所述螢光淬滅基團為 QSY7 ；螢光發射基團為銪螯合分子。
8.一種用於目標物質篩選的螢光法中由於螢光淬滅作用引起的假陽性樣品的排除方法，包括1)在一定的激發光和發射光條件下，同時檢測如權利要求3、4和6所述螢光檢測樣品的螢光強度；其中所述螢光檢測樣品中的生物活性物質、底物和待測目標物質均相同；其中所述螢光檢測樣品中的反應為同步進行，具體地，各螢光檢測樣品中的生物活性物質和底物為同時加入，權利要求3所述螢光測試樣品驗證組中的待測目標物質隨後加入；2)從加入底物後開始的48hr內，優選為12hr內，分孵育時間段對步驟1)所述螢光檢測樣品的螢光強度進行檢測，具體地，所述分孵育時間段是指在加入待測目標物質前、加入待測目標物質後即刻、加入待測目標物質後每0. 5-lhr ；3)根據步驟2)中如權利要求3、4和6所述螢光檢測樣品的螢光強度檢測結果，判定待測目標物質是否為假陽性樣品。
9.權利要求8所述的排除方法，其用於螢光法篩選中假陽性結果的排除。
10.權利要求9所述的排除方法，其中的假陽性結果是指螢光淬滅作用引起的假陽性結果。
全文摘要
本發明涉及用於目標物質篩選的螢光法中螢光測試樣品的製備方法，包括1)向反應板中加入a)生物活性物質，和b)所述生物活性物質的底物，底物兩端分別偶聯有螢光淬滅基團和螢光發射基團；2)將1)中所得樣品在一定條件下孵育一定時間以達到螢光法可檢測的螢光強度；3)向2)中所得樣品中再加入待測目標物質，得到所述螢光法的螢光測試樣品。本發明還涉及按照上述方法製備的螢光測試樣品(驗證組)，以及用於對照的(篩選組)和(陰性對照組)。本發明還涉及用於目標物質篩選的螢光法中由於螢光淬滅作用引起的假陽性樣品的排除方法，以及所述排除方法用於排除螢光法篩選中假陽性結果，特別是螢光淬滅作用引起的假陽性結果的用途。
文檔編號G01N21/64GK102243176SQ20101017247
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優先權日2010年5月14日
發明者周文霞, 周金武, 張永祥, 楊日芳, 程軍平, 程肖蕊, 聶愛華 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所