人免疫缺陷病毒Ⅰ型的人工假病毒及其製備和應用的製作方法

2023-06-13 12:15:26 3

專利名稱：：人免疫缺陷病毒Ⅰ型的人工假病毒及其製備和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒。
背景技術：
：愛滋病全名為人免疫缺陷綜合症，其病原體為人免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVkus,HIV)，是一種生存於人的血液之中並能夠破壞人體免疫系統，進而使人體失去對其它疾病的抵抗能力，引發不可治癒的感染和腫瘤，最終導致被感染者死亡的病毒。其中，HIV-1為主要的流行和致病亞型。HIV檢測時，有以下三個主要步驟需要陽性參照1.從標本中提取HIVRNA，包括病毒外膜、核衣殼打開/破碎，核酸釋放。2.HIVRNA被逆轉錄(也稱反轉錄)為cDNA。3.cDNA與PCR反應液和DNA多聚酶混合，在PCR儀中擴增並得到信號。現有的陽性參照，主要有下述幾種來源病人血液(/血製品)；體內或體外轉錄RNA;質粒或化學合成。所有陽性參照中，最準確貼切的陽性參照應該是含該HIV病毒的天然樣本(如病人血液、淋巴)，其同質性可充分保證其作為前述三個步驟的陽性參照，但其缺陷在於天然樣本來源少，且由於含有天然病毒，因此具有傳染性和危害性。要克服天然病毒來源少且具有傳染性的缺點，本質上可通過離體培養來解決，即把HIV(尤其是基因組經過無害化改造的HIV)導入合適的人工培養宿主細胞系，重組HIV顆粒即可從細胞中產生並分泌至培養基上清。然而，該技術的關鍵步驟為保密狀態，目前只為少數實驗室所擁有；另一方面，這種HIV生產方法可能尚存在若干缺陷，如成本高、病毒數量仍然較低、結構不天然、重複性差等。體外轉錄的HIVRNA，因為它與標本中待測指標一樣，都是RNA，因此可以作為逆轉錄的陽性參照；但是，由於其不具備病毒外殼，因此不適合作為從標本中提取病毒RNA操作的陽性參照。用含HIVDNA序列的質粒作為陽性參照，其優點是製備純化容易，但由於質粒是閉合環狀超螺旋雙鏈形式，非單線性，也不是RNA，因此它只能作為PCR參照，而無法作為RNA提取和逆轉錄的參照。而採用化學合成製備的HIVRNA陽性參照，目前技術尚不成熟，且成本高，還會因為沒有核衣殼、膜的保護而容易降解，因此到目前為止還無實際應用的報導。
發明內容本發明的目的是提供一種易於獲得，安全，廉價的人免疫缺陷病毒I型(HIV-l)的人工假病毒，其製備及應用。假病毒即指反轉錄病毒載體，為經過基因改造的反轉錄病毒，具有原始病毒的基本結構和部分生活史，而不具有多數調節基因及主要致病成份。所謂基本結構，乃假病毒的外膜蛋白及脂類、衣殼蛋白、複製酶(起切割、逆轉錄、整合作用的蛋白)、RNA基因組，分別由來源於天然病毒的erw、gag、pol、目的基因(序列)所編碼/代表。所謂部分生活史，乃假病毒僅可在宿主細胞中產生組件並組裝，且只能一次性地感染靶細胞，不產生新病毒。本發明利用反轉錄病毒系統(Clontech公司的RetroX^system)，將經篩選獲得的目的DNA片段重組(分子生物學常規技術)入pLXSN(plasmid-LTR-X-SV40promoter-Neomycin)質粒載體，然後導入(方法脂質體轉染)病毒生產細胞(Clontech公司的PT67),攜帶目的序列(以RNA形式)的假病毒便可以從生產細胞中產生，分泌到液態的培養基中。收集此培養基，2000RPM離心10分鐘去除大部分細胞碎片和雜質，就得到假病毒粗製品。RetroX(R)system反轉錄病毒系統包括PT67生產細胞、2種克隆載體pLXSN和pLNCX2供選擇、載體附帶正反向測序引物、正對照克隆(AP基因)質粒pLAPSN，即X4P，Alkalinephosphatase(鹼性磷酸酯酶報告基因)。PT67細胞來源於常見的小鼠胚胎成纖維細胞系NIH3T3，已經穩定轉染了莫洛尼逆轉錄病毒(Mo-MLV,Moloneymurineleukemiavirus,莫洛尼株型鼠科白血病病毒)的gag-pol基因，10A1逆轉錄病毒(10A1-MLV，10A1株型鼠科白血病病毒)的env基因(也稱IOAI)，形成穩定轉染(整合入細胞染色體)的輔助篩選基因分別是TKgene(thymidinekinase,胸腺激酶)和DHFRgene(dihydrofolatereductase,二氫葉酸還原酶)。採用RetroX(R)system反轉錄病毒系統製作反轉錄病毒的步驟為把目的序列重組進某一載體，擴增重組質粒，轉染PT67細胞，收穫上清。本發明第一方面公開了一種人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒，為反轉錄病毒，由pLXSN質粒載體所轉化的PT67細胞產生，其中，pLXSN質粒載體含有SEQIDN0:1的多核苷酸序列。較佳的，SEQIDNO:1位於pLXSN載體的EcoRI和Xhol位點之間。pLXSN質粒載體為Clontech公司開發的逆轉錄病毒載體，pLXSN質粒載體是plasmid-LTR-X-SV40promoter-Neomycin的縮寫，LTR=Longterminalrepeat,反轉錄病毒特有的長末端重複序列，即在10000nt全長基因組的兩端500nt左右相同序列的鹼基，能夠引導中間體DNA的產生及整合進人細胞的基因組/染色體中，也能夠引導從中間體DNA產生新的病毒RNA基因組/長RNA鏈，X=SequenceofInterest,感興趣的序列/目的序列，本專利中為獨特的1300ntHIV病毒序列，SV40promoter=Simianvacuolatingvirus40promoter猴空泡病毒的啟動子序列，在人細胞中仍具有啟動下遊序列產生RNA的很強能力，Neomycin=Neomycinresistantgene,新黴素抗性基因，細胞若含有此基因，且表達產物蛋白，則能夠抵禦環境中的新黴素毒性，SV40-Neomycin與目的序列合放一起，就可通過新黴素篩選來挑出(/使存活)含目的序列的細胞株——篩穩定轉染/生產細胞株。本發明第二方面公開了一種pLXSN質粒載體，它含有SEQIDNO:l的多核苷酸序列。本發明第三方面公開了一種宿主細胞，它是被pLXSN質粒載體所轉化的PT67細胞，其中，pLXSN質粒載體含有SEQIDNO:l的多核苷酸序列。本發明第四方面公開了上述人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒的製備方法，包括下列步驟3)培養上述宿主細胞；4)從培養物中分離出人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒。上述步驟1可採用細胞培養領域的常規配方培養，如DMEM，90%;小牛血清，10%;4mML-谷醯胺；100U/ml青黴素G鈉100pg/ml硫酸鏈黴素.1mM丙酮酸鈉。本發明第五方面公開了上述人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒在製備HIV-1病毒檢測的陽性參考品或HIV-1病毒檢測的標準品中的應用。上述HIV-1病毒檢測的陽性參考品包括HIV-1病毒檢測的PCR陽性參考品、RNA提取陽性參考品及逆轉錄陽性參考品。要獲得適合作為陽性對照或標準品的人免疫缺陷病毒工型的人工假病毒，合適的目的序列選取是關鍵，目的序列的選取主要需要考慮以下幾個方面的因素，首先，目的序列的序列在各種不同基因型的人免疫缺陷病毒I型中應該是保守的，即絕大多數基因型的HIV-1，也就是絕大多數病人所攜帶的HIV-1病毒，都具有這一段特定鹼基序列，其次，對於PCR和病毒包裝來說，片段越短效率越高，而對於模擬HIV-1的目的/功能來說，則越接近基因組全長越有代表性。綜合考慮上述因素，本發明選取了SEQIDN0:1的序列作為目的序列，按照標準NCBIreferencesequence(NC—001802)，該鹼基序列為HIV-1病毒337到1641位的序列，含有HIV-1gag基因的大部分(編碼衣殼蛋白)，但是翻譯起始密碼子不存在(巳作ATG—〉TTG突變)。選取該序列首先是因為該序列包含了HIV的基因組序列最為保守的序列，以此作為HIV-1通用定量檢測試劑盒的檢測參數/指標/對象，可以提高檢出率，降低漏檢率，且目前主要的商用和實驗室PCR檢測方法都針對此區域。其次，該序列PCR和病毒包裝效率高，與其他長片段相比，相對容易亞克隆進假病毒載體pLXSN，且其對應的病毒產率高達l(TlO8，且滴度、穩定性、靈敏度等均能滿足要求；試驗發現，含有HIV-1gag起始密碼子的HIV-1gag基因或HIV-1gag-pol雙基因均無法產生高滴度假病毒，推測HIV-1gag蛋白表達可能干擾反轉錄病毒的組裝，因為HIV-1gag蛋白與反轉錄病毒的衣殼蛋白畫LVgag在性質、分子量、名稱上都相似；換句話說，HIV-1與國LV是相似的病毒。本發明的人工假病毒易於獲得且安全廉價，可用作HIV-1病毒PCR、RNA提取和逆轉錄的陽性參考品或HIV-1病毒標準品。圖l:以pSPAX2質粒為模板，PCR擴增得到的HIVDNA序列電泳圖泳道1:DNA分子量標記，從上往下為2000，1000，750，500,250，lOObp。泳道2:DNA分子量標記，從上往下為10000，8000，7000，6000，5000，4000,3000,2000，1000bp。(上面7條未明顯分離開。)泳道3:PCR產物，約4300bp，模板是pSPAX2質粒。圖2:酶切圖，PCR片段和載體片段經限制性內切酶切割產生粘末端。泳道l:DNA分子量標記，從上往下為10000，8000,7000,6000，5000，4000，3000,2000，薩bp。(上面7條未明顯分離開。)泳道2:PCR產物經EcoRI和BglII酶切，所得條帶約3000bp與1300bp;1300bp條帶為目的條帶。泳道3:空白。泳道4:pLXSN載體經EcoRI和BamHI酶切，所得條帶約5850bp。圖3:酶切鑑定圖。把轉化所得的細菌培養過夜後提取質粒，酶切鑑定是否含有目的片段。泳道l:DNA分子量標記，從上往下為10000，8000，7000,6000,5000,4000,3000,2000，1000bp。(上面6條未明顯分離開。)泳道2:1號菌落質粒經HindIII酶切得到627，731，5828bp的條帶，表明含有目的片段。泳道3:2號菌落質粒經HindIII酶切得到627，731，5828bp的條帶，表明含有目的片段。泳道4:3號菌落質粒經HindlII酶切得到627，731，5828bp的條帶，表明含有目的片段。圖4:DNA標準模板realtimePCR檢測圖圖5:DNA標準模板realtimePCR檢測的Ct值標準曲線圖6:假病毒realtimePCR檢測(定量)圖Ct=20.48換算為滴度8.1Xl7拷貝/mL。圖7:實施例2假病毒作為陽參/標準品，梯度稀釋realtimePCR檢測圖。稀釋倍數原倍，10，100，1000，10000倍圖8:實施例2假病毒realtimePCR檢測Ct值稀釋曲線圖9:實施例2國家標準品realtimePCR檢測圖10000，1000，IOO個病毒。圖10:實施例2國家標準品realtimePCR檢測的Ct值標準曲線圖ll:實施例2陰性對照realtimePCR檢測圖圖12:4種HIV假病毒設計所對應的滴度測定圖(realtimePCR法)具體實施例方式下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明，而非限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。實施例1人免疫缺陷病毒I型人工假病毒的製備1.含HIV-l序列的質粒載體製備，及轉染生產細胞。1.1克隆目的HIV-1DNA。pSPAX2質粒源於Addgene公司，含HIV-1病毒的gag-pol雙基因區域，這正是本實驗所需DNA。以pSPAX2質粒作為模板，PCR擴增到足夠HIV-1DNA序列(結果如圖1所示，4300bp)。混合H2010XPCRbufferd,sHIV-1gagTTGsenseHIV-lpolantisK0D+pSPAX2模板PCR熱循環條件第一步94°C3min。第二步94。C25sec，57°C30sec,68°C4min30sec;30循環。第三步68°C3min。電泳，紫外光下切膠回收按照膠回收試劑盒說明書操作。引物序列gagEcoRIsense:CTGGAATTCACTGGTGAGAGITGGpolXholantis:GGTCCTCGAGTTAATCCTCATCCT注DNA聚合酶T0Y0B0公司(株式會社)的K0D+DNApolymerase。及其對應的10XPCRbuffer,Mg2+(25mM'25X)和dNTPs(2mMeachofdATP，dTTP，dCTP，dGTP，10X)。PCR管普通薄壁PCR管(0.2mL型)PCR儀博日定性PCR儀。引物下劃線處為突變位點。1.2HIV-1DNAPCR產物和質粒載體酶切。PCR產物酶切PCR產物(gagTTG-pol)——17pL10XHbuffer——2pLEcoRI-0.5pLBglII——0.5(aL37°C處理10-20hr。載體酶切H20——16nLpLXSN載體——l^L10XHbuffer-2^LEcoRI-0.5|aLBamHI-0.5pL37。C處理IO-20hr。注EcoRI，BglII，BamHI及配套的10XHbuffer,10XKbuffer,為寶生物(大連)株式會社產品。BglII和BamHI為同尾酶。1.3酶切後的HIV-1DNAPCR產物和質粒載體進行連接反應。酶切後PCR產物(gagTTG)——16|aL酶切後pLXSN載體——ljuL10XT4ligationbuffer-2pLT4腿ligase-lpL16°C處理10-20hr。注T4DNAligase,及配套的10XT4ligationbuffer,為寶生物(大連)株式會社產口口o1.4連接產物轉化感受態大腸桿菌。從-7(TC冰箱取出一管(10(VL)感受態細胞(DH-5a大腸桿菌)，解凍。加連接產物(步驟1.3)，混勻。冰浴30min.42°C熱激90sec。冰浴2min。加lmLLB，150-200rpm搖40_60min.37。C。離心，3000rpm,3min。吸走部分上清，留下100-30(VL，用移液器混勻上清和沉澱，塗布於氨苄青黴素LB瓊脂平板。37。C培養14-16hr。1.5從菌落中篩選/鑑定預期的重組質粒(酶切法)。1.5.1提取質粒。從平板上挑選3個菌落，於3mLLB中搖床培養，15小時後按照Qiagen說明書提取質粒。(鹼裂解/矽基質吸附法。)1.5.2酶切鑑定。H20——14|iL待鑑定質粒——4|uL10XMbuffer——2|iLHindIII——0.5|uL37°C處理IO-20hr。陽性標準可見627'731，5828bp明亮的電泳條帶。注HindIII，及配套的10XMbuffer,為寶生物(大連)株式會社產品。1.5.3測序鑑定。把一個陽性菌落送測序公司進行鑑定，測序引物用載體附帶的pLXSN5'primer和pLXSN3'primer。測定結果符合預期。1.6轉染生產細胞生產細胞是培養於35mm皿的PT67細胞(clontech公司)，細胞匯合度在50-80%時換液，開始轉染。A液DMEM250pL+脂質體lO(iL，混勻，靜置5min;B液DMEM250(xL+質粒(pLXSN-gagTTG)4嗎[20nL(0.2一L)]，混勻，靜置5min;混合A液和B液，混勻，靜置20min;加入到細胞上清。4-7hr後再次換液。轉染48-72hr後收穫粗病毒(細胞培養基上清)。注脂質體是Lipofectamine2000(Invitrogen).2.細胞培養及假病毒的獲得2.1細胞的復甦。將液氮凍存的細胞(凍存管中)於37。C水浴融解，立即用酒精棉擦拭，移入培養皿(如60mm直徑的培養皿)，添加合適體積的完全培養基(如5mL適合60mm皿)。12-24hr後換液，去除未貼壁的細胞。此後正常培養(完全培養基用於PT67細胞，條件培養基用於穩定轉染了目標質粒的PT67細胞)。2.2細胞的培養貼壁的細胞用完全培養基(PT67細胞)或條件培養基(穩定轉染了目標質粒的PT67細胞)培養，每2-3天換液，即移去舊培養上清，加入等體積新鮮培養基。細胞在70-90%匯合度時應該消化，然後傳代或凍存。注l:完全培養基面EM(含L-Glutamine4mM禾口sodiumpyruvateacidlraM)+FBS(10%)+penicillin(100U/mU+str印tomycin(100)ng/mU注2:條件培養基DMEM(含L-Glutamine4mM禾口sodiumpyruvateacidImM)+FBS(10%)+G418(0.6mg/mL)。注3:FBS(FetusBovineSer咖，胎牛血清)是Invitrogen(澳大利亞)公司的產品，品牌為Gibco;其餘均為Sigma-Aldrich公司產品。2.3細胞的消化。貼壁細胞用DMEM洗滌一次，加胰酶(0.25%)lmL,l-2min後，吸去胰酶。胰酶消化液0.25%Trypsin(牛胰蛋白酶，Invitrogen公司，Gibco品牌)。2.4細胞的傳代。消化後，加完全培養基，用移液器輕輕吹起細胞，分至所需培養皿，一般1份傳3-10份。2.5細胞的凍存。消化後，加細胞凍存液，轉移至凍存管，立即存於-2(TC，卜2hr，此後轉移到-70°C，5-24hr，此後凍存於液氮。細胞凍存液DMEM(含L-Glutamine4mM和sodiumpyruvateacidlmM，70%體積)+「83(20%體積)+DMS0(Dimethylsulphoxide,10%體積)注:DMS0為Sigma-Aldrich公司產品。2.6細胞的篩選。使用條件培養基培養細胞。G418含量為0.6rag/mL，基於濃度梯度敏感實驗(killingcurvs)o2.7假病毒的獲得和目的核酸的定量/滴度測定。2.7.1對瞬時轉染的細胞，轉染48-72hr後收穫粗病毒(細胞培養基上清，離心2000rpm10min後，取上清)。對穩定轉染的細胞，則當細胞密度達到50-90%，培養48-72hr後收穫粗病毒(細胞培養基上清，離心2000rpm10min後，取上清)。2.7.2(採用TRIzol法提取假病毒RNA。)向100|iLHIV-1粗病毒中加TRIzol(Invitrogen公司)O.5mL，充分搖勻，靜置5-15min加lOOiaL三氯甲烷(氯仿，CHC13)，劇烈搖勻，靜置10-20ra]'n。離心，12000rpm,15min.小心地吸取離心管上層清澈液體，體積為V(通常400pL左右)。加異丙醇，體積0.8V(30(VL左右);加糖原(Glycogen)助沉,約1^(20叫，母液)。離心，12000rpm，15mi.n.留沉澱，加70%~80%乙醇洗滌。離心，7000-8000rpm,10-15min，留沉澱。離心，3000-5000rpin，lmin，留沉澱。30pLDEPC水溶解RNA沉澱。2.7.3取DNA標準品(模板)(HIV-1線性化DNA/PCR產物，經OD/吸光度測量和電泳條帶光密度掃描測定濃度)稀釋一定倍數後，得到102，103,104,105,106數量的模板。與2.7.2獲得的假病毒RNA同時進行RealtimePCR(採用上海之江公司的HIV-1RNA/DNA定量檢測試劑盒)。標準品的擴增曲線如圖4所示，假病毒定量曲線如圖6所示，設定閾值為0.02,得到各自的Ct值(ThresholdCycle)。把各數量級標準品的Ct與數量的對數(IO為底)作圖，得到標準曲線，如圖5。並得到線性關係方程，Y=-3.403X+41.34(X為模板DNA數量的對數，Y為該模板對應測得的Ct值)，相關係數R^0.99，說明線性非常好。經過計算(標準曲線和稀釋度)，假病毒滴度(假病毒顆粒數量)約8.IX107。3.獲得的假病毒理化性能測試，致病性評估試驗3.1理化性能測試蛋白印記實驗(WesternBlotAssay)。取100pL假病毒原液，用20nL裂解液(250mMTris-HCl，10%SDS，0.5%溴酚藍，50%甘油，5%(3-巰基乙醇)處理。進行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)，然後把蛋白條帶轉膜至硝酸纖維素膜，分別用anti-p24mAb(抗-逆轉錄病毒核衣殼蛋白capsid/p24單抗)和anti-10AlMb(抗-逆轉錄病毒膜蛋白10A1單抗)進行孵育，1-2小時後，添加HRP-pAb(辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗)進行顯色。結果——得到陽性信號(在預期的位置出現單一條帶)，該試驗表明病毒核衣殼蛋白、膜蛋白，以及病毒RNA(見定量結果)共同存在，這符合逆轉錄假病毒的特徵。3.2致病性測試細胞培養實驗。在正常培養的A549(人肺細胞系)和H印G2(人肝細胞系)中，各投入lmL假病毒，第1，3，5，10，15天用顯微鏡觀察細胞形態，以及檢査細胞活力(MTT法)。結果——細胞形態正常，活力也正常。說明假病毒對細胞無明顯毒性。4.不同目的基因的假病毒性能比較試驗參考前述方法，設計了HIV-1的4種區段，分別製備假病毒[1]gag-pol雙基因，含起始密碼子和終止密碼子，4300bp;[2]gag-pol雙基因，起始密碼子被突變去除(ATG—〉TTG)，含終止密碼子(TAA)，4300bp;[3]部分gag基因，含起始密碼子，不含終止密碼子，1300bp;[4]部分gag基因(本發明)，起始密碼子被突變去除(ATG--〉TTG)，不含終止密碼子(TAA)，1300bp。同時測定滴度，比較高低。結果如圖12所示，觀K定發現，前三種假病毒的滴度很低，而第四種假病毒滴度較高。從左到右，四條曲線分別代表1，gag-TTG，測算得滴度8.1X107;2，gag-TTGpol，測算得滴度3.1X106;3，gagpol，測算得滴度1.3X106;4，gag，測算得滴度7.7X105;很明顯，gag-TTG假病毒(部分gag基因，起始密碼子被突變去除(ATG—〉TTG)，不含終止密碼子(TAA)，1300bp)滴度高出其餘設計20倍以上(25-IOO倍)。實施例2人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒的應用(l)作為RNA提取的對照。取下述樣品a，lOOiaL假病毒原液(按實施例1的方式製備)。數量約為1X107。b,以lOpL假病毒原液+9(^L牛血清進行10倍稀釋,假病毒總量相當於10|aL原液。數量約為1X106。c，以10pL上級病毒液+90pL牛血清進行10倍稀釋，假病毒總量相當於ljaL原液。數量約為1X105。d，以10pL上級病毒液+9(VL牛血清進行10倍稀釋,假病毒總量相當於0.lpL原液。數量約為1X104。e,以10pL上級病毒液+9(VL牛血清進行10倍稀釋，假病毒總量相當於0.OlpL原液。數量約為1X103。f，10(VL牛血清。作為陰性對照。g,1(%LHIV-1RNA國家定量標準品Bl，HIV-1RNA理論濃度為105IU/mL，含量為104IU。h，IOO^iLHIV-1RNA國家定量標準品B2，HIV-1認A理論濃度為104IU/mL，含量為103IU。i,1(%LHIV-1RNA國家定量標準品B3，HIV-1RNA理論濃度為103IU/mL，含量為102IU。j,IO(VLHIV-1RNA國家陰性參考品Nl，HIV-1RNA理論濃度為0IU/mL，含量為0IU。上述10種樣本同時提取RNA，方法與〃實施例1-2.7.2〃中相同。提取所得RNA的逆轉錄及檢測結果參見下述(2)的部分。注l:HIV-1RNA國家標準品包括6個定量標準品、5個線性標準品、8個陰性對照、8個陽性對照)，是目前唯一法定的HIV-1RNA診斷試劑參考品。由中國藥品生物製品檢定所製備，全部為人血漿。定量標準品濃度為105、104、1(flU/mL三個水平，同時可作為陽性參考品；陰性參考品Nl為不含HIV-1的血清；本實驗取此四份關鍵參考品來作對照。注2:牛血清為Invitrogen(澳大利亞)公司的產品，品牌為Gibco。(2)作為逆轉錄反應的對照。取(1)中所述10份樣品的RNA提取物，進行逆轉錄反應，方法如下混合液A:RNA15|dL，5XRTbuffer5|liL,隨機引物hexamer3|nL，混勻，70。C處理5min，立即冰浴5min。混合液B:混合液A23pL,dNTPs(10mMeach)lpL,RTase(Promega公司顧LV逆轉錄酶)lpL，混勻，25°C10-20min，42°C30-80min,70°C10-20min。即為逆轉錄產物-c醒。檢測結果參見下述的(3)。(3)作為realtimePCR的對照和標準品。取(2)中所述10份樣品的脂A逆轉錄產物(即cDNA)，進行realtimePCR定量。方法參見儀器(AppliedBiosystems公司ABI7000定量PCR儀、上海宏石SLAN定量PCR儀)及試劑盒說明書(之江公司HIV-1RNA/DNA定量試劑盒)。反應液PCRmix-30uLTaqDNApolymerase-0.4uLcDNA樣本——lOuL反應條件第一步，95'C——4min，第二步，95'C——15sec，60'C——lmin，螢光檢測；循環40次。結果(如圖7-ll所示)表格htableseeoriginaldocumentpage16tableseeoriginaldocumentpage17結論由定量結果可知，本公司(之江公司)的假病毒在核酸提取、逆轉錄反應、realtimePCR過程中，靈敏度和線性度與國家標準品(代表臨床樣本)相近，提示其可以作為參考品或標準品使用。但拷貝數轉換為國際單位(IU)約為10:1。g卩，假病毒原液濃度8.lX10'拷貝AiL(根據公司標準品)，相當於國際濃度8.1X107IU/mL。formulaseeoriginaldocumentpage18ttgttggtcccccagattgttaaaagcsttgggaccaggs1020gcgacactaggacagcatgtcagggagtggggggacccggcc已taaagca1080卿gtttt.ggggigcceiagta3caaatcc已gctacc3t幼tg3t3caga幼1140ggcaattttaggaaccaaag3犯g3Ctgttaagtgtttcaattgtggcaaagaagggcac1200atagcca^aaattgcagggcccctaggaaaaagggctgttggaa已tgtgg3已3gg3agg31260aagattgtactg卿gac己ggctaattttt1306〈210〉2〈211>5874〈212〉DNA〈213〉artificialsequence<223〉pLXSN載體〈400〉2tttga^gsccccacccgtaggtgg認gctagcttaagtaacgccactttgcaaggcat60at已ELCtgELgatcagatcaaggtcagg犯C3犯g犯acagc1203C￡Lgg3ta_tCtgtggt鄉cggttcctgccccggctcagggccaagaaca180g3tg聊C3gctgagtgatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccgg240ctcggggccaagaacagatggtccccagatgcggtccagccctcagcagtttctagtgaa300tcatcagatgtttcc已gggtgccccaaggaaccctgtacctta"tttgaac360taaccaatC3gttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttccgctctccgagctcaataaa420agagcccacaacccctcactcggcgcgccagtcttccgat3gactgcgtcgcccgggtac480ccgtattcccaata犯gcctcttgctgtttgcatccgaatcgtggtctcgctgttccttg540gg鄉gtctxCtCtg8gtgattgactacccacgacgggggtctttcatttgggggctcgt600ccgggatttggsgacccctgcccagggacc3ccgacccaccaccgggaggtaagctggcc660ctgtgtctgtccgattgtctagtgtctatgtttgatgttatgcgcctgcg720tctgtactagttagctaactagctctgtatctggcggacccgtggtgg犯ctgacgagtt780ctgaacacccggccgcaaccctggg卿cgtXCCElgggSLCtttgggggccgtttttgtgg840cccgacctgagg83ggg3gtcgstgtgg犯tccgaccccgtc郷3tatgtggttctggt9003gg卿Cg3gagttcccgcctccgtctgaatttttgctttcggtttggaa960ccgaagccgcgcgtcttgtctgctgcagcgctgcagcatcgttctgtgttgtctctgtct1020gactgtgtttct.gtatttgtCtgaELagLttELgggcc卿ctgttaccactcccttaagttt1080gaccttaggtcax;tgga犯gatgtcgagcggatcgctcac犯ccagtcggtageitgtcaa1140g33g卿Cgttgggttaccttctgctctgc3g犯tggCC已acctttaacgtcggatggcc1200gcg卿cggcacctttaaccgagacctcatcacccaggtt犯ggLtcaa^ggtcttttcacc1260tggcccgcatggacacccagaccaggtcccctacatcgtgaxxtgggaagccttggcttt1320tgacccccctccctgggtcaagccctttgtacaccctaagcctccgcctcctcttcctcc1380atccgccccgtctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctcccttta1440tccagccctcactccttctct鄉cgccggctcgaggatccggctgtgga1500atgtgtgtcagttagggtgtgg犯agtccccaggctccccagc郷c卿1560gcatgcatctcaattagtcagCEL3CC3ggtgtggaaagtccccaggctccCC6LgC￡LggCa1620aagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgc1680ccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattt1740tttttatttatgc卿ggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtEigtgag1800gaggcttttttggaggcctaggcttttgca犯犯gcttgggctgcaggtc眺gcggstc1860tgatcaaLgsg雄gg3tgaggatcgtttcgcatgattg犯c犯gatggattgcacgc鄉1920ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcgg1980ctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaa2040gaccgscctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggct2100ggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactg犯gcggg犯ggga2160ctggctgctattgggcg鄉tgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgc2220tccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctac2280ctgcccattcga^ccgtccaeLgcgeiaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatgg鄉c2340cggtcttgtcgat.caggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgasct2400gttxgccaggctc犯ggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcga2460tgcctgcttgtggccgcUttctggattcatcgactgtgg2520ccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctga2580卿gcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgaformulaseeoriginaldocumentpage21tgatccggcacgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagatt44403CgCgCag3atcaag犯gstcctttgatcttttctacggggtctgacgct4500cagtgga^cgaa犯ctcacgttaagggattttggtcatg3aaggatcttc4560acctagatcca犯atgaagt111aaatcaaatatgagtaa_4620已cttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtcta4680tttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgt卿taactacgatacgggagggc4740ttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagat4800agccgg鄉ggccgagcgcag鄉tggtcctgcaacttta4860tccgcctccatccagtctatt犯ttgttgccggg犯gctagagt犯gtagttcgccagtt4920a^t3gtttgcgcaacgttgttgccattgctgc郷catcgtggtgtcacgctcgtcgttt4980ggt3tggcttcattcagctccggttcccaacgatc犯ggcgagttacatgatcccccaitg5040ttgtgC33犯犯gCggtt3gctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggcc5100gcagtgttatcactc已tggttatggcagcactgcat肌ttctcttactgtcatgccatcc5160gtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaacc肌gtC6LttCtg6lgELatagtgtatg5220cggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcei￡LCaCgggdt￡L￡Lt￡LCCgCgCCElCat￡LgC8Lg￡L5280aLCttt肌^gtgctcatcattgg犯aacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatctta5340CCgCtgttggLgatccagttxgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatct5400tttactttcaccagcgtttctgggtgagca犯aacagga3ggc犯aatgccgc犯aaagLg5柳gg犯t鄉ggcgacacggaaatgttg犯tactcatactcttcctttttcaatattattga5520agcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacat已tttgaatgtat5580gggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaacc5640tgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaa5700gai3ttgctagc犯ttgctagc犯ttgctsgcaattc3t3ccagatcaccgaaaactgtcc5760tccaaatgtgtccccctcacactcccaaat"tcgcgggcttctgcctcttagaccactcta5820ccctattcccggagccaa郞ccgcggcccttccgtttctttgct587權利要求1.一種人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒，為反轉錄病毒，由pLXSN質粒載體所轉化的PT67細胞產生，其中，pLXSN質粒載體含有SEQIDNO1的多核苷酸序列。2.如權利要求1所述人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒，其特徵在於，所述SEQIDNO:1位於pLXSN載體的EcoRI和Xhol位點之間。3.—種pLXSN質粒載體，它含有SEQIDN0:1的多核苷酸序列。4.如權利要求3所述pLXSN質粒載體，其特徵在於，所述SEQIDN0:1位於pLXSN載體的EcoRI和Xhol位點之間。5.—種宿主細胞，它是被權利要求3或4所述pLXSN質粒載體所轉化的PT67細胞。6.—種人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒的製備方法，包括下列步驟1)培養權利要求5所述宿主細胞；2)從培養物中分離出人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒。7.如權利要求1或2所述人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒在製備HIV-1病毒檢測的陽性參考品或HIV-1病毒檢測的標準品中的應用。8.如權利要求7所述人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒的應用，其特徵在於，所述HIV-1病毒檢測的陽性參考品包括HIV-1病毒檢測的PCR陽性參考品、RNA提取陽性參考品及逆轉錄陽性參考品。全文摘要本發明公開了人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒及其製備與應用。本發明的人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒為反轉錄病毒，由pLXSN質粒載體所轉化的PT67細胞產生，其中，pLXSN質粒載體含有SEQIDNO1的多核苷酸序列。本發明的人工假病毒易於獲得且安全廉價，可用作HIV-1病毒PCR、RNA提取和逆轉錄的陽性參考品或HIV-1病毒標準品。文檔編號C12N5/10GK101418286SQ20081020413公開日2009年4月29日申請日期2008年12月5日優先權日2008年12月5日發明者鋆張,邵俊斌申請人:上海之江生物科技有限公司