一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法

2023-06-13 16:53:41

一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法
【專利摘要】本發明涉及一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，屬於生物分離分析【技術領域】。該方法如下：將蛋白質與螢光標記ssDNA庫混合後在冰上孵育；用低pH值毛細管區帶電泳對孵育後的混合樣品分離，電泳運行緩衝液pH值＜3；電泳分離時，混合樣品中游離蛋白質、游離ssDNA和蛋白質與ssDNA形成的複合物據所帶電荷性質分別向與其電荷性質相反方向移動；對在毛細管出、入口端收集的收集物進行CE-LIF分析，驗證所述方法可行。所述方法可抑制電滲流、抑制帶正電荷樣品和鹼性蛋白質在毛細管內壁的吸附；實現不同電荷類型樣品的在線分離；增加進樣量可增大樣品在線富集量，單次分析收集得到較多的蛋白質與ssDNA複合物。
【專利說明】—種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基於低PH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，所述複合物為蛋白質與ssDNA複合物，屬於生物分離分析【技術領域】。
【背景技術】
[0002]寡核苷酸文庫是一類含有IO13~IO15種不同鹼基的單鏈DNA分子(single-stranded DNA, ssDNA)混合物,其中可能含有一種或數種與祀分子具有高特異性，高親和性結合的DNA分子。核酸適配體(Aptamer)是指通過指數富集配體系統進化(SELEX)技術，從隨機寡核苷酸文庫中篩選得到的，具有與靶分子高親和性和高特異性的寡核苷酸序列配體。核酸適配體親和力高、特異性強、易製備及修飾、其靶分子分布廣。
[0003]毛細管電泳(CE)具有高效、快速以及檢測靈敏度高等優點，在生物、醫藥以及化工等領域具有廣闊的應用前景，已成為重要的分離分析技術，並被逐漸應用於核酸適配體的篩選中。
[0004]利用CE結合SELEX技術篩選核酸適配體的技術即為CE-SELEX。CE-SELEX使核酸適配體篩選周期縮短至傳統SELEX技術的三分之一，大大加快了核酸適配體的篩選速度，受到核酸適配體研究學者的青睞。傳統的CE-SELEX技術中，初始的ssDNA文庫與靶分子混合孵育後，經CE分離得到ssDNA與靶分子的複合物，通過收集複合物並將結合的ssDNA序列分離，再將這部分序列進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，得到次級寡核苷酸文庫，然後重複進行直至篩選得到高親和力和特異性的核酸適配體。
[0005]由於傳統的CE-SELEX技術採用的是毛細管區帶電泳，其樣品的分析量很少(一般為納升級)，因此單次分析所收集的複合物量也較少，這樣就使得次級寡核苷酸文庫容量偏少，從而不利於高親和性和高特異性核酸適配體的篩選。此外，常規的毛細管區帶電泳採用的是弱鹼性的電泳運行緩衝液，用來產生電滲流。在電滲流存在的條件下，CE-SELEX技術中複合物的收集需要確定收集的時間窗口，並且通常需要多次分析以收集到較大量的複合物，收集過程較繁瑣。因此需要提供一種單次分析可收集大體積複合物的方法，以克服篩選過程中複合物收集量少的缺點。

【發明內容】

[0006]針對傳統的CE-SELEX技術單次分析中蛋白質與ssDNA複合物收集量少的缺陷，本發明的目的在於提供一種基於低PH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，所述複合物為蛋白質與ssDNA。由於所述低pH值毛細管區帶電泳所用電泳運行緩衝液的？!1值 3，因此蛋白質在此電泳條件下帶有淨正電荷而向負極遷移；ssDNA分子由於存在較多的磷酸集團，在此電泳條件下帶有淨負電荷向正極遷移；所述低PH值毛細管區帶電泳由於抑制了電滲流，蛋白質與ssDNA分子依據其帶電性向相反方向遷移，便於蛋白質與ssDNA複合物的收集；本發明所述方法通過增加進樣時間來增大進樣量，從而增加單次分析中所述複合物的收集量；同時，對收集物在毛細管電泳-雷射誘導螢光(CE-LIF)下分析，驗證了所述方法的可行性。
[0007]為實現本發明的目的，採用的技術方案如下。
[0008]一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，所述方法步驟如下:
[0009](I)蛋白質與螢光標記ssDNA庫混合得到混合樣品，在冰上孵育；
[0010](2)採用低pH值毛細管區帶電泳，經壓力進樣，對孵育後的混合樣品進行電泳分離，其中，電泳運行緩衝液為毛細管區帶電泳通常使用的電泳運行緩衝液，PH值< 3 ;
[0011]混合樣品中含有游離蛋白質、游離ssDNA和蛋白質與ssDNA形成的複合物，電泳分離過程中，所述游離蛋白質、游離ssDNA和蛋白質與ssDNA形成的複合物根據自身所帶電荷的性質分別向與其電荷性質相反的方向移動，在毛細管的出口端和入口端對分離後的樣品進行收集；例如，毛細管的出口端為負極，入口端為正極；當採用正電壓進行電泳時，游離蛋白質帶有淨正電荷，電泳分離過程中向出口端遷移，在出口端進行收集；游離ssDNA帶有淨負電荷，電泳分離過程中向入口端遷移，在入口端進行收集；蛋白質與ssDNA形成的複合物帶有淨正電荷時，電泳分離過程中向出口端遷移，在出口端進行收集，蛋白質與ssDNA形成的複合物帶有淨負電荷時，電泳分離過程中向入口端遷移，在入口端進行收集；當採用負電壓進行電泳時，游離蛋白質帶有淨正電荷，電泳分離過程中向入口端遷移，在入口端進行收集；游離ssDNA帶有淨負電荷，電泳分離過程中向出口端遷移，在出口端進行收集；蛋白質與ssDNA形成的複合物帶有淨正電荷時，電泳分離過程中向入口端遷移，在入口端進行收集，蛋白質與ssDNA形成的複合物帶有淨負電荷時，電泳分離過程中向出口端遷移，在出口端進行收集；
[0012](3)對在毛細管出口端和入口端收集到的收集物分別進行毛細管電泳-雷射誘導螢光分析，採用壓力進樣，驗證所述基於低PH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法可行。
[0013]其中，優選步驟(I)中，蛋白質溶於純水中製成原始蛋白質儲備液；ssDNA溶於純水中製備成原始ssDNA儲備液，將原始蛋白質儲備液稀釋後得到蛋白質樣品溶液，將原始ssDNA儲備液稀釋後得到ssDNA樣品溶液，將兩種樣品溶液等體積混合得到混合樣品，然後在冰上孵育。
[0014]更優選步驟(I)中，原始蛋白質儲備液的濃度為100 μ mol/L,原始ssDNA儲備液的濃度為100 μ mol/L，蛋白質樣品溶液的濃度為5 μ mol/L, ssDNA樣品溶液的濃度為2 μ mol/L，蛋白質樣品溶液與ssDNA樣品溶液混合後得到的混合樣品在冰上孵育的時間為0.5h。
[0015]更優選步驟(2)中，低pH值毛細管區帶電泳所使用的毛細管為石英熔融毛細管，外包娃膠層，總長度為33.5cm,有效長度為25cm,內徑為75μηι;毛細管電泳儀為Agilent7100毛細管電泳儀；電泳運行緩衝液為50mM的NaH2PO4-H3PO4溶液，通過50mM的NaH2PO4溶液與50mM的H3PO4溶液按體積比為8.1:11.9混合得到，pH值為2.6 ;進樣方式為:50mbar，IOs ;分析溫度為15°C ;分析電壓為+IOkV ;檢測條件為UV195nm。
[0016]優選步驟(3 )中，對步驟(2 )中出口端和入口端的收集物進行CE-LIF分析，採用壓力進樣，所用電泳運行緩衝液為毛細管區帶電泳領域中通常所使用的口11值> 7.0的電泳運行緩衝液。
[0017]更優選步驟(3)中，毛細管電泳-雷射誘導螢光所使用的毛細管為石英熔融毛細管，外包娃膠層，總長度為50.2cm,有效長度為40cm,內徑為75 μ m ;毛細管電泳儀為Beckman P/ACETM MDQ毛細管電泳儀；電泳運行緩衝液為50mM的Na2B4O7-H3BO3溶液，通過200mM的Na2B4O7溶液和200mM的H3BO3溶液按體積比7:3混合後稀釋得到，pH值為8.7 ;進樣方式為:0.5psi,5s ;分析溫度為:25°C ;分析電壓為+20kV，雷射誘導螢光檢測的激發波長為488nm,發射波長為520nm。
[0018]有益效果
[0019]1.本發明提供了一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，所述方法中，採用PH < 3的毛細管區帶電泳運行緩衝液來抑制毛細管內壁的矽羥基解離，從而大大抑制了電滲流；在低PH值的條件下，對帶正電荷的樣品進行分析，可以有效的抑制樣品在毛細管內壁的吸附；所述方法在以蛋白質為靶分子的核酸適配體篩選過程中，在抑制鹼性蛋白質在毛細管內壁的吸附方面具有顯著的有益效果；
[0020]2.本發明提供了一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，在所述電泳中，由於帶相反電荷的樣品向相反方向遷移，因此電泳過程即實現了兩種不同電荷類型樣品的在線分離；
[0021]3.本發明提供了一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，在所述電泳中，增加進樣量可以增大樣品的在線富集量；對於孵育後的蛋白質與ssDNA混合樣品而言，增加進樣量即增大了其中複合物的量，有益於收集得到較多的複合物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為實施例1中轉鐵蛋白(Trf)樣品的低pH值毛細管區帶電泳的分析結果。
[0023]圖2為實施例2中ssDNA樣品的低pH值毛細管區帶電泳的分析結果。
[0024]圖3為實施例3中混合樣品的低pH值毛細管區帶電泳的分析結果。
[0025]圖4為實施例3中出口端收集物的CE-LIF檢測譜圖。
【具體實施方式】
[0026]為了充分說明本發明的特性以及實施本發明的方式，下面給出實施例。
[0027]以下實施例1~4中，ssDNA購自生工生物工程(上海)有限公司，為帶有螢光標記的單鏈隨機寡核苷酸文庫，所述文庫兩端各有20個鹼基的固定序列，中間含40個隨機鹼基，總長 80 個鹼基，鹼基序列為:5』 -FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG- (40N) -CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3，；
[0028]轉鐵蛋白(Trf)購自北京紐樸生物技術有限公司；
[0029]毛細管為熔融石英毛細管，外包矽膠層，購自邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司。
[0030]以下實施例1~3中，低值pH毛細管區帶電泳採用Agilent7100毛細管電泳儀，在毛細管出口端配備DAD檢測器(Agilent, Santa Clara, CA);所用毛細管外包矽膠層，總長度為33.5cm,有效長度為25cm，內徑為75 μ m ；DAD檢測器檢測條件為UV195nm ；電泳運行緩衝液為50mM NaH2PO4-H3PO4溶液，配製方法為:稱取0.7800g的NaH2PO4於50mL燒杯中，加入0.238mL的H3PO4，用純水溶解後，轉入IOOmL容量瓶中定容，電泳運行緩衝液的pH值為2.6。
[0031]實施例1
[0032]原始 Trf儲備液製備:稱取0.004(^的1'忖，加入50(^1^純水配製成1.0\10-411101/
L的原始Trf儲備液，在4°C保存。[0033]將原始Trf儲備液用純水稀釋得到Trf樣品溶液，將10 μ L濃度為5.0X 10_6mol/L的Trf樣品溶液,在Agilent7100毛細管電泳儀中，經50mbar壓力進樣IOs,以50mM,pH值為2.6的NaH2PO4-H3PO4溶液為電泳運行緩衝液，進行低pH值毛細管區帶電泳，電泳分析時間為20min,分析電壓為+10KV,分析溫度為15°C,毛細管的出口端為負極,入口端為正極，DAD檢測器檢測結果如圖1所示。
[0034]由圖1可知，在正電壓下，Trf在9.5min處產生信號峰，說明Trf在此電泳分析條件下帶有淨正電荷，向負極端遷移經過檢測窗口產生信號峰；7min以及8min處為雜質信號峰。
[0035]實施例2
[0036]原始ssDNA儲備液配製方法為:所述ssDNA呈晶體狀，經3000轉/分離心5min，加入純水配製成1.0X 10_4mol/L的原始ssDNA儲備液，在94°C水浴5min後冰上冷卻，4°C保存。
[0037]將原始ssDNA儲備液用純水稀釋得到ssDNA樣品溶液，將10 μ L濃度為5.0X l(T6mol/L的ssDNA樣品溶液,在Agilent7100毛細管電泳儀中，經50mbar壓力進樣IOs,以50mM，pH值為2.6的NaH2PO4-H3PO4溶液為電泳運行緩衝液，進行低pH值的毛細管區帶電泳，電泳分析時間為13min，分析電壓為-10KV，分析溫度為15°C，毛細管的出口端為正極，入口端為負極，DAD檢測器檢測結果如圖2所示。
[0038]由圖2可知，在負電壓下，ssDNA在6.5min處產生信號峰，說明ssDNA在此分析條件下帶有淨負電荷，向正極端遷移經過檢測窗口產生信號峰；2.5min以及7.5min處為雜質的信號峰。
[0039]綜合圖1和圖2結果可知，帶有相反電荷的Trf和ssDNA分別在正電壓和負電壓下出峰，說明PH值為2.6的電泳運行緩衝液有效的抑制了電滲流的產生。
[0040]實施例3
[0041 ] 將5 μ L濃度為1.0Χ l(T5mol/L的Trf樣品溶液與5 μ L濃度為4.0X KTW/L的ssDNA樣品溶液混合得到混合樣品，在冰上孵育0.5h。
[0042]將混合樣品在Agilent7100毛細管電泳儀中，經50mbar壓力進樣IOs,以50mM,pH值為2.6的NaH2PO4-H3PO4溶液為電泳運行緩衝液，進行低pH值毛細管區帶電泳分離。電泳分離過程中，毛細管兩端採用裝有30 μ L電泳運行緩衝液的離心管作為收集瓶；電泳分析電壓為+10KV,分析溫度為15°C,分析時間為20min,毛細管的出口端為負極,入口端為正極，DAD檢測器結果如圖3所示。
[0043]結果為:Trf帶有淨正電荷，向毛細管的出口端遷移並經過檢測窗口，產生信號峰；ssDNA由於帶有淨負電荷，在正電壓下向毛細管的入口端遷移，檢測窗口檢測不到游離ssDNA的信號峰；此時，正向電壓下檢測到的Trf信號峰之後的峰為Trf與ssDNA形成的複合物的信號峰；電泳分離過程完成，游離Trf以及所述複合物進入出口端收集瓶，而游離ssDNA則進入入口端收集瓶。
[0044]將5 μ L濃度為1.0Χ l(T5mol/L的Trf樣品溶液與5 μ L濃度為4.0 X l(T6mol/L的ssDNA樣品溶液混合得到混合樣品，在冰上孵育0.5h。
[0045]將混合樣品在Agilent7100毛細管電泳儀中經50mbar壓力進樣30s,以50mM, pH值為2.6的NaH2PO4-H3PO4溶液為電泳運行緩衝液，進行低pH值毛細管區帶電泳分離。電泳分離過程中，毛細管兩端採用裝有30 μ L電泳運行緩衝液的離心管作為收集瓶；電泳分析電壓為+10KV,分析溫度為15°C,分析時間為32min,毛細管的出口端為負極,入口端為正極，DAD檢測器檢測結果如圖3所示；由於進樣時間增加至30s，使得進樣量增大，因此，經低pH毛細管電泳分離所得的Trf與ssDNA形成的複合物的量增加，所述複合物的紫外吸收強度較進樣IOs時增加；電泳分離過程完成，游離Trf以及所述複合物進入出口端收集瓶，而游離ssDNA則進入入口端收集瓶。
[0046]不同於傳統的毛細管區帶電泳收集方法，本發明所述方法無需確定所要收集物的出峰時間窗口，其電泳分離過程即實現了複合物與游離ssDNA的在線分離，便於收集。
[0047]實施例4
[0048]採用CE-LIF檢測實施例3出口端收集瓶中的收集物，所用毛細管電泳儀為Beckman P/ACETM MDQ 配備雷射誘導突光檢測器(Beckman Instruments, Fullerton, CA)；所用毛細管外包娃膠層，總長度為50.2cm,有效長度為40cm,內徑為75μηι;電泳運行緩衝液為50mM，pH值為8.7的Na2B4O7-H3BO3溶液，配製方法為:將200mM的Na2B4O7溶液和200mM的H3BO3溶液按體積比7:3混合得到混合溶液，取IOOmL混合溶液加入300mL超純水得到；雷射誘導螢光檢測器的激發波長為488nm，發射波長為520nm。
[0049]將實施例3中進樣時間為IOs和30s的出口端的收集物作為樣品，在毛細管電泳儀上，分別以0.5psi壓力進樣5s，進行毛細管區帶電泳分離分析，電泳分析電壓為+20KV，分析溫度為25°C，分析時間為lOmin，毛細管的出口端為負極，入口端為正極，採用雷射誘導螢光進行檢測，檢測所得結果如圖4所示。
[0050]混合樣品中所用ssDNA帶有螢光標記，因此其與Trf結合所形成的複合物也帶有螢光標記。由圖4可知，進樣IOs和進樣30s所得到的出口端收集物均可以在6.4min時檢測到明顯的螢光信號，證明出口端成功收集到了複合物，說明實施例3所述的收集方法可行；進樣時間為30s時，收集物的螢光信號明顯強於進樣時間為IOs時收集物的螢光信號，說明增加進樣時間，複合物的收集量隨之增加。
[0051]綜上所述，以上僅為本發明的較佳實施例而已，並非用於限定本發明的保護範圍。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種基於低PH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，其特徵在於:所述方法步驟如下: (O蛋白質與螢光標記SSDNA庫混合得到混合樣品，在冰上孵育； (2)採用低pH值毛細管區帶電泳，經壓力進樣，對孵育後的混合樣品進行電泳分離，其中，毛細管區帶電泳運行緩衝液的？11值< 3 ； 混合樣品中含有游離蛋白質、游離ssDNA和蛋白質與ssDNA形成的複合物，電泳分離過程中，所述游離蛋白質、游離ssDNA和蛋白質與ssDNA形成的複合物根據自身所帶電荷的性質分別向與其電荷性質相反的電極方向移動，在毛細管的出、入口端對分離後的樣品進行收集； (3)對在毛細管出、入口端收集到的收集物進行毛細管電泳-雷射誘導螢光分析，採用壓力進樣，驗證所述基於低PH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法可行。
2.根據權利要求1所述的一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，其特徵在於:步驟(I)中，蛋白質溶於純水中製成原始蛋白質儲備液；ssDNA溶於純水中製備成原始ssDNA儲備液，將原始蛋白質儲備液稀釋至後得到蛋白質樣品溶液，將原始ssDNA儲備液稀釋後得到ssDNA樣品溶液，將兩種樣品溶液等體積混合得到混合樣品。
3.根據權利要求2所述的一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，其特徵在於:步驟(I)中，原始蛋白質儲備液的濃度為ΙΟΟμπιοΙ/L，原始ssDNA儲備液的濃度為100 μ mol/L，蛋白質樣品溶液的濃度為5 μ mol/L, ssDNA樣品溶液的濃度為2 μ mol/L,混合樣品在冰上孵育的時間為0.5h。
4.根據權利要求1所述的一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，其特徵在於:步驟(2)中，所使用的毛細管為石英熔融毛細管，外包矽膠層，總長度為33.5cm，有效長度為25cm,內徑為75 μ m ;毛細管電泳儀為Agilent7100毛細管電泳儀；電泳運行緩衝液為50mM的NaH2PO4-H3PO4溶液，pH值為2.6 ;進樣方式為:50mbar，IOs ;分析溫度為15°C ;分析電壓為+IOkV ;檢測條件為UV195nm。
5.根據權利要求1所述的一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，其特徵在於:步驟(3)中的毛細管區帶電泳的電泳運行緩衝液的pH值> 7.0。
6.根據權利要求1或5所述的一種基於低pH值毛細管區帶電泳的複合物收集方法，其特徵在於:步驟(3)中所使用的毛細管為石英熔融毛細管，外包矽膠層，總長度為50.2cm,有效長度為40cm，內徑為75 μ m ;毛細管電泳儀為Beckman P/ACETM MDQ毛細管電泳儀；電泳運行緩衝液為50mM的Na2B4O7-H3BO3溶液，pH值為8.7 ;進樣方式為:0.5psi,5s ;分析溫度為:25°C;分析電壓為+20kV，雷射誘導螢光檢測的激發波長為488nm，發射波長為520nm。
【文檔編號】B01D57/02GK103551035SQ201310533807
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月1日 優先權日:2013年11月1日
【發明者】屈鋒, 李倩, 趙新穎, 劉弘洋 申請人:北京理工大學