酪氨醯-trna合成酶多肽的血小板生成活性的製作方法

2023-06-02 15:18:46

專利名稱：酪氨醯-trna合成酶多肽的血小板生成活性的製作方法
技術領域：
本發明一般地涉及血小板生成組合物，該組合物包含酪氨醯-tRNA合成酶多肽， 包括其截短體和/或變體，以及涉及利用這種組合物治療疾病或疾病狀態的方法，所述疾 病或疾病狀態受益於增加的血小板生成，諸如與血小板減少症有關的疾病或疾病狀態。
背景技術：
血小板減少症一般涉及其中個體的每單位體積外周血的血小板數目低於正常的 疾病狀態。例如，正常血小板計數一般為約150，OOOmm3至約450，OOOmm3,而血小板減少症 的特徵通常為血小板計數降低到約100，000/mm3或更少。血小板(Platelets)或凝血細胞(thrombocytes)是無色的血細胞，其在血液凝集 中通過聚集在一起和在血管洞形成栓塞而發揮重要作用。血小板生成指血小板從前體造血 細胞諸如巨核細胞形成的過程。血小板生成主要受促血小板生成素的調節，促血小板生成 素進一步受多種機制調節，諸如應答增加的血小板水平時受體介導的攝取和破壞等。血小板減少症與許多潛在的因素有關，諸如增加的血小板的破壞、減少的血小板 產生、血小板的消耗、血小板的誘捕，以及藥劑誘發的血小板減少症。考慮到血小板在血凝 中的中心作用，血小板減少症的最初症狀通常包括多種形式的出血和紫癜。因為個體處於 增加的出血風險中，早期診斷和治療是重要的，特別是阻止進展為更為嚴重的症狀，諸如腦 出血。降低的血小板計數的疾病狀態的治療通常受病因學和疾病嚴重度指導。目前可用 的用於血細胞減少症以及相關疾病狀態的治療包括，例如，皮質類固醇類、IVIG、脾切除術 和血小板輸注，這些方法是減輕性非特異的，或者是強烈的但昂貴的。此外，以前利用血小 板生成的主要生物介質促血小板生成素的努力在臨床上沒有取得成功，因為在患者觀察到 嚴重效應，所述患者產生了對該藥物的免疫反應，以及隨後產生對他們自己的內源性促血 小板生成素的免疫反應。促血小板生成素模擬物和促血小板生成素受體的小分子激活劑在 開發中，但尚未得到食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批准。
催化tRNA分子的氨醯化的氨醯-tRNA合成酶在翻譯過程中對於解碼遺傳信息是 必不可少的。在高等真核生物中，氨醯-tRNA合成酶與其他多肽結合以形成超分子多酶復 合物。每種真核生物的tRNA合成酶由核心酶和另外的結構域組成，核心酶與對應的原核 tRNA合成酶密切相關，所述另外的結構域附加在核心酶的氨基末端或羧基端。例如，人酪氨醯-tRNA合成酶(YRS)具有羧基末端結構域，其不是原核生物和低等真核生物的YRS分子 的一部分。氨醯tRNA合成酶，諸如酪氨醯-tRNA合成酶，目前與哺乳動物細胞內的擴展功能 有關，包括信號轉導通路中的活性等。發明概述本發明源自以下意想不到的發現包含酪氨醯-tRNA合成酶(YRS)多肽的組合物， 包括其截短的和/或變異的多肽，刺激體內血小板生成(即增加血小板形成)。因此，本發 明的實施方案一般可以用於治療和/或降低發展為與血小板減少症或降低的血小板水平 有關的疾病或疾病狀態。某些實施方案包括增加個體內血小板計數的方法，其包括給予個體包含血小板生 成有效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽的組合物，由此增加個體內的血小板計數。某些實 施方案包括治療個體血小板減少症或降低個體發展為血小板減少症的風險的方法，其包括 給予個體包含血小板生成有效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽的組合物，由此治療個體的 血小板減少症或降低個體發展為血小板減少症的風險。某些實施方案包括刺激個體的血小 板生成的方法，包括給予個體包含血小板生成有效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽的組合 物，由此刺激個體的血小板生成。某些實施方案包括維持個體(例如，經歷與降低的血小板 計數有關的治療的個體)的血小板計數的方法，其包括給予個體包含血小板生成有效濃度 的酪氨醯-tRNA合成酶多肽的組合物，由此維持個體的血小板計數。某些實施方案包括刺激個體的巨核細胞遷移、增殖和/或分化的方法，其包括給 予個體血小板生成有效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，由此刺激個體的巨核細胞增殖和 /或分化。某些實施方案包括刺激個體的嗜中性細胞遷移或增殖的方法，其包括給予個體血 小板生成有效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，由此刺激個體的嗜中性細胞增殖。在某些方面，個體患與降低的或減少的血小板計數有關的疾病或疾病狀態，或者 處於患與降低的或減少的血小板計數有關的疾病或疾病狀態的風險中。在某些方面，個 體具有約100，000/mm3或更低的、約110，000/mm3或更低的、約120，000/mm3或更低的、約 130，000/mm3或更低的、約140，000/mm3或更低的、或者約150，000/mm3或更低的血小板計 數。在某些實施方案中，與降低的或減少的血小板計數有關的疾病或疾病狀態包括，但不限 於出血、瘀傷、鼻衄(鼻出血)、脾功能亢進、低體溫、Epstein-Barr病毒感染、傳染性單核 細胞增多症、Wiskott-Aldrich症候群、母源性噻嗪類藥物攝入、先天性缺巨核細胞性血小 板減少症、血小板減少-橈骨缺失症候群、範科尼貧血(Fanconi Anemia)、巨大血小板綜合 徵(Bernard-Soulier syndrome)、May_Hegglin 畸形(May-Hegglin anomaly)、灰白血小板 症候群(Grey platelet syndrome)、奧爾波特症候群(Alport syndrome)、新生兒風疹、再 生障礙性貧血、骨髓增生異常症候群、白血病、淋巴瘤、骨髓的腫瘤、癌症、營養缺乏、放射接 觸、肝功能衰竭、細菌性膿毒症、麻疹、登革熱、HIV感染或AIDS、早熟、胎兒成紅細胞增多症 (erythroblastosis fetalis)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、母源性ITP、溶血尿毒症綜 合徵、彌散性血管內凝血、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、輸血後紫癜、系統性紅斑狼瘡、 類風溼性關節炎、新生兒同種免疫血小板減少症、和陣發性睡眠性血紅蛋白尿症、C型肝炎 病毒感染(HCV)、藥劑誘發的的血小板減少症、和化療誘發的血小板增多症(CIT)，以及本 領域已知的其他疾病。在某些方面，個體是血小板供者。
在某些實施方案中，與降低的或減少的血小板計數有關的疾病狀態是由藥劑或 藥品誘發的(例如，藥劑誘發的血小板減少症、化療誘發的血小板增多症)。降低血小板 計數的藥劑或藥品可以選自化療劑、非留體抗炎劑、磺胺類藥、萬古黴素、氯吡格雷、糖蛋 白Ilb/IIIa抑制劑、幹擾素、丙戊酸、阿昔單抗、利奈唑胺(linezolid)、法莫替丁、美貝 維林(mebeverine)、組胺阻斷劑、烷化劑、肝素、乙醇和抗生素。在某些實施方案中，化療 劑可以選自順鉬(CDDP)、卡鉬(carboplatine)、甲基苄胼(procartazine)、氮介、環磷醯 胺、喜樹鹼、異環磷醯胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝 基尿、更生黴素(dactinomycin)、道諾黴素、阿黴素(doxorubicin)、博來黴素、普卡黴素 (plicomycin)、絲裂黴素、依託泊苷(VP 16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結合劑、紫杉 酚、吉西他濱、長春瑞賓、法尼基蛋白轉移酶抑制劑、反鉬(transplatinUm)、5-氟尿嘧啶、 長春新鹼、長春花鹼和甲氨蝶呤、Temazolomide (DTIC水性形式)，或者前述的任一類似物 或衍生物變體。在要求保護的方法的某些實施方案中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含哺乳動物酪 氨醯-tRNA合成酶，包括在它的C末端截短的哺乳動物酪氨醯-tRNA合成酶。在本文提供的 某些方法中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO 1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序 列，其中約1-50個胺基酸殘基從它的C末端截去。在本文提供的某些方法中，酪氨醯-tRNA 合成酶多肽包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中約50-100個胺基酸 殘基從它的C末端截去。在某些實施方案中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID N0:1, 2,3,6,8,10，12或14的胺基酸序列，其中約100-150個胺基酸殘基從它的C末端截去。在 其他實施方案中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO 1，2，3，6，8或10的胺基酸序列， 其中約150-200個殘基從它的C末端截去。在其他實施方案中，本文提供的方法包括其中 酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO 1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中約200-250 個胺基酸殘基從它的C末端截去。C-末端截短的酪氨醯-tRNA合成酶多肽的特定實例包括 如下的多肽其包含或由SEQ ID NOS :1，2或3所示的胺基酸序列的胺基酸1-343、胺基酸 1_；344、胺基酸1-350、胺基酸1-353或胺基酸1-364組成。C-末端截短的酪氨醯-tRNA合 成酶多肽的另外實例包括SEQ ID NOS 3和8的多肽。在本發明方法的某些實施方案中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含在其N-末端截 短的哺乳動物酪氨醯-tRNA合成酶。在本文提供的某些方法中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中約1-50個胺基酸殘基從它的 N-末端截去。在本文提供的某些方法中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO =1,2,3, 6,8,10，12或14的胺基酸序列，其中約50-100個殘基從它的N末端截去。在某些實施方 案中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO 1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其 中約100-150個胺基酸殘基從它的N-末端截去。在其他實施方案中，酪氨醯-tRNA合成酶 多肽包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中約150-200個殘基從它的N-末 端截去。在其他實施方案中，本文提供的方法包括其中酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中約200-250個胺基酸殘基從它的N-末端截去。 N-末端截短的酪氨醯-tRNA合成酶多肽的特定實例包括SEQ ID NOS :6，10，12和14的多 肽。在本文提供的某些方法中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽選自(a)包含與SEQ ID NO 2中所示的胺基酸序列至少80%—致的胺基酸序列的多肽，其中在341位的丙氨酸不被酪 氨酸取代；(b)包含與SEQ ID NO 2中所示的胺基酸序列至少90% —致的胺基酸序列的多 肽，其中在341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(c)包含與SEQ ID NO 2中所示的胺基酸序列 至少95%—致的胺基酸序列的多肽，其中在341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(d)包含與 SEQ ID NO :2中所示的胺基酸序列至少98%—致的胺基酸序列的多肽，其中在341位的丙 氨酸不被酪氨酸取代；以及(e)包含SEQ ID NO 2中所示的胺基酸序列的多肽。在本文提供的某些方法的實施方案中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽選自(a)包含與 SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的胺基酸序列至少80% —致的胺基酸序列的多 肽；(b)包含與SEQ ID而1，2，3，6，8，10，12或14中所示的胺基酸序列至少90%—致的氨 基酸序列的多肽；(c)包含與SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的胺基酸序列至少 95%—致的胺基酸序列的多肽；(d)包含與SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的氨 基酸序列至少98%—致的胺基酸序列的多肽；以及(e)包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12 或14中所示的胺基酸序列的多肽。除了本文所描述的方法外，本發明的某些實施方案包括適合用於給藥的組合物， 其包含本文所描述的生理學上可接受的賦形劑和/或載體，以及血小板生成有效濃度的酪 氨醯-tRNA合成酶多肽。其中，該組合物能夠刺激血小板生成(例如，增加或維持個體的血 小板計數)、刺激巨核細胞增殖和/或分化、和/或刺激個體的嗜中性細胞增殖。在某些組 合物中，如上文和本文其他位置所描述的，酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含在它的C-末端截 短的哺乳動物酪氨醯-tRNA合成酶。在某些組合物中，如上文和本文其他位置所描述的，酪 氨醯-tRNA合成酶多肽包含在它的N-末端截短的哺乳動物酪氨醯-tRNA合成酶。在某些實施方案中，本文所描述的血小板生成組合物包含酪氨醯-tRNA合成酶多 肽，其選自(a)包含與SEQ ID NO :2中所示的胺基酸序列至少80%—致的胺基酸序列的 多肽，其中在341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(b)包含與SEQ ID NO :2中所示的胺基酸序 列至少90%—致的胺基酸序列的多肽，其中在341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(c)包含與 SEQ ID NO :2中所示的胺基酸序列至少95%—致的胺基酸序列的多肽，其中在341位的丙 氨酸不被酪氨酸取代；(d)包含與SEQ ID NO 2中所示的胺基酸序列至少98%—致的氨基 酸序列的多肽，其中在；341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；以及(e)包含SEQ ID NO :2中所示 的胺基酸序列的多肽。在某些實施方案中，本文所描述的血小板生成組合物包含酪氨醯-tRNA合成酶多 肽，其選自:(a)包含與SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的胺基酸序列至少80% 一致的胺基酸序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的胺基酸 序列至少90%—致的胺基酸序列的多肽；(c)包含與SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中 所示的胺基酸序列至少95%—致的胺基酸序列的多肽；(d)包含與SEQ ID N0:l，2，3，6，8， 10，12或14中所示的胺基酸序列至少98%—致的胺基酸序列的多肽；以及(e)包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的胺基酸序列的多肽。在某些實施方案中，本發明的組合物還包含第二酪氨醯-tRNA合成酶多肽，包括 其中兩個酪氨醯-tRNA合成酶多肽形成二聚體。在某些方面，該二聚體是同型二聚體。在其 他方面，該二聚體是異質二聚體，例如全長酪氨醯-tRNA合成酶多肽和截短的酪氨醯-tRNA 合成酶多肽之間的異質二聚體。在某些實施方案中，本發明的組合物還包含異源性多肽，其中酪氨醯-tRNA合成酶多肽和異源性多肽形成異質二聚體，例如雙功能異質二聚體。在某些實施方案中，本文所提供的血小板生成組合物包含生理學上可接受的賦形 劑和/或載體，以及血小板生成有效濃度的嵌合的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，其中嵌合的多 肽包含酪氨醯-tRNA合成酶多肽的兩個或更多個生物活性片段，其中所述兩個或更多個片 段包含YRS多肽的至少10個連續的胺基酸，其中所述兩個或多個片段相連接以形成嵌合的 多肽，以及其中嵌合的酪氨醯-tRNA合成酶多肽能夠刺激個體的血小板生成和/或增加個 體的血小板計數。在某些實施方案中，本文所提供的血小板生成組合物包含生理學上可接受的賦形 劑和/或載體，以及血小板生成有效濃度的嵌合的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，其中嵌合的多 肽包含(a)酪氨醯-tRNA合成酶多肽的一個或多個生物活性片段，其中所述一個或多個片 段包含YRS多肽的至少10個連續的胺基酸；以及(b) —個或多個異源性多肽，其中(a)中 的一個或多個片段和(b)中的一個或多個異源性多肽相連接以形成嵌合的多肽，以及其中 嵌合的多肽能夠刺激個體的血小板生成(即，增加或維持個體的血小板計數)、刺激巨核細 胞增殖和/或分化、和/或刺激個體的嗜中性細胞增殖。某些實施方案涉及刺激早期巨核細胞祖細胞增殖和/或分化的方法，其包括用酪 氨醯-tRNA合成酶多肽孵育造血幹細胞的培養物足夠的時間以允許早期巨核細胞祖細胞 的增殖，從而刺激早期巨核細胞祖細胞的增殖和/或分化。在某些實施方案中，離體或體外 實施該方法。在某些實施方案中，培養物從骨髓獲得。在某些實施方案中，培養物從臍帶血 獲得。在某些實施方案中，這種方法還包括將所述細胞給予有需要的個體。某些實施方案涉及刺激表達CXCR-2的細胞遷移的方法，其包括，用酪氨醯-tRNA 合成酶多肽接觸該細胞，從而刺激表達CXCR-2的細胞的遷移。在某些實施方案中，接觸細 胞的步驟在體外或離體發生。在某些實施方案中，接觸的步驟包括給予有需要的個體組合 物，該組合物包含有效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽。某些實施方案涉及減輕個體的肺部炎症和/或其症狀的方法，其包括給予個體有 效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，從而減輕個體的肺部炎症和/或其症狀。在某些實施 方案中，個體有慢性阻塞性肺部疾病(COPD)。在某些實施方案中，酪氨醯-tRNA合成酶多肽 的給藥對實現循環中的嗜中性細胞對變應原的脫敏是有效的。附圖簡述

圖1顯示了人酪氨醯-tRNA合成酶的全長胺基酸序列(SEQ ID NO :1)。圖2顯示了全長人酪氨醯-tRNA合成酶的Y341A變體的胺基酸序列(SEQ ID NO 2)。圖3顯示了具有血小板生成活性的C-末端截短的(胺基酸1-364)人酪氨醯-tRNA 合成酶的胺基酸序列(SEQ ID NO :3)。圖4顯示了編碼人酪氨醯-tRNA合成酶的全長胺基酸序列的多核苷酸序列(SEQ ID NO 4)。圖5(a)和5(b)顯示了截短的人酪氨醯_tRNA合成酶給藥後對血小板數的體 內影響。對於圖5(a)，給小鼠一天兩次皮下注射1、3和10μ g/kg的C-末端截短的酪氨 醯-tRNA合成酶多肽(SEQ ID NO :3)，注射7天，所述多肽具有8胺基酸的C-末端標籤 L-E-H-H-H-H-H-H(SEQ ID NO :5)，並在研究結束時確定血小板計數。對於圖5(b)，給小鼠一天兩次皮下注射3 μ g/kg的與圖5 (a)相同的C-末端截短的多肽，注射7天，並在研究結 束時確定血小板計數。圖6顯示了具有8胺基酸C-末端標籤L-E-H-H-H-H-H-H(SEQ ID NO 5)的C-末 端截短的人酪氨醯-tRNA合成酶多肽給藥後對巨核細胞數目的體內影響。一天兩次給動物 皮下注射3和300 μ g/kg的SEQ ID NO 3的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，注射6天並在研究 結束時檢測骨髓和脾的組織學，所述多肽具有8胺基酸C-末端標籤(SEQ ID NO :5)。圖7顯示了 SPl人酪氨醯-tRNA合成酶剪接變體的胺基酸序列(SEQ ID NO 6), 其表示了全長野生型YRS多肽序列的N-末端截短的變體。SPl剪接變體具有與野生型序列 沒有序列相似性的8或9個N-末端胺基酸。「X"表示任意胺基酸。圖8顯示了編碼SEQ ID NO 6的SPl人酪氨醯-tRNA合成酶多肽的核酸序列(SEQ ID NO 7)。圖9顯示了 SP2人酪氨醯-tRNA合成酶剪接變體的胺基酸序列(SEQ ID NO 8), 其表示全長野生型YRS多肽序列的C-末端截短的變體。SP2變體具有與野生型序列沒有序 列相似性的35個C末端胺基酸。「X"表示任意胺基酸。圖10顯示了編碼SEQ ID NO 8的SP2人酪氨醯-tRNA合成酶多肽的核酸序列(SEQ ID NO 9)。圖11顯示了 SP3人酪氨醯-tRNA合成酶剪接變體的胺基酸序列(SEQ ID NO 10)， 其表示全長野生型YRS多肽序列的N-末端截短的變體。圖12顯示了編碼SEQ ID NO 10的SP3人酪氨醯-tRNA合成酶多肽的核酸序列 (SEQ ID NO :11)。圖13顯示了 SP4人酪氨醯-tRNA合成酶剪接變體的胺基酸序列(SEQ ID NO 12), 其表示全長野生型YRS多肽序列的N-末端截短的變體。圖14顯示了編碼SEQ ID NO 12的SP4人酪氨醯-tRNA合成酶多肽的核酸序列 (SEQ ID NO 13)。圖15顯示了 SP5人酪氨醯-tRNA合成酶剪接變體的胺基酸序列(SEQ ID NO 14)， 其表示全長野生型YRS多肽序列的N-末端截短的變體。SP5變體具有與野生型序列沒有相 似性的約8個N-末端胺基酸。「X"表示任意胺基酸。圖16顯示了編碼SEQ ID NO 14的SP5人酪氨醯-tRNA合成酶多肽的核酸序列 (SEQ ID NO 15)。圖17舉例說明了野生型(WT)人酪氨醯-tRNA合成酶的可選擇的基因剪接，如可 選擇的剪接變體SPl至SP5的CDNA序列所表示的。圖18提供了人酪氨醯-tRNA合成酶剪接變體SPl至SP5的cDNA序列的NCBI注釋。圖19描繪了與全長人YRS多肽相比，SPl至SP5 YRS多肽的預期和報告的開放讀 碼框架的蛋白序列比對。圖20顯示了 YRS多肽在大鼠中的血小板生成活性(參見實施例4)。圖21顯示了 M07e原巨核細胞應答YRS多肽刺激時的遷移(參見實施例5)。圖22顯示了酪氨醯-tRNA合成酶多肽促進THP-I細胞到HUVEC-2細胞的內皮單 層的細胞粘附(參見實施例6)。
圖23顯示了酪氨醯-tRNA合成酶多肽增加了粘附分子VCAM-I在HUVEC-2細胞的 內皮單層中的表達(參見實施例6)。圖M顯示了酪氨醯-tRNA合成酶多肽刺激轉染了 CXCR-2受體的293和CHO細胞 系的遷移(參見實施例7)。圖M的左圖顯示了 ^3/CXCR-2細胞的結果；以及圖M的右 圖顯示了 CH0/CXCR-2細胞的結果。圖25顯示了 YRS多肽對多形核(PMN)細胞遷移的刺激作用(參見實施例8)。圖沈顯示了酪氨醯-tRNA合成酶多肽對骨髓細胞培養物中的巨核細胞祖細胞的 影響，如通過集落數目所測定的(參見實施例10)。圖沈(A)顯示了 YRS多肽對原始譜系限 制性祖細胞或早期祖細胞的集落形成的刺激作用，以及圖26(B)和(C)分別顯示了 YRS多 肽對相對成熟的中間祖細胞(B)和晚期祖細胞(C)的抑制作用。發明詳述本發明涉及以下意想不到的發現包括其截短體和變體在內的酪氨醯-tRNA合成 酶(YRS)多肽能夠模擬和刺激正常的血小板生成過程，並且因此具有治療上有益的血小板 生成活性。因此，本發明的某些實施方案涉及使用YRS多肽刺激天然的血小板生成過程，並 且從而增加有需要的個體，諸如患有與血小板減少(例如，減少的血小板計數)有關的疾病 的個體的血小板產生。與其他治療方法相比，使用YRS多肽的優勢包括例如，不同於傳統 治療的作用機制，與促血小板生成素信號的協同作用，更高的效能，以及與使用去免疫性分 子有關的益處(例如，不受潛在的針對促血小板生成素不利的免疫應答的影響)。其他的優 勢對本領域的技術人員是顯而易見的。 除非特別相反地指明，本發明的實施可以利用本技術領域內的分子生物學和重組 DNA技術的常規方法，其中的許多方法出於示例的目的描述於下文。這些技術在文獻中被充 分地解釋。參見，例如 Sambrook, et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 2 版，1989) ；Maniatis et al, Molecular Cloning :A Laboratory Manual(1982)； DNA Cloning :A Practical Approach, vol.I & II (D. Glover, ed. ) ；Oligonucleotide Synthesis(N. Gait, ed. ,1984) ；Nucleic Acid Hybridization(B. Hames & S.Higgins, eds. ,1985) ；Transcription and Translation (B.Hames & S.Higgins, eds. ,1984)； Animal Cell Culture(R. Freshney, ed.,1986) ；A Practical Guide to Molecular Cloning(B. Perbal, ed.，1984)。本文引用的所有的出版物、專利和專利申請都通過引用的方式以其整體併入。定義除非另外指明，本文所用的所有技術和科學術語都具有與本領域所屬技術人員所 通常理解的含義相同的含義。儘管在實施或檢驗本發明時可以使用與本文所述的相似或等 同的任何方法和材料，本文描述了優選的方法和材料。出於本發明的目的，如下定義以下術語。本文使用的冠詞「a」和「an」指該冠詞的一個或多個(即至少一個)語法對象。例 如，「an element」指一個元件或多個元件。所用「約」指與參考的量、水平、值、數、頻率、百分比、尺度、尺寸、數額、重量或長度 多達30，25，20，25，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1 %不同的量、水平、值、數、頻率、百分比、尺度、
尺寸、數額、重量或長度。
適用於參照多核苷酸或多肽序列的術語「生物活性片段」是指具有至少約0. 1， 0.5，1,2,5,10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85， 90,95,96,97,98,99,100，110，120，150，200，300，400，500，600，700，800，900，1000 % 或更
多的參照序列活性的片段。下述的生物活性片段包含在本發明的範圍內長度至少約18， 19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，160，180， 200，220，240,260, 280，300，320，340，360，380，400或更多(包括兩者之間的所有整數)個
連續的核苷酸或胺基酸殘基的生物活性片段，其包含或編碼參照多核苷酸或多肽的血小板 生成活性，例如參照多肽序列SEQ ID NOS =1,2,3,6,8,10，12和14，或參照核苷酸序列SEQ ID N0S:4，7，9，11，13和15。生物活性片段的特定實例包括但不限於C-末端截短的酪氨 醯-tRNA合成酶多肽，該酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含以下胺基酸或由以下胺基酸組成 SEQ ID NO 1中所示的胺基酸序列中的胺基酸1-343，胺基酸1_344，胺基酸1_350，胺基酸 1-353或胺基酸1-364，以及SEQ ID NOS 3和6的多肽。生物活性片段的其他實例包括但 不限於N-末端截短的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，該酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NOS 6,10，12和14中所示的胺基酸序列或由SEQ ID NOS :6，10，12和14中所示的胺基酸 序列組成。代表性的生物活性片段通常參與相互作用，例如分子內的或分子間的相互作用。 分子間的相互作用可以是特異性結合相互作用或酶性相互作用。分子間的相互作用可以在 YRS多肽和靶分子之間，該靶分子諸如與調節血小板生成過程有關的靶分子。YRS多肽的生 物活性片段包括多肽片段，該多肽片段包含與SEQ ID N0S:1，2，3，6，8，10，12或14中的任 一個的胺基酸序列充分相似或一致的胺基酸序列，或衍生自SEQ ID NOS =1,2,3,6,8,10,12 或14中的任一個的胺基酸序列，包括其血小板生成有效的部分；或由SEQ ID NOS =4,7,9, 11，13和15的核苷酸序列編碼。所用的「編碼序列」是指有助於編碼基因的多肽產物的任一核酸序列。與之相反， 術語「非編碼序列」是指無助於編碼基因的多肽產物的任一核酸序列。整個說明書中，除非上下文另外要求，詞語「包含(comprise) 」、「包含 (comprises) 」、「包含(comprising) 」被理解為意指包括陳述的步驟或元素或者步驟或元素 的組，但不排除任何其他的步驟或元素或者步驟或元素的組。所用「由...組成(consisting of) 」指包括且限於跟隨在詞組「由...組成」後 的任何內容。因此，詞組「由...組成」表明所列出的元素是必需的或強制的，以及可以不 存在其他元素。所用「基本上由...組成(consisting essentially of) 」指包括列在該詞 組後的任何元素，並限於不妨礙或不促進在所列元素的公開內容中指明的活性或作用的其 他元素。因此，詞組「基本上由...組成」表明所列元素是必需的或強制的，但其他元素是 任選的，可以存在或可以不存在，這取決於它們是否影響所列元素的活性或作用。術語「互補的」和「互補性」是指鹼基配對法則相關的多核苷酸(即，核苷酸序列)。 例如，序列「A-G-T」和序列「T-C-A」是互補的。互補性可以是「部分的」，其中依照鹼基配對 法則只有部分核酸的鹼基是匹配的。或者，核酸之間可以有「完全的」或「全部的」互補性。 核酸鏈間的互補性程度對核酸鏈間的雜交的效率和強度具有重要的影響。所用的「對應(corresponds to) 」 或「對應(corresponding to) 」 是指(a)具有 與參照多核苷酸序列的全部或部分基本上一致或互補的核苷酸序列的多核苷酸，或者編碼 與肽或蛋白中的胺基酸序列一致的胺基酸序列的多核苷酸；或者(b)具有與參照肽或蛋白中的胺基酸序列基本上一致的胺基酸序列的肽或多肽。所用「衍生物」指通過修飾衍生自基本序列的多肽，例如通過與另外的化學部分的 結合或絡合(例如，聚乙二醇化)或者通過本領域所理解的翻譯後修飾技術。術語「衍生 物」在其範圍內還包括對母體序列作出的改變，包括提供功能上等同分子的添加或刪除。如本文所使用的，「功能」和「功能的」等術語是指生物學上的、酶的或臨床上的功 能。所用的「基因」是指遺傳單元，其位於染色體上的特定基因座，以及由轉錄的和/ 或翻譯的調節序列、和/或編碼區、和/或非翻譯序列(即，內含子、5'和3'非翻譯序列) 組成。「同源性」是指一致的或組成性保守取代的胺基酸的百分數。同源性可以利用諸如 GAP(Deveraux et al.，1984，Nucleic Acids Research 12,387-395)的序列比對程序來確 定，其通過引用的方式併入本文。通過這種方式，可以通過在比對中插入空位來比較具有與 本文中所引用的序列相似或基本上不同的長度的序列，這種空位可以通過例如利用GAP的 比較算法來確定。術語「宿主細胞」包括個體細胞或細胞培養基，其可以是或已經是本發明的任一重 組體載體或分離的多核苷酸的受體。宿主細胞包括單一宿主細胞的子代，且由於天然的、偶 然的或有意的突變和/或改變，該子代可以不必與原始的母代細胞完全一致(在形態學上 或在總DNA互補物中)。宿主細胞包括用本發明的重組體載體或多核苷酸在體內或體外轉 染或感染的細胞。包含本發明的重組體載體的宿主細胞是重組體宿主細胞。所用「分離的」指基本上或實質上沒有在其天然狀態下通常伴隨它的組分的物質。 例如，本文使用的「分離的多核苷酸」指其已經從天然存在狀態中位於其側面的序列中純化 的多核苷酸，例如，從序列中離開的DNA片段，該序列通常鄰近所述片段。可選地，本文所用 的「分離的肽」或「分離的多肽」等指肽或多肽分子從它天然的細胞環境中以及從與細胞的 其他組分的結合中體外分離和/或純化，即，它不與體內物質結合。術語「從......獲得」是指諸如例如，多核苷酸提取物或多肽提取物的樣品從個
體的特定來源分離，或來自個體的特定來源。例如，提取物可以從直接分離自個體的組織或 生物流體獲得。本文所用的術語「寡核苷酸」是指由經磷酸二酯鍵(或與其相關的結構變體或合 成的類似物)連接的多個核苷酸殘基(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或與其相關的結構 變體或合成的類似物)組成的多聚體。因此，雖然術語「寡核苷酸」通常是指其中的核苷 酸殘基及核苷酸殘基間的鍵是天然形成的核苷酸多聚體，但也應該了解，各種類似物也包 含在該術語範圍內，包括但不限於肽核酸(PNAs)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、 2-0-甲基核糖核酸等。分子的確切尺寸可以根據特定的應用改變。寡核苷酸在長度上通常 相當短，一般約為10 30個核苷酸殘基。儘管術語「多核苷酸」或「核酸」通常用於大的 寡核苷酸，但術語「寡核苷酸」可以指任何長度的分子。本文中使用的術語「可操作地連接」指將結構基因置於啟動子的調控下，然後該啟 動子調控所述基因的轉錄和任選地翻譯。在構建異源啟動子/結構基因組合中，通常優選 地是將遺傳序列或啟動子置於距基因轉錄起始位點一定距離處，該距離近似等同於該遺傳 序列或啟動子與它在天然條件(即遺傳序列或啟動子起源的基因)中調控的基因之間的距離。如本領域已知的，可以允許該距離的一些變化，而沒有功能的損失。類似地，調節序列元 件相對於置於其控制下的異源基因的優選定位由該元件在它天然條件(即它來源的基因) 中的定位限定。本文使用的敘述「多核苷酸」或「核酸」指代mRNA，RNA, cRNA, cDNA或DNA。該術 語通常指至少10個鹼基長度的多聚形式的核苷酸，核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類型 的核苷酸的修飾形式。該術語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。術語「多核苷酸變體」和「變體」等指下述多核苷酸展示了與參照多核甘酸序列或 在下文定義的嚴緊條件下與參照序列雜交的多核苷酸基本的序列一致性。這些術語還包括 通過至少一個核苷酸的添加、刪除或取代區別於參照多核苷酸的多核苷酸。因此，術語「多 核苷酸變體」和「變體」包括其中一個或多個核苷酸被添加或刪除，或者被另外的核苷酸取 代的多核苷酸。在這方面，本領域已知，可以對參照多核苷酸作出包括突變、添加、刪除和取 代在內的某些改變，由此改變的多核苷酸保留參照多核苷酸的生物功能或活性。多核苷酸 變體包括，例如，與SEQ ID NO :4所示的序列或其編碼血小板生成性酪氨醯-tRNA合成酶多 肽的生物活性片段的部分具有至少50% (以及至少51%至至少99%和兩者之間的所有整 數百分比)序列一致性的多核苷酸。術語「多核苷酸變體」和「變體」還包括天然存在的等 位變體。「多肽」、「多肽片段」、「肽」和「蛋白」在本文交替使用，指胺基酸殘基的聚合體以及 其變體和合成的類似物。因此，這些術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是合成的非天 然存在的胺基酸(諸如相應天然存在胺基酸的化學類似物)的胺基酸聚合體，以及適用於 天然存在的胺基酸聚合體。術語「酪氨酸RNA合成酶」和「酪氨醯-tRNA合成酶」在本文交替使用，指本發明 的「 YRS 」多肽。敘述的「YRS多肽」、「YRS多肽片段」、「截短的YRS多肽」或「其變體」包括，但不限 於具有與SEQ ID NOS :1，2，3，6，8，10，12或14的任一個所示的參照序列(包括其生物活 性片段，諸如具有參照序列至少 10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200 或更多個(包括兩者之間的所有整數)的連續胺基酸)共享至少50% (和至少51%-至 少99%以及兩者之間的所有整數百分比)序列一致性的胺基酸序列的多肽。這些敘述還包 括YRS多肽的天然等位變體，其可以存在和發生在一個種或屬到另一個種或屬。包括其截短體和/或變體在內的YRS多肽包括如下多肽其展示了參照YRS多肽 的至少約 10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，110%，120%，130%， 140 %, 150%, 200%, 300 %, 400%, 500%, 600 %, 700%, 800%, 900 %，1000 % 或更大的特 異性生物活性(即，諸如具有個體內或體外的血小板生成活性)。出於本申請的目的，可以 通過測量YRS多肽增加個體的血小板計數或增加個體的巨核細胞數目(參見，例如實施例 1)的能力來定量YRS-相關的生物活性。此外，用於測量人血小板產生的合適的動物模型在 Suzuki et al,European Journal of Haemotology 78 :123_130，2007 中被描述，其通過弓| 用的方式併入本文。用於測量血小板生成活性的合適的體外模型被描述於實施例2中，並 且還包括測定巨核細胞集落形成，如Dessypris et al, Exp Hematol. 18 :754_7，1990中所 示例的。包括其截短體和/變體的YRS多肽是顯示了低於野生型YRS的特異活性的約25%， 10%，5%或的那些，其與野生型參照YRS多肽相比，具有明顯降低的生物活性。
敘述的多肽「變體」指通過至少一個胺基酸殘基的添加、刪除或取代區別於參照多 肽的多肽。在某些實施方案中，多肽變體通過可以是保守的或非保守的一個或多個取代與 參照多肽區分。在某些實施方案中，多肽變體包含保守性取代，在這方面，本領域熟知一些 胺基酸可以改變為具有廣泛相似特性的另一些，而不改變多肽活性的性質。多肽變體還包 括其中一個或多個胺基酸被添加或刪除、或者被另外胺基酸殘基取代的多肽。本發明包括全長YRS多肽(例如，具有Y341A取代的全長多肽)的變體、全長YRS 多肽的截短的片段、截短的片段的變體以及它們相關的生物活性片段在本文所述方法中的 用途。典型地，YRS多肽的生物活性片段可以參與相互作用，例如，分子內或分子間的相互作 用。分子間相互作用可以是特異性結合相互作用或者酶性相互作用(例如，相互作用可以 是暫時的，形成或打斷共價鍵)。YRS多肽的生物活性片段包括包含胺基酸序列的多肽，所 述序列與(假定的)全長YRS多肽序列的胺基酸序列充分相似，或源自(假定的)全長YRS 多肽序列的胺基酸序列，諸如SEQ ID NO :1，或其部分，諸如SEQ ID NOS :3，6，8，10，12和14 的多肽。一般地，生物活性片段包含具有YRS多肽的至少一種活性的結構域或基序，並且可 以包括一個或多個(在一些情況下，是全部的)不同活性結構域，以及包括具有血小板生成 活性的片段。在一些情況下，YRS多肽的生物活性片段具有對於特定的截短的片段獨特的 生物活性(例如，血小板生成活性)，這樣使得全長YRS多肽可能沒有該活性。在一些情況 下，生物活性可以通過將生物活性YRS多肽片段與其他的全長YRS多肽序列分離，或者通過 改變全長YRS野生型多肽序列的某些殘基(例如，Y341A)以暴露血小板生成活性結構域而 被揭示。截短的YRS多肽的生物活性片段可以是多肽片段，其是，例如，SEQ ID NOS :1,2,3, 6,8,10,12 或 14 的任一個所示的胺基酸序列的 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170， 180，190，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380,400 或更多(包括兩者之間的所有 整數)個連續的胺基酸。在某些實施方案中，生物活性片段包含血小板生成刺激序列、結構 域或基序。適宜地，該生物活性片段具有不低於其衍生的野生型多肽的活性的約1 %，10%， 25%，50%。本文所用的敘述「序列一致性」或者例如包含「與...50% —致的序列」指序列在 比較窗中基於一個一個核苷酸或基於一個一個胺基酸一致的程度。因此，「序列一致性百分 比」可以通過以下來計算比較兩個在比較窗中最優比對的序列，確定相同的核酸鹼基(例 如 A，T，C，G，I)或相同的胺基酸殘基(例如，Ala, Pro, Ser, Thr, Gly，VaI, Leu, He，Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg，His, Asp, GIu，Asn，Gin, Cys和Met)在兩條序列中出現的位置的數目 以得到匹配的位置數，將匹配的位置數除以比較窗中總位置數(即，窗大小)，並將得到的 結果乘以100以得到序列一致性百分比。用於描述兩個或更多個多核苷酸或多肽間的序列關係的術語包括「參照序列」、 「比較窗」、「序列一致性」、「序列一致性百分比」和「基本一致性」。「參照序列」是長度為至少 12個但通常是15至18個，經常是至少25個單體單位(包括核苷酸和胺基酸殘基)。因為 兩個多核苷酸各自可以包含(1)在兩個多核苷酸間相似的序列(即，完整多核苷酸序列的 僅一部分)和( 在兩個多核苷酸間不同的序列，兩個(或更多個)多核苷酸間的序列比 較通常通過比較「比較窗」中的兩個多核苷酸的序列來進行以鑑定和比較序列相似性的局 部區域。「比較窗」指至少6個連續位置、通常為約50至約100個、更通常約100至150個的連續位置的概念節段，其中在一序列與具有相同連續位置數的參照序列最優比對後，將 該序列與參照序列比較。比較窗可以包含與參照序列(其不包含添加或刪除)相比約20% 或更少的添加或刪除(即空位)用於兩個序列的最優比對。用於比對比較窗的序列的最優 比對可以通過算法的計算機運行(Wisconsin遺傳學軟體包發行版7. 0 (Genetics Software Package Release 7. 0)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison，WI，USA)或通過目測以及選擇的各種方法的任一種產生的最 佳比對(即，產生整個比較窗的最高同源性百分比)來實施。例如Altschul et al,1997, Nucl. Acids Res. 25 :3389公開的BLAST程序家族也可以作為參考。可以在Ausubel et al, 「 Current Protocols in Molecular Biology" , John Wiley & Sons Inc,1994-1998, 第15章的19. 3單元中找到序列分析的詳細討論。本文所用的「個體」包括呈現能夠用本發明的血小板生成性YRS多肽治療的症狀 或處於呈現該症狀風險中的任何動物。合適的個體(患者)包括實驗室動物(諸如小鼠、大 鼠、兔或豚鼠)、農場動物、和家養動物或寵物(諸如貓或狗)。非人靈長類，以及優選的人 患者包括在內。典型的個體包括呈現異常量的一種或多種生理活性、或者處於呈現異常量 的一種或多種生理活性的風險中的動物，所述異常量的生理活性能夠通過血小板生成多肽 來調節，諸如降低的或減少的血小板計數(S卩，血小板減少症)。典型地，患有血小板減少症 或者如本文所用的「減少的」的血小板計數的個體指與正常的血小板計數相比，血小板計數 降低至約100，000/mm3或更低、約110，000/mm3或更低、約120，000/mm3或更低、約130，000/ mm3或更低、約140，000/mm3或更低、約150，000/mm3或更低的個體。如本文所用的，個體「正 常」的血小板計數通常為約150，000/mm3至450，000/mm3。作為一個實例，「個體」還可以將 經歷、正在經歷或已經經歷移植過程，諸如幹細胞或骨髓移植。個體還可以具有肺部病症或 疾病，諸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)，和/或正患肺部炎症。如本文所用的「血小板生成」指血小板或凝血細胞的形成。如本文所描述的，酪氨醯-tRNA合成酶多肽的「血小板生成有效濃度」指能夠「治 療」個體的量，諸如「有效」刺激或增強血小板生成，如一般通過增加的血小板水平、維持的 血小板水平、增加的巨核細胞數和/或增加的嗜中性細胞產生所測量的。「巨核細胞」一般指負責對正常的凝血必需的血液凝血細胞(即血小板)產生的骨 髓細胞。巨核細胞通常佔1/10000個骨髓細胞。巨核細胞衍生自骨髓中的多能造血幹細胞 前體細胞。促血小板生成素(TPO)是巨核細胞產生的主要信號，即TPO足以但並非絕對必 需用於誘導骨髓中的祖細胞向終末巨核細胞表型分化。用於巨核細胞分化的其他分子信號 包括GM-CSF，IL-3，IL-6，IL-I 1，趨化因子(SDF-I ；FGF-4)和促紅細胞生成素。巨核細胞被認為通過以下譜系發育=CFU-Me (多能造血幹細胞或原始血細胞)_ > 原巨核細胞->前巨核細胞->巨核細胞。在原巨核細胞階段，細胞失去了分裂的能力，但 仍能夠複製其DNA和繼續發育，成為多倍體。成熟時，巨核細胞開始產生血小板的過程。促 血小板生成素在誘導巨核細胞形成小的原血小板過程或者形成用於在釋放前儲存血小板 的胞質內膜中發揮作用。釋放時，這些原血小板過程中的每個能夠產生2000-5000個新血 小板。總之，約2/3的新釋放的血小板會留在循環中，以及約1/3會被脾扣押。釋放血小板 後，剩下的細胞核通常跨過骨髓屏障到達血液，在肺中被肺泡巨噬細胞消耗。「嗜中性細胞」或嗜中性粒細胞一般指人中數量大的一類白細胞，其與嗜鹼性細胞和嗜酸性細胞一起形成了多形核細胞家族(PMNs)的部分。嗜中性細胞可以根據它們在蘇 木精和伊紅(H&E)組織學或細胞學製備中的獨特染色特徵容易地鑑定。嗜中性細胞正常存 在於血流中，但在炎症(主要是感染或癌症的結果)的開始(即，急性)階段是遷移到炎症 部位的第一組炎症細胞之一。通常，嗜中性細胞首先通過血管、然後通過間質組織遷移，追 隨在炎症部位起源的化學信號(例如，白介素-8 (IL-8)、幹擾素-γ (IFN- y )和C5a)。「嗜 中性細胞減少症」指存在低嗜中性細胞計數，其能夠由先天(遺傳性)病症導致，它能夠因 為其他疾病狀態發生，如在再生障礙性貧血或某些類型的白血病的情況下。某些藥劑，諸如 化療劑也可以導致嗜中性細胞減少症。嗜中性細胞減少症有明顯的感染傾向。嗜中性細胞 減少症還可以由細胞內嗜中性寄生物的定殖導致。所用「增強(enhance)」 或「增強(enhancing) 」，或者「增加(increase) 」 或「增加 (increasing) 」，或者「刺激(stimulate) 」或「刺激(stimulating) 」 一般指與無 YRS 多肽 導致的反應或對照分子/組合物導致的反應相比，一種或多種藥劑或組合物在細胞內產生 或導致更大的生理反應的能力。可測量的生理反應可以包括更強的細胞生長、擴增或遷移 等，這從本領域的理解和本文的描述是顯而易見的。在本領域已知的方法中，體外集落形成 測定代表本文提供的測量對藥劑的細胞反應的一種方式。「增加的」或「增強的」量通常是 「統計學上顯著的」量，並可以包括為沒有YRS多肽(缺乏試劑)時或對照組合物產生的量 的 1. 1,1. 2，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30 或更大倍數(例如，500，1000 倍)(包括兩者之 間並大於1的所有整數和小數點，例如1. 5，1. 6，1. 7. 1. 8等)的增加。一般地，術語「減少」涉及本發明的一種或多種YRS多肽「降低」相關生理或細胞 反應的能力，諸如疾病或疾病狀態的症狀(例如，肺部炎症等)，如根據診斷領域的常規技 術所測量的。相關反應的一個具體實例包括免疫細胞(例如，嗜中性細胞)向某些組織諸 如肺的遷移。其他相關的生理或細胞反應(體內或體外的)對本領域技術人員是顯而易見 的。與無YRS多肽或對照組合物產生的反應相比，反應的「降低」可以是統計學上顯著的。「遷移」指細胞遷移，這是可以根據常規體外測定測量的過程，如本文所述的以及 本領域已知的(參見，例如，實施例8)。遷移還指體內遷移，諸如細胞從一組織遷移到另一 組織(例如，從骨髓遷移到外周血，或者從外周血遷移到肺組織)，或者從一個組織的部位 遷移到同一組織的另一部位。體內遷移(例如趨化作用)通常發生在應答感染或損傷的/ 刺激的組織時。「分化」指較不特化的細胞(例如，多能、全能、專能等)變為更特化的細胞類型的 過程。「脫敏」一般指減少或消除了生物體對物質或刺激物如變應原或刺激劑(包括外來 抗原以及「自身抗原」)的不利(病理學的)免疫反應。例如，某些肺部疾病或疾病狀態與對 外源刺激劑諸如煙的不利反應有關，這樣使嗜中性細胞對這些刺激劑脫敏可以預防(即， 減少發生的風險)或減少這些疾病或疾病狀態，和/或它們的症狀。如本文所用的，「治療(Treatment) 」或「治療(treating) 」包括對與血小板減少 症(即，減少的血小板水平)或發展為血小板減少症的風險相關的疾病或疾病狀態的症狀 或病理產生的任何所需的效應，並且可以包括被治療的疾病或疾病狀態的一個或多個可測 量的標誌物的即便最小的變化或改善。「治療(Treatment)」或「治療(treating) 」並不必 然表示疾病或疾病狀態或其相關症狀的徹底根除。接受該治療的個體是有需要的任何動物，包括靈長類，特別是人，以及諸如馬、牛、豬和羊的其他動物，以及通常的家禽和寵物。如 本文所述的，臨床改善的示例性標誌物包括血小板生成的YRS多肽給藥後增加的血小板計 數、維持正常血小板計數、和/或增加的巨核細胞數。所用「載體「指在其中可以插入或克隆多核苷酸的多核苷酸分子，優選DNA分子， 例如來自質粒、噬菌體、酵母或病毒的DNA分子。載體優選包含一個或多個獨特的限制性位 點，並能夠在包括靶細胞或組織或者其祖細胞或組織在內的限定的宿主細胞中自主複製， 或者與限定的宿主的基因組整合以使克隆的序列可複製。因此，載體可以是自主複製的載 體，即作為染色體外實體存在的載體，其複製獨立於染色體的複製，例如，線性或閉環質粒、 染色體外元件、小型染色體或人工染色體。載體可以包含用於確保自我複製的任何元件。可 選擇地，載體可以是當導入宿主細胞時，被整合進基因組並與它被整合進的染色體一起復 制的載體。載體系統可以包含單一載體或質粒，兩個或更多個載體或質粒，其一起包含待被 導入宿主細胞基因組的總DNA，或者轉位子。載體的選擇通常會依賴於載體與它被導入的宿 主細胞的相容性。在本例中，載體優選是在細菌細胞中具有可操作功能的載體。載體還可 以包括選擇性標誌物，諸如能夠用於選擇合適的轉化子的抗生素抗性基因。術語「野生型」和「天然存在的」交替使用，指具有從天然存在的來源分離的基因 或基因產物的特徵的基因或基因產物。野生型基因或基因產物(例如，多肽)是在群體中 最常見的，並因此任意地指定為基因的「正常」或「野生型」形式。血小板生成性酪氨醯-tRNA多肽以及其變體本發明部分涉及意外的發現某些酪氨醯-tRNA合成酶多肽，包括其截短體和/或 變體，模擬並刺激體內的天然血小板生成過程。因此，本發明的血小板生成性多肽包括全長 酪氨醯-tRNA合成酶多肽，以及酪氨醯-tRNA合成酶多肽的任何生物活性片段，或者其變體 或修飾體，其中所述多肽能夠刺激個體內或體外血小板生成(即血小板形成)、巨核細胞增 殖和/或分化、和/或嗜中性細胞增殖。氨醯-tRNA合成酶，諸如酪氨醯-tRNA合成酶，通常通過它們的關聯胺基酸催化 tRNA的氨醯化。因為它們在連接胺基酸與tRNAs內包含的核苷酸三聯子中的中心作用，氨 醯-tRNA合成酶被認為是進化中首先出現的蛋白之一。酪氨醯-tRNA合成酶特別屬於I類 tRNA合成酶家族，其在活性部位具有兩個高度保守的序列基序，HIGH和KMSKS。I類tRNA 合成酶在腺核苷酸的2' -OH進行氨醯化，並且通常是單聚或雙聚的(分別是一個或兩個亞 單位)。人酪氨醯-tRNA合成酶由三個結構域組成1)氨基末端Rossmarm摺疊結構域， 其負責形成活化的E. Tyr-AMP中間物，並在細菌、古菌(archeae)和真核生物中是保守的； 2) tRNA反密碼子識別結構域，其在細菌和真核生物間不是保守的；以及3)人酪氨醯-tRNA 合成酶獨特的羧基末端結構域，其主要結構與假定的人細胞因子內皮單核細胞激活蛋白II 49%—致，與來自秀麗隱杆線蟲(Caenorhabditis elegans)的甲硫氨醯-tRNA合成酶的羧 基末端結構域50%—致，以及與來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Arclp羧基 末端結構域43%—致。人酪氨醯-tRNA合成酶的前兩個結構域與來自釀酒酵母、詹氏甲烷球菌 (Methanococcus jannaschii)禾口月旨肪嗜熱芽抱桿菌(Bacillus, stearothermophitus)分 別有52，36和16% —致性。已知參與脂肪嗜熱芽孢桿菌中的酪氨醯-腺苷酸複合物形成的15個胺基酸中的9個在所有生物體中是保守的，而參與tRNATiT識別的胺基酸不是保守 的。大腸桿菌中表達的重組人和脂肪嗜熱芽孢桿菌酪氨醯-tRNA合成酶的動力學分析表示 人酪氨醯-tRNA合成酶氨醯化人但不是脂肪嗜熱芽孢桿菌的tRNAT、或者相反。據認為人 酪氨醯-tRNA合成酶的羧基末端結構域從甲硫氨醯基-tRNA合成酶的羧基末端結構域的基 因複製發展而來，並且可以指引tRNA到酶的活性部位。真核生物的酪氨醯-tRNA合成酶的生物片段將蛋白合成與細胞信號傳導通路關 連，諸如血小板生成。這些片段可以通過可選的剪接或蛋白水解天然產生。例如，如本發明 所提供的，前血小板生成N-末端片段小型-YRS能夠刺激體內血小板生成。此外，全長YRS 多肽序列的某些突變賦予野生型參照序列增加的血小板生成活性(例如，Y341A)。全長YRS 多肽序列的截短的剪接變體的實例包括圖17-19中所述的SP1-SP5多肽。包含催化的結構域和反密碼子識別結構域的人小型YRS的結構(即，SEQ ID NO 3;或者小型-Tyr)已經被報導為1.18 A的解析度。然而人和細菌的酶的催化結構域重疊， 相對於催化結構域的反密碼子識別結構域的空間布置在關於細菌直向同源物(orthologs) 的小型YRS中是獨特的。不希望受任一理論約束，反密碼子識別結構域的獨特位置可以解 釋為什麼片段小型YRS在不同細胞信號傳導通路中更有活性。因此，本發明的實施方案包括組合物用於刺激個體的血小板生成的用途，所述組 合物包含血小板生成性YRS多肽，包括其截短的、變體和/或修飾的多肽。本發明包括的變 體蛋白是有生物活性的，即它們繼續具有參照YRS多肽序列的血小板生成活性(例如，SEQ ID NOS :1，2，3，6，8，10，12和14)。這種變體可以由例如基因多態性或由人工操縱而產生。 參照YRS多肽片段的生物活性變體會具有與參照蛋白的胺基酸序列至少40^,50^,60%, 70 %，一般至少75 %，80 %，85 %，通常約90 %至95 %或者更大，以及典型地約98 %或更大 的序列相似性或一致性，如本文其他地方描述的利用預設參數的序列比對程序所確定的。 一般地，參照YRS多肽的生物活性變體可以與該蛋白的區別多達200，100,50或20個氨基 酸殘基或適宜地少至1-15個胺基酸殘基、少至1-10個，諸如6-10個、少至5個、少至4、3、 2或甚至1個胺基酸殘基。在一些實施方案中，YRS多肽與SEQ ID NOS 1，2，3，6，8，10，12 和14中的參照序列的不同達至少一個但少於15，10或5個胺基酸殘基。在另外的實施方 案中，它與SEQ ID NOS :1，2，3，6，8，10，12和14中的參照序列的不同達至少一個殘基但少 於殘基的20%，15%，10%或5%。YRS多肽可以以不同方式改變，包括胺基酸取代、刪除、截短和插入。用於這種操 縱的方法通常是本領域已知的。例如，截短的和/或變異的YRS多肽的胺基酸序列變體可 以通過DNA中的突變製備。用於誘變和核苷酸序列改變的方法是本領域已知的。例如，參 見 Kunkel (1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 :488-492)，Kunkel et al, (1987，Methods in Enzymol,154 :367-382), U. S. Pat. No. 4,873,192, Watson, J. D. et al, (" Molecular Biology of the Gene"，第四版，Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif, 1987)以及其 中引用的參考文獻。關於不影響感興趣蛋白的生物活性的合適胺基酸取代的指導可以見於 Dayhoff et al. , (1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C)的模型中。本領域已知用於篩選組合文庫基因產物的方法以及 用於篩選cDNA文庫具有選定特性的基因產物的方法，所述組合文庫通過點突變或截短制 備。這些方法適用於通過YRS多肽的組合誘變產生的基因文庫的快速篩選。增強文庫中的功能突變體頻數的技術，遞歸集合誘變(Recursive ensemble mutagenesis) (REM)可以用 於與篩選測定組合以鑑定YRS多肽變體(Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :7811-7815 ；Delgrave et al.，(1993)Protein Engineering, 6 :327-331)。保守性 取代，諸如將一個胺基酸與具有相似特性的另一個胺基酸交換，可以是理想的，如下文更詳 細地討論的。血小板生成活性截短的和/或變體YRS多肽可以在沿它們序列不同位置包含保守 性胺基酸取代，如與參照YRS胺基酸序列所比較的(例如，SEQ ID NOS =1,2,3,6,8,10,12 或14)。「保守性胺基酸取代」是其中胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基替代的取代。 具有類似側鏈的胺基酸殘基家族已在本領域中被定義，其通常可以如下進行亞分類酸性的殘基由於丟失了 H離子在生理pH下帶負電荷，以及該殘基被水性溶液吸 引以使它在包含它的肽在生理PH的水性介質中時尋找該肽構象的表面位置。具有酸性側 鏈的胺基酸包括穀氨酸和天冬氨酸。鹼性的殘基由於結合H離子在生理pH下或其一個或兩個pH單位內帶正電荷(例 如，組氨酸)，以及該殘基被水性溶液吸引以使它在包含它的肽在生理PH的水性介質中時 尋求該肽構象的表面位置。具有鹼性側鏈的胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶電荷的殘基在生理pH下帶電荷，並且因此包括具有酸性或鹼性側鏈的胺基酸 (即，穀氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和組氨酸)。疏水的殘基在生理pH下不帶電荷，並且該殘基在水性溶液中被排斥以使它在包 含它的肽在水性介質中時尋求該肽構象的內部位置。具有疏水側鏈的胺基酸包括酪氨酸、 纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。中性/極性的殘基在生理pH下不帶電荷，但該殘基不足以被水性溶液排斥以使 它會在包含它的肽在水性介質中時尋求該肽構象的內部位置。具有中性/極性側鏈的氨基 酸包括天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。該說明還將某些胺基酸表徵為「小的」，因為它們的側鏈不足夠大到提供疏水性， 即便缺乏極性基團。除脯氨酸外，「小」胺基酸是具有4個或更少的碳的那些，其時至少一 個極性基團在側鏈上，另三個碳或更少不在側鏈上。具有小側鏈的胺基酸包括甘氨酸、絲 氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。基因編碼的次級胺基酸脯氨酸是特例，由於它已知的對肽鏈的次 級構象的影響。脯氨酸的結構與所有其他天然存在的胺基酸的不同在於它的側鏈結合到 α-氨基基團的氮，以及α-碳。然而，幾個胺基酸相似矩陣(例如，ΡΑΜ120矩陣和ΡΑΜ250 矩陣，如例如 Dayhoff et al. , (1978), A model of evolutionary change in proteins. Matrices for determining distance relationships In M. 0. Dayhoff, (ed. )，Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pp.345—358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC;以及 Gonnet et al.，Gcience，256 :14430-1445，1992 所公 開的)將脯氨酸與甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸包括在同一組中。因此，出於本發明的 目的，脯氨酸被分類為「小」胺基酸。用於極性或非極性分類所需的吸引或排斥程度是主觀的，因此，本發明特別包括 的胺基酸已經被分類為一種或另一種。沒有具體命名的大多數胺基酸可以基於已知的行為 進行分類。胺基酸殘基可以進一步亞分類為環狀的或非環狀的，芳香族的或非芳香族的，與殘基側鏈取代基因有關的自明的分類，以及分類為小的或大的。如果殘基包括羧基碳在內 總共含4個碳原子或更少，被視為小的，前提是存在額外的極性取代基，三個或更少的不存 在。當然，小殘基一直不是芳香族的。取決於它們的結構特性，胺基酸殘基可以分為兩類或 更多類。對於天然存在的蛋白胺基酸，根據該方案的亞分類呈現在表A中。表 A胺基酸亞分類
權利要求
1.包含血小板生成有效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽的藥物，其用於治療個體的血 小板減少症或降低個體發展為血小板減少症的風險，或者用於增加或維持個體的血小板計數。
2.增加個體的血小板計數的方法，包括給予所述個體包含血小板生成有效濃度的酪氨 醯-tRNA合成酶多肽的組合物，由此增加所述個體的血小板計數。
3.治療個體的血小板減少症或降低個體發展為血小板減少症的風險的方法，包括給予 所述個體包含血小板生成有效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽的組合物，由此治療所述個 體的血小板減少症或降低所述個體發展為血小板減少症的風險。
4.刺激個體的血小板生成的方法，包括給予所述個體包含血小板生成有效濃度的酪氨 醯-tRNA合成酶多肽的組合物，由此刺激所述個體的血小板生成。
5.維持個體的血小板計數的方法，包括給予所述個體血小板生成有效濃度的酪氨 醯-tRNA合成酶多肽，由此維持所述個體的血小板計數。
6.刺激個體的巨核細胞增殖、遷移和/或分化的方法，包括給予所述個體血小板生成 有效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，由此刺激所述個體的巨核細胞增殖和/或分化。
7.刺激個體的嗜中性細胞增殖的方法，包括給予所述個體血小板生成有效濃度的酪氨 醯-tRNA合成酶多肽，由此刺激所述個體的嗜中性細胞增殖。
8.如權利要求1-7中任一項所述的藥物或方法，其中所述個體患有與降低或減少的血 小板計數有關的疾病或疾病狀態，或處於患所述疾病或疾病狀態的風險中。
9.如權利要求1-7中任一項所述的藥物或方法，其中所述個體具有約150，000/mm3或 更低的血小板計數。
10.如權利要求8所述的藥物或方法，其中所述與降低或減少的血小板計數有關的疾 病或疾病狀態選自出血、鼻衄、脾功能亢進、低體溫、Epstein-Barr病毒感染、傳染性單核細 胞增多症、Wiskott-Aldrich症候群、母源性噻嗪類藥物攝入、先天性缺巨核細胞性血小板 減少症、血小板減少-橈骨缺失症候群、範科尼貧血、巨大血小板症候群、May-Hegglin畸 形、灰白血小板症候群、奧爾波特症候群、新生兒風疹、再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合 徵、白血病、淋巴瘤、骨髓的腫瘤、癌症、營養缺乏、放射接觸、肝功能衰竭、細菌性膿毒症、麻 疹、登革熱、HIV感染或AIDS、早熟、胎兒成紅細胞增多症、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、 母源性ITP、溶血尿毒症症候群、彌散性血管內凝血、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、輸血 後紫癜、系統性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、新生兒同種免疫血小板減少症、以及陣發性睡 眠性血紅蛋白尿症、C型肝炎病毒感染(HCV)、藥劑誘發的血小板減少症、和化療誘發的血 小板增多症(CIT)。
11.如權利要求8所述的藥物或方法，其中與降低或減少的血小板計數有關的疾病或 疾病狀態由藥劑或藥品誘發。
12.如權利要求11所述的藥物或方法，其中所述藥劑或藥品選自化療劑、非留體抗炎 劑、磺胺類藥、萬古黴素、氯吡格雷、糖蛋白Ilb/IIIa抑制劑、幹擾素、丙戊酸、阿昔單抗、利 奈唑胺、法莫替丁、美貝維林、組胺阻斷劑、烷化劑、肝素、乙醇和抗菌化療劑。
13.如權利要求12所述的藥物或方法，其中所述化療劑選自順鉬(CDDP)、卡鉬、甲基 苄胼、氮介、環磷醯胺、喜樹鹼、異環磷醯胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝基尿、更生黴 素、道諾黴素、阿黴素、博來黴素、普卡黴素、絲裂黴素、依託泊苷(VP 16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結合劑、紫杉酚、吉西他濱、長春瑞賓、法尼基蛋白轉移酶抑制劑、反鉬、5-氟 尿嘧啶、長春新鹼、長春花鹼和甲氨蝶呤、temazolomide以及其衍生物。
14.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含在它的C-末端截短的哺乳動物酪氨醯-tRNA合成酶。
15.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中至少約1-50個胺基酸殘基從 它的C-末端截去。
16.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中至少約50-100個胺基酸殘基 從它的C-末端截去。
17.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中至少約100-150個胺基酸殘基 從它的C-末端截去。
18.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中至少約150-200個殘基從它的C-末端截去。
19.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中至少約200-250個胺基酸殘基從它的 C-末端截去。
20.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含在它的N-末端截短的哺乳動物酪氨醯-tRNA合成酶。
21.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中至少約1-50個胺基酸殘基從 它的N-末端截去。
22.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中至少約50-100個胺基酸殘基 從它的N-末端截去。
23.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中至少約100-150個胺基酸殘基 從它的N-末端截去。
24.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中至少約150-200個殘基從它的N-末端截去。
25.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中至少約200-250個胺基酸殘基從它的 N-末端截去。
26.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 選自(a)包含與SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列至少80%—致的胺基酸序列的多肽，其中341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(b)包含與SEQID NO :2所示的胺基酸序列至少90%—致的胺基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(c)包含與SEQID NO :2所示的胺基酸序列至少95%—致的胺基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(d)包含與SEQID NO :2所示的胺基酸序列至少98%—致的胺基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；以及(e)包含SEQID NO :2所示的胺基酸序列的多肽。
27.如權利要求1至7中任一項所述的藥物或方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 選自(a)包含與SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的胺基酸序列至少80% —致的氨 基酸序列的多肽；(b)包含與SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的胺基酸序列至少90% —致的氨 基酸序列的多肽；(c)包含與SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的胺基酸序列至少95% —致的氨 基酸序列的多肽；(d)包含與SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的胺基酸序列至少98% —致的氨 基酸序列的多肽；以及(e)包含SEQID NO :1，2，3，6，8，10，12或14所示的胺基酸序列的多肽。
28.適合用於給藥的組合物，包含生理學上可接受的賦形劑和/或載體以及血小板生 成有效濃度的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，其中所述組合物能夠刺激個體的血小板生成和/ 或增加個體的血小板計數。
29.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含在它的C-末 端截短的哺乳動物酪氨醯-tRNA合成酶。
30.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中至少約1_50個胺基酸殘基從它的C-末端截去。
31.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1,2,3,6,8,10，12或14的胺基酸序列，其中至少約50-100個胺基酸殘基從它的C-末端截 去。
32.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中至少約100-150個胺基酸殘基從它的C-末端截去。
33.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中至少約150-200個殘基從它的C-末端截去。
34.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中至少約200-250個胺基酸殘基從它的C-末端截去。
35.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含在它的N-末 端截短的哺乳動物酪氨醯-tRNA合成酶。
36.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQID N0:.1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中至少約1_50個胺基酸殘基從它的N-末端截去。
37.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1,2,3,6,8,10，12或14的胺基酸序列，其中至少約50-100個胺基酸殘基從它的N-末端截去。
38.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8，10，12或14的胺基酸序列，其中至少約100-150個胺基酸殘基從它的N-末端截去。
39.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中至少約150-200個殘基從它的N-末端截去。
40.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO: 1，2，3，6，8或10的胺基酸序列，其中至少約200-250個胺基酸殘基從它的N-末端截去。
41.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽選自(a)包含與SEQID NO :2所示的胺基酸序列至少80%—致的胺基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(b)包含與SEQID NO :2所示的胺基酸序列至少90%—致的胺基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(c)包含與SEQID NO :2所示的胺基酸序列至少95%—致的胺基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(d)包含與SEQID NO :2所示的胺基酸序列至少98%—致的胺基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；以及(e)包含SEQID NO :2所示的胺基酸序列的多肽。
42.如權利要求觀所述的組合物，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽選自(a)包含與SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的胺基酸序列至少80% —致的氨 基酸序列的多肽；(b)包含與SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的胺基酸序列至少90% —致的氨 基酸序列的多肽；(c)包含與SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的胺基酸序列至少95% —致的氨 基酸序列的多肽；(d)包含與SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的胺基酸序列至少98% —致的氨 基酸序列的多肽；以及(e)包含SEQID NO :1，2，3，6，8，10，12或14所示的胺基酸序列的多肽。
43.如權利要求觀所述的組合物，還包含第二酪氨醯-tRNA合成酶多肽，其中兩個酪氨 醯-tRNA合成酶多肽形成二聚體。
44.如權利要求43所述的組合物，其中所述二聚體是同型二聚體。
45.如權利要求44所述的組合物，其中所述二聚體是異質二聚體。
46.如權利要求45所述的組合物，其中所述異質二聚體包含全長的酪氨醯-tRNA合成 酶多肽和截短的酪氨醯-tRNA合成酶多肽。
47.如權利要求觀所述的組合物，還包含異源多肽，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽 和所述異源多肽形成異質二聚體。
48.組合物，其包含生理學上可接受的賦形劑和/或載體以及血小板生成有效濃度的 嵌合的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，其中所述嵌合的多肽包含酪氨醯-tRNA合成酶多肽的兩 個或更多個生物活性片段，其中所述兩個或更多個片段包含權利要求觀-42中任一項所述 的多肽的至少10個連續的胺基酸，其中所述兩個或更多個片段相連接以形成嵌合的多肽， 以及其中所述嵌合的酪氨醯-tRNA合成酶多肽能夠刺激個體的血小板生成和/或增加個體 的血小板計數。
49.組合物，其包含生理學上可接受的賦形劑和/或載體以及血小板生成有效濃度的 嵌合的酪氨醯-tRNA合成酶多肽，其中所述嵌合的多肽包含(a)酪氨醯-tRNA合成酶多肽 的一個或多個生物活性片段，其中所述一個或多個片段包含權利要求觀-42中任一項所述 的多肽的至少10個連續胺基酸；和(b) —個或多個異源多肽，其中所述(a)的一個或多個 片段以及所述(b)的一個或多個異源多肽相連接以形成嵌合的多肽，以及其中所述嵌合的 多肽能夠刺激個體的血小板生成和/或增加個體的血小板計數。
50.抗體或抗原結合片段，其特異地結合權利要求觀-49中任一項所述的酪氨醯-tRNA 合成酶多肽。
51.鑑定或表徵樣品中YRS多肽的方法，包括(a)獲得生物樣品；(b)用權利要求50所述的抗體或抗原結合片段接觸所述生物樣品；以及(c)檢測所述抗體或抗原結合片段對所述生物樣品的特異性結合的存在或缺乏，由此 鑑定或表徵所述樣品中的YRS多肽。
52.如權利要求51所述的方法，其中所述生物樣品獲自個體。
53.組合物，其包含分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自(a)包含與SEQID NO :4，7，9，11，13或15所示的核苷酸序列至少80%—致的核苷酸 序列的多核苷酸；(b)包含與SEQID NO :4，7，9，11，13或15所示的核苷酸序列至少90%—致的核苷酸 序列的多核苷酸；(c)包含與SEQID NO :4，7，9，11，13或15所示的核苷酸序列至少95%—致的核苷酸 序列的多核苷酸；(d)包含與SEQID NO :4，7，9，11，13或15所示的核苷酸序列至少98%—致的核苷酸 序列的多核苷酸；(e)包含SEQID NO :4，7，9，11，13或15所示的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼能夠刺激個體的血小板生成和/或增加個體的血小板計數的 酪氨醯-tRNA合成酶多肽。
54.載體，其包含權利要求53所述的多核苷酸。
55.宿主細胞，其包含權利要求M所述的載體。
56.刺激早期巨核細胞祖細胞增殖和/或分化的方法，包括用酪氨醯-tRNA合成酶多肽 孵育造血幹細胞培養物足夠的時間以允許所述早期巨核細胞祖細胞增殖，由此刺激早期巨 核細胞祖細胞增殖和/或分化。
57.如權利要求56所述的方法，其中離體或體外實施所述方法。
58.如權利要求57所述的方法，其中從骨髓獲得所述培養物。
59.如權利要求57所述的方法，其中從臍帶血獲得所述培養物。
60.如權利要求57所述的方法，還包括將所述細胞給予有需要的個體。
61.刺激表達CXCR-2的細胞遷移的方法，包括用酪氨醯-tRNA合成酶多肽接觸所述細 胞，由此刺激所述表達CXCR-2的細胞遷移。
62.如權利要求61所述的方法，其中接觸所述細胞的步驟體外或離體發生。
63.如權利要求61所述的方法，其中接觸步驟包括給予有需要的個體包含有效濃度的 酪氨醯-tRNA合成酶多肽的組合物。
64.減輕個體的肺部炎症和/或其症狀的方法，包括給予所述個體有效濃度的酪氨 醯-tRNA合成酶多肽，由此減輕所述個體的肺部炎症和/或其症狀。
65.如權利要求64所述的方法，其中所述個體患有慢性阻塞性肺部疾病(COPD)。
66.如權利要求64所述的方法，其中所述酪氨醯-tRNA合成酶多肽的給藥對於實現循 環中的嗜中性細胞對變應原的脫敏是有效的。
全文摘要
本文提供了血小板生成組合物，其包含酪氨醯-tRNA合成酶多肽，包括其截短體和/或變體。還提供了利用這種組合物治療疾病狀態的方法，所述疾病狀態受益於增加的血小板生成，諸如血小板減少症。
文檔編號A61K38/53GK102105164SQ200980129525
公開日2011年6月22日 申請日期2009年6月10日 優先權日2008年6月11日
發明者張偉, 拉傑什·貝拉尼, 傑弗裡·迪安·沃特金斯, 阿蘭·菲利普·瓦瑟洛特 申請人:Atyr醫藥公司