抗血管發生組合物及其治療應用的製作方法

2023-06-13 18:58:26

專利名稱：抗血管發生組合物及其治療應用的製作方法
抗血管發生組合物及其治療應用本發明涉及人皰疹病毒6型(HHV_6)U94基因及其產物蛋白質Rep在人類治療中 的用途。根據本發明，將蛋白質R印或編碼R印的人皰疹病毒6型(HHV-6)U94基因遞送至 人血液(BEC)和淋巴(LEC)內皮細胞，藉此抑制血管發生和淋巴管發生(lymphangiogenic) 的過程。本發明還提供適合用於遞送U94基因或從其編碼的蛋白質至治療部位的表達載體 和藥物組合物。
背景技術：
血管發生描述了從預先存在的微脈管系統(microvasculature)形成新的血管。 在生理條件下，血管發生是高度調節的現象，由許多促血管發生(proangiogenic)和抗血 管發生(antiangiogenic)因子的受緊密控制和平衡的合成介導(Hanahan和FoIkman， 1996, Cell 86:353-364)。在生理條件中，血管發生發生在胚胎發生過程中和出生後早期， 以及在成年人中在創傷癒合和女性生殖周期期間。在生理條件下，細胞處於距離血管(它 們的氧氣源)100-200 μ m內。多細胞生物體生長時，為了補充新的血液供應，細胞誘導血 管發生和脈管發生(vasculogenesis)。不受調節的血管發生見於病理病症中，如慢性炎 性疾病銀屑病、嬰兒期血管瘤、消化性潰瘍、眼新血管形成、動脈粥樣硬化和癌(Mauriz和 Gonzalez-Gallego, 2008, J Pharm ki，先於印刷版的電子出版)。癌作為快速增殖和擴大的異常細胞的小群而起始。此過程是血管發生依賴性的， 因為處於血管100 μ m之外的腫瘤細胞變得缺氧。在沒有足夠血液供應的情況下，腫瘤不 能生長超過l_2mm大小。在腫瘤細胞獲得產生其自身或改變其環境以從頭產生血管發生 刺激物的能力前，其細胞可以保持休眠或甚至由於其他宿主因子而消失。腫瘤從休眠至活 性狀態的進程依賴於包含轉換為血管發生表型的一系列事件(John等，2007，Br J Surg 95 =281-293)。這可以通過包含低氧、代謝性應激、機械性應激和免疫/炎症反應的多種信 號觸發。此轉換還可以通過抗血管發生因子的喪失引發。為了產生毛細管芽(capillary sprout)，內皮細胞增殖、遷移、降解基膜並形成新管腔組織(new lumen organisation)的 結構。為了刺激血管發生，腫瘤細胞和宿主細胞都分泌多種因子。迄今，已報導了超過12 種促血管發生分子，其中最有效力的是鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)和血管內皮生長 因子(VEGF)。抗血管發生治療抑制血管出芽並發揮作用以阻斷血管發生轉換通過針對幹擾腫瘤血管發生的治療來阻止腫瘤生長和轉移的想法最先由R)lkman 發表(Folkman 1971,N Engl J Med 285 :1182-1186)。抗血管發生治療的理論優勢是基於 以下觀察，避開藥物抗性亞群的選擇，內皮細胞是同質的、二倍體的、遺傳上穩定的靶標。這 與腫瘤細胞的高遺傳不穩定性、異質性和突變率相反。此外，由於單個血管網可以支持不同 腫瘤細胞群體生長的事實，血管生長的抑制可以影響許多腫瘤細胞的存活。目前，已描述 了不同的抗血管發生抑制劑幹擾血管發生因子或其他受體、內皮細胞增殖的抑制、金屬蛋 白酶(MMP)的抑制、內皮細胞黏附的抑制和概述於Mauriz和Gonzalez-Gallego (J Pharm Sci, 2008)中的其他抑制劑。通過靶向VEGF信號發放抑制腫瘤血管發生是理性和具有潛在價值的治療策略，且它是目前抑制腫瘤生長和轉移形成的最有前景的新策略之一。FDA 已於2004年和2006年批准了首批藥物。如在Drevs和khneider(J Int Med 2006,260 517-529)中所概述，貝伐單抗(Bevacizumab, Avastin, Genentech)是抗-VEGF-As 的人 源化重組單克隆抗體，其與某些化療方案組合已在結腸直腸癌、肺癌和乳腺癌中顯示臨床 上相關的存活率改善。已用小分子如Sorafenib (Nexavar，Bayer)和Sunitinib (Sutent， Pfizer)顯示了抗腫瘤活性(當加至結腸直腸癌、腎細胞癌、黑素瘤和胃腸基質瘤(GIST)的 標準治療時)，二者均具有針對VEGF受體酪氨酸激酶的活性。抗血管發生治療的問題目前的抗血管發生治療使用能夠特異性阻斷單個促血管發生分子活性的抑制劑。 隨著腫瘤的發展，促血管發生因子的數目趨於增加(Fidler，2001，J Natl Cancer Inst 93:1040-1041)。這可限制具有窄作用譜的單個藥劑的用途，並可導致抗藥性或耐藥性。實 際上，已描述了在幾乎所有患者中，腫瘤最終對抗血管發生治療產生抗藥性，但尚未闡明潛 在的抗藥性機制。腫瘤可激活替代途徑來刺激血管發生過程；例如，在小鼠中，VEGF抑制 可以誘導bFGF途徑的增加。因此，已開展組合策略來獲得最大效應。已用實驗模型，其顯 示若組合使用長春花鹼和抗血管發生劑DClOl (靶向VEGFR2的單克隆抗體)，則接種入免 疫缺陷小鼠的人成神經細胞瘤細胞系不形成腫瘤(Klement等，2000，J Clin Invest 105 R15-R24)。類似地，Kamat 和同事(Cancer Res 2007,67 :281-288)已顯示紫杉燒(taxane) 與AEE788( 二元的表皮生長因子受體(EGFR)和VEGFR抑制劑)組合在卵巢癌鼠模型中的 功效。普遍的觀點是，必須在血管發生過程的不同階段同時阻斷血管發生。因此，存在對基於通過幹擾導致細胞獲得抗血管發生表型和功能的胞內信號，通 過作用於內皮細胞水平來阻斷血管發生的更有效的癌治療的迫切需要。能夠抑制血管發生的新藥物的可用性可能為需要調節血管發生過程的所有疾病 開啟了有益的應用。這對通過作用於內皮細胞內部，以明顯的新機制顯示有效的抗血管發生特性的藥 物尤其正確。如Rui-Chen 在 Cancer Metastasis Rev (2006, 25 :677-694)中所概述，在過 去幾年中已清楚，最終受生長因子、細胞因子和趨化因子的複雜網絡調節的淋巴管發生 (lymphangiogenesis，新淋巴管的形成)有助於腫瘤轉移。幾篇研究已發現淋巴管發生因 子、淋巴管(lymphatic)侵入、遠端轉移和(在一些情況下)差的臨床結果之間的正相關。 腫瘤衍生的淋巴管發生因子如VEGF-C的相關作用對腫瘤淋巴管發生很關鍵。實際上，最近 的研究已表明，響應快速的腫瘤生長，淋巴管經歷引人注目的淋巴管發生改變，例如淋巴管 內皮細胞(LEC)出芽、腫瘤內和腫瘤周圍(peritumoural)脈管形成和鄰近腫瘤組織的集合 淋巴管膨大。人乳腺癌VEGF-C的過量表達與腫瘤內淋巴管發生、腫瘤內淋巴管的增加的數 目和局部淋巴結轉移的高頻率密切相關。這些實驗已提供了淋巴管可以在腫瘤內增殖並作 為淋巴發生傳播的管道這一原理的證據。因此，已提出將腫瘤內和外周LEC的靶向或阻斷 淋巴管發生作為抗轉移法的重要途徑。目前不存在能夠幹擾淋巴管發生和預防癌轉移的有效藥物。代表用於轉移癌的潛在治療的抗淋巴管發生治療是腫瘤學領域中未滿足的需要。能夠抑制淋巴管發生的新藥物的可用性可能為需要調節淋巴管發生過程的所有疾病開啟了有益的應用。最佳的藥物應通過幹擾導致細胞獲得淋巴發生表型和功能的胞內信號來在LEC 水平發揮其抗淋巴管發生活性。HHV-6U94 基因HHV-6U94 基因首次由 Thomson 等(Thomson 等，nature 351 :78-80,1991)描述。序 列(從完整的HHV-6 DNA序列(Gompels等，Virology 209 =29-51,1995)獲得)以基因識別 號1487994儲存在RefSeq資料庫中(國家生物技術信息中心，http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)。U94是涉及HHV-6複製調節的潛在相關基因(Caseli等，Virology 346 =402-414, 2007)。現有技術Cancer Cell International Q005，5 19)描述了 U94 基因在命名為 PC3 的 人前列腺腫瘤細胞系中的穩定表達抑制其在培養物中的集落形成和在裸鼠中的腫 瘤發生。所觀察到的抗腫瘤效應由PC3細胞中纖連蛋白(FNl)的上調和血管生成 素-樣-4(Angiopoietin-like-4，ANGPTL4)表達的降低引起。之前的研究表明，在穩定表達U94的NIH3T3細胞系中，U94抑制癌基因H-ras的 轉化(Arauji JC 等，J Virol 1995,69 :4933-4940 ；Araujio JC 等，Oncogene 1997,14 937-943)。這些文章中沒有一篇提出U94基因和所編碼的R印蛋白質以正常的人原代血管和 淋巴管內皮細胞為治療靶點來發揮其抗(淋巴管)血管發生的效應。本發明的公開內容本發明基於這樣的發現，當遞送至人原代BEC或LEC時，HHV-6U94基因(U94)或 U94蛋白質產物Rep損傷細胞在體外形成毛細管樣結構的生理學能力。在第一個實施方案中，本發明提供Rep蛋白質、其類似物或編碼它們的核酸分子 在抑制內皮細胞功能，從而在有需要的哺乳動物受試者中，優選在有需要的人類受試者中 預防或治療血管發生和/或淋巴管發生相關狀態(state)、病症或疾病中的用途。由血管發生和/或淋巴管發生介導並可以從本發明的治療受益的狀態、病症 或疾病包含但不限於血管瘤、實體瘤、卡波希肉瘤、白血病、轉移、毛細血管擴張症、銀 屑病、硬皮病(scleroderma)、膿性肉芽腫、心肌血管發生、斑塊新血管形成(plaque neovascularisation) > S ^ II/JC {RiJ (coronary collaterals)、|Sf { J (cerebral collaterals)、雲力■ J0C _ (arteriovenous malformations) > ifilifil iW ^ ^ (ischemic limb angiogenesis)、角膜疾病、潮紅、新生血管性青光眼、糖尿病性視網膜病、 晶狀體後纖維組織形成、關節炎、類風溼性關節炎、糖尿病性新血管形成、黃斑變性、班氏吳 策線蟲感染、巴爾通體感染(Bartonella infection)、創傷癒合、消化性潰瘍、骨折、瘢痕疙 瘩、血管發生、血細胞發生、排卵、月經。該治療在於以足以控制病症或疾病的臨床方面的量 對個體施用Rep蛋白質、其類似物或編碼它們的核酸分子。在本發明的另一實施方案中，提供Rep蛋白質、其類似物或編碼它們的核酸分子 在控制生育中的用途，通過對女性施用有效量的Rep蛋白質、其類似物或編碼它們的核酸 分子，使得子宮內膜血管形成被抑制和胚胎植入不能發生或持續。還在另一個實施方案中，本發明提供用於治療上文所述疾病或病症的藥物製劑。該藥物製劑包含與可藥用載體組合的Rep蛋白質、其類似物或編碼它們的核酸分子。Rep蛋 白質、其類似物或編碼它們的核酸分子在該劑型中的量必須足以基本減輕疾病的表現或緩 解狀態或病症的症狀。可以通過與疾病相關的臨床症狀和通過非侵入性和/或侵入性儀器 和實驗室方法測定疾病的表現。還在另一個實施方案中，本發明提供R印蛋白質、其類似物或編碼它們的核酸分 子對通過促進或阻斷血管或淋巴管內皮細胞或其他細胞類型在胞外環境中釋放生物活性 分子來抑制內皮細胞功能的用途。附圖描述圖 1 顯示通過 AMAXA 核轉染(nucleofection)pSR2ph_U94 後 U94 轉錄物在 BEC 中的存在。已將pSR2ph-U94質粒DNA用作陽性對照(C+)，而已進行了持家基因β -肌動 蛋白cDNA的擴增，以驗證獲自轉染細胞的所有樣品都已被正確處理。所獲得的結果顯示， pSR2ph-U94轉染後，U94基因在BEC中轉錄至多5天。圖2顯示，與pSR2ph轉染或未轉染(NT)的細胞相比，pSR2ph_U94轉染的BEC和 LEC在接種於Cultrex BME上後M小時未形成毛細管樣結構。圖3顯示，與未處理的細胞或用熱滅活的R印(5μ g/ml)處理的細胞相比，用重組 R印蛋白質(5yg/ml)處理M小時的BEC在接種於Cultrex BME上後M小時未形成毛
細管樣結構。圖4顯示，與pSR2ph轉染的BEC相比，pSR2ph_U94轉染的BEC具有受損的遷移 能力。實際上，如靠下的圖中所示，與pSR2ph轉染的BEC超過60%的封閉(seal)相比， pSR2ph-U94轉染的BEC在用200 μ 1吸頭產生創傷劃痕後8小時僅達到20%封閉。圖5R印對血管發生的影響。與未處理的環(平板Α)相比，按5 μ g/ml的濃度用 重組R印處理主動脈環7天導致自發血管發生(平板B)的完全降低。用20mg/ml的VEGF 刺激主動脈環7天強烈增加微血管派生(平板C)，而在VEGF刺激開始時將R印(μ g/ml)加 至環顯著減少了微血管的數目(平板D)。發明詳述本發明提供用於在有需要的哺乳動物受試者中，尤其是在有需要的人類受試者中 抑制血管發生和/或淋巴管發生的治療組合物，所述組合物以能夠抑制內皮細胞功能的量 包含a)編碼具有抗血管發生和抗淋巴管發生活性的蛋白質的HHV-6核酸分子，其中所 述核酸分子具有選自以下的序列i) SEQ ID NO 1 (U94 基因)；ii)由於遺傳密碼的簡併性而不同於SEQ ID NO 1的序列；iii)在嚴格條件下，尤其是在50°C或更高溫度和0. IxSSC (15mM氯化鈉/1. 5mM檸 檬酸鈉)下與SEQ ID NO 1雜交的序列；和/或b)包含上文所定義的核酸分子的表達載體；和/或c)由上文所定義的核酸分子編碼的R印蛋白質，優選SEQ ID NO :2的蛋白質或其 攜帶保守取代的類似物。所提供的HHV U94基因和R印蛋白質令人驚奇地能夠抑制人血管內皮細胞和淋巴 管內皮細胞的體外毛細管樣結構形成和創傷癒合修復。
可以將抗血管發生/抗淋巴管發生的U94和/或R印、其類似物、同源物或衍生物 與治療有效量的負調血管發生/淋巴管發生的其他分子，如血小板因子4、血小板反應蛋 白-1、金屬蛋白酶組織抑制劑、促乳素、制管張素、內皮抑制素、bFGF可溶性受體、VEGF可溶 性受體、VEGF抗體、bFGF抗體、轉化生長因子β、幹擾素α和胎盤增殖蛋白相關蛋白質組合。本發明的抗血管發生/抗淋巴管發生分子還可以與化療劑組合。本發明包含抗血管發生/抗淋巴管發生R印的類似物，其可以通過提供功能上等 同的分子的取代、添加或缺失來改變蛋白質序列而獲得。這包括改變序列，其中用功能上等 同的胺基酸殘基取代序列內的殘基，產生沉默改變(保守取代)。例如，可以用起功能等同 物作用的具有相似極性的另一個胺基酸取代序列內的一個或多個胺基酸殘基，產生沉默改 變。序列內胺基酸的取代物可以選自該胺基酸所屬類別的其他成員。例如，非極性(疏水) 胺基酸包含丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性 中性胺基酸包含甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺。帶正電 荷(鹼性)胺基酸包含精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷(酸性)胺基酸包含天冬氨酸 和穀氨酸。抗血管發生/抗淋巴管發生R印及其類似物可以衍生自組織或通過本領域已知的 多種方法產生。導致它們的產生的操作可以發生在基因或蛋白質水平。例如，可以通過本 領域已知的眾多策略(Sambrook 等，1990，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)中的ft—禾中: !^7 )^3 隆的編碼抗血管發生/抗淋巴管發生Rep及其類似物的基因序列。可以用一種或多種限制 性內切酶在適當的位點處切割序列，然後在需要時進行其他酶修飾、分離和在體外連接。在 編碼衍生物或類似物的基因的產生中，應注意確保所修飾的基因保留在相同的翻譯閱讀框 之內，不被翻譯終止信號間斷。優選通過重組法產生抗血管發生/抗淋巴管發生R印及其類似物。術語「分離的」指從其最初的環境移出Rep。例如，存在於活個體中的天然存在的 Rep不是分離的，但從天然系統中的一些或所有共存物質分開的相同的Rep是分離的。Rep 可以是載體的部分和/或組合物的部分，且還可以是分離的，其中這種載體或組合物不是 其天然環境中的部分。希望表達Rep時，可以使用任意適合的系統。對本領域技術人員而言，適合的載 體、表達載體及其構建的一般性質是顯而易見的。適合的表達載體可以基於噬菌體或質粒，二者一般都是宿主特異性的，雖然通常 可以改造它們用於其他宿主。其他適合的載體包含粘粒和反轉錄病毒和任意其他載體，其 可以是給定系統特異性或非特異性的。對本領域技術人員而言，表達調節中必需和/或有 用的控制序列，如識別、啟動子、操縱子、誘導物、終止子和其他序列是顯而易見的。可以容易地將編碼R印或R印樣蛋白質的DNA插入適合的載體。理想地，接收載體 具有便於插入的適合的限制位點，但也可以使用例如平端連接，雖然這可以導致閱讀框和 插入方向的不確定性。本領域技術人員可以自然地按希望的表達系統來選擇適合的載體。可以通過用所獲得的質粒轉化適合的生物或真核細胞系，用氨苄青黴素、卡那黴 素或需要時通過其他適合的方式選擇轉化體，並在必要時加入色氨酸或其他適合的啟動子誘導物(如吲哚丙烯酸)來表達R印。可以通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳-SDS-PAGE和通 過Western印跡分析來分析表達的程度。用於培養和轉化培養物等的適合的方法有用地闡述於例如Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 2 版，Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis, Cold Spring Harbor)； Current Protocols in Molecular Biology(Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith 禾口 Stuhl 編輯，Greene Publ. Assoc.，ffiley-Interscience, NY, N. Y. 1992)中。可 以從發酵或細胞培養物分離Rep並用多種常規方法中的任一種進行純化，這些常規方法包 括使用HPLC和FPLC的液相層析，如正相或反相；親和層析(如用無機配體或抗體)；大小 排阻層析；固定化金屬螯合層析；凝膠電泳。本領域技術人員可以選擇最適當的分離和純 化技術而不背離本發明的範圍。可以通過幾種化學技術中的任一種產生R印。例如，可以用最初由 R.B.Merrifield, "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis Of A TetrapeptideJ. Am. Chem. Soc.，83，2149-54 頁(1963)描述的固相合成技術來制 備R印，或可以通過在溶液中合成來製備R印。肽合成技術的概述可見於E. Gross & H.J.Meinhofer, The Peptides :Analysis, Synthesis, Biology；Modern Techniques Of Peptide And Amino Acid Analysis, John Wiley & Sons, (1981)禾口 M. Bodanszky, Principles Of Peptide Synthesis, Springer-Verlag(1984)中。可以通過多種方法在體外測定Rep或其編碼核酸的功能活性和/或治療有效劑 量。例如，測定血管發生抑制性Rep在體外抑制或幹擾內皮細胞在胞外基質上形成毛細管 樣結構的性能的能力時，可以使用本領域已知的多種生物測定，其包含但不限於創傷癒合、 內皮細胞增殖的抑制、內皮細胞遷移的抑制和細胞計數。用於在體內抑制血管發生的能力的測定包括雞尿囊絨膜測定和小鼠、大鼠或兔角 膜袋(corneal pocket)測定。還可以用多種已知的體內和體外測定來測定抗血管發生蛋白質影響血管發生的 能力。這類測定公開於 Jain 等，(Nature Med 1997,3 =1203-1208)中。可以從使用本發明的上述組合物或與其他血管發生抑制因子組合的體外抑制測 定推斷抑制體內血管發生(定義為胞外基質毛細管樣結構形成和內皮細胞增殖和遷移的 抑制)的治療有效劑量。有效劑量還依賴於遞送的方法和手段。例如，在一些應用中，如在 銀屑病或糖尿病性視網膜病的治療中，在局部眼科載體中遞送抑制劑。在其他應用中，如在 實體瘤的治療中，利用生物可降解的聚合植入物遞送抑制劑。還可以例如通過聚乙二醇處 理來修飾蛋白質。可以用本發明的治療組合物治療的與異常血管發生或新血管形成相關的疾病、障 礙或病症包含但不限於視網膜新血管形成、腫瘤生長、血管瘤、實體瘤、白血病、轉移、銀屑 病、新生血管性青光眼、糖尿病性視網膜病、關節炎、類風溼性關節炎、子宮內膜異位症和早 產兒視網膜病(ROP)。本文所用的術語「有效劑量」指足以顯示可檢測的療效的本發明的抗血管發生蛋 白質的量。療效非限制性地包含，例如，抑制不希望的組織或惡性細胞的生長、抑制不適當 的血管發生(新血管形成)、限制慢性炎症引起的組織損傷、抑制腫瘤細胞生長。受試者的 精確有效量可以依賴於受試者的尺寸和健康、待治療病症的性質和嚴重度。因此，不可能預先指定精確有效量。但是，可以通過基於本文所提供的信息的常規實驗來測定給定情況的
有效量。本發明的抗血管發生蛋白質可口服施用、局部施用，或通過腸胃外途徑施用，其包 括皮下和肌內注射、植入持續釋放的長效製劑、靜脈內注射或鼻內施用。因此，優選將本發 明的抗血管發生蛋白質作為藥物組合物施用，該藥物組合物包含與可藥用載體組合的本發 明的抗血管發生蛋白質。術語「可藥用」指可在無過度毒性的情況下對哺乳動物施用的化合 物和組合物。示例性可藥用鹽包含無機酸鹽，如氫氯化物、氫溴化物、磷酸鹽和硫酸鹽；和有 機酸鹽，如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽。這類組合物可以是水溶液劑、乳劑、霜劑、 軟膏劑、混懸劑、凝膠劑和脂質體混懸劑。適合的載體(賦形劑)包含水、鹽水、林格氏液、葡 萄糖溶液和乙醇、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇(PEG)、磷酸鹽、 醋酸鹽、明膠、膠原、Carbopol 、植物油的溶液。此外，還可以包含適合的防腐劑、穩定劑、 抗氧化劑、抗微生物劑和緩衝劑，例如BHA、BHT、檸檬酸、抗壞血酸和四環素。用於製劑的霜 劑或軟膏劑基質包含羊毛月旨、Silvadene (Marion)、Aquaphor (Duke Laboratories)。 其他局部製劑包含氣溶膠、繃帶和其他創傷敷料。備選地，可以將本發明的治療化合物摻 入或封裝入適合的聚合物基質、納米泡(nanobubble)或膜中，從而提供適合用於局部植入 待治療部位附近的持續釋放遞送裝置。其他裝置包含留置導管和如Alzet 微泵的裝置。 可以用市售載體如 Sorbi-care (Allergan)、Neodecadron (Merck, Sharp & Dohme)、 Lacrilube 配製眼科製劑，或可以利用局部製劑，如描述於美國專利號5，124，155中的局 部製劑，該專利在此引用作為參考。此外，可以以固體形式，尤其是作為凍乾粉末提供本發 明的治療化合物。凍幹製劑通常包含穩定劑和填充劑，例如人血清白蛋白、蔗糖和甘露醇。 可在Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.)中獲得可藥用賦形劑的透徹 討論。可以以基因治療的形式使用本發明的編碼抗血管發生蛋白質的DNA，並通過本領 域技術人員已知的任意方法遞送至宿主，以治療與血管發生相關的障礙或組織重塑相關的 病症。本發明的優選實施方案涉及抑制實體瘤的血管發生以預防進一步的腫瘤生長和 轉移的方法。為此目的，基因轉移可接近的任意實體瘤或腫瘤周圍區域可以是進行所公開 的治療應用的靶點。可以通過本領域已知的很多方法直接將包含於重組病毒的或非基於病 毒的基因轉移系統內的編碼血管發生多肽的DNA導向腫瘤周圍的靶細胞，這些方法包括但 不限於(a)與對腫瘤內和腫瘤周圍部位施用有效量的DNA相結合的外科方法(如果可能， 涉及最初除去部分或全部腫瘤)；(b)將基因轉移載體直接注射入腫瘤內或鄰近腫瘤的部 位；和(c)用本領域已知的技術局部或全身遞送基因轉移載體和/或基因產物。任意實體 瘤可以是治療的可能靶點。尤其易受基因治療應用的實體瘤的不以任意方式旨在作為限 制的實例是(a)中樞神經系統的瘤，例如，但同樣不限於膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、成神 經細胞瘤、腦膜瘤、室管膜瘤；(b)激素依賴性組織的癌，如前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸 癌、卵巢癌、乳癌，其包含但不限於原位癌、髓樣癌、導管癌、浸潤性(滲透性)癌和粘液癌； (c)黑素瘤，其包含但不限於皮膚黑素瘤和眼黑素瘤；(d)肺癌，其至少包含鱗狀細胞癌、梭 形細胞癌、小細胞癌、腺癌和大細胞癌；和(e)胃腸系統，如食管、胃、小腸、結腸、結腸直腸、 直腸和肛門區域的癌，其至少包含大腸腺癌。
在本發明尤其優選的實施方案中，將本發明的U94基因、所編碼的Rep蛋白質或 其類似物用於腫瘤的預防性和治療性處理，該腫瘤顯示分化為內皮樣細胞和在適合的基質 上形成自身毛細管樣結構的能力。這些包含人乳腺癌Gerwe等，hvest New Drugs, 2008 年11月14日，先於印刷版的電子版)和人黑素瘤(Mourad-kidan等，Am. J. Pathol. 173 1839-52，2008)，其促進其癌要素(cancer element)轉化進入能夠進行血管發生和支持腫 瘤存活和發展以及轉移性擴散的內皮樣細胞。這是本發明的區別性特徵，因為迄今針對U94 設想的治療應用不允許預測其在表徵為具有血管發生能力的要素的腫瘤治療中的特定效
果 ο可以通過基於病毒或非病毒的方法，將編碼抗血管發生蛋白質的DNA遞送至哺乳 動物宿主的全身或遞送至實體瘤周圍的靶細胞。可以用於本發明的病毒載體系統包含但不 限於腺病毒載體、反轉錄病毒載體、腺伴隨病毒載體、單純皰疹病毒載體、SV40載體、多瘤病 毒載體、乳頭瘤病毒載體、小RNA病毒載體和痘苗病毒載體。優選通過直接注射入實體瘤和/或實體瘤周圍的靜息組織，如脂肪或肌肉組織， 來對宿主施用包含本發明的編碼抗血管發生蛋白質的DNA的重組病毒或載體。轉染靶脂肪 和肌肉組織區域內的腫瘤細胞當然可以是有用的。抗血管發生多肽在這些周圍細胞中的瞬 時表達可導致這些蛋白質的局部胞內增加。可以用於本發明的非病毒載體包含但不限於DNA-脂質複合物，例如脂質體介導 的或配體/聚-L-賴氨酸的綴合物，如唾液酸糖蛋白介導的遞送系統(見，例如!Signer等， 1994, J. Biol. Chem. 269 :2550-2561 ；Derossi 等，1995, Restor. Neurol. Neuros. 8 :7-10 ； 和 Abcallah 等，1995，Biol. Cell85 :1-7 ;Karmali 和 Chaudhuri，2006，Med Res Rev 27: 696-722)；生物可降解聚合物(見，例如Luten等，2008，J Control Release 126:97-110)； 或負載質粒 DNA 的微泡(microbubble，見，例如 Bekeredjian 等，2003，Circulation 108 1022-1026)。還可以使用「裸」DNA的直接注射(見，例如Lin等，Circulation 1990,82 2217-2221)。本發明還提供包含一個或多個填充了本發明藥物組合物的一種或多種成分的包 裝(container)的藥包或藥盒。可選地，這類包裝可以按管理藥品或生物製品的生產、使用 或銷售的政府機構規定的形式與公告或傳單結合，該公告或傳單反映了由生產、使用或銷 售用於人類施用的機構批准。本申請通篇引用的參考文獻在此引入作為參考。通過以下實 施例進一步說明本發明。
實施例以下實施例進一步說明本發明。這些實施例並非旨在限制本發明的範圍。依據本 公開內容，對本領域普通技術人員而言，權利要求範圍內的大量實施方案是顯而易見的。實施例1原代人內皮細胞轉染按照之前所述(Rotola等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95 :13911-13916)，通 過HHV-6變體B的ORF U94的PCR擴增獲得全長U94基因。將來自HHV-6B Rl菌株的U94 基因(Dewhurst 等，2000，Virology 190:490-493)克隆入 pSR2ph 載體(pSR2ph_U94)。按 照廠家的說明用AMAXA裝置(Koln，德國)核轉染pSR2ph_U94 0 μ g)入IO6BEC或LEC。轉染後在不同時間點(1、2、3和5天)收穫細胞並提取總RNA。反轉錄後，按Rotola等，1998， Proc Natl Acad Sci USA 95 :13911-13916 所述，用 U94 特異性引物通過 PCR 擴增 cDNA。 如

圖1中所示，如U94轉錄本在所評估的各時間點的存在所表明，U94基因在BEC中持續表 達。用LEC進行pSR2ph-U94轉染獲得了相似的結果。我們用pSR2ph_U94質粒作為反應的 陽性對照，而持家基因β-肌動蛋白的擴增驗證了 cDNA樣品的適合性。實施例2pSR2ph_U94轉染的內皮細胞在培養物基膜提取物(BME)上的索帶(cord)形成用已在使用前於-20°C冷卻的無菌吸頭將200 μ 1 4 V的BME (10mg/ml) (Cultrex ； Trevigen Inc.，Gaithersburg, MA)轉移至預冷的48孔培養板。輕輕攪動以 確保包被後，將平板在37°C孵育1小時，使Cultrex BME固化。然後將原代BEC或LEC按 6 X IO4/孔的密度接種在EGM中。細胞接種後M小時觀察索帶形成。在包含VEGF的內皮生 長培養基(EGM)存在的情況下，兩種內皮細胞類型都在接種後M小時在Cultrex BME上 自發形成毛細管樣結構。如圖2中代表性地所顯示，pSR2ph-U94轉染後1天收穫並在EGM 存在的情況下培養在Cultrex 上的BEC和LEC未能在接種M小時後形成管。具體而言， 我們觀察到，粘附至Cultrex BME的細胞形成幾乎不形成空心管樣結構的單層。相反，用 pSR2ph空質粒轉染的BEC或LEC保持形成毛細管樣結構的複雜網絡的能力。實施例3Rep處理的內皮細胞在培養物基膜提取物(BME)上的索帶形成通過Hindi 11消化從pSR2ph切下R印編碼基因並亞克隆入細菌pQE30載體 (Qiagen)，獲得重組質粒pQE-r印。將基因與氨基端的6個組氨酸殘基(His)6延伸符合讀 框地克隆在T5啟動子/Iac操縱子的控制下。用重組質粒轉化M15大腸桿菌(E. coli)菌 株，該菌株含有PREP4質粒，該質粒包含編碼Iac阻抑物的IacI基因。加入異丙基硫代半 乳糖苷(IPTG)後，T5/lac啟動子被激活，導致克隆入pQE30的融合蛋白質的高產率產生。 按已描述的方法(Caselli等，2006，Virology 346 :402-414)，在無內毒素汙染的情況下產 生和純化R印蛋白質。按從0. 1至5 μ g/ml的劑量範圍用重組R印處理原代BEC或LEC 24小時並懸浮 在EGM中。然後按6 X IO6細胞/孔的濃度將細胞接種在BME包被的48孔板上。未處理的 細胞在細胞接種後M小時顯示索帶形成。Rep處理後1天收穫並在EGM存在的情況下培養 在Cultrex 上的BEC或LEC未能在接種後M小時形成管。重組R印以劑量依賴的方式 抑制BEC或LEC的血管發生活性，在5 μ g/ml的蛋白質濃度觀察到最佳抑制。為了確認特 異性，還用等量(5yg/ml)通過在100°C下煮沸蛋白質製劑10分鐘獲得的熱變性Rep進行 了實驗(圖3)。結果顯示，熱變性消除了 Rep活性，表明該蛋白質的摺疊對其作用很重要。實施例4pSR2ph-U94轉染的MDA_MB_231細胞在培養物基膜提取物(BME)上的索帶形成按照廠家的說明用AMAXA裝置將pSR2ph_U94 (2 μ g)核轉染入106MDA_MB_231細 胞(ATCC編號HTB-沈衍生自人乳腺癌)。然後按6 X IO4/孔的濃度將MDA-MB-231細胞接 種在RPMI-1640培養基中。在培養基中不存在任意促血管發生因子的情況下，細胞在接種 後M小時在Cultrex 上自發形成毛細管樣結構。pSR2ph-U94轉染後1天收穫並培養在 Cultrex: 上的細胞未能在接種後M小時形成管。另一方面，用pSR2ph空質粒轉染的細胞保持形成毛細管樣結構的複雜網絡的能力。實施例5內皮細胞遷移測定按照廠家的說明用AMAXA裝置(KoIn，德國)將pSR2ph_U94 O μ g)核轉染入 IO6BEC或LEC。轉染後M小時收穫細胞，接種(2. 5 X IO5細胞/孔)在膠原包被的12孔培 養板上並培養至匯合。同時，用重組R印(5yg/ml)處理原代BEC或LEC對小時，按上文接 種在膠原包被的12孔培養板上並培養至匯合。用200 μ 1或Iml吸頭劃開匯合的單層。通 過光學顯微鏡(Leica DM IRB，Wetzlar，德國)觀察內皮細胞遷移，並用使用數字分析系統 (QffIN LITE版本2. 3 ;Leica)的 CCD光學器件(Hitachi Denshi Color Camera KP-D50E/K ； Rodgau，德國)拍照。在8小時的時程內觀察創傷封閉的百分比。如圖4中所示，對照BEC在 200 μ 1吸頭引起創傷劃痕後8小時達到60-80%封閉。與對照BEC同時劃開的pSR2ph_U94 轉染的BEC在創傷劃開後8小時僅顯示約20-30%封閉。用pSR2ph-U94轉染的LEC獲得了 相似的結果。這些結果表明，U94基因在細胞中表達減弱了 BEC和LEC在創傷癒合測定中 的遷移。用按5 μ g/ml的濃度用重組R印蛋白質處理M小時或未處理的BEC和LEC進行 了相同的測定。與它們的未處理的副本相比，在Rep處理的BEC或LEC中，細胞遷移受到強 烈的影響。實際上，Rep處理的細胞在創傷劃開後8小時僅顯示對照細胞創傷封閉活性的 10%。實施例6主動脈環測定按之前所述(NicosiaR. F.和 Ottinetti A. 2000. Lab. Invest. 63 :115-122)進行 大鼠主動脈環測定。簡言之，通過(X)2飽和空氣處死大鼠，在解剖顯微鏡下切下背主動脈並 剔除脂肪。製備約Imm厚的環並在使用前在4°C下在DMEM中保存少於2小時。將8體積從 大鼠尾製備的1型膠原溶液(1. 5mg/ml)與1體積10XDMEM和1體積NaHCO34mg/ml)混 合。將40 μ 1膠原溶液放入4孔板的各孔中並將一個主動脈環轉移至各孔內。在37°C下在 潮溼空氣中孵育平板30分鐘以獲得膠凝(jellification)。孵育後，往各孔中加入500 μ 1 EBM,其單獨包含重組R印(0. 5-5 μ g)或包含與20ng/ml VEGF組合的重組R印。將平板孵 育10-12天。通過每三天進行拍照並計數從主動脈環起始的血管數目來獲得血管發生的定 量。實施例7Rep阻斷大鼠主動脈環的血管發生還用主動脈環測定研究了重組R印對血管發生的影響。此方法允許研究分子幹擾 哺乳動物微血管體外生長的能力。用重組R印處理主動脈環導致自發微血管派生的急劇降 低。在5μ g/ml的蛋白質濃度下孵育7天後觀察到由R印誘導的最大的血管發生抑制。此 時，與用R印處理的環中5士4的微血管數相比，對照培養物中微血管的數目為45士8(圖 5)。如預期，用20mg/ml的血管內皮生長因子(VEGF)刺激主動脈環強烈地增加了微血管派 生085 士 74)。R印(5 μ g/ml)加入到VEGF處理的環降低微血管數量為285 士 74。較低濃度 的U94 (2. 5-1 μ g/ml)仍然是抑制性的，但有效性較低。在0. 5 μ g/ml的濃度下，Rep不影 響大鼠主動脈血管發生。此結果顯示，R印不僅能夠幹擾自發血管發生的潛在機制，還使主動脈環對有效力的VEGF誘導的血管發生活性完全不敏感。
權利要求
1.用於在哺乳動物受試者中預防或治療血管發生和/或淋巴管發生相關的疾病、狀態 或病症的治療組合物，其單獨包含以下或包含以下的組合a)編碼具有抗血管發生和抗淋巴管發生活性的蛋白質的HHV-6核酸分子，其中所述核 酸分子具有選自以下的序列i)SEQID NO 1 ；ii)由於遺傳密碼的簡併性而不同於SEQID NO 1的序列；iii)在嚴格條件下與SEQID NO 1雜交的序列；b)包含如上所定義的核酸分子的表達載體；c)由如上所定義的核酸分子編碼的蛋白質，或其攜帶保守性取代且保留抗血管發生和 抗淋巴管發生活性的類似物。
2.權利要求1的組合物，其中所述哺乳動物受試者是人類。
3.權利要求1的組合物，其中所述核酸分子是裸DNA的形式。
4.權利要求1的組合物，其中所述表達載體是病毒載體。
5.權利要求4的組合物，其中所述病毒載體是以下之一腺病毒載體、反轉錄病毒載 體、腺伴隨病毒載體、單純皰疹病毒載體、SV40載體、多瘤病毒載體、乳頭瘤病毒載體、小 RNA病毒載體和痘苗病毒載體。
6.權利要求1的組合物，其中所述由核酸分子編碼的蛋白質具有序列SEQID NO :2。
7.權利要求6的組合物，其中所述蛋白質是純化的重組蛋白質的形式。
8.權利要求1的組合物，其是DNA-脂質複合物、脂質體介導的或配體/聚-L-賴氨酸 的綴合物、唾液酸糖蛋白介導的遞送系統、生物可降解聚合物或負載質粒DNA的微泡的形 式。
9.權利要求1-8中任一項的組合物，其用於以下疾病或病症之一的治療血管瘤、實體 瘤、卡波西肉瘤、白血病、轉移、毛細血管擴張症、銀屑病、硬皮病、膿性肉芽腫、心肌血管發 生、斑塊新血管形成、冠狀動脈側枝、腦側枝、動靜脈畸形、缺血性肢血管發生、角膜疾病、潮 紅、新生血管性青光眼、糖尿病性視網膜病、晶狀體後纖維組織形成、關節炎、類風溼性關節 炎、糖尿病性新血管形成、黃斑變性、班氏吳策線蟲感染、巴爾通體感染、創傷癒合、消化性 潰瘍、骨折、瘢痕疙瘩、血管發生、血細胞發生、排卵或月經。
10.權利要求1-8中任一項的組合物，其用於顯示分化為內皮樣細胞和形成毛細管樣 結構的能力的腫瘤的治療。
11.權利要求1-8中任一項的組合物，其用於人乳腺癌和人黑素瘤的治療。
12.權利要求1-8中任一項的組合物，其用於抑制子宮內膜血管形成中的或胚胎植入 中的血管發生和/或淋巴管發生。
全文摘要
本發明描述了人皰疹病毒6型(HHV-6)U94基因及其產物蛋白質Rep、適合用於遞送U94基因或從其編碼的蛋白質至治療部位的表達載體和藥物組合物對在有需要的受試者中抑制血管發生和淋巴管發生過程的用途。
文檔編號C12N15/38GK102066406SQ200980121826
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月10日 優先權日2008年6月12日
發明者A·卡魯索, D·迪盧卡 申請人:福玻斯有限公司