一種製備骨形態發生蛋白bmp-2成熟肽的方法

2023-06-13 15:28:11 3

專利名稱：一種製備骨形態發生蛋白bmp-2成熟肽的方法
技術領域：
本發明涉及製備骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的方法，特別是獲得與天 然BMP-2成熟肽胺基酸序列完全一致的BMP-2成熟肽的方法。(二) 背景技術骨形態發生蛋白-2 (BoneMorphogeneticProtein-2， BMP-2 )屬於轉化生 長因子超家族成員。BMP具有誘導未分化間充質細胞向軟骨、骨分化，並且 對胚胎骨骼及多種器官的形成和發育起著重要調節作用。BMP獨特的誘導成 骨活性使其在骨骼損傷與疾患，如骨折、骨缺損及口腔頗面外科中具有廣闊的應用前景。近年來，通過DNA重組技術，十多種重組BMP蛋白在基礎及 臨床應用上均得到了廣泛研究，對BMP在生物進化，發育和遺傳等方面作用 的研究正不斷深入。BMP在細胞內先以前體的方式產生，包括信號肽、前肽和羧基端的成熟 肽。成熟肽中含有7個高度保守的半胱氨酸，它們形成三個鏈內二硫鍵及一 個鏈間二硫鍵並將兩條多肽鏈連接為二聚體，BMP前體蛋白經過N位糖基化， 蛋白水解酶裂解及二聚體化而形成BMP成熟肽，其活性形成多為其同源二聚 體，沒有糖基化的同源二聚體仍然具有生物學活性。多種組織細胞在胚胎髮 育的不同階段表達BMP，並已從牛、鼠、兔、人等多種動物骨組織中分離出 了 BMP。另外，牙質、胎盤、骨肉瘤等組織中均含有豐富的BMP。應用放射 免疫技術能檢測到血清中的BMP,成年人約14-18n/mlg,兒童為20-72ng/ml。天然BMP-2成熟肽的第一個胺基酸不是曱硫氨酸，常規的製備技術是在 成熟肽或截短型的N末端添加曱硫氨酸，利用大腸桿菌直接表達，包含體復 性法製備BMP-2，如華東基因技術研究所開發截短型的rhBMP-2，去除N端 7個胺基酸後，人為添加一個甲硫氨酸，以其密碼子ATG作為起始密碼子， 在大腸桿菌胞內高效表達，包含體蛋白復性得到有生物活性同二聚體。在本發明之前，現代醫學33巻5期(2005/10)康春雨章慶國發表的《人 骨形態發生蛋白-2真核表達質粒的製備、轉染及表達》介紹了製備攜帶有 hBMP-2的全長真核表達質粒pcDNA3.1-BMP2的方法，通過脂質體法將所得 到的重組真核質粒轉染到兔骨髓基質細胞中，用G418進行梯度篩選，從而得 到能夠穩定表達hBMP-2的細胞克隆。採用逆轉錄聚合SW:反應(RT-PCR)檢 測骨髓基質細胞(MSCs)hBMP-2mRNA的表達。中國專利申請CN1484651介紹了將蛋白質在原核生物中表達，該械束達 蛋白質氨末端由一種TGF- 0超家族的蛋白質的前序列或其部分組成，將蛋白 質或另 一種TGF- P超家族蛋白質的成熟區域連接到該蛋白質上，所連接上的 蛋白質具有和成熟區BMP - 2至少35 %的同源性。蛋白質的表達在至少有一 部分蛋白質以包含體的形式而獲得。眾所周知，利用原核體系表達藥用蛋白具有成本低廉，易於大規模生產 的優點。由於去糖基化的BMP-2仍然有生物學活性，這為原核體系表達BMP-2 創造了條件，華東基因技術研究所成功地利用大腸桿菌製備得到具有生物學 活性的重組人BMP-2。但是得到的產物與天然的BMP-2胺基酸序列不一致， 用於人體可能產生免疫原性。利用包含體製備目標蛋白雖然具有成本低的優 點，但是包含體中含有一定的雜蛋白和核酸，目標蛋白佔總蛋白的80%左右。
發明內容本發明提供了一種製備骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的方法，該方法制 得的產物可與天然BMP-2成熟肽M酸序列完全一致，為實現本發明的目的， 本發明採用如下技術方案，本發明製備BMP-2成熟肽的方法包括如下順序步 驟(1) 刪除DsbA基因信號肽第2-18個胺基酸編碼基因，保留第一個曱硫 氨酸的密碼子作為起始密碼子，得到編碼不含信號肽的DsbA的 DNA片段，將該片段重組於表達載體中，獲得重組質粒1;所述DsbA 基因可以大腸桿菌染色體的DNA作模板擴增出來，也可用pET等 含有DsbA基因的質粒作為模板擴增出來，用質粒做模板更容易一(2) 將編碼骨形態發生蛋白BMP-2完整成熟狀的DNA重組於重組質粒 l中DsbA基因的下遊，獲得重組質粒2;(3) 將重組質粒2轉化入宿主菌株的菌體中，得到工程菌，所述宿主菌 為無疏氧還蛋白還原酶缺陷的大腸桿菌宿主的DE3溶原菌；(4) 工程菌在含有抗生素的培養基中培養，添加誘導劑使目的基因表達； (5 )工程菌細胞經破菌，分離純化得到BMP-2融合蛋白； 蛋白酶酶切BMP-2融合蛋白，經分離得到所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽。其中，所述步驟(l)中含有DsbA基因的質粒優選為pET39。大腸桿菌 基因組DNA中也含有該基因，可以用PCR方法擴增得到編碼DsbA的基因。 所述步驟(3)中宿主菌抹優選為大腸桿菌BL21 (DE3)。所述步驟(4)中目 的基因的表達在缺乏氧化環境條件下進行。所述步驟(6)中蛋白酶為腸激酶 或重組腸激酶輕鏈。所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，所述步驟(2)中，重組質粒2中骨形態發生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA與DsbA基因的下 遊之間，還重組有編碼 "Linker-6His-蛋白酶識別位點"的序列。所述6His部件也可位於DsbA基因的上遊，蛋白酶識別位點為腸激酶。具體地說，例如， 取含有DsbA基因的質粒pET39,刪除pET39中的DsbA信號肽基因，獲得重 組質粒1: pET39 ( SP-);將編碼"Linker-6His-Eksite"的DNA片段與編碼骨 形態發生蛋白 BMP-2成熟肽的 DNA拼接，獲得編碼 "Linker-6His-Eksite-BMP-2 " 的 DNA 片段；再將編碼 "Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片段通過限制性內切酶^/ TI和5awHI 重組於重組質粒1: pET39 (SP-)中DsbA基因的下遊，獲得重組質粒2: pET39 ( SP- BMP-2 )。所述方法推薦按如下順序步驟進行 (1 )以含有DsbA基因的質粒pET39作為PCR模板，利用PCR技術刪除 pET39中的DsbA信號肽基因第2~18個胺基酸編碼基因，保留第一個曱 硫氨酸的密碼子作為起始密碼子，獲得的DNA片段重組於表達載體中， 獲得重組質粒1: pET39 ( SP-);(2) 將骨形態發生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重組於重組質粒1中DsbA 基因的下遊，獲得重組質粒2: pET39 ( SP-BMP-2 );(3) 將重組質粒2: pET39(SP-BMP-2)轉化入宿主菌林大腸桿菌的菌體中， 得到工程菌；(4) 工程菌在Luria-Bertani培養基中培養，使目標融合蛋白得到表達；(5) 工程菌細胞經破菌，分離純化得到BMP-2融合蛋白；(6) 以腸激酶酶切BMP-2融合蛋白，經分離得到所述的骨形態發生蛋白 BMP-2成熟肽。進一步，骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，優選按如下順序步驟進行(1) 以含有DsbA基因的質粒pET39為模板，刪除該質粒中的DsbA信號 肽基因第2~18個胺基酸編碼基因，保留第一個曱硫氨酸的密碼子作為起 始密碼子，得到的片段重組於表達載體中，獲得重組質粒1: pET39(SP-);(2) 將編碼"Linker-6His-Eksite"的DNA片段與編碼骨形態發生蛋白 BMP-2成熟肽的DNA拼接，獲得編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA 片段；再將編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片段重組於重組質 粒1: pET39( SP-)中DsbA基因的下遊，獲得重組質粒2: pET39( SP-BMP-2 );(3 )將重組質粒2: pET39( SP- BMP-2 )轉化入宿主菌抹￡.co// BL21 (DE3 ) 的菌體中，得到工程菌；(4) 工程菌在Luria-Bertani培養基中，30°C 、 200 r/min培養到ODgoo約 0.5時，添加終濃度為O.l-lmM誘導劑異丙基硫代-P-D-半乳糖苷，30-37 。C下繼續培養2 10h，使目的基因表達；(5) 發酵結束後，離心收集工程菌細胞，破菌後，離心，收集上清液過 含N產的螯合柱，以50mM咪唑緩衝液預洗脫，以含咪唑120~150mM的 緩衝液洗脫目標蛋白，收集洗脫液；50mM咪唑緩衝液(pH7.3 )配製取 咪唑0.68g和氯化鈉1.17g，加水使溶解成100ml,加入O.lmol/ml鹽酸溶 液42.2ml，再加水稀釋至200ml，即得。(6)往含BMP-2融合蛋白的洗脫液中，加入終濃度0.1 lmM的二乙胺四乙 酸，以及腸激酶5U/mL, 25。C下進行酶切，蛋白酶酶切融合蛋白，經分離 得到所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽。U為酶活單位，定義為在23。C條 件下，8小時將50嗎胰蛋白酶原95%轉化為胰蛋白酶所需的酶量，下同。 再進一步，具體地說，骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法按如下 順序步驟進行(1 )以含有DsbA基因的質粒pET39為模版，引物 DsbA-l: 5， -AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3，， DsbA-2: 5' -TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3'， PCR參數94 。C 3min94°C 30s 40°C 30s 72°C lmin3個循環 94。C 30s 48°C 30s 72°C lmin 27個循環 72 °C lOmin 4°C lOmin以iV&I和5s/ TI酶切PCR產物和pET39質粒，使不含信號肽基因的 DNA片段置換pET39中原有的DsbA基因，獲得不含DsbA信號肽基因的 重組質粒1: pET39 (SP-); (2 )將編碼"Linker-6His-Eksite "的DNA片段 ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCATC ATGATGACGATGACAAA,其中CTTAAG為55pTI識別序列，與編碼骨形態 發生蛋白BMP-2成熟肽的DNA拼接，獲得編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2" 的DNA片段虧1物Linker-1: 5 ，-ATAQHMSCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTC ATCATCATC AT-3' 引物Linker-2: 5， -TTGCTTATGCTTTGCTTGTTTGTCATCGTCATCATGATGATGATGATGATGACC 3， 虧1物BMP2-1: 5 ，-GACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAA-3 ， 引物BMP2-2: 5，-TTCGGATCCTTAGCGACAGCCACAACCTT-3，取濃度為lOuM的引物Linker-1和Link-2各2uL,加入2uL dNTP, 5uL 10 x DNA Polymerase Buffer,補ddH20至50uL反應體系，沸水浴lOmin,放入50t:7JC浴冷卻3min，補加2.5U Pfti DNA polymerase,轉入72水浴 10min,使兩個引物互為模板，形成DNA雙鏈，得到反應產物A;以引物BMP2-1和BMP2-2作為正反向引物，以BMP-2基因為模板進 行PCR擴增，退火溫度設為50。C，延伸時間30s,得到反應產物B;以產物A和產物B作為PCR模板，以引物Linker-l和BMP2-2作為正 反向引物進行基因拼接，獲得編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片 段，反應體系和反應參數如下 PCR參數94 X: 3min94°C 30s 60°C 30s 72°C lmin 30個循環 72*C lOmin 化 lOmin ;(3) 將編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片,殳重組於重組質粒 pET39 (SP-)中DsbA基因的下遊，獲得重組質粒2: pET39 ( SP-BMP誦2 );(4) 將重組質粒2: pET39( SP- BMP-2 )轉化入宿主菌抹￡.co//BL21(DE3) 的菌體中，得到工程菌；(5) 工程菌在Luria-Bertani培養基中經種子培養得工程菌種子液，培養 好的工程菌種子液按1%的接種量接種到搖瓶裝液量為20%的 Luria-Bertani培養基發酵培養，30°C、 200 r/min培養到OD柳約為 0.5時添加誘導劑異丙基石危代-P -D-半乳糖苷至終濃度為0.2mM， 30 r溫度下繼續培養3h，使目的基因表達；(6) 發酵結束後，離心收集工程菌細胞，超聲破菌後，離心，收集上清 液過含Ni2+的螯合柱，以50mM咪喳緩沖液預洗脫，以含150mM咪 唑的Tris-HCl (pH7.8)緩沖液洗脫，收集洗脫液；(7) 往含BMP-2融合蛋白的洗脫液中，加入終濃度lmM的二乙胺四乙 酸，以及腸激酶5U/mL， 25。C下進行酶切，蛋白酶酶切融合蛋白，經分離得到所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽。 本發明首先要把DsbA信號肽基因的去除，以實現DsbA的胞內表達，二 石克鍵形成蛋白A (disulfide bond formation protein A, DsbA)是大腸桿菌周質胞 腔中輔助多種含有二疏鍵的蛋白質正確摺疊並具有生物學活性的一種二石克鍵 異構酶.於1991年由Bardwe11發現,是該家族中第一個被發現的蛋白質，它存在 於E. coli周質空間(periplasm)中,具有最強的氧化性，分子量為21 kD. DsbA能 催化周質空間內的蛋白質形成二硫鍵，而且具有很好的溶解性。天然的DsbA 基因含有信號肽基因，指導DsbA分泌至具有氧化環境的周質空間。含有七個 半胱氨酸殘基的BMP-2融合蛋白在具有氧化環境的周質空間表達會通過二硫 鍵形成多聚體。為了使DsbA融合蛋白在缺乏氧化環境的胞內表達，必須刪除 其編碼信號肽第2-18胺基酸殘基的DNA片段，保留第一個胺基酸甲硫氨酸 密碼子ATG作為翻譯其始密碼子。設計5，突變引物，以攜帶DsbA基因的pET39為模板，利用PCR技術 擴增得到不含信號肽基因的編碼DsbA的DNA片段，利用限制性內切酶TWfeI 和ApTI將突變後DNA重組於pET39中，得到質粒pET39 ( SP-)構建編碼 "DsbA-Linker-6His-Eksite-BMP-2"融合蛋白的工程菌為了使融合蛋白的兩個 主要部分在空間上相互獨立，在DsbA的C端設計GSGSG作為連接肽(G、 S分別是甘氨酸、絲氨酸的單字母縮寫)。為了方便融合蛋白的分離純化，在 Linker的C端設計6His親和標籤，為表達產物可用N嚴親和層析分離純化創 造條件。為了獲得與天然BMP-2胺基酸序列完全一致的產物，在BMP-2的N 端設計腸激酶的識別位點(DDDDK)(D、 K分別是天冬氨酸、賴氨酸的單字 母縮寫)。由於實驗室已經擁有編碼BMP-2的基因，為了構建該工程菌，在已經刪除DsbA信號肽基因的J^出上，利用DsbA基因3，末端含有的^; TI 位點，設計編碼"Linker-6His-Eksite"的DNA與編碼BMP-2的基因拼接，利 用限制性內切酶^pTI和BamHI將突變後DNA重組於pET39 ( SP (-)中。 重組質粒轉化表達宿主五.coZ/BL21 (DE3)得到工程菌。工程菌的表達與表達產物的分離純化，工程菌在含有抗生素的LB培養基 中生長至OD6oo=0.5左右，加入終濃度為O.l-lmM的IPTG，使目的基因表達， 工程菌細胞經超聲破菌後12000rpm離心，利用SDS-PAGE分析沉澱和上清， 確定融合蛋白的溶解性。可溶的融合蛋白經N嚴親和層析一步分離純化，可得到純度大於95%的 BMP-2融合蛋白。BMP-2成熟肽單體的獲得，用重組腸激酶酶切融合蛋白，由於BMP-2成 熟肽在水溶液中的溶解度很小，在酶切過程中出現沉澱現象，離心分離後， DsbA擔體和腸激酶在上清液中，大部分BMP-2成熟肽單體在沉澱中，從而 成功得到BMP-2成熟肽單體，BMP-2成熟肽單體可用於復性法製備具有生物 學活性的二聚體。利用本發明方法，可以得到與天然BMP-2胺基酸序列完全一致的BMP-2 成熟肽。而且採用融合表達策略以後，融合蛋白溶解性好，含有親和層析的 標籤，可以用N產親和純化的方法分離純化融合蛋白，純度可達950/。以上。 酶切後BMP-2成熟肽單體由於在水溶液中的溶解度小而沉澱出來，可以用簡 單的離心分離目標蛋白和融合伴侶(DsbA擔體蛋白)。本發明與現有技術相比，其有益效果體現在用本發明方法製得的產物 與天然BMP-2成熟肽胺基酸序列完全一致；融合表達實現可溶性表達，融合 蛋白可以用N產親和層析一步純化，進一步簡化了 BMP-2復性前的純化步驟。(四)


圖1為重組質粒pETDsbA-BMP的質粒圖譜。(五)
具體實施例方式以下以具體實施例來說明本發明的技術方案，但本發明的保護範圍不限於此實施例l: DsbA信號肽基因的去除引物設計DsbA-l: 5, AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT 3， 24bpDsbA-2: 5' TCGCTTAAGTATTTCACTGT 3' 20bp PCR模板pET39質粒 PCR參數 94 。C 3min94°C 30s 40匸30s 72°C lmin 3個循環 94°C 30s 48°C 30s 72°C lmin 27個循環 72 。C lOmin 4°C lOmin以AWel和5s; TI酶切PCR產物和pET39質粒，使不含信號肽基因的DNA 片段置換pET39中原有的DsbA基因，獲得的重組質粒命名為pET39 ( SP-)。實施例2:編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"基因的獲得首先根據大腸桿菌偏愛密碼子設計編碼"Linker-6His-Eksite"的DNA片 段，序列如下ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCAT CATCATCATCATGATGACGATGACAAA，其中劃線部分為仏/ TI識別序列。 為了使該DNA片段與BMP-2基因順利拼接，設計以下四條引物，以SOE技術進行拼接。引物Linker-1:5， ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCAT 3， 46bp引物Linker-2:5， TTGCTTATGCTTTGCTTGTTTGTCATCGTCATCATGATGATGATGATGAT GACC3， 54 bp 引物BMP2-1:5， GACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAA 3， 30 bp 引物BMP2-2:5' TTCGGATCCTTAGCGACAGCCACAACCTT 3' 30 bp 操作方法由於引物Linker-l和引物Linker-2有18bp反向互補，取濃度為10uM 的引物Linker-1和Link-2各2uL，加入2uL dNTP， 5uL 10X DNA Polymerase Buffer,補ddH20至50uL反應體系，沸水浴10min，放入50。C水浴冷卻 3min,補加2.5U Pfii DNA polymerase,轉入72水浴10min，使兩個引物 互為模板，形成DNA雙鏈。反應產物命名為產物A。BMP-2基因的重新擴增以引物BMP2-1和BMP2-2作為正反向引物， 以實驗室已經得到的BMP-2基因為模板進行PCR擴增，退火溫度設為50 。C，延伸時間30s，得到的產物命名為產物B。基因拼接以產物A和產物B作為PCR模板，以引物Linker-l和BMP2-2 作為正反向引物進行基因拼接，反應體系和反應參數如下 PCR參數 94 X: 3min94"C 30s 60°C 30s 72°C lmin 30個循環72 °C 10min 4°C 10min得到的PCR產物命名為產物C,為編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的 DNA片段。實施例3:工程菌構建以j^/ TI和JSamffl酶切產物C，按常規分子生物學技術重組於pET39( SP-) 中，得到重組質粒pETDsbA-BMP(質粒圖傳見圖1 )，重組質粒pETDsbA-BMP 轉化五.co&BL21 (DE3)，經測序鑑定後保存該工程菌。用於表達研究和生產。實施例4: "DsbA-Linker-6His-Eksite-BMP-2"融合蛋白的胞內表達試驗用無菌牙籤挑取陽性克隆的單菌落於含有50ug/mL卡那黴素的3mL LB培養基中，30 。C、 200r/min培養16小時，得工程菌種子液。培養好的工程菌種子液按1%的接種量接種到搖瓶裝液量為20 %的Luria-Bertani培養基中，30 。C、 200 r/min培養到(9￡)600約0.5時，添加誘導劑 IPTG至終濃度為0.2mM,誘導外源基因表達，在30。C溫度下繼續培養3h。 收集菌體作全菌SDS-PAGE分析，可得到表觀分子量為36kD的表達產物。實施例5:融合蛋白的溶解性分析以及分離純化發酵結束後，以3000rpm轉速離心收集工程菌細胞，以20mM Tris-HCl pH8.0緩衝液重懸菌體，超聲破菌後，以離心12000rpm轉速離心，分別收集 沉澱和上請，沉澱以4MUrea, O.lMNaCl溶液溶解，以SDS-PAGE分析沉澱 和上清夜目標蛋白的含量，本發明中，融合蛋白主要存在於上清液中，說明 融合蛋白以可溶的形式存在於工程菌細胞中。(1) 融合蛋白的分離純化由於融合蛋白含有6His親和純化標籤，融合蛋白可以特異性地吸附於Ni2+ 螯合柱上，以50mM咪唑緩衝液預洗脫，以含咪唑150mM的Tris-HCl、 pH7.8緩衝液洗脫目標蛋白，收集洗脫液；(2) 融合蛋白的酶切以及BMP-2成熟肽單體的獲得在N嚴螯合親和層析的含有融合蛋白的洗脫液中，加入終濃度為lmM 的EDTA和5U/mL的腸激酶，在25。C條件下進行酶切，在酶切過程中釋 放出BMP-2成熟肽單體，由於BMP-2成熟肽單體的溶解性很小，酶切過 程中溶液由澄清逐漸變為渾濁。 酶切結束後，以大於5000rpm的轉速離心收集沉澱，用20mM Tris-HCl 洗滌沉澱一次，沉澱為純度大於90。/。的BMP-2成熟肽單體，該單體可用於進 一步復性以製備具有生物學活性的重組同源二聚體。BMP-2成熟肽單體的N-端15個胺基酸序列測定結果為N-Gln Ala Lys His Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys，與天然的BMP-2成熟肽N-端氨 基酸序列完全一致。實施例6:以得到的BMP-2成熟肽單體體外復性獲得同源二聚體用含有8M尿素、10mM 二硫蘇糖醇(DDT )、 5mM EDTA的Tris-HCl pH8.5 的緩衝液溶解BMP-2單體沉澱，室溫下磁力攪拌2小時，以稀釋法復性，復 性體系主要物質的終濃度如下0.5ML-精氨酸、O.IM氯化鈉、0.5M尿素、 lmM還原型穀胱甘肽GSH、 O.lmM氧化型穀胱甘肽GSSG。在4-10。C冰箱放 置24小時以上，以非還原性SDS-PAGE分析二聚體的形成情況，隨著復性時 間的延長，表觀分子量為25kD的蛋白質逐漸增多。以還原性SDS-PAGE分析 時該條帶消失，可以推斷表觀分子量為25kD的蛋白質為BMP-2成熟肽的二聚體。實施例7:基因測序分析經檢測，本發明所得BMP-2融合蛋白的基因序列如下(劃線部分為BMP-2 成熟肽基因)ATGGCGCAGTATGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAAC CGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCTTTCTTCTGCCCG CACTGCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAA AAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATG GGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATG GCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTA CAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATC AACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGACGTGGAACAGCTTC GTGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTG CAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAA TCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGTTTGTTCAGCAGTATGCTGATATCATCATCATGATGACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAACGGAAGAGGCTGAAATCCTCCTGCAAAAGACATCCGCTGTATGTGGATTTTAGCGATGTGGGCTGGAACGATTGGATTGTGGCGCCGCCGGGCTATCATGCGTTTTATTGCCATGGCGAATGCCCGTTTCCGCTGGCGGATCATCTGAACTCCACCAACCATGCGATTGTGCAGACCCTGGTGAACTCTGTGAACAGCAAAATTCCGAAAGCGTGCTGTGTGCCGACCGAACTGAGCGCGATTTCGATGCTGTATCTGGATGAAAACGAAAAAGTGGTGCTGAAAAACTATCAGGATATGGTGGTGGAAGGTTGTGGCTGTCGCTAA:本發明所得BMP-2融合蛋白的胺基酸序列如下(劃線部分為BMP-2成熟 肽胺基酸)MAQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQVLEFFSFFCPHCYQFEEVLHISDNVKKKYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVOTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLD ENEKVVLKNYODMVVEGCGCR* :結論用本發明方法製得的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽與天然BMP-2 成熟肽胺基酸序列完全一致。序列表.ST25SEQUENCE LISTING<120〉 <211〉 浙江工業大學一種製備骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的方法 8Patentlri version 3. 2 165 DNAUnknown 人工序列<400〉 1atacttaagc gagaaaaaag gttctggttc tggtcatcat catcatcatc ettgatgacga 60 tgaca 65<210〉 2<211〉 46 DNA <213〉人工序列<■〉 2atacttaagc gagaaaaaag gttctggttc tggtcatcat catcat 46 3 <211〉 54 <212〉 DNA <213〉人工序列 3 一—ttgcttatgc tttgcttgtt tgtcatcgtc atcatgatga tgatgatgat gacc 54<210〉 4<211〉 30 DNA <213〉人工序列 4gacgatgaca aacaagcaaa gcataagcaa 30<210〉 5<211〉 29 DNA 人工序列 5ttcggatcct tagcgacagc cacaacctt 29<210〉 6<211〉 957 DNA 人工合成 6atggcgcagt atgaagatgg taaacagtac actaccctgg aaaaaccggt 3gctggcgcg 60ccgcaagtgc tggagttttt ctctttcttc tgcccgcact gctatcagtt tgaagaagtt 120ctgcatattt ctgataatgt gaagaaaaaa ctgccggaag gcgtgaagat gactasatac 180cacgtcaact tcatgggtgg tgacctgggc aaagatctga ctcaggcatg ggctgtggcg 240atggcgctgggcgtggaagacaaagtgactgttccgctgtttgaaggcgt300cagaccattcgttctgcttctgatatccgcgatgtatttatcaacgcaggtattaaaggt360gaagagtacgacgcgacgtggaacagcttcgtggtga幼tctctggtcgctc8gcaggaa420aaagctgcagctgacgtgcaattgcgtggcgUccggcgatgtttgttaacggtaaatat480cagctgaatccgcsgggtatggataccagcaatatgtttgttcagcagtatgctgataca540gtgaaatacttaagcgagaaaaaaggttctggttctggtcatcatcatcatcatcatgat600gacgatgaca幼CEiaigcaaeigcataagcaacgga卿ggctgaaatcctcctgcaa幼ga660catccgctgtatgtggattttagcgatgtgggctgg咖gattggattgtggcgccgccg720ggctatcatgcgttttattgccatggcgaatgcccgtttccgctggcggatcatctgaac780tccaccaaccatgcgattgtgcagaccctggtgaactctgtgaacagcaa840gcgtgctgtgtgccgaccgaactgagcgcgatttcgatgctgtatctgga900aaagtggtgctgaaaaactatcaggatatggtggtggaaggttgtggctgtcgctaa957 7 318 PRT 人工合成 7Met Ala Gin Tyr Glu Asp Gly Lys Gin Tyr Thr Thr Leu Glu Lys Pro1510 15Val Ala Gly Ala Pro Gin Val Leu Glu Phe Phe Ser Phe Phe Cys Pro2025 30His Cys Tyr Gin Phe Glu Glu Val Leu His lie Ser Asp Asn Val Lys3540 45Lys Lys Leu Pro Glu Gly Val Lys Met Thr Lys Tyr His Val Asn Phe5055 60Met Gly Gly Asp Leu Gly Lys Asp Leu Thr Gin Ala Trp Ala Val Ala6570 75 80Met Ala Leu Gly Val Glu Asp Lys Val Thr Val Pro Leu Phe Glu Gly8590 95Val Gin Lys Thr Gin Thr lie Arg Ser Ala Ser Asp lie Arg Asp Val100105 110Phe lie Asn Ala Gly lie Lys Gly Glu Glu Tyr Asp Ala Thr Trp Asn115120 125Ser Phe Val Val Lys Ser Leu Val Ala Gin Gin Glu Lys Ala Ala Ala130135 140Asp Val Gin Leu Arg Gly Val Pro Ala Met Phe Val Asn Gly Lys Tyr145150 155 160Gin Leu Asn Pro Gin Gly Met Asp Thr Ser Asn Met Phe Val Gin Gin165170 175Tyr Ala Asp Thr Val Lys Tyr Leu Ser Glu Lys Lys Gly Ser Gly Ser 180 185 190Gly His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gin Ala Lys His 195 200 205Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr 210 215 220Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp lie Val Ala Pro Pro225 230235240Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala 245 250 255Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala lie Val Gin Thr Leu Val Asn 260 265 270Ser Val Asn Ser Lys lie Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu 275 280 285Ser Ala lie Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu 290 295 300Lys Asn Tyr Gin Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 305 310 315<210〉 <220〉 815PRTUnknown人工合成 8Gin Ala Lys His Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 15 10 1權利要求
1. 一種骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，其特徵在於所述方法包括如下順序步驟(1)刪除DsbA基因信號肽第2～18個胺基酸編碼基因，保留第一個甲硫氨酸的密碼子作為起始密碼子，得到編碼不含信號肽的DsbA的DNA片段，將該片段重組於表達載體中，獲得重組質粒1；(2)將編碼骨形態發生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重組於重組質粒1中DsbA基因的下遊，獲得重組質粒2；(3)將重組質粒2轉化入宿主菌株的菌體中，得到工程菌，所述宿主菌為無硫氧還蛋白還原酶缺陷的大腸桿菌宿主的DE3溶原菌；(4)工程菌在含有抗生素的培養基中培養，添加誘導劑使目的基因表達；(5)工程菌細胞經破菌，分離純化得到BMP-2融合蛋白；(6)蛋白酶酶切BMP-2融合蛋白，經分離得到所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽。
2. 如權利要求1所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，其 特徵在於所述步驟(1)中所述DsbA基因來自質粒pET39。
3. 如權利要求1所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，其 特徵在於所述步驟(3)中宿主菌林為大腸桿菌BL21(DE3)。
4. 如權利要求1所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，其特徵在於所述步驟(4)中目的基因的表達在缺乏氧化環境條件下進行。
5. 如權利要求1所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，其 特徵在於所述步驟(6)中蛋白酶為下列之一腸激酶，重組腸激酶 輕鏈。
6. 如權利要求1~5之一所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方 法，其特徵在於所述步驟(2)中，重組質粒2中骨形態發生蛋白BMP-2 完整成熟肽的DNA與DsbA基因的下遊之間，還重組有編碼"Linker-6His-蛋白酶識別位點"的序列。
7. 如權利要求6所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，其 特徵在於所述蛋白酶識別位點為腸激酶或凝血因子。
8. 如權利要求1所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，其 特徵在於所述方法按如下順序步驟進行(1)以含有DsbA基因的質粒pET39作為PCR模板，利用PCR技 術刪除pET39中的DsbA信號肽基因第2 18個胺基酸編碼基 因，保留第一個曱硫氨酸的密碼子作為起始密碼子，獲得的 DNA片段重組於表達載體中，獲得重組質粒l: pET39(SP-);(2 )將骨形態發生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重組於重組質粒 1中DsbA基因的下遊，獲得重組質粒2: pET39(SP-BMP-2);(3) 將重組質粒2: pET39 (SP-BMP-2)轉化入宿主菌株大腸桿菌 的菌體中，得到工程菌；(4) 工程菌在Luria-Bertani培養基中培養，^f吏目標融合蛋白得到表 達；(5) 工程菌細胞經破菌，分離純化得到BMP-2融合蛋白；(6) 以腸激酶酶切BMP-2融合蛋白，經分離得到所迷的骨形態發生 蛋白BMP-2成熟肽。
9.如權利要求8所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，其 特徵在於所述方法按如下順序步驟進行(1)以含有DsbA基因的質粒pET39為模板，刪除該質粒中的DsbA 信號肽基因第2-18個胺基酸編碼基因，保留第一個曱硫氨酸的密碼 子作為起始密碼子，得到的片段重組於表達栽體中，獲得重組質粒1: pET39 ( SP-);(2 )將編碼"Linker-6His-Eksite"的DNA片段與編碼骨形態發生蛋 白BMP-2成熟肽的DNA拼接，獲得編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2" 的DNA片段；再將編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片段 重組於重組質粒l: pET39(SP-)中DsbA基因的下遊，獲得重組質 粒2: pET39 ( SP誦BMP-2 );(3 )將重組質粒2: pET39 ( SP- BMP-2 )轉化入宿主菌林BL21(DE3)的菌體中，得到工程菌；(4 )工程菌在Luria-Bertani培養基中，30°C 、 200 r/min培養到OD600 約0.5時，添加終濃度為O.l-lmM i秀導劑異丙基闢"戈-p-D-半乳泮唐 苷，30-37匸下繼續培養2 10h,使目的基因表達；(5)發酵結束後，離心收集工程菌細胞，破菌後，離心，收集上清 液過含N產的螯合柱，以50mM咪唑緩沖液預洗脫，以含咪唑 120~150mM的緩衝液洗脫目標蛋白，收集洗脫液；(6 )往含BMP-2融合蛋白的洗脫液中，加入終濃度O.l-lmM的二乙胺四乙酸，以及腸激酶5U/mL， 25。C下進行酶切，蛋白酶酶切融合蛋白，經分離得到所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽。
10.如權利要求8所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的製備方法，其特徵在於所述方法按如下順序步驟進行(1)以含有DsbA基因的質粒pET39為模版，引物DsbA-l: 5， -AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3，，DsbA-2: 5， -TCGCTTAAGTATTTCACTGT畫3，， PCR參數94 °C 3min94X: 30s 40。C 30s 72°C lmin3個循環 94€ 30s 48°C 30s 72°C lmin 27個循環 721: lOmin 4。C lOmin以iV&I和仏; TI酶切PCR產物和pET39質粒，使不含信號肽基 因的DNA片段置換pET39中原有的DsbA基因，獲得不含DsbA信 號肽基因的重組質粒l: pET39(SP-); (2)將編碼 "Linker-6His-Eksite " 的 DNA 片段 ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCA TCATCATGATGACGATGACAAA,其中CTTAAG為醜spTI識別序列， 與編碼骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的DNA拼接，獲得編碼 "Linker-6His國Eksite-BMP國2"的DNA片段引物Linker-1: 5 ，-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTC ATC ATC ATC AT國3' 引物Linker-2: 5， -TTGCTTATGCTTTGCTTGTTTGTCATCGTCATCATGATGATGATGATGATGACC 3， 虧i物BMP2-1: 5 ，-GACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAA-3 ， 引物BMP2-2: 5，-TTCGGATCCTTAGCGACAGCCACAACCTT-3，取濃度為lOuM的引物Linker-l和Link-2各2uL,加入2uL dNTP， 5uL 10 xDNA Polymerase Buffer,補ddH20至50uL反應體系，沸水浴 10min,放入50。C水浴冷卻3min，補加2.5U PfU DNA polymerase,轉 入72水浴10min，使兩個引物互為才莫板，形成DNA雙鏈，得到反應 產物A;以引物BMP2-1和BMP2-2作為正反向引物，以BMP-2基因為模 板進行PCR擴增，退火溫度設為50。C，延伸時間30s,得到反應產物 B;以產物A和產物B作為PCR模板，以引物Linker-l和BMP2-2作 為正反向引物進行基因拼接，獲得編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2" 的DNA片段，反應體系和反應參數如下 PCR參數94 °C 3min94°C 30s 60°C 30s 72°C lmin 30個循環 72 °C lOmin 4。C lOmin ;(3) 將編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片^殳重組於重組 質粒pET39( SP-)中DsbA基因的下遊，獲得重組質粒2: pET39(SP誦BMP-2 );(4) 將重組質粒2: pET39( SP- BMP-2 )轉化入宿主菌林Eco" BL21(DE3)的菌體中，得到工程菌； (5 )工程菌在Luria-Bertani培養基中經種子培養得工程菌種子液， 培養好的工程菌種子液按1%的接種量接種到搖瓶裝液量為20 %的Luria-Bertani培養基發酵培養，30°C、 200 r/min培養到 OD6。。約為0.5時添加誘導劑異丙基琉代-p-D-半乳糖苷至終濃 度為0.2mM， 30X:溫度下繼續培養3h,使目的基因表達；(6) 發酵結束後，離心收集工程菌細胞，超聲破菌後，離心，收集 上清液過含N產的螯合柱，以50mM咪唑緩沖液預洗脫，以含 150mM咪唑的Tris-HCl、 pH7.8緩沖液洗脫，收集洗脫液；(7) 往含BMP-2融合蛋白的洗脫液中，加入終濃度lmM的二乙胺 四乙酸，以及腸激酶5U/mL， 25。C下進行酶切，蛋白酶酶切融 合蛋白，經分離得到所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽。
全文摘要
本發明提供了一種製備重組骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽的方法刪除DsbA基因信號肽第2～18個胺基酸編碼基因，保留第一個甲硫氨酸的密碼子作為起始密碼子，得到片段重組於表達載體中，獲得的重組質粒1；將骨形態發生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重組於重組質粒1中DsbA基因的下遊，獲得重組質粒2；將重組質粒2轉化入表達宿主菌株的菌體中，得到工程菌經培養、添加誘導劑使目的基因表達，破菌、分離純化得到DsbA-BMP-2融合蛋白，蛋白酶酶切DsbA-BMP-2融合蛋白，經分離得到所述的骨形態發生蛋白BMP-2成熟肽。本發明方法製得的產物可與天然BMP-2成熟肽胺基酸序列完全一致，實現可溶性胞內融合表達，融合蛋白可以用Ni2+親和層析一步純化，進一步簡化了BMP-2復性前的純化步驟。
文檔編號C12P21/02GK101235084SQ200710067138
公開日2008年8月6日 申請日期2007年1月31日 優先權日2007年1月31日
發明者於真真, 付水星, 任慧穎, 偉 徐, 林陳水, 明 許, 鄭小玲, 錢俊青, 黎小軍 申請人:浙江工業大學