一種快速檢測細交鏈格孢菌酮酸的方法與流程
2023-06-13 21:45:01 3
本發明屬於食品檢測領域，涉及一種快速檢測細交鏈格孢菌酮酸的方法。
背景技術：
細交鏈格孢菌酮酸(tenμazonic acid，TA)是鏈格孢黴、稻瘟病黴、高粱點黴等在特定條件下產生的有毒代謝產物之一，是繼交鏈孢酚(Alternariol,AOH)、交鏈孢酚單甲醚(Alternariol monomethyl ether，AME)後發現的一種鏈格孢黴毒素。TA是一種廣泛存在於穀物、蔬菜、水果中的天然毒物，它能在生長、加工、貯藏等環節產生，在小麥、番茄醬、食用油、葡萄酒等農產品中均曾發現過TA汙染。各種鏈格孢黴毒素中，TA毒性最強，長期食用被TA汙染的食品，可能會嚴重危害人體健康。雄性小鼠經口半致死量為182mg/kg，雌性小鼠經口半致死量為81mg/kg。有研究報導指出，TA與某些其他真菌毒素複合汙染時，會產生協同效應使毒性作用增強，加大對人體和動物的健康威脅。由於TA具有多種生物學特性，在各種鏈格孢黴毒素中對哺乳類動物的毒性最大，是目前鏈格孢黴毒素中被研究最多的一種毒素。隨著人們安全意識的提高，對真菌毒素的檢測要求也越來越高。TA常用檢測方法有氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜-質譜法等，但這些方法對設備和人員的素質要求較高、耗時長、設備昂貴，不適合大批量和快速的現場檢測，所以急需一種簡單快速高靈敏的檢測方法。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明的目的在於提供一種快速檢測細交鏈格孢菌酮酸的方法。
為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：
1、一種快速檢測細交鏈格孢菌酮酸的方法，包括如下步驟：
(1)取酶標板，每孔加入細交鏈格孢菌酮酸與BSA的偶聯物，孵育後洗板，拍幹，然後向每孔加入封閉液進行封閉，再洗板，拍幹，得到細交鏈格孢菌酮酸與BSA的偶聯物包被的酶標板；
(2)將固體糧食粉碎後過40～60目篩，獲得固體糧食顆粒，將所述固體糧食顆粒加入甲醇溶液中，渦旋震蕩後離心，取上清液與NaCl溶液混合後加入PBS進行稀釋，製得待測樣品溶液；
(3)將細交鏈格孢菌酮酸標準品溶液稀釋成一系列的濃度梯度，然後將不同濃度的細交鏈格孢菌酮酸標準品溶液分別加入步驟(1)中的酶標板的標準孔中，將步驟(2)中製得的待測樣品溶液加入所述酶標板的樣品孔中，然後向所述酶標板的每孔加入細交鏈格孢菌酮酸抗體，孵育後洗板，拍幹；再向所述酶標板的每孔加入酶標二抗，孵育後洗板，拍幹；最後向所述酶標板的每孔加入化學發光液，輕拍混勻，利用化學發光免疫分析儀測定各孔的發光值RLU；
(4)檢測結果計算與分析，即得樣品中細交鏈孢菌酮酸的含量。
進一步優化，包括如下步驟：
(1)取酶標板，每孔加入經碳酸鹽緩衝液稀釋後的細交鏈格孢菌酮酸與BSA的偶聯物，4℃孵育12h後以PBST緩衝液洗板，拍幹，然後按200μL/孔向每孔加入封閉液在37℃下封閉60min，PBST緩衝液洗板，拍幹，得到細交鏈格孢菌酮酸與BSA偶聯物包被的酶標板，包被濃度為0.5～4.0μg/mL，包被量為100μL/孔；所述碳酸鹽緩衝液濃度為0.05mol/L，pH為9.6；所述PBST緩衝液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；
(2)將固體糧食粉碎後過40目篩，獲得固體糧食顆粒，按料液比(g/mL)1:15將所述固體糧食顆粒加入質量分數為50～100％甲醇溶液中，渦旋震蕩5min後以4000r/min離心10min，取上清液與質量分數為10％的NaCl溶液等體積混合後加入PBS緩衝液稀釋25倍，製得待測樣品溶液；所述PBS緩衝液濃度為0.01mol/L，pH為5.8～8.0；
(3)以步驟(2)中PBS緩衝液將濃度為1.0mg/mL細交鏈格孢菌酮酸標準品溶液稀釋成0.018、0.054、0.164、0.494、1.481、4.444、13.333、40ng/mL 7個濃度，然後將不同濃度的細交鏈格孢菌酮酸標準品溶液各取50μL分別加入步驟(1)中的酶標板的標準孔中，取50μL步驟(2)中製得的待測樣品溶液加入所述酶標板的樣品孔中，然後向所述酶標板的每孔加入50μL細交鏈格孢菌酮酸抗體，37℃下孵育15～60min後以步驟(1)中PBST緩衝液洗板，拍幹；再向所述酶標板的每孔加入100μL酶標二抗，37℃下孵育60min後以步驟(1)中PBST緩衝液洗板，拍幹；最後向所述酶標板的每孔加入50～150μL化學發光液，輕拍混勻，利用化學發光免疫分析儀測定各孔的發光值RLU；所述細交鏈格孢菌酮酸抗體經步驟(2)中PBS緩衝液稀釋40000～100000倍；所述酶標二抗經步驟(2)中PBS緩衝液稀釋4000～10000倍；
(4)檢測結果計算與分析，即得樣品中細交鏈孢菌酮酸的含量。
進一步優化，包括如下步驟：
(1)取酶標板，每孔加入經碳酸鹽緩衝液稀釋後的細交鏈格孢菌酮酸與BSA的偶聯物，4℃孵育12h後以PBST緩衝液洗板，拍幹，然後按200μL/孔向每孔加入封閉液在37℃下封閉60min，PBST緩衝液洗板，拍幹，得到細交鏈格孢菌酮酸與BSA的偶聯物包被的酶標板，包被濃度為2μg/mL，包被量為100μL/孔；所述經碳酸鹽緩衝液濃度為0.05mol/L，pH為9.6；所述PBST緩衝液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；
(2)將固體糧食粉碎後過40目篩，獲得固體糧食顆粒，按料液比(g/mL)1:15將所述固體糧食顆粒加入質量分數為50～100％甲醇溶液中，渦旋震蕩5min後以4000r/min離心10min，取上清液與質量分數為10％的NaCl溶液等體積混合後加入PBS緩衝液稀釋25倍，製得待測樣品溶液；所述PBS緩衝液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；
(3)以步驟(2)中PBS緩衝液將濃度為1.0mg/mL細交鏈格孢菌酮酸標準品溶液稀釋成0.018、0.054、0.164、0.494、1.481、4.444、13.333、40ng/mL 7個濃度，然後將不同濃度的細交鏈格孢菌酮酸標準品溶液各取50μL分別加入步驟(1)中的酶標板的標準孔中，取50μL步驟(2)中製得的待測樣品溶液加入所述酶標板的樣品孔中，然後向所述酶標板的每孔加入50μL細交鏈格孢菌酮酸抗體，37℃下孵育30min後以步驟(1)中PBST緩衝液洗板，拍幹；再向所述酶標板的每孔加入100μL酶標二抗，37℃下孵育60min後以步驟(1)中PBST緩衝液洗板，拍幹；最後向所述酶標板的每孔加入125μL化學發光液，輕拍混勻，利用化學發光免疫分析儀測定各孔的發光值RLU；所述細交鏈格孢菌酮酸抗體經步驟(2)中PBS緩衝液稀釋80000倍；所述酶標二抗經步驟(2)中PBS緩衝液稀釋8000倍；
(4)檢測結果計算與分析，即得樣品中細交鏈孢菌酮酸的含量。
進一步優化，步驟(1)中，所述酶標板為96孔可拆化學發光酶標板。
進一步優化，步驟(1)中，所述封閉液為質量分數為5.0％的脫脂奶粉、質量分數為10.0％的脫脂奶粉、質量分數為0.5％的BSA、質量分數為1.0％的BSA、質量分數為0.5％的OVA或質量分數為1.0％的OVA中的一種。
進一步優化，步驟(3)中，所述細交鏈格孢菌酮酸抗體為細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體。
進一步優化，步驟(3)中，所述酶標二抗為辣根過氧化酶標記的羊抗小鼠IgG。
進一步優化，步驟(3)中，所述化學發光物質為ECL發光試劑。
本發明的有益效果在於：本發明提供一種快速檢測細交鏈格孢菌酮酸的方法，該方法為以辣根過氧化酶催化魯米諾-過氧化氫發光體系的icCLEIA分析方法檢測穀物中細交鏈格孢菌酮酸含量，該方法的檢測範圍為0.032ng/mL～30.244ng/mL，IC50為0.973ng/mL，最低檢出限為0.010ng/mL，線性回歸方程為y＝49.82-20.14x，R2＝0.9966。通過對麵粉和燕麥進行測試，發現麵粉樣品的平均加標回收率為82.43％-96.09％，燕麥樣品的平均加標回收率為81.53％-93.41％，批間變異系釋與批內變異係數均小於12％；與農產品中常見的重點真菌毒素交叉反應率均小於1％，表明方法特異性良好。該方法與UPLC-MS/MS準確度一致，可滿足穀物中細交鏈格孢菌酮酸的快速檢測。傳統酶聯免疫方法的OD值在2.0左右，本方法魯米諾發光強度為5個量級，發光信號強度大，發光持續時間長，對細交鏈格孢菌酮酸檢測更加靈敏，為製備檢測細交鏈格孢菌酮酸殘留化學發光酶聯免疫試劑盒提供基礎。
附圖說明
為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：
圖1為實施例1中多克隆抗體效價變化圖；
圖2為實施例3中PBS緩衝液的pH值對檢測結果的影響圖；
圖3為實施例4中TAO-BSA的包被濃度對檢測結果的影響圖；
圖4為實施例5中不同封閉液對檢測結果的影響圖；
圖5為實施例6中細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體稀釋倍數對檢測結果的影響圖；
圖6為實施例7中競爭反應時間對檢測結果的影響圖；
圖7為實施例8中羊抗小鼠IgG-HRP稀釋倍數對檢測結果的影響圖；
圖8為實施例9中ECL發光試劑添加量對檢測結果的影響圖；
圖9為實施例10中標準曲線圖；
圖10為實施例11中其他毒素的化學發光酶聯免疫反應結果圖；
圖11為實施例13中化學發光酶聯免疫方法與UPLC-MS/MS兩者檢測結果的線性回歸分析圖。
具體實施方式
下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。
材料與試劑：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Desoxynivalenol,DON)、T-2毒素(T-2toxin,T-2)、展青黴素(Patulin,PAT)、玉米赤黴烯酮(Zearalenone,ZEN)、赭麴黴毒素A(Ochratoxin A,OTA)、鏈格孢黴毒素鏈格孢酚(Alternariol，AOH)(新加坡Pribolab公司)；黃麴黴毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、雞卵白蛋白(Ovalbumin from egg,OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(美國sigma公司)；脫脂奶粉(伊利有限公司)；高靈敏ECL發光試劑(A液：穩定劑，B液：增強型化學發光劑)(上海生工生物有限公司)；羊抗小鼠IgG-HRP(武漢博士德公司)；TA與血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)的偶聯物：免疫原TAO-KLH、TA與BSA的偶聯物：包被原TAO-BSA(實驗室自製)；其他試劑均為國產或進口分析純；麵粉，燕麥(均購買於當地超市)。
移液器(德國eppendorf公司)；DHP-600型電熱恆溫培養箱(北京市永光明醫療儀器廠)；Syneng H1MG酶標儀(Gene Company Limited公司)；96孔可拆化學發光酶標板(上海生工生物有限公司)；JS系列電子天平(精度0.0001g，上海精天電子儀器有限公司)。Waters Quatrro-Premier XE超高效液相色譜-串聯質譜儀(配有Acquity UPLC BEH C18色譜柱(50mm×2.1mm，1.7μm))(美國Waters公司)。
SPF級6-8周齡雌性Balb/c小鼠(重慶騰鑫生物技術公司)
實施例1
細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體
取6-8周齡Balb/c雌性小鼠，採用頸背部皮下注射免疫。首次免疫採用TAO-KLH與等體積弗氏完全佐劑混合併完全乳化後免疫；21d後加強免疫，用上述TAO-KLH與弗氏不完全佐劑混合乳化免疫；每間隔2周加強免疫一次，第5次免疫後7d眼眶取血。離心取上清液與甘油等體積混合後-20℃冰箱保存。
細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體效價測定
免疫注射後間隔7天，斷尾取血，用間接ELISA法檢測血清效價。以OD450nm值接近1.0時的稀釋倍數作為血清效價。效價變化如圖1所示，由圖1可知，免疫次數增加，血清效價不斷提高，五免後效價均大於10000，說明免疫效果好，後續實驗均使用2號鼠五免後的抗血清。
實施例2
(1)取酶標板，每孔加入經碳酸鹽緩衝液稀釋後的細交鏈格孢菌酮酸與BSA偶聯物(TAO-BSA)，4℃孵育12h後以PBST緩衝液洗板2次，拍幹，然後按200μL/孔向每孔加入5.0％脫脂奶粉在37℃下封閉60min，PBST洗板2次，拍幹；得到TAO-BSA包被的酶標板，包被濃度為1.0μg/mL，包被量為100μL/孔；所述碳酸鹽緩衝液濃度為0.05mol/L，pH為9.6；所述PBST緩衝液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；
(2)以PBS緩衝液將濃度為1.0mg/mL細交鏈格孢菌酮酸標準品溶液稀釋成0.018、0.054、0.164、0.494、1.481、4.444、13.333、40ng/mL 7個濃度，然後將不同濃度的細交鏈格孢菌酮酸標準品溶液各取50μL分別加入步驟(1)中的酶標板的標準孔中，然後向所述酶標板的每孔加入50μL實施例1中製備的細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體，37℃下孵育後以步驟(1)中PBST緩衝液洗板2次，拍幹；再向所述酶標板的每孔加入100μL辣根過氧化酶標記的羊抗小鼠IgG(羊抗小鼠IgG-HRP)，37℃下孵育60min後以步驟(1)中PBST緩衝液洗板6次，拍幹；最後向所述酶標板的每孔加入100μL ECL發光試劑，輕拍混勻，利用化學發光免疫分析儀測定各孔的發光值RLU；所述細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體經PBS緩衝液稀釋40000倍；所述辣根過氧化酶標記的羊抗小鼠IgG經步驟(2)中PBS緩衝液稀釋4000倍；所述PBS緩衝液的濃度為0.01mol/L，pH為5.8。
實施例3
PBS緩衝液的pH值對檢測結果的影響
由於反應體系的pH能直接影響抗原抗體間的結合，進而影響方法的檢測限及靈敏度，將PBS緩衝液稀的pH分別調至5.8、6.4、7.4、8.0，其餘步驟按照實施例2操作。實驗結果如圖2所示，由圖2可知，IC50隨pH增大先緩慢下降後上升，RLUmax先上升後下降，RLUmax/IC50在pH為7.4時最高，故選擇PBS緩衝液pH為7.4。
實施例4
TAO-BSA的包被濃度對檢測結果的影響
包被抗原的使用濃度過高，既浪費抗原，又可使本底增高；包被原濃度過低，固相載體上有大量微孔不能與抗原結合，增加了非特異性反應，影響檢測的敏感性。將TAO-BSA的濃度分別調至4.0、2.0、1.0、0.5μg/mL，PBS緩衝液pH為7.4，其餘步驟按照實施例2操作。實驗結果如圖3所示，由圖3可知，TAO-BSA包被濃度越小，TA標準品競爭結合特異性抗血清越多，洗板後殘留的抗體越少，抗體結合的羊抗小鼠IgG-HRP量少，HRP催化魯米諾產生的發光強度越低，IC50隨TAO-BSA包被濃度減少先下降後上升，RLUmax/IC50在包被濃度為2.0μg/mL時最大，IC50越低，RLUmax/IC50越大，說明方法的檢測效果越好，故選擇TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL。
實施例5
不同封閉液對檢測結果的影響
抗原在包被的時候濃度較低，固相載體表面尚有未被結合的位點，封閉就是讓大量的不相關蛋白質佔據固相載體上暴露的結合位點，同時穩定結合的抗原分子，從而阻止一抗和二抗與固相載體非特異性結合，產生高背景值，降低特異性與敏感性。在高靈敏的化學發光反應中背景值尤為重要。
分別以5.0％脫脂奶粉、10.0％脫脂奶粉、0.5％BSA、1.0％BSA、0.5％OVA、1.0％OVA為封閉液，PBS緩衝液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，其餘步驟按照實施例2操作。實驗結果如圖4所示，由圖4可知，未封閉時高背景會掩蓋檢測物的發光信號，故RLUmax較封閉組低。蛋白的種類不同可能與酶標板及後續抗體的作用效果有差異，5％脫脂奶粉、10％脫脂奶粉和1％BSA為封閉液時，發光值較其他組更高，但IC50值也較高，敏感性較差，1.0％OVA的RLUmax/IC50明顯高於其他組，且IC50值最低，靈敏度高，故選擇1.0％OVA為封閉液。
實施例6
細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體稀釋倍數對檢測結果的影響
細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體與羊抗小鼠IgG-HRP結合率有關，將細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體分別稀釋40000、60000、80000、100000倍，PBS緩衝液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，其餘步驟按照實施例2操作。實驗結果如圖5所示，由圖5可知，多克隆抗體稀釋倍數越大濃度越低，與羊抗小鼠IgG-HRP特異性結合減少，魯米諾發光信號降低，故RLUmax隨多克隆抗體的稀釋倍數增加而不斷降低；IC50值先降低，在80000倍時達到最小值後緩慢上升，且RLUmax/IC50在稀釋80000倍時最高，故選擇多克隆抗體稀釋80000倍。
實施例7
競爭反應時間對檢測結果的影響
競爭反應是包被原與毒素標準品同時與細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體特異性結合，將競爭反應時間分別設定為15、30、45、60min，PBS緩衝液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，其餘步驟按照實施例2操作。實驗結果如圖6所示，由圖6可知，反應時間越長，與包被原結合的多克隆抗體越多，與羊抗小鼠IgG-HRP特異性結合增加，RLUmax有逐漸上升趨勢，在30min與45min上升較為緩慢，可能反應已達到平衡，整體IC50值差異較小，但在30min時RLUmax/IC50值最大，故選擇競爭反應時間為30min。
實施例8
羊抗小鼠IgG-HRP稀釋倍數對檢測結果的影響
羊抗小鼠IgG-HRP濃度過高，本底增加；濃度過低，魯米諾發光信號不強，敏感性差。將羊抗小鼠IgG-HRP分別稀釋4000、6000、8000、10000倍，PBS緩衝液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競爭反應時間為30min，其餘步驟按照實施例2操作。實驗結果如圖7所示，由圖7可知，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋倍數越高，HRP的濃度越低，催化魯米諾-過氧化氫發光體系由化學能轉化為光能的效率降低，RLUmax逐漸降低，IC50先降低後上升，在稀釋度為8000倍時RLUmax/IC50值遠高於其他稀釋度且敏感性高，故選擇羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000。
實施例9
ECL發光試劑添加量對檢測結果的影響
將ECL發光試劑的添加量分別調至50、75、100、125、150μL/孔，PBS緩衝液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競爭反應時間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，其餘步驟按照實施例2操作。實驗結果如圖8所示，由圖8可知，ECL發光試劑添加量越大，HRP催化魯米諾產生的發光強度越高，RLUmax不斷增大，背景值也不斷加大；IC50先下降後上升，每孔添加125μL時IC50最小，且RLUmax/IC50值最大，故選擇添加量125μL/孔。
實施例10
PBS緩衝液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競爭反應時間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，ECL發光試劑添加量125μL/孔，其餘步驟按照實施例2操作，以細交鏈格孢菌酮酸標準品溶液濃度的對數值lgC為橫坐標，各標準品孔發光強度RLU與最大發光值RLUmax的比值為縱坐標，每個梯度做4個重複，繪製細交鏈格孢菌酮酸標準品溶液化學發光酶聯免疫吸附分析方法的標準曲線，如圖9所示，由圖9可知，其線性回歸方程為y＝49.82-20.14x，R2＝0.9966，根據檢測線計算得到檢測的線性範圍0.032ng/mL～30.244ng/mL，IC50為0.973ng/mL。
PBS緩衝液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競爭反應時間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，ECL發光試劑添加量125μL/孔，其餘步驟按照實施例2操作，測定10個不同批次的空白標準品的RLU值，計算平均值(X)和標準差(SD)，按照公式LOD％＝(X-3SD)/X×100％進行計算，得出最低檢出限為0.010ng/mL。
實施例11
細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體與細交鏈格孢菌酮酸特異性結合測試
以交叉反應率來評價細交鏈格孢菌酮酸多克隆抗體的特異性，交叉反應率越低特異性越好。將AFB1、DON、T-2、PAT、ZEN、OTA和AOH真菌毒素標準品倍比稀釋為0.061、0.122、0.244、0.488、0.977、1.953、3.906、7.813、15.625、31.250、62.5、125、250、500ng/mL14個濃度，設置PBS緩衝液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競爭反應時間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，ECL發光試劑添加量125μL/孔，其餘步驟按照實施例2，分別作分析物及其類似物的競爭抑制曲線，如圖10所示，得出各毒素的IC50值，並計算交叉反應率，計算公式如下：
通過計算可知，AFB1、DON、T-2、PAT、ZEN、OTA和AOH真菌毒素的IC50值都大於500ng/mL，交叉反應率計算結果均小於1％，無明顯交叉反應，說明製備的多克隆抗體與TA毒素可特異性結合，其他6種農產品中重點毒素對細交鏈格孢菌酮酸檢測的幹擾程度很小，該方法具有較好的特異性。
實施例12
(1)稱取2.0g麵粉於50mL離心管中，加入30mL質量分數為70％甲醇溶液中，渦旋震蕩5min後以4000r/min離心10min，取1mL上清液與質量分數為10％的NaCl溶液等體積混合後加入PBS緩衝液稀釋25倍，製得待測樣品溶液；所述PBS緩衝液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；設置測試條件：PBS緩衝液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競爭反應時間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，ECL發光試劑添加量125μL/孔，取50μL該待測樣品溶液加入酶標板的樣品孔中，其餘步驟按照實施例2操作。
(2)稱取2.0g粉碎後的燕麥片於50mL離心管中，加入30mL質量分數為100％甲醇溶液中，渦旋震蕩15min後以4000r/min離心10min，取上清液與質量分數為10％的NaCl溶液等體積混合後加入PBS緩衝液稀釋25倍，製得待測樣品溶液；所述PBS緩衝液濃度為0.01mol/L，pH為7.4；設置測試條件：PBS緩衝液pH為7.4，TAO-BSA包被濃度為2.0μg/mL，1.0％OVA為封閉液，多克隆抗體稀釋80000倍，競爭反應時間為30min，羊抗小鼠IgG-HRP稀釋度為8000，ECL發光試劑添加量125μL/孔，取50μL該待測樣品溶液加入酶標板的樣品孔中，其餘步驟按照實施例2操作。
(3)檢測結果計算與分析，即得樣品中細交鏈孢菌酮酸的含量，計算公式如下：
C(樣品)＝N×10(49.82-r)/20.14
N：樣品稀釋總倍數
r：樣品孔發光強度RLU與0標準品孔的發光值RLUmax的比值，RLU/RLUmax
(4)取不同批次化學發光酶標板，分別向麵粉樣品和燕麥樣品中添加細交鏈格孢菌酮酸，添加量分別為5.0、10.0、20.0ug，按照(1)、(2)中的方法，每個添加量做3次重複，每次做7個重複孔，計算批內變異係數和批間變異係數。變異係數(Coefficient of variation,CV)計算公式為：
CV(％)＝(SD/X)×100
結果見表1。
表1 麵粉、小麥樣品添加回收試驗結果表
由表1可知，麵粉樣品的平均回收率為82.43％-96.09％，燕麥樣品的平均回收率為81.53％-93.41％。麵粉樣品的批內變異係數為4.08％-5.02％，批間變異係數為8.33％-11.37％；燕麥樣品的批內變異係數為2.61％-4.83％，批間變異係數為9.56％-10.32％，均小於15％，說明以本發明中的方法檢測細交鏈格孢菌酮酸的精密度高。
實施例13
分別向麵粉和燕麥樣品中添加細交鏈格孢菌酮酸，添加量分別為5.0、10.0、20.0ug，分別採用UPLC-MS/MS和實施例12中(1)方法進行檢測，以UPLC-MS/MS檢測結果為橫坐標，以化學發光酶聯免疫方法檢測結果為縱坐標做線性回歸分析，結果如圖11所示，由圖11可知，線性回歸方程為：y＝0.825x-0.073，R2＝0.9984，說明icCLEIA與UPLC-MS/MS方法具有良好的一致性和準確度。
本發明中的方法不僅可以用於麵粉和燕麥中細交鏈格孢菌酮酸的檢測，還可以用於大米、小麥、玉米、各種米粉等糧食中細交鏈格孢菌酮酸的檢測。
最後說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的範圍。