通過吸引效應t細胞和耗損調節性t細胞治療癌症的製作方法

2023-06-13 15:52:16

專利名稱：通過吸引效應t細胞和耗損調節性t細胞治療癌症的製作方法
技術領域：
本申請主要涉及癌症治療領域，更具體地涉及用於癌症免疫治療的方法和組合物。
背景技術：
腫瘤的放射治療和化療並不能完全清除腫瘤細胞，同時還損傷了免疫系統。殘存的腫瘤細胞(包括轉移腫瘤)往往最終奪取了患者的生命。免疫治療提供了最理想的完全清除殘存腫瘤的方法，但是腫瘤往往因免疫系統的激活不足而逃脫免疫系統的攻擊。免疫系統的激活不足原因在於浸入免疫組織的腫瘤細胞不足，或缺乏足夠強的對浸潤腫瘤的淋巴細胞的活化信號。增加T淋巴細胞對腫瘤的浸潤常常帶來良好的預後。如何增加對腫瘤的免疫力成為清除腫瘤而又不損傷免疫系統的關鍵。
CD4+CD25+T細胞亞群是被證明在器官特異性自身免疫和慢性感染中T細胞應答的一種有效調節物(Sakaguchi，2004；Shevach，2002；Maloy和Powrie，2001；Casares等人，2003；Golgher等人，2002)。近來的研究支持了這樣的觀點，即疫苗誘導的抗腫瘤免疫應答的效用受到CD4+CD25+T細胞的限制(Machiels等人，2001；Sutmuller等人，2001；Steitz等人，2001；Yu等人，2003；Houghton等人，2001；Toes等人，1999)。
因此，存在著對於更好地了解癌症中涉及的免疫應答組分和機制的需要，和對於基於這種了解的其他癌症療法的需要。

發明內容
本發明人已經觀察到CD4+CD25+T細胞在人和鼠科動物的腫瘤內的選擇性聚集。這些細胞在腫瘤發展的後期階段構成了腫瘤浸潤淋巴細胞的大部分。在此，本發明人顯示出，在腫瘤內發現了與CD8+T細胞緊密接觸的CD4+CD25+T細胞，這些T細胞於體內在局部的腫瘤部位抑制了CD8+T細胞的增殖和幹擾素-γ產生。阻斷IL-10和TGF-β的作用可以部分地逆轉由CD4+細胞引起的抑制。此外，腫瘤內的CD4+細胞的局部耗損(depletion)導致根除完全形成的高攻擊性腫瘤，和導致形成長期的抗腫瘤記憶。因此，CD4+CD25+T細胞在腫瘤中保持了這樣的環境，即該環境隱藏了腫瘤細胞的免疫原性。該研究舉例說明了，由T調節細胞引起的抗腫瘤免疫性的抑制主要出現在腫瘤部位，抑制的局部逆轉甚至在腫瘤形成晚期階段也可以是對於完全形成的癌症的有效治療。
本發明的一個方面涉及這樣的方法，其包括通過向受試者施用至少一種耗損調節性T細胞(特別是CD4+T細胞)的第一化合物來耗損患有癌症的受試者中的調節性T細胞(特別是CD4+T細胞)。在大多數的實施方案中，該耗損導致受試者的抗癌症免疫性的激活，和引起導向抗癌症的免疫應答。在本發明的一些實施方案中，受試者可以具有腫瘤，例如但不限於固體腫瘤。耗損的CD4+T細胞可以位於癌症和/或腫瘤的部位。在一些實施方案中，耗損的CD4+T細胞在腫瘤內。在一些實施方案中，耗損的CD4+T細胞在腫瘤的外部。在其他實施方案中，發現耗損的CD4+T細胞位於腫瘤的內部和外部。耗損可以僅僅局限於接近腫瘤和/或在腫瘤中的CD4+T細胞，或者耗損可以是全身性的。「耗損(depletion)」表示在調節性T細胞(特別是CD4+T細胞)的局部化或全身性群體中的任何減少。「耗損」不要求沒有CD4+T細胞保留在受試者中或者在受試者內的一些局部化區域中。此外，「耗損」不要求消滅在受試者的癌症部位內部或接近癌症部位的所有或基本上所有的CD4+T細胞。在本發明的大多數實施方案中，「耗損」要求CD4+T細胞群體的足夠數量的減少，以引起治療效果。
在某些實施方案中，受試者中的CD8+T細胞相對於CD4+T細胞沒有被耗損。在某些實施方案中，CD8+T細胞參與了導向抗癌症的免疫應答。要注意，「受試者中的CD8+T細胞相對於CD4+T細胞沒有被耗損」表示，相對於CD4+T細胞群體來說，CD8+T細胞群體的大小相對於受試者中的CD8+T細胞沒有耗損的情況沒有減少。本發明的一些優選的實施方案將會涉及受試者中的CD8+T細胞群體相對於受試者中的CD4+T細胞群體的富集。
第一化合物可以是任何目前已知或稍後測定用於耗損CD4+T細胞的化合物。在一些實施方案中，第一化合物是抗CD4抗體。抗體可以是抗人CD4的抗體。抗體可以是單克隆抗體。抗體可以是人源化抗體。在另一些實施方案中，第一化合物是抗CD25抗體或者CD4+CD25+的IL-2毒素。IL-2毒素能夠優先耗損CD4+CD25+細胞。
在某些實施方案中，該方法進一步定義為向受試者施用至少一種第二化合物。第二組合物可以是CD8+T細胞的激活劑。CD8+T細胞的激活劑可以是抗體，包括但不局限於單克隆抗體和/或人源化抗體。CD8+T細胞的激活劑可以是編碼激活CD8+T細胞的肽或蛋白質的核酸。例如，激活劑可以是編碼LIGHT的核酸。在某些實施方案中，第二化合物為化療藥物。化療藥物可以是對CD8+T細胞基本上無毒的化療藥物。化療藥物可以是對於CD8+T細胞比對於CD4+T細胞具有更小毒性的化療藥物。第二化合物可以是抗癌疫苗。抗癌疫苗可以是基因疫苗或肽疫苗。第二化合物可以是編碼治療性肽的核酸。在某些實施方案中，第一化合物和第二化合物同時進行遞送。在某些實施方案中，第一化合物和第二化合物在不同的時候進行遞送。第一化合物根據腫瘤的大小可以60μg-600μg抗CD4抗體的劑量進行施用。這樣不會對於全身的CD4細胞產生明顯的影響。
受試者可以是哺乳動物，包括但不局限於人。癌症可以是任何形式的癌症。例如，在一些情況下，癌症是固體癌症，例如但不局限於乳腺癌、卵巢癌、肺癌、頭和頸癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、胃癌、腦癌、黑色素瘤、鼻咽癌、皮膚癌或腎癌。癌症可以是轉移的癌症，例如轉移的乳腺癌。癌症可以是生血細胞的癌症，例如淋巴瘤或白血病。當然，熟練技術人員會理解根據本發明可以治療任何數目的癌症。
本發明的另一個方面涉及癌症的診斷或預後方法，其包括分析受試者中的CD4+T細胞群體。CD4+T細胞可以位於受試者中的腫瘤內。在某些實施方案中，腫瘤內CD4+T調節細胞的升高的水平表明對於受試者的不良預後。在某些實施方案中，該方法進一步包括分析患有癌症的受試者中的CD8+T細胞群體。相對於正常的CD8+T細胞水平，受試者中CD8+T細胞的升高或正常的水平可以是積極的預後指標和/或癌症的診斷。
本發明的另一個方面涉及調節性T細胞耗損劑在製備藥物中的用途，其中所述藥物通過耗損患者(包括動物，哺乳動物，特別是人類)的調節性T細胞而治療或者預防腫瘤(特別是癌症，例如實體癌)。
本發明在另一方面涉及藥物組合物，它包含調節性T細胞耗損劑作為活性成分，所述藥物組合物通過耗損患者(包括動物，哺乳動物，特別是人類)的調節性T細胞而治療或者預防腫瘤(特別是癌症，例如實體癌)。
調節性T細胞耗損劑是任何一種或多種耗損調節性T細胞的化合物、組合物、混合物或者聯合製劑。「耗損」一詞在上文有說明。調節性T細胞耗損劑包括，但不限於，抗調節性T細胞抗體，如人源化的抗-CD4抗體；或者此處公開的、現有技術已知的或將要被發現的耗損調節性T細胞(特別是CD4+T細胞)的任何其它化合物或者一個或者多個這種化合物的組合。
在這些方面，所述調節性T細胞優選是CD4+T細胞，特別是CD4+CD25+T細胞。所述調節性T細胞可以在腫瘤部位處，和/或在腫瘤內，和/或在腫瘤外。所述耗損可以是腫瘤局部的，和/或是全身性的。
在一個實施方案中，所述調節性T細胞耗損劑是調節性T細胞的抗體，特別是抗CD4+抗體，如抗CD4+CD25+抗體；或者，所述調節性T細胞耗損劑是IL2-毒素。所述抗體優選是抗人CD4+抗體。所述抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體。優選地，抗體是人源化抗體。
在一個實施方案中，所述患者的CD8+T細胞不被耗損。優選地，CD8+T細胞參與對腫瘤的免疫應答。
在另一實施方案中，所述藥物還包括其它活性成分，並且所述藥物被配製成適於所述調節性T細胞耗損劑和所述其它活性成分同時給藥或者分開給藥的形式。所述其它活性成分可以是CD8+T細胞的激活劑。所述激活劑的例子是抗體，尤其是單克隆抗體，人源化抗體等。在一個具體實施方案中，所述激活劑是編碼激活CD8+T細胞的多肽的核酸。特別地，所述激活劑是編碼LI GHT的核酸，尤其是編碼突變LIGHT的核酸。
在一個實施方案中，所述其它活性成分是包含並表達編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤(優選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含並表達腫瘤抗原)或者包含腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預防性疫苗。在另一個實施方案中，所述其它活性成分是包含並表達編碼突變LIGHT的核酸的重組病毒(優選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組病毒的藥用組合物。優選地，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI(人類中的EQLI)的突變LIGHT。或者，所述突變LIGHT優選是具有細胞外域胺基酸序列和標籤序列(例如便於純化的標籤)，如具有LIGHT第85-239位的胺基酸序列和flag序列。
在一個實施方案中，所述其它活性成分是化學治療藥物，尤其是對CD8+T細胞沒有實質性毒性的化療藥物，或者對CD8+T細胞的毒性比對CD4+T細胞的毒性小的化療藥物。例如，所述其它活性成分是放療藥物。
在一個實施方案中，所述其它活性成分是抗癌疫苗，例如基因疫苗或者肽疫苗。
在一個實施方案中，所述其它活性成分是治療性多肽或者編碼治療性多肽的核酸。
在一個實施方案中，所述腫瘤是實體癌，例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、頭頸癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、胃癌、腦癌、黑素瘤、食道癌、皮膚癌或者腎癌，特別是乳腺癌，轉移性乳腺癌；或者所述腫瘤是血液癌，例如淋巴瘤或者白血病。
本發明在另一方面還涉及可用於分析患者體內調節性T細胞(特別是CD4+T細胞，特別是CD4+CD25+T細胞)群體的試劑在製備用於癌症診斷或者預後的藥劑或者藥劑盒中的用途。優選地，所述調節性T細胞在患者腫瘤內。此時，特別地，腫瘤內調節性T細胞水平升高表明患者預後不佳。
在一個實施方案中，所述藥劑或者藥劑盒還包含用於分析癌症患者體內CD8+T細胞群體的試劑。在該實施方案中，特別地，相對於CD8+T細胞的正常水平，所述患者體內CD8+T細胞水平升高或者正常水平是癌症的正預後指標和/或診斷。
在另一方面本發明還涉及包含並表達編碼突變LIGHT的核酸cDNA的重組病毒，優選地，該重組病毒是重組腺病毒或者禽痘病毒。優選地，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI(人類中的EQLI)的突變LIGHT。在另一個實施方案中，所述突變LIGHT具有細胞外域胺基酸序列和標籤序列(例如便於純化的標籤)，如具有LIGHT第85-239位的胺基酸序列和flag序列。
在另一方面本發明還涉及包含本發明重組病毒的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預防性疫苗。
在另一方面本發明還涉及本發明病毒或者組合物在製備用於治療癌症的藥物中的用途。
在另一方面，本發明還涉及治療癌症或者破壞腫瘤的方法，包括向癌症患者給予包含並表達編碼突變LIGHT的核酸的重組病毒(優選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組病毒的藥用組合物；或者向癌症患者給予包含並表達編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤(優選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含並表達腫瘤抗原)或者包含這種腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預防性疫苗。在一個優選實施方案中，所述給予是向腫瘤內給予。
在另一方面，本發明還涉及包含並表達編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤，優選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含並表達腫瘤抗原；還涉及包含本發明腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預防性疫苗。
在另一方面，本發明還涉及用於篩選或者測試癌症治療劑的方法，包括通過體內或者體外實驗測試候選物質是否能夠耗損調節性T細胞。
當在權利要求和/或說明書中與術語「含有」結合使用時，使用詞「a」或「an」可以表示「一個」，但是其也是與「一個或多個」、「至少一個」和「一個或多於一個」的含義是一致的。在此處使用的「另一個」可以表示至少第二個或更多個。
可考慮到，在該說明書中所討論的任何實施方案可以就本發明的任何方法或組合物進行實施，反之亦然。此外，本發明的組合物可以用於獲得本發明的方法。
在整個該申請中，術語「大約」用於表明，值包含用於測定該值的設備、方法的固有誤差變化，或者包含在研究受試者中存在的變化。
在權利要求中使用術語「或」是用於表示「和/或」，除非明確地表明只涉及一種選擇，或者兩種選擇是相互排斥的。
在該說明書和權利要求中使用時，詞「含有」、「具有」、「包括」或「包含」是寬泛的或無限制的，它們不排出另外的、未描述的成分或方法步驟。
本發明的其他目標、特徵和優點將會從下面的詳述中清楚地了解到。可是，應當理解，詳述和特殊的實施例雖然指出了本發明的特殊實施方案，但只是為了舉例說明，因為從該詳述中，在本發明的精神和範圍內的各種變化和修飾對於本領域熟練技術人員來說都會是顯而易見的。


下面的附圖形成了本說明書的一部分，包括這些附圖是為了進一步證明本發明的某些方面。通過參考這些附圖中的一幅或多幅並聯合此處給出的特殊實施方案的詳細描述可以更好地理解本發明。
圖1.T細胞浸潤乳腺癌組織。檢查來自20位患者的乳腺癌樣品，並顯示出具有代表性的圖片。原位(a和b)或侵入的(c和d)乳腺癌組織用蘇木精和伊紅(HE)(a和c)或者抗CD4(褐色)和抗CD8(藍色)(b和d)染色。在圖版b和d中的箭頭指明以更高放大倍率顯示的位於右下角的區域。在隨機挑選的高倍視野(×40)中，在10個原位的和10個侵入的乳腺癌組織中計數CD8+細胞和CD4+細胞的數量，並對於每個癌症組織計算CD4+細胞與CD8+細胞的比例。
圖2.CD4+CD25+T細胞在腫瘤內部聚集從而抑制腫瘤的排異。a，強抗原Ld不阻止腫瘤生長。將5×105Ag104和Ag104Ld腫瘤細胞皮下接種至C3B6F1小鼠。檢測腫瘤的生長，並如下計算體積體積＝長×寬×高/2。(b-c)，將106Ag104Ld腫瘤細胞在尾的基部皮下接種至C3B6F1小鼠，並在腫瘤接種之後的7或16天從小鼠中分離出腹股溝LN、脾和腫瘤組織。通過FACS來測定CD4+CD25+T細胞在淋巴細胞中的百分數(b)和CD45RB在CD4+CD25+或CD4+CD25-T細胞上的表達(c)。(d-e)，在腫瘤接種之後的16天，從這些具有腫瘤的小鼠中收集脾和腫瘤組織。通過使用磁性系統的負選擇性小珠法而從脾中富集CD4+T細胞。用磁性系統進一步將來自脾的CD4+CD25-T細胞與CD4+CD25+T細胞分離開。腫瘤浸潤T細胞用生物素化的抗Thy1.2抗體並隨後用抗生物素磁性小珠進行富集。浸潤腫瘤的CD4+T細胞進一步用FACS進行分離，這是在使用PE綴合的抗CD4抗體進行染色之後進行分類。d，從這些純化的CD4+T細胞群體中分離得到總RNA，並對源自RNA的cDNA施行關於foxp-3的實時PCR。e，將96孔平板中每孔5×104個來自未經過試驗的原初小鼠的經純化的CD4+CD25-T細胞用最佳劑量(2μg/ml)的經包被的抗CD3抗體刺激72小時。或者加入5×104個來自具有腫瘤的小鼠的腫瘤組織或脾的CD4+T細胞，以便與純化的CD4+CD25-T細胞共培養，和在培養的最後24小時加入3H，並測量其的摻入。(f)，在腫瘤接種之後14天給予小鼠抗CD25抗體，2天之後收集脾和腫瘤組織，將在CD4或CD8細胞中的CD25+或CD25-細胞的百分數與未經過處理的進行比較。當在體內用抗體耗損CD4+(g)或CD25+(h)細胞時，監測腫瘤的生長。
圖3.CD4+細胞抑制腫瘤浸潤CD8+T細胞的增殖和IFN-γ產生。將106Ag104Ld腫瘤細胞皮下接種至C3B6F1小鼠，並在腫瘤接種之後14天腹膜內(i.p.)注射抗CD4抗體(GK1.5)。在CD4耗損之後1星期從小鼠中分離出脾以及腫瘤組織。通過FACS測定腫瘤組織中CD8+T細胞的百分數(a)。用抗Thy1.2磁性小珠系統富集腫瘤浸潤T細胞(TIL)。脾細胞和純化的TIL在體外用PMA和離子黴素於布雷菲爾德菌素A的存在下刺激4小時。通過FACS測定腫瘤中總CD8+T細胞之中的產生IFN-γ的CD8+T細胞百分數。將106MC57-SIY腫瘤細胞在多個位點皮下注射至處於Rag-1-/-背景的2C TCR轉基因小鼠，以激活2CT細胞。在激活之後96小時分離2C T細胞，其具有CD62L1o℃D44high表型。將CFSE標記的激活的2C T細胞以寄養的方式轉移至這些具有Ag104Ld腫瘤的經過或未經過CD4耗損的小鼠中。在轉移2C T細胞之後2天從小鼠中收集腫瘤組織。通過FACS監測CFSE標記的2C T細胞的增殖。
圖4.CD4+細胞保持腫瘤內部的抗炎環境。(a-b)，在腫瘤接種之間1天，通過用抗CD4抗體腹膜內(i.p.)處理小鼠來耗損CD4+細胞。將106Ag104Ld腫瘤細胞皮下接種至C3B6F1小鼠，在腫瘤接種之後2星期從小鼠中收集脾(a)以及腫瘤組織(b)並勻漿。將碎片旋轉沉澱，收集上清液並對其施用細胞計量小珠陣列試劑盒(CBA)。c，將105Ag104Ld腫瘤細胞皮下接種至C3B6F1小鼠，並在腫瘤接種之前1天和之後7天將100μg阻斷性抗IL-10受體(IL-10R)抗體注射給小鼠。聯合抗IL-10R處理，在腫瘤接種之後7天，將100μg LPS或100μg對抗性抗CD40抗體以腹膜內(i.p.)方式給予小鼠。d，將105Ag104Ld腫瘤細胞皮下接種至C3B6F1小鼠，並在腫瘤接種之前1天和之後7天將抗CD4抗體或250μg抗TGF-β抗體注射給小鼠。監測腫瘤的生長。
圖5.CD4+細胞的腫瘤內耗損導致形成的腫瘤的排異。將105Ag104Ld腫瘤細胞皮下接種至C3B6F1小鼠，並在腫瘤接種之後14天以腫瘤內的方式注射12.5μg抗CD4抗體(GK1.5)。在CD4耗損之後2天，從小鼠中分離出脾以及腫瘤組織。通過FACS測定脾或腫瘤組織中淋巴細胞之中的CD4+T細胞的百分數(a)。監測腫瘤的生長(b)。
具體實施例方式
本發明在某些實施方案中提供了包括耗損CD4+T細胞在內的對於癌症的治療。某些實施方案中，抗CD4抗體如人源化抗CD4抗體可以用於在腫瘤的部位耗損CD4+T細胞，因此使得CD8+T細胞能夠更有效地識別和破壞腫瘤。
人源化抗體本發明的某些實施方案旨在抗體的使用，包括抗CD4抗體。涉及製備單克隆和多克隆抗體，包括製備人源化抗體的方法在本領域中是眾所周知的(Smith等人，2004；Hinoda等人，2004)。用於製備人源化抗體的方法包括涉及免疫由於基因改變(例如轉基因整合入至少一個導致產生人源化抗體的基因)而產生人源化抗體的動物的方法。
此處使用的「人源化」定義為這樣的化合物，即當注射入人體中時，不會產生導向抗該化合物的治療上顯著的免疫應答。例如，當注射入人體中時，人源化抗CD4抗體可以產生抗CD4+T細胞的顯著的免疫應答；可是，在人體中沒有產生抗該人源化抗CD4抗體的治療上顯著的免疫應答。
用於產生多克隆抗體的方法在本領域中是眾所周知的。多克隆抗體可以通過多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射希望對於其產生抗體的目標和佐劑而在動物中形成。在一些情況下，將目標或目標胺基酸序列的片段與在該待免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(例如，使用雙官能或衍生化試劑如馬來醯亞胺基苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯、N-羥基琥珀醯亞胺、glytaraldehyde或琥珀酸酐的匙孔血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)綴合是有用的。然後，可以將動物產生的導向抗目標的抗體隨後進行純化，並用於治療。
用於產生單克隆抗體的方法在本領域中也是眾所周知的。從基本上均一的抗體的群體中獲得單克隆抗體，即包含該群體的抗體是同一的，除了可以較小數量存在的可能天然出現的突變。因此，修飾語「單克隆」表明了抗體的特徵不是無聯繫的抗體的混合物。用於製備單克隆抗體的方法通常包括使用雜交瘤細胞。
其他類型的抗體也可以用於本發明。例如，可以在本發明的某些實施方案中使用雙特異性抗體，其對於至少兩種不同的抗原具有結合特異性，和/或雜綴合抗體，其由兩個共價結合的抗體組成。
藥物組合物本發明藥物組合物含有有效量的一種或多種耗損CD4+T細胞的化合物(例如，人源化的抗-CD4抗體；或者此處公開的、現有技術已知的或將要被發現的耗損CD4+細胞的任何其它化合物)或溶解或分散於藥物可接受的載體中的額外物質。術語「藥物或藥理可接受的」是指當施用於動物(如果合適，例如為人類)時，不產生不利的、過敏的或其它不想要的反應的分子實體和組合物。根據本發明的公開內容以及Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.MackPrinting Company，1990(此處引用作為參考)的說明，本領域普通技術人員知道如何製備含有至少一種耗損CD4+T細胞的化合物或額外活性成分的藥物組合物。而且，對於動物(例如人類)施用來說，應理解該製劑應該滿足FDA的生物學標準所要求的無菌性、熱原性、總體安全性和純度標準。
如此處所用，″藥物可接受的載體″是指本領域普通技術人員所知的任何和所有溶劑、分散介質、包衣劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延緩試劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩定劑、凝膠、結合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、類似物質及其組合(參見，例如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990，pp.1289-1329，此處引用作為參考)。除非傳統載體與活性組分不相容，否則它們都可以用於所述藥物組合物中。
耗損CD4+T細胞的化合物可以含有不同類型的載體，這取決於它是以固體、液體還是氣霧劑的形式施用以及它是否需要滅菌以適用於注射之類的施用途徑。本發明組合物可以如本領域普通技術人員所知的經靜脈內、皮內、透皮、鞘內、動脈內、腹膜內、鼻內、直腸內、表皮(topical)、肌內、皮下、黏膜地、口服、表皮地、局部地、吸入(例如氣霧劑吸入)、注射、輸注、連續輸注等方式施用，或直接、經導管、經灌洗器而局部灌注擴散於靶細胞，或以霜劑、液體組合物(例如脂質體)或其它方式或上述的任何組合來施用。參見，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack PrintingCompany，1990，此處引用作為參考)。
用於癌症的組合療法為了增強耗損CD4+T細胞的化合物(例如人源化的抗-CD4抗體)的效能，理想的是將本發明的這些組合物和方法與有效治療過度增生性疾病的物質(例如抗癌試劑)聯用。「抗癌」試劑能對受試者中的癌產生負影響，例如，通過殺死一種或多種癌細胞、在一種或多種癌細胞中誘導細胞凋亡、降低一種或多種癌細胞的生長速率、降低轉移的發生率或數目、減少腫瘤大小、抑制腫瘤生長、減少對腫瘤或一種或多種癌細胞的血液供應、提高對一種或多種癌細胞或腫瘤的免疫應答、防止或抑制腫瘤的發展、或者增加癌症患者的壽命。抗癌試劑包括，例如，化療試劑(化學療法)、放療試劑(放射療法)、手術方法(手術)、免疫治療試劑(免疫療法)、遺傳治療試劑(基因療法)、激素療法、其它生物試劑(生物療法)和/或替代性療法。
更一般地說，這樣的試劑將與耗損CD4+T細胞的化合物一起以有效殺死癌細胞或抑制其增殖的組合量提供。這樣的方法可以包括將細胞與試劑和耗損CD4+T細胞的化合物同時接觸，或者在一個時間段內接觸，其中將耗損CD4+T細胞的化合物與試劑分開施用給細胞、組織或生物產生了所需的治療效果。這也可以通過下述方式實現將細胞、組織或生物與同時含有耗損CD4+T細胞的化合物和一種或多種試劑的單一組合物或藥物製劑接觸，或者將細胞與兩種或多種不同的組合物或製劑接觸，其中一種組合物包含耗損CD4+T細胞的化合物，而另一種組合物包含一種或多種試劑。
當用於細胞、組織或生物時，術語「接觸」和「暴露」在此處是指這樣一種過程，藉助於該過程，耗損CD4+T細胞的化合物和/或其它試劑(例如化療試劑或放療試劑)的治療構建物被遞送於靶細胞，或被直接並列置於所述靶細胞、組織或生物中。為了殺死細胞或使細胞靜息，耗損CD4+T細胞的化合物和/或額外試劑以有效殺死所述細胞或防止它們分裂的組合量遞送給一種或多種細胞。
耗損CD4+T細胞的化合物可以在其它試劑之前、與其同時和/或在其之後施用，其間的時間間隔為數分鐘至數星期。在一些實施方案中，耗損CD4+T細胞的化合物與其它試劑分開施用於細胞、組織或生物，在這樣的實施方案中，通常應該保證每次遞送之間的時間間隔不應太長，從而使得耗損CD4+T細胞的化合物和試劑仍能對所述細胞、組織或生物施加有利的組合效果。例如，在這樣的情況下，設想可以將兩個、三個、四個或更多特徵(modality)和耗損CD4+T細胞的化合物幾乎同時(即少於大約1分鐘)與所述細胞、組織或生物接觸。在其它方面，一種或多種試劑可以和耗損CD4+T細胞的化合物幾乎同時施用，或在施用耗損CD4+T細胞的化合物之前和/或之後大約1分鐘、大約5分鐘、大約10分鐘、大約20分鐘、大約30分鐘、大約45分鐘、大約60分鐘、大約2小時、大約3小時、大約4小時、大約5小時、大約6小時、大約7小時、大約8小時、大約9小時、大約10小時、大約11小時、大約12小時、大約13小時、大約14小時、大約15小時、大約16小時、大約17小時、大約18小時、大約19小時、大約20小時、大約21小時、大約22小時、大約22小時、大約23小時、大約24小時、大約25小時、大約26小時、大約27小時、大約28小時、大約29小時、大約30小時、大約31小時、大約32小時、大約33小時、大約34小時、大約35小時、大約36小時、大約37小時、大約38小時、大約39小時、大約40小時、大約41小時、大約42小時、大約43小時、大約44小時、大約45小時、大約46小時、大約47小時、大約48小時、大約1天、大約2天、大約3天、大約4天、大約5天、大約6天、大約7天、大約8天、大約9天、大約10天、大約11天、大約12天、大約13天、大約14天、大約15天、大約16天、大約17天、大約18天、大約19天、大約20天、大約21天、大約1周、大約2周、大約3周、大約4周、大約5周、大約6周、大約7周o r大約8周或更多周之內施用，或在由這些時間所導出的任何時間範圍內施用。
可以使用耗損CD4+T細胞的化合物和一種或多種試劑的不同組合方案。此種組合的非限制性例子如下所示，其中含有耗損CD4+T細胞的化合物的組合物為「A」，試劑為「B」A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/AB/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A含有耗損CD4+T細胞的化合物的組合物向細胞、組織或生物的施用可以遵循施用化療劑的一般方案進行，同時考慮毒性(如果有毒性的話)。預期，如果必要的話，應該重複治療周期。在特定的實施方案中，設想多種額外試劑可以以與本發明的任何組合應用。LIGHT治療以及LIGHT治療與調節性T細胞耗損劑治療的聯合
LIGHT是一個新發現的作用於免疫調節的基因。我們所進行的突變能夠提高其在細胞表面表達的穩定性從而更好地刺激免疫反應。對LIGHT的四個胺基酸的突變阻止了該蛋白質的降解。我們關於採用LIGHT將腫瘤組織轉化為淋巴組織的發明包括了一個新的基因免疫治療的思想和一個新的突變基因。
我們已經明確一種新的對腫瘤的免疫治療方法通過在腫瘤組織中誘發淋巴組織使淋巴細胞能夠直接接觸腫瘤細胞，在腫瘤內部誘導適當的免疫反應從而根除腫瘤。LIGHT是作為基質細胞表達的淋巴毒受體和T細胞表達的HVEM的配合體。通過將突變的LIGHT引入腫瘤組織之中，將誘發出高水平的化學因子和粘附分子，並且伴隨大量的未活化T淋巴細胞的津潤。LIGHT的突變體阻止了蛋白酶對其的降解，使得LIGH能夠在腫瘤細胞的表面完整表達。LIGHT對免疫反應的協同激活活性將對腫瘤特異的T淋巴細胞反應的選擇性激活有極大的幫助，從而有益於清除現存的高進行性的原發腫瘤和其他衍生部位的腫瘤。表達LIGHT的腫瘤細胞可以作為臨床相關的治療性疫苗，可用於根除已存的原發腫瘤。表達LIGHT的腫瘤細胞作為臨床相關的治療性疫苗將在腫瘤內部吸引並活化原始淋巴細胞，從而產生更多的抗腫瘤淋巴細胞用於清除腫瘤。我們的研究已經證明腫瘤壞死因子超家族(TNFSF14)和LIGHT能夠在腫瘤內部的基質細胞和淋巴細胞表面形成受體信號並吸引腫瘤特異性的T細胞。我們發現LIGHT轉化的腫瘤細胞能夠通過協同其兩類受體的新的作用而增強對已存原發腫瘤的免疫清除反應。我們的研究數據表明腫瘤組織表達的LIGHT具有更強的激發對原發進行性腫瘤的清除作用，強於其他細胞因子和協同刺激分子的激發作用(Nature Immunology，Vol.5，No.2，2004年2月，p.141-149)。到目前為止，象LIGHT這樣，有如此雙重的徵召和激活T細胞的效能的分子尚未見有任何其他的報導。這樣的特性使我們能夠開發出一種全新的對腫瘤的免疫治療方法。
在一個優選實施方案中，所述LIGHT是人類LIGHT。在另一個優選實施方案中，LIGHT是突變LIGHT。特別優選的是，所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EQLI(對於人而言)的突變LIGHT。在另一個實施方案中，所述突變LIGHT具有細胞外域胺基酸序列和標籤序列(例如便於純化的標籤)，如具有LIGHT第85-239位的胺基酸序列和flag序列。LIGHT胺基酸序列以及胺基酸殘基編號參見Nature Immunology，Vol.5，No.2，2004年2月，p.141-149。
LIGHT或者突變體LIGHT的給藥優選是通過各種病毒投送系統或表達LIGHT的腫瘤細胞來進行的。具體地，包括向癌症患者給予包含並表達編碼突變LIGHT的核酸的重組病毒(優選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組病毒的藥用組合物；或者向癌症患者給予包含並表達編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤(優選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含並表達腫瘤抗原)或者包含這種腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預防性疫苗。在一個優選實施方案中，所述給予是向腫瘤內給予。特別是，將上述重組病毒或者腫瘤細胞注射到腫瘤原發部位優選的病毒投送系統包括，但不限於，重組的腺病毒和禽痘病毒(fowlpox virus)等其他病毒。在特別優選的實施方案中，突變體LIGHT通過重組的腺病毒和禽痘病毒來給藥。如果原發腫瘤細胞在1-2月內未能被清除，腫瘤將被手術切除或放射照射。我們的前期實驗發現經過LIGHT的治療處理，動物體建立了強烈的腫瘤免疫記憶，能夠清除末梢部位的腫瘤。因而我們預計應該對擴散轉移部位的腫瘤有同樣的清除作用。
使用重組的腺病毒和禽痘病毒來給藥具有特別的優點，例如，效率更高和更安全。由於易於生產而且產量高，重組腺病毒已經廣泛用於人和動物實驗，但是大多數患者可能會有抗腺病毒抗體，它們可能會迅速中和注入的腺病毒。還不清楚腫瘤內注射腺病毒是否會避免這種快速清除。很少有患者在血清中有抗禽痘病毒抗體。因此，這種重組病毒的持續是一個潛在優點。但是，產生高滴度禽痘病毒是困難的。有可能能夠初始使用重組腺病毒、然後用禽痘病毒治療患者，以降低宿主對清除病毒的反應。我們的初步結果顯示，使用帶有重組LIGHT的5×1010病毒顆粒在腫瘤內注射到已建立的Ag104Ld腫瘤中，導致局部和遠處腫瘤的排斥(5/5)，而對照病毒(沒有LIGHT)沒有明顯保護(5隻小鼠中0隻被排斥)。
CD4+CD25+T細胞是調節性T細胞，它們能夠抑制效應T細胞殺滅腫瘤細胞的能力。耗損調節性T細胞特別是CD4+CD25+細胞能夠增強抗腫瘤活性。將在腫瘤內給予LIGHT和耗損調節性T細胞相結合，是一種新的免疫治療的有效治療方法。
升高的CD4+調控性T細胞水平是診斷和預後的指示劑本發明可以用作癌症的診斷和/或預後指示劑，以及癌症預後的指示劑。例如，腫瘤中升高的CD4+T細胞可能表明某些癌症患者的較差的預後。此外，本發明也可以用於確定潛在新治療劑對癌症的功效，並且本發明也可以用於藥物開發。例如，導致癌變腫瘤中CD4+T細胞減少的化合物可能表明該化合物具有作為癌症治療劑的顯著潛力。在其它情況下，使用細胞系的體外測試法可以用於確定化合物對CD4+T細胞的作用。在某些實施方案中，測試化合物對動物或人類腫瘤中CD4+T細胞的減少可能表明改善的功效。此外，本發明也提供了用於確定受試者是否應該接受導致CD4+T細胞減少的治療有效量的藥物的方法。例如，CD4+T細胞數量增加的患者尤其能從導致受試者腫瘤位點CD4+T減少的療法中得到益處。
一旦患者被診斷患有癌症，我們將檢查腫瘤樣品的活體解剖中的調控性CD4+T細胞。如果CD4佔據統治地位，患者將用抗-CD4抗體局部治療。如果非常難以局部注射腫瘤，則可以進行全身性注射。如果滲透性淋巴細胞是有限的，則50ul至100ul ad-LIGHT(1-5×1010vp)將被注射入腫瘤組織，並在3天後使用抗-CD4抗體，以允許在其後的兩周中產生強免疫應答(進行或不進行組合治療)。或者，抗-CD4與抗-CD137或其它CD8刺激物聯合使用。
耗損CD4+T細胞和/或治療癌症的化合物和組合的體外證實本領域普通技術人員得到和體外測試大量化合物或化合物組合，它們能耗損CD4+T細胞、刺激對抗癌症的免疫應答、和/或產生在本發明中有用的任何其它效果。此類測試可以用如以下實施例所述和/或本領域普通技術人員熟知的那些方法來進行。
簡言之，通過用人類CD4肽或蛋白質免疫小鼠可以得到和測試候選化合物體外耗損CD4+T細胞和/或治療癌症的能力。可選擇地，我們從非盈利性機構American Tissue Culture Center獲得了含有抗人類CD4抗體地小鼠雜交瘤。如早前所述，通過用人類免疫球蛋白基因來替換CD4基因可以得到人源化的CD4。另一種選擇是，人源化的抗-CD4抗體可以從一些私人公司獲得。
一旦確定了候選化合物或組合在體外顯示可用於本發明，則通常用下述的體內方法來測試它們。
耗損CD4+T細胞的化合物的體內證實可以獲得並體內測試大量具有如下特徵的化合物或化合物組合耗損CD4+T細胞；刺激對抗癌症的免疫應答；和/或導致任何可用於本發明的其它效果。通常，只有在用如上所述的體外方法顯示某一特定候選物或組合具有希望時，才進行此類體內測試。可以用描述於下面實施例中的和/或本領域普通技術人員已知的那些方法來進行此類測試。
簡而言之，將獲得候選物質，並測試其體內耗損CD4+T細胞和/或治療癌症的能力。
一旦候選化合物或組合在體內顯示可用於本發明，其通常作為下述臨床試驗的主題。
因此，本發明還涉及用於篩選或者測試癌症治療劑的方法，包括通過體內或者體外實驗測試候選物質是否能夠耗損調節性T細胞。
臨床試驗使用體外和體內方法，例如那些此處所述的和/或本領域已知的方法，鑑定有前途的化合物或組合後，此類化合物和組合可以稱為下面所一般描述的臨床試驗的主題。
一旦患者被診斷患有癌症和潛在的轉移，我們將檢查腫瘤樣品的活體解剖中的調控性CD4+T細胞。如果CD4佔據統治地位，患者將用抗CD4抗體局部治療。如果非常難以局部注射腫瘤，甚至難以用放射幹預(指導)，則可以進行全身性注射。如果滲透性淋巴細胞是有限的，則50ul至100ul ad-LIGHT(1-5×1010vp)將被注射入腫瘤組織，並在3天後使用抗CD4抗體，以允許在其後的兩周中產生強免疫應答(進行或不進行組合治療)。或者，抗-CD4與抗-CD137或其它CD8刺激物聯合使用。
發明的有益效果在發明人的實驗中，用突變LIGHT治療導致對腫瘤的免疫力提高500倍。耗損調節性T細胞提供另外的增強效果，這種治療已經顯示對已確立腫瘤非常有效(增加100-500倍)。將在腫瘤內給予LIGHT和耗損調節性T細胞相結合，提供了更好的效果。
實施例引入下面實施例來證明本發明的優選實施方案。本領域普通技術人員將意識到，下面實施例所公開的技術代表本發明人所發現的用於很好實施本發明的技術，因此可以認為它們構成了實施本發明的優選方式。但是，在閱讀本發明公開內容後，本領域普通技術人員也應認識到，可以對所公開的具體實施方案進行許多改變而仍能得到相似的結果，但又不背離本發明的精神和範圍。
實施例1材料和方法小鼠和細胞系。5-8周大小的雌性C3H×B6F1(C3B6F1)和C3H小鼠購自US National Cancer Institute的Frederick CancerResearch Facility，並被飼養於芝加哥大學的不含病原體的特定設備中。根據學院和National Institutes of Health(NIH)的規定對動物進行照料和研究，並經芝加哥大學的動物使用委員會的批准。已經描述了表達鼠H-2Ld(AG104-Ld)的Ag104細胞系(Wang，2001)和Ag104纖維肉瘤(Wick等人，1997)。
組織學和免疫學。用於組織學檢查的人類腫瘤組織於10％緩衝的中性福馬林中固定，石蠟包埋，並使用標準方法用蘇木精和曙紅(HE)染色，或根據製造商的說明用特異於CD4(NovocastraLaboratories，UK)和CD8(DAKO，CA)的單克隆抗體染色。分別通過使用DAB(Sigma-Aldrich，MO)的過氧化物酶技術或使用Vector Blue(Vector，CA)的APAAP技術來揭示抗-CD4或抗-CD8抗體的結合。對於乳腺癌樣本，在一個隨機選取的40倍高被視野中對CD4+和CD8+細胞進行手工計數。
測量脾和腫瘤中的細胞因子。根據描述(Janssen等人，2003)，本發明人製備了腫瘤和脾的勻漿。簡而言之，收集相當數量的腫瘤或脾組織，稱重，並在含有蛋白酶抑制劑的PBS中進行勻漿，通過離心收集上清液。根據製造商的說明，在配有細胞QuestPro和CBA軟體的FACSCaliber血細胞計數器(BD Pharmingen)中使用細胞計數珠陣列試劑盒(CBA)來定量上清液中的細胞因子數量。
流式細胞分析。使用異硫氰酸螢光素(FITC)綴合的、藻紅蛋白(PE)綴合的、Cy-鉻綴合的或生物綴合的針對小鼠CD45RB、CD4、CD8、CD25和I FN的抗體(均來自BD Pharmingen)進行FACS分析。鏈黴親合素-Cy-鉻綴合物來自BD Pharmingen；針對2C TCR的生物素綴合的克隆型抗體(1B2)細胞染色按照所描述的進行(Sun和Bevan，2003)。對於細胞內細胞因子染色，在Brefeldin A(Sigma-Aldrich)的存在下，用PMA(50ng/ml，Sigma-Aldrich)和離子黴素(500ng/ml，Sigma-Aldrich)對純化自腫瘤組織的T細胞再刺激4小時。對於CFSE-標記的2C T細胞的分析，用生物素化的1B2抗體對分離的腫瘤或脾單細胞懸浮液進行染色，洗滌，並用PE偶聯的抗-CD8和CyC偶聯的鏈黴親合素的混合物染色。用FlowJo軟體(BD Pharmingen)分析FACS數據。
細胞分離和體外檢測。為了從腫瘤組織中分離CD4+T細胞，先使小鼠放血以減少血液對腫瘤組織的汙染。收集腫瘤組織，再PBS中洗滌，切成片，並在37℃搖床中重懸於Dulbecco′s改良Eagle′s培養基25分鐘，所述培養基添加了2％胎牛血清和1.5mg/ml膠原酶D(膠原酶D溶液)。25分鐘後收集細胞懸浮液，在膠原酶D溶液中對細胞塊再消化25分鐘直到所有的腫瘤組織分解成單細胞懸浮液。使用AutoMACS系統(Miltenyi Biotech，CA)，用生物素綴合的Thy-1.2抗體接著用抗生物素磁珠從所述單細胞懸浮液中富集腫瘤浸潤型T細胞。用PE綴合的抗-CD4對富集的腫瘤浸潤型T細胞進行染色，並在MoFlo上用FACS分選為CD4+群體。通過AutoMACS系統(Miltenyi Biotech)，使用CD4+T細胞或CD4+CD25+調控性T細胞分離磁珠系統(Miltenyi Biotech)分別從脾單細胞懸浮液中純化CD4+或CD4+CD25-以及CD4+CD25-細胞。對於所有的細胞分離，通常能得到超過90％純度的所需群體。對於T細胞共刺激檢測，發明人用50μl2μg/ml的抗-CD3抗體包被96孔板過夜。接著用PBS洗滌所述板，將6×104個純化的CD4+CD25-T細胞培養於每孔中，其中添加或不添加分離自帶有腫瘤的小鼠的脾或腫瘤組織的6×104個CD4+T細胞。在所有檢測中，於3天培養期的最後24小時向每孔加入1μCi的[3H]胸苷，從而估算T細胞增殖。在TopCount微量板閃爍計數器(Packard，MA)中測量[3H]胸苷的整合。
2C T細胞的適應性轉移。本發明人首先通過將106MC57-SIY個腫瘤細胞皮下接種於B6/Rag-1-/-背景的2C小鼠(2C小鼠)的多個位點來激活2C T細胞(Sun和Bevan，2003)。發明人接著從這些被攻擊的2C小鼠中分離淋巴結細胞和脾細胞，並在腫瘤接種後5天用CD8+T細胞富集試劑盒(Miltenyi Biotec)對CD8+T細胞進行負選擇。當分析時，大部分2C細胞表達CD44高CD62L低表型。按照所描述的(Sun和Bevan，2003)，接著用CFSE對這些2C T細胞進行標記。發明人將3×106個CFSE-標記的T細胞(體積0.2-ml)靜脈內注射於帶有腫瘤的小鼠的眼窩後血管叢(retro-orbital plexus)。轉移後48小時從脾和腫瘤中分離細胞，並進行FACS分析。
體內細胞耗損和細胞因子阻斷。按照標準程序(Sun和Bevan，2003)，使用針對CD4+細胞的mAb GK1.5、針對CD8+細胞的mAb 2.34和針對CD25+細胞的PC61系統性耗損小鼠中的淋巴細胞亞類。用流式細胞術對脾細胞和淋巴結細胞的檢查顯示耗損的CD4+或CD8+亞類佔總淋巴細胞的不到0.5％，其它亞類的水平正常。用溶於50μl PBS的12.5-50μg GK1.5進行了腫瘤內CD4+細胞耗損。為了阻斷IL-10或TGF-β，在腫瘤攻擊前1天以及腫瘤攻擊後7天將100μg抗-IL-10受體或250μg抗-TGF-β抗體經腹膜內(i.p.)注射入小鼠。腫瘤攻擊後7天，將100μg脂多糖(LPS)或/和拮抗性抗-CD40抗體經腹膜內給予小鼠。
實時定量性RT-PCR檢測。按照描述(Shedlock和Shen，2003)，對foxp-3進行實時定量性反轉錄PCR(RT-PCR)檢測。簡而言之，從腫瘤中分離總RNA，使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia，NJ)將5μg總RNA反轉錄成互補。在CepheidSmartCycler實時熱循環儀(Cepheid，CA)上進行實時定量性PCR分析。根據製造商的說明(PE Applied Biosystems，MA)，用含有AmpliTaqGold DNA Polymerase的TaqMan Universal PCR master混合物擴增每一cDNA樣品中的foxp-3和GAPDH。發明人利用比較型CT(擴增曲線和閾值的交點處的閾值循環數目)方法確定了目標基因的濃度，並將數值對內部GAPDH對照進行標準化。用於foxp-3的引物序列為5′-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3′(正向引物)和5′-TTCTCACAACCAGGCCACTTG-3′(反向引物)，用於FOXP-3的探針為5′-ATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTC-3′。
實施例2
耗損CD4+T細胞導致癌腫瘤的破壞在人患者中CD4+T細胞浸潤侵襲性乳腺癌。人類癌症常常具有抗原性，但令人費解的是大多數人類癌症不能誘導排斥，甚至在淋巴細胞顯著浸潤腫瘤組織時也是如此(Rosenberg，1999；Beck-Engeser等，2001)。為了研究浸潤腫瘤的淋巴細胞的狀態和性質，本發明人檢查了幾種人類癌症組織，包括乳腺癌、結腸癌、肺癌和黑素瘤，並觀察到常常存在顯著的浸潤腫瘤的淋巴細胞。為了進一步分析何種類型的T淋巴細胞浸潤腫瘤組織，本發明人用抗-CD4和抗-CD8抗體染色乳腺癌樣本並發現不同程度的CD8+和CD4+T細胞浸潤(圖1a-d)。令人感興趣的是，在本發明人檢查的乳腺癌樣本中，本發明人觀察到在腫瘤進展的早期非常少的CD4+T細胞浸潤乳腺癌組織。然而，隨著腫瘤發展，腫瘤內部的CD4+T細胞群體急劇增加。為了驗證這一觀察結果，本發明人計數了十個早期乳腺癌組織、原位乳腺癌相對於十個晚期侵襲性乳腺癌組織中存在的CD4+和CD8+T細胞的數量，發現CD4+/CD8+T細胞比例急劇增加(圖1e).本發明人還觀察到CD4+T細胞常常與CD8+T細胞緊密接觸(圖1b和d)。考慮到這些癌症的漸進性質，本發明人推測缺少對癌症的免疫排斥可能並非由弱免疫識別引起而是由異常免疫應答引起。
強抗原不阻礙腫瘤生長。由於在研究腫瘤浸潤性CD4+T細胞體內對於人類癌症的基本作用方面存在的局限性，本發明人開發了一種小鼠腫瘤模型，該模型與具有一定CD4+及CD8+T細胞浸潤的人類癌症極為相似。Ag104是一種在C3H小鼠中自發形成的低分化實體瘤，其具有高度的進行性、差的免疫原性並對免疫治療具有抗性(Belkaid等，2002；Wang，2001；Dudley等，2002)。當接種少至104個細胞時，Ag104在C3H和C3B6F1小鼠中均100％生長。導致在免疫活性同基因野生型小鼠體內快速生長的該腫瘤的低免疫原性，可能由腫瘤抗原的弱表達或者不表達所致。為了排除這種解釋，本發明人用編碼Ld抗原(一種強抗原)的基因轉染Ag 104腫瘤細胞系。轉染的腫瘤細胞系體外表達高水平的Ld。出乎意料地，表達Ld的Ag104腫瘤(Ag104Ld)在104低劑量時與親本腫瘤以相似的動力學方式生長(圖2a)。據報導，可以選擇抗原丟失的變體來避免免疫識別(Pardoll，2003)。然而，本發明人發現，分離自帶有腫瘤的小鼠的Ag104Ld腫瘤細胞與注射前的細胞表達相當水平的Ld(數據未顯示)。從該研究，本發明人得出這樣的結論抗原性腫瘤可以在不喪失其腫瘤抗原的情況下進展。因此，由Ag104Ld腫瘤在免疫活性同基因野生型小鼠體內的快速生長指示的該腫瘤的弱免疫原性，不可能由I型MHC的低表達或者抗原的丟失引起。
抗原Ld不阻礙腫瘤生長的一個原因可能是該抗原被免疫系統所忽視並且從未被免疫系統發現。為了檢測此可能性，本發明人在接種Ag104Ld腫瘤後20天通過手術除去該腫瘤，然後在手術後3周用更高劑量的腫瘤細胞再次攻擊小鼠。令人驚奇的是，所有這些小鼠均排斥第二次腫瘤攻擊，而幼稚小鼠卻死於腫瘤負載(表1)。該結果說明，T細胞被Ld抗原致敏，並且在手術除去腫瘤後，這些T細胞能夠發展成記憶細胞並賦予抗第二次腫瘤攻擊的保護作用。本發明人能夠證明，這些記憶T細胞主要是Ld特異性的，因為這些小鼠不能排斥親本腫瘤Ag104(表1)。這些結果提示我們，抗原特異性T細胞確實存在，但是其在帶有腫瘤的小鼠中不能適當地發揮功能。這提出了一種可能性Ag104Ld腫瘤的弱免疫原性可能不是由弱免疫識別引起而是由腫瘤存在時，尤其是腫瘤微環境中的異常免疫應答引起的。
CD4+CD25+T細胞在腫瘤內部聚積。為了研究甚至在免疫原性抗原存在的情況下腫瘤排斥仍然受損的原因，本發明人首先在動物模型中檢查了浸潤腫瘤的淋巴細胞(TIL)。免疫組織化學染色揭示，Ag104Ld腫瘤組織被CD4+和CD8+細胞浸潤，這些細胞以在人類腫瘤組織中看到的相似方式共同定位。觀察到非常少的浸潤腫瘤的DX5+NK或NK T細胞(數據未顯示)。令人驚奇的是，聚積在腫瘤中的淋巴細胞主要由CD4+CD25+T細胞亞群組成(圖2b)。本發明人然後在腫瘤攻擊後第0、7或16天比較了脾、引流淋巴結(draining lymph node，DLN)和腫瘤中CD4+CD25+T細胞佔淋巴細胞的百分數。本發明人發現，隨著時間推移，腫瘤內部的CD4+CD25+T細胞百分數急劇增加，而在脾和DLN中其保持恆定(圖2b)。這些數據表明，在效應部位而不是在淋巴器官中存在增加百分數的CD4+CD25+T細胞。這些CD4+CD25+T細胞是CD45RBlow表型的(FIG.2c)，這與對CD4+CD25+調節性T細胞的觀察結果一致(Golgher等，2002)。FOXP3是對小鼠CD4+CD25+調節性T細胞分化和功能關鍵的forkhead/winged螺旋轉錄因子基因(Wang等，2002；van Elsas等，2001；Dieckmann等，2001)。實時聚合酶鏈式反應(PCR)證明，與從帶有腫瘤的小鼠的脾臟分離的CD4+T細胞或者從幼稚小鼠的脾臟分離的CD4+CD25-T細胞相比，從該腫瘤分離的CD4+T細胞中FOXP3 mRNA的表達強得多(FIG.2d)。這些觀察結果提出了這種可能性，即在腫瘤發展過程中，積累構成效應部位70％CD4+T細胞的CD4+CD25+細胞抑制局部免疫應當。本發明人推測，癌症免疫原性差可能是由於在腫瘤環境中積累的CD4+CD25+T細胞產生的免疫調節機制引起的。
CD4+CD25+T細胞抑制抗癌免疫。為了檢查腫瘤浸潤CD4+CD25+T細胞是否抑制體外T細胞應答，本發明人從已經在C3B6F1小鼠中建立20天的腫瘤組織分離CD4+T細胞，並在最佳劑量平板結合的刺激性抗CD3抗體(2μg/ml)存在的情況下將它們與從幼稚C3B6F1小鼠獲得的純化CD4+CD25-T細胞共培養。發明人發現，這些腫瘤浸潤CD4+T細胞的確顯著抑制通過3H摻入測量的CD4+CD25-T細胞的增殖，而從帶有腫瘤的小鼠的脾臟分離的CD4+T細胞不產生這種抑制(FIG.2e)。因為CD4+和CD8+細胞能夠在T細胞活化的早期表達CD25，所以產生了在體內耗損CD25+細胞是否會消除將被激活的CD8+T細胞的疑問。但是，發明人觀察到，在腫瘤攻擊後的2周，在脾臟和腫瘤中大部分CD8+T細胞是CD25-(FIG.2f)。耗損CD25+細胞沒有減小CD8+群體，因為僅僅很少的CD8+細胞表達CD25(FIG.2f)。在腫瘤環境內部，優先積累的CD4+CD25+細胞和CD8+細胞都沒有表達CD25。為了直接研究CD4+T細胞在體內腫瘤免疫中的根本作用，發明人耗損了CD4+細胞，然後觀察腫瘤生長。驚奇地發現，當CD4+細胞被耗損時，高度血管化和低免疫原性的Ag104Ld腫瘤被迅速排斥(FIG.2g andTable 2)。CD4+細胞耗損產生的腫瘤排斥是CD8+細胞依賴性的，因為腫瘤在沒有CD4+細胞、也沒有CD8+細胞時不受控制地生長(Table2)。NK1.1+NK and NKT細胞的耗損不引起腫瘤排斥(Table 2)。為了證實表達CD25的CD4+T細胞亞群導致了體內抗腫瘤免疫的抑制，發明人用抗CD25抗體處理帶腫瘤的小鼠兩周。在腫瘤攻擊後14天用該抗體耗損CD25+細胞顯著地抑制腫瘤的生長(FIG.2h)。這些數據表明，在抗腫瘤免疫應答的後期，主要是CD25+T細胞起抑制作用。
即使在不存在抗原Ld的情況下，耗損CD4+細胞也允許50％小鼠完全排斥親本Ag104腫瘤(表1)，而且剩下的50％小鼠延遲了腫瘤生長動力學(數據未顯示)。這些觀察結果提示，一旦解除CD4介導的抑制，其它腫瘤抗原也可能誘導抗腫瘤免疫。為了測試排斥是否導致針對其它腫瘤抗原的保護性免疫，首先接種Ag104Ldtumor細胞，14天後耗損CD4+細胞。耗損CD4+細胞引起的腫瘤排斥不僅針對Ag104Ldtumor細胞的後來攻擊產生保護作用，而且針對Ag104tumor細胞的後來攻擊產生保護作用(表1)。這些數據表明，抑制性CD4+細胞的去除使得擴大的CD8+細胞群體參與保護性免疫。
調節性T細胞在效應期抑制CD8+T 細胞。為了測試CD4+細胞是否在致敏期或效應期抑制CD8+T細胞應答，本發明人在腫瘤攻擊前3天或腫瘤攻擊後20天耗損CD4+細胞。對外周血的FACS分析證實，每一處理均在頭20天或腫瘤攻擊後20-40天消除CD4+細胞。將CD4耗損限制在頭20天，或者換言之，在腫瘤生長的致敏期，導致延遲的但進行性的腫瘤發育(表2)。在效應期，即腫瘤攻擊後20天——建立的腫瘤達到500mm3以上平均大小時進行CD4耗損，導致完全的腫瘤排斥(表2)。在腫瘤進展的整個持續期耗損CD4+細胞時，也觀察到排斥(表2)。在腫瘤攻擊前3天和腫瘤攻擊後10天注射抗-CD4抗體。本發明人必需看到可能導致此類大體積、充分血管化的高度進行性腫瘤完全被破壞的任何其它處理。這些數據提示，在免疫應答晚期而不是在早期缺少CD4+細胞對於增強CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫更為關鍵。
如上述，CD4耗損介導的腫瘤排斥依賴於CD8+T細胞，這提示在腫瘤內部CD4+細胞可能抑制CD8+細胞。本發明仍接著檢查了CD4+細胞如何抑制CD8+T細胞的功能。首先，發明人在CD4+耗損後檢測到腫瘤內CD8+T細胞急劇增加(圖3a)並且檢測到CD8+T細胞產生增加的IFN-γ(圖3b)。這提示，CD4+細胞可以抑制應答腫瘤的CD8+細胞的擴增。為了檢測這一假說，本發明人將CFSE標記的2C T細胞過繼轉移至帶有Ag104Ld的C3B6F1小鼠中，其中所述2C T細胞在2C/Rag-1-/-小鼠中通過MC57-SIY腫瘤細胞(Sun和Bevasn，2003)激活。2C T細胞來源於T細胞受體(TCR)轉基因2C小鼠，其可以直接識別Ag104Ld上的Ld抗原。這些轉移的效應2C T細胞表達高水平的CD44並下調CD62L的表達(數據未顯示)。在CD4+T細胞耗損前，僅有少數的CFSE標記的效應2C細胞存在於腫瘤中，但在耗損後，觀察到該效應細胞的數量和百分比急劇增加(圖3c)。更重要的是，這些2C T細胞主要在CD4+T細胞耗損後於效應部位發生增殖，這提示抑制作用主要存在於局部腫瘤部位(圖3c)。因此，這些CD4+細胞在腫瘤部位抑制了CD8+T細胞增殖、成熟和擴張。
IL-10和TGF-β參與體內的抑制機制。為了研究CD4+細胞抑制抗腫瘤免疫的機制，本發明人比較了CD4+細胞耗損前後脾和腫瘤中的細胞因子水平。在脾中，在存在CD4+細胞時或不存在CD4+細胞時進行檢測，細胞因子水平沒有顯著差異(圖4a)。Th2細胞因子，IL-4和IL-5，在存在或缺少CD4+T細胞時於腫瘤部位沒有表現出顯著差異(圖4b)。然後，缺少CD4+T細胞時，腫瘤組織中的炎性細胞因子(包括IFN-γ，TNF，IL-6和MCP-1)相較於存在CD4+細胞時的水平急劇增加。在耗損CD4+細胞後，抗炎性細胞因子IL-10的水平也低的多(圖4b)。這些結果提示，CD4+細胞維持了抑制抗腫瘤免疫的抗炎性環境。
本發明人推測如果阻斷抗炎性細胞因子的作用可能促進抗腫瘤免疫。事實上，在本發明人用抗-IL-10受體(IL-10R)抗體處理小鼠後，腫瘤生長被急劇抑制(圖4c)。用抗IL-10R抗體聯合炎性信號(如LPS)或抗-CD40抗體激動劑處理小鼠時，腫瘤生長進一步收到抑制(圖4c)。TGF-β是可以抑制炎性反應的另一種細胞因子。為了在模型中研究TGF-β在介導抗腫瘤免疫方面的作用，本發明人在用Ag104Ld腫瘤細胞進行攻擊時阻斷了TGF-β。TGF-β阻斷後腫瘤被完全排斥(圖4d)。這些結果說明，腫瘤內的抗炎性環境在防止腫瘤排斥方面是關鍵的。CD4+細胞表現出可以活躍地維持此抗炎性環境以抑制抗腫瘤免疫，由此促進抗原性腫瘤生長。
在效應部位耗損CD4+CD25+T細胞可以根除已經建立的腫瘤。由於CD4+CD25+T細胞是腫瘤發展期間腫瘤內的主要CD4+T細胞群體，故本發明人提出在腫瘤部位耗損CD4+細胞將足以實現腫瘤排斥。在帶有腫瘤的宿主中在腫瘤部分使用少量的抗CD4抗體選擇性地耗損CD4+細胞，可以有效地逆轉CD8+細胞對腫瘤的免疫耐受，並同時保持淋巴組織中有正常數量的CD4+細胞。為了確保在腫瘤建立後於效應部位耗損CD4+抑制性細胞可以促進抗腫瘤免疫，本發明人使用了低劑量的抗CD4抗體(10-15μg)進行腫瘤內注射以保證在腫瘤內而不是系統性地耗損CD4+T細胞(圖5a)。本發明人發現，接種腫瘤後14天於腫瘤內耗損CD4+細胞快速地導致對充分建立的腫瘤的完全排斥作用(圖5b)。此結果證實，腫瘤內CD4+抑制性細胞的耗損足以導致對已經建立的腫瘤的排斥作用，並提示抗腫瘤CD8+T細胞的有效抑制作用主要發生在效應部位並且是可以逆轉的。重要的是，局部處理可以成為可負擔的有效腫瘤免疫治療處理方法。
對弱腫瘤抗原的不良免疫應答常常被認為是免疫活性宿主中腫瘤進行性生長的基礎，並被推測為成功免疫治療的主要障礙。在本研究中，本發明人將強Ld同種抗原引入小鼠Ag104纖維肉瘤細胞系中，該細胞系是一種可以在數周內殺死宿主的、高度進行性、侵襲性和血管化的腫瘤。然而，存在強抗原未能引起抗腫瘤免疫應答以阻止或延遲腫瘤生長。在人和動物癌症中一般可以觀察到淋巴細胞浸潤(Gilboa，1999；Clark等，1989；Clemente等，1996)，但是很少觀察到對癌症的免疫排斥。在具有明顯T細胞浸潤的情況下，宿主不能根除腫瘤是一個一直未得以充分理解的令人困惑的現象。在動物模型中對TIL的更近觀察揭示，CD4+亞群CD4+CD25+T細胞選擇性地聚積在腫瘤內並包括了所有TIL的大多數。本發明人還證實，在腫瘤進展過程中，CD4+CD25+T細胞主要在腫瘤內介導抑制性環境並廢除CD8+T細胞的效應功能。局部腫瘤內耗損這些調節性T細胞使得腫瘤的免疫原性被暴露出來並逆轉CTL耐受性，導致對已經充分建立的腫瘤的快速排斥作用。更重要的是，在本研究中，本發明人闡明了，T調節性細胞可以是一種重要的局部因子，其可以抑制針對強腫瘤抗原的免疫應答，導致癌症在免疫活性宿主中進行性生長。
對CD4+T細胞在腫瘤免疫中的作用已經進行廣泛研究(Liyanage等，2002)。研究表明CD4+T細胞在促進CD8+T細胞應答(Woo等，2001；Woo等，2002；Wang等，2004)和發展CD8T細胞記憶(Yu等，2004；Ward等，1989；Shedlock and Shen，2003)中具有重要作用。在抗腫瘤免疫中，CD4+T細胞被證明對於維持過繼轉移CD8+T細胞的功能是重要的(Sun and Bevan，2003；Dudley等，2002；Wang等，2002)。在小鼠中耗損CD4+細胞顯著削弱粒細胞/巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF)疫苗/抗-CTLA4處理保護動物不被後續腫瘤攻擊的能力(vanElsas等，2001)。另一方面。最近的研究強烈支持這樣的觀點，即，CD4+細胞中的群體，CD4+CD25+T細胞，顯著限制疫苗誘導的抗腫瘤免疫應答，並且在腫瘤攻擊之前抑制或者消除它們能夠顯著增強腫瘤免疫治療(Machiels等，2001；Sutmuller等，2001；Steitz等，2001；Yu等，2003；Houghton等，2001)。例如，在一項研究中，當動物在腫瘤攻擊之前用anti-CD25抗體處理時，GM-CSF轉導的腫瘤疫苗與anti-CTLA4的結合更有效地消除已經建立的腫瘤。(Yu等，2003)。儘管這些研究表明調節性T細胞能夠抑制CD8+T細胞的初始致敏，但仍然普遍關注的是，在帶有腫瘤的宿主中耗損CD4+CD25+T細胞可能會無意中消除了CD4+T細胞的輔助功能，CD4+T細胞在被腫瘤或者免疫接種活化之後也能表達CD25+標誌。本發明人提出，CD4+細胞在初始階段主要起到增強性輔助細胞作用，但是一旦腫瘤變為長期持久和確立的腫瘤，CD4+T調節細胞積累增加，抑制CD8+細胞的功能並遮蔽腫瘤的免疫原性。的確，該研究已經證明，調節性T細胞可更大程度地參與效應期(effector phase)，主要在局部腫瘤位點，通過直接抑制腫瘤浸潤性CD8+效應細胞(effector細胞)來實現。在腫瘤部位耗損這些調節性T細胞高效地逆轉了CTL耐受化(tolerization)，導致已確立腫瘤的快速排斥。因此，該研究證明，CD4+CD25+T細胞對於抗腫瘤免疫(主要是CD8+T細胞應答)的抑制主要在腫瘤部位在效應期發生，在腫瘤發展後期耗損T調節性細胞不會減弱可能的T輔助細胞功能。事實上，耗損T調節性細胞揭露了腫瘤細胞的免疫原性，並且，對於甚至缺乏強抗原Ld的親本腫瘤細胞的再次攻擊提供長期保護。該結果提示，免疫的誘導不是僅僅針對Ld，相反，調節性T細胞的耗損揭露了對以前沒有免疫原性的腫瘤抗原的免疫，擴充了具有腫瘤反應性的CD8+T細胞集合(repertoire)。親本Ag104(無Ld)腫瘤系(高度進行性的，沒有免疫原性抗原)不能對傳統免疫治療產生反應，卻在耗損調節性T細胞後顯示了增強的免疫原性，導致腫瘤排斥或者延遲的腫瘤發展。可以想到，通過耗損CD4+細胞局部誘導的這種強抗腫瘤免疫可能會導致遠處腫瘤的排斥。
腫瘤微環境可能允許在腫瘤發展以後激活或者擴增調節性T細胞。本發明人推測，在腫瘤組織內部的慢性發炎可能與慢性自身免疫發炎或者持久感染過程中對正常組織的保護性免疫的一些方面類似，後者允許積累CD4+CD25+T細胞亞群以下調免疫應答，限制局部炎症和減輕局部組織破壞(Sakaguchi，2004；Shevach，2002；Maloy andPowrie，2001；Casares等，2003；Golgher等，2002)。此外，腫瘤介導的抑制性因子相對於效應T細胞而言可能有利於調節性T細胞的生存。結果，設計用來在正常組織中防止失控的炎性應答的同樣的調節機制有可能抑制抗腫瘤免疫。在各種腫瘤組織中找到含有CD4+CD25+群體的腫瘤浸潤T細胞是不罕見的(Dieckmann等，2001；Liyanage等，2002；Woo等，2001；Woo等，2002；Wang等，2004)。通過表面標誌和細胞因子譜來更好地表徵從腫瘤組織分離的CD4+T細胞的性質將是有益的。
對於確定腫瘤內部免疫應答的結果，理解T效應細胞與T調節性細胞的平衡可能更重要。最近的研究證明，在腫瘤內部迅速募集幼稚淋巴細胞和擴充CD8+T細胞可能是一種建立主要是促炎性環境、導致排斥當地和遠處腫瘤的方法(Janssen等，2003)。現在，本發明人進一步在本研究中證明，耗損調節性T細胞是另一種將腫瘤內部抗炎環境轉化為促炎環境的有效方法。局部治療以消除調節性T細胞與全身性治療相比具有三個優點第一，它需要非常低劑量的抗體，因此，該治療在臨床上的費用是可負擔的，即使對於發展中國家；第二，它避免了全身耗損所有CD4+T細胞所誘導的副作用，而全身耗損所有CD4+T細胞可能會消除T輔助細胞介導的針對病原體的保護性免疫；第三，它不會妨礙在淋巴組織中輔助CD4+T細胞對CD8+T細胞的有效致敏，因為所述耗損是局部的。因此，腫瘤環境中調節性T細胞是一種引人注目的靶標，它們的耗損可能會導致當前免疫治療方法的改進。快速擴充腫瘤部位的效應細胞、同時局部耗損調節性細胞的聯合治療可能提供一種增強抗腫瘤免疫和對癌症患者產生臨床上有利的結果的有效策略。
* * *基於本文公開的內容，本文公開和要求保護的所有組合物和方法都能夠不需要過度實驗而製備和實施。儘管本發明的組合物和方法已經通過優選的實施方案進行了說明，但是對本領域技術人員顯而易見的是，本發明組合物和方法以及該方法的步驟和步驟順序可以進行改動，而不背離本發明的概念、精神和範圍。更具體的是，很明顯，可以用化學和生理學相關的某些試劑替代本文公開的試劑，同時實現相同或者類似的結果。所有這些本領域技術人員明顯的替代和修改都被認為包括在權利要求書限定的本發明精神、範圍和概念之內。
表1 CD4耗損誘導針對Ld以外的抗原的免疫應答。

a所示腫瘤細胞數被皮下注射到C3B6F1小鼠中。在手術去除或者經抗CD4抗體處理排斥第一次腫瘤後30天，進行再次攻擊。
b在第一次腫瘤攻擊後21天手術去除腫瘤。
c在第一次腫瘤攻擊後第14天用抗CD4抗體耗損CD4+細胞。耗損通過用FACS檢查外周血來證實。
表2 通過清除CD4+細胞增加腫瘤排斥

a所示腫瘤細胞數被皮下注射到C3B6F1小鼠中。
b從一個獨立實驗獲得的或者從兩個獨立實驗綜合的結果。
c在腫瘤攻擊之前3天和之後7天用抗CD4抗體耗損CD4+細胞。
d在腫瘤攻擊之前3天和之後7天用抗CD4抗體耗損CD4+細胞。在腫瘤攻擊後14天用抗CD8抗體耗損CD8+細胞。
e在腫瘤攻擊前3天用anti-asialo GM-1抗體耗損NK細胞。
f在腫瘤攻擊之前3天或之後7天用抗NK1.1抗體耗損NK和NKT細胞。
各種細胞群的耗損通過用FACS檢查外周血來證實。
表3 CD4+細胞引起的抑制是在效應期(effector phase)而不是在致敏期(priming phase)

a所示腫瘤細胞數被皮下注射到C3B6F1小鼠中。
b假定腫瘤攻擊是在第0天。
CD4+細胞用抗CD4抗體耗損。CD4+細胞不存在的天通過用FACS檢查外周血來證實。
c結果從多個獨立實驗總結而來。
d平均腫瘤大小達到500mm3以上。
參考文獻以下參考文獻併入本文作為參考，它們補充、解釋或者教導了這裡使用的方法、技術和/或組合物，或者提供了為這些方法、技術和/或組合物提供了背景。
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權利要求
1.調節性T細胞耗損劑在製備藥物中的用途，其中所述藥物通過耗損患者(包括動物，哺乳動物，特別是人類)的調節性T細胞而治療或者預防腫瘤(特別是癌症，例如實體癌)。
2.權利要求1的用途，其中所述調節性T細胞是CD4+T細胞，特別是CD4+CD25+T細胞。
3.權利要求1-2之一的用途，其中所述調節性T細胞在腫瘤部位處，和/或在腫瘤內，和/或在腫瘤外。
4.權利要求1-3之一的用途，其中所述耗損是腫瘤局部的，和/或是全身性的。
5.權利要求1-4之一的用途，其中所述調節性T細胞耗損劑是調節性T細胞的抗體，特別是抗CD4+抗體，如抗CD4+CD25+抗體；或者，所述調節性T細胞耗損劑是IL2-毒素。
6.權利要求5的用途，其中所述抗體是抗人CD4抗體。
7.權利要求5的用途，其中所述抗體是單克隆抗體或者多克隆抗體。
8.權利要求5的用途，其中所述抗體是人源化抗體。
9.權利要求1-8之一的用途，其中所述患者的CD8+T細胞不被耗損。
10.權利要求1-9之一的用途，其中CD8+T細胞參與對腫瘤的免疫應答。
11.權利要求1-10之一的用途，其中所述藥物還包括其它活性成分，並且所述藥物被配製成適於所述調節性T細胞耗損劑和所述其它活性成分同時給藥或者分開給藥的形式。
12.權利要求11的用途，其中所述其它活性成分是CD8+T細胞的激活劑。
13.權利要求12的用途，其中所述激活劑是抗體，尤其是單克隆抗體，人源化抗體等。
14.權利要求12的用途，其中所述激活劑是編碼激活CD8+T細胞的多肽的核酸。
15.權利要求14的用途，其中所述激活劑是編碼LIGHT的核酸。
16.權利要求14的用途，其中所述激活劑是編碼突變LIGHT的核酸。
17.權利要求11的用途，其中所述其它活性成分是包含並表達編碼突變LIGHT的核酸的腫瘤細胞或者腫瘤(優選地，該腫瘤細胞或者腫瘤還包含並表達腫瘤抗原)或者包含腫瘤細胞或者腫瘤的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預防性疫苗。
18.權利要求11的用途，其中所述其它活性成分是包含並表達編碼突變LIGHT的核酸的重組病毒(優選重組腺病毒或者禽痘病毒)或者包含這種重組病毒的藥用組合物。
19.權利要求16-18任一項的用途，其中所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI的突變LIGHT。
20.權利要求16-18任一項的用途，其中所述突變LIGHT具有細胞外域胺基酸序列和標籤序列(例如便於純化的標籤)，如具有LIGHT第85-239位的胺基酸序列和flag序列。
21.權利要求11的用途，其中所述其它活性成分是化學治療藥物，尤其是對CD8+T細胞沒有實質性毒性的化療藥物，或者對CD8+T細胞的毒性比對CD4+T細胞的毒性小的化療藥物。
22.權利要求11的用途，其中所述其它活性成分是放療藥物。
23.權利要求11的用途，其中所述其它活性成分是抗癌疫苗，例如基因疫苗或者肽疫苗。
24.權利要求11的用途，其中所述其它活性成分是治療性多肽。
25.權利要求11的用途，其中所述其它活性成分是編碼治療性多肽的核酸。
26.權利要求11的用途，其中所述腫瘤是實體癌，例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、頭頸癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、胃癌、腦癌、黑素瘤、食道癌、皮膚癌或者腎癌，特別是乳腺癌，轉移性乳腺癌；或者所述腫瘤是血液癌，例如淋巴瘤或者白血病。
27.藥物組合物，包含調節性T細胞耗損劑作為活性成分，所述藥物組合物通過耗損患者(包括動物，哺乳動物，特別是人類)的調節性T細胞而治療或者預防腫瘤(特別是癌症，例如實體癌)。
28.權利要求27的藥物組合物，其特徵在於權利要求2-26之任何一項的限定部分所限定的特徵。
29.可用於分析患者體內調節性T細胞(特別是CD4+T細胞，特別是CD4+CD25+T細胞)群體的試劑在製備用於癌症診斷或者預後的藥劑或者藥劑盒中的用途。
30.權利要求29的用途，其中所述調節性T細胞在患者腫瘤內。
31.權利要求30的用途，其中腫瘤內調節性T細胞水平升高表明患者預後不佳。
32.權利要求29的用途，其中所述藥劑或者藥劑盒還包含用於分析癌症患者體內CD8+T細胞群體的試劑。
33.權利要求32的用途，其中相對於CD8+T細胞的正常水平，所述患者體內CD8+T細胞水平升高或者正常水平是癌症的正預後指標和/或診斷。
34.包含並表達編碼突變LIGHT的核酸cDNA的重組病毒，優選地，該重組病毒是重組腺病毒或者禽痘病毒。
35.權利要求34的重組病毒，其中所述突變LIGHT包含阻止蛋白酶對其降解的突變，例如，所述突變LIGHT是不含蛋白酶裂解位點的LIGHT，特別是不含LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位點EKLI的突變LIGHT。
36.權利要求34的重組病毒，其中所述突變LIGHT具有細胞外域胺基酸序列和標籤序列(例如便於純化的標籤)，如具有LIGHT第85-239位的胺基酸序列和flag序列。
37.包含權利要求34-36之一的重組病毒的藥用組合物，特別是治療性疫苗或者預防性疫苗。
38.權利要求34-36之一的病毒或者權利要求37的組合物在製備用於治療癌症的藥物中的用途。
39.用於篩選或者測試癌症治療劑的方法，包括獲得候選物質，和在(非人動物優選實驗動物，特別是患有癌症的那些)體內或者體外實驗中測試候選物質是否能夠耗損調節性T細胞。
全文摘要
本發明涉及調節性T細胞耗損劑在製備藥物中的用途，其中所述藥物通過耗損患者(包括動物，哺乳動物，特別是人類)的調節性T細胞而治療或者預防腫瘤(特別是癌症，例如實體癌)。所述調節性T細胞耗損劑的例子是抗CD文檔編號A61K39/235GK1833724SQ200510055009
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月14日 優先權日2005年3月14日
發明者傅陽心 申請人:傅陽心