一種使蘋果樹合成蝦青素提高其抗光氧化能力的方法
2023-06-02 15:23:56
專利名稱：一種使蘋果樹合成蝦青素提高其抗光氧化能力的方法
一種使蘋果樹合成蝦青素提高其抗光氧化能力的方法技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體地說，是一種通過植物遺傳轉化方法使蘋果樹合成蝦青素提高其抗光氧化能力的方法。
背景技術：
蘋果樹在高溫強光的生長季節很容易遭受光氧化損傷，表現為兩方面，一方面，葉片在進行光合作用時會因光氧化損傷而導致光合效率降低；另一方面，蘋果果實則常出現日燒現象，通常蘋果日燒是由於果實在溫度逆境和強光下發生的光氧化傷害所致，每年在世界蘋果產區都不同程度的有所發生，一旦發病，會嚴重降低果品的產量與品質，給生產造成很大損失。隨著矮化栽培制度的普及和全球氣候變暖，蘋果日燒有逐年加重的趨勢。黃 色(金冠等)、綠色(澳洲青蘋)和晚熟紅色品種(紅富士等)常因高溫強光季節抗氧化能力較低而容易發生日燒。針對葉片因光氧化損傷而導致光合效率降低，目前生產上尚沒有有效的專門提高果樹葉片抗光氧化能力的預防方法。針對蘋果果實日燒，目前國內採取的措施主要有兩種，一是綜合防治，即加強果園栽培管理、合理負載量、葉幕微氣候和增強樹勢等，二是果實套袋技術，即在花後4-6周左右對幼果套袋，等到果實採收前2-4周把袋摘掉，讓果實上色，避免在高溫強光期果實直接暴露於強光下，從而防止日燒；國外發達國家對蘋果日燒的主要預防技術包括噴水、遮陰、噴布保護膜等，其中最有效的是噴水，最先進的是在果園的典型位置，在果面安裝溫度感應器，並且與自動噴水系統相連，當高溫強光天氣果面溫度升高到一定溫度時，自動噴水系統就啟動噴水，對果面降溫，從而達到防止日燒的目的。但目前生產上建議的綜合防治技術和果實套袋技術都有明顯的缺點。前者難以掌握，通常達不到效果；果實套袋技術如果操作得當，通常可以有效地防止日燒，但是，生產上如果摘袋時間不合適，或遇上不利天氣，可能導致更為嚴重的日燒，另外，套袋費工費時，隨著勞動力價格的快速上升，套袋成本太高，將越來越難以實施。國外的噴水預防蘋果日燒技術在許多地方不具備噴水條件，難以實施。蝦青素(Astaxanthin)是一種氧化型酮式紅色類胡蘿蔔素，具有很強的抗光氧化能力，能夠淬滅由光氧化產生的多種活性氧，防止活性氧對細胞的傷害。有研究表明，蝦青素抗氧化活性是維生素E的550倍，是￠-胡蘿蔔素、玉米黃素等類胡蘿蔔素的10倍，被譽為「超級維生素E」、「超級抗氧化劑」。而蘋果體內類胡蘿蔔素代謝途徑中不能合成蝦青素，但富含蝦青素合成的前體物質￠-胡蘿蔔素。蝦青素合成關鍵酶￠-胡蘿蔔素酮化酶(BKT)和￠-胡蘿蔔素羥化酶(CRTR-B)能夠共同作用轉化玉米黃素、P _胡蘿蔔素形成蝦青素。目前，利用蝦青素關鍵酶合成基因轉化蘋果，提高蘋果果實和葉片的抗光氧化能力方面的研究在國內外尚未見報導。
發明內容本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種編碼￠-胡蘿蔔素羥化酶的DNA序列。本發明的再一的目的是提供一種重組表達載體。本發明的另一的目的是提供一種基因工程化的宿主細胞。本發明的第四個目的是提供一種使蘋果樹合成蝦青素提高其抗光氧化能力的方法。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是一種編碼￠-胡蘿蔔素羥化酶的DNA序列，所述的DNA序列包括a) SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列，或b)與(a)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列。為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是一種重組表達載體，所述的載體是由如上所述的DNA序列與SEQ ID NO. 6所示的編碼P -胡蘿蔔素酮化酶的DNA序列以及質粒或病毒所構建的重組表達載體。所述的質粒是PCAMBIA1301。所述的載體是通過 下列步驟構建的a)把如上所述的DNA序列和SEQ ID NO. 6所示的DNA序列分別連入載體 pMD-18T，得到載體 pMD-18T-bkt 和 pMD-18T_crtR-B ；b)以 pMD_18T_bkt 為模板，以 SEQID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示的DNA序列為引物擴增得到含有BamHI和SacI酶切位點的bkt基因片段，用BamHI和SacI雙酶切後與BamHI、SacI雙酶切pBI221回收的大片段連接，得到中間載體pBI221-bkt ；c)中間載體pBI221-bkt經HindIII和EcoRI雙酶切後的小片段與表達載體PCAMBIA1301經HindIII和EcoRI雙酶切的大片段連接，獲得中間載體pCAMBIA1301-bkt ；d)以 pMD-18T_crtR-B 為模板，以 SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10 所示的DNA序列為引物擴增得到含有BglII和BstEII酶切位點的約879bp的crtR-B基因片段，用BglII和BstEII雙酶切回收後與BglII和BstEII雙酶切pCAMBIA1301_bkt回收的大片段連接，獲得載體 pCAMBIA1301-bkt-crtR-B。為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是一種基因工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞是用如上任一所述的重組表達載體轉化或轉導的宿主細胞及其後代細胞。所述的宿主細胞是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞或動物細胞，或這些宿主細胞的後代。所述的宿主細胞是農桿菌細胞。為實現上述第四個目的，本發明採取的技術方案是一種使蘋果樹合成蝦青素提高其抗光氧化能力的方法，所述的方法包括以下步驟a)構建如上所述的重組表達載體；b)利用步驟a)所述的重組表達載體轉化感受態農桿菌，獲得工程菌；c)利用步驟b)獲得的工程菌轉化蘋果組培苗。所述的蘋果組培苗是「Brookfield嘎啦」組培苗。本發明通過遺傳轉化，將蝦青素合成關鍵酶基因BKT和CRTR-B轉入蘋果基因組中，通過調控代謝途徑，在蘋果中合成蝦青素，培育出富含蝦青素的蘋果，增強蘋果葉片和果實的抗光氧化能力，從而提高光合效率、預防日燒的發生，從根本上克服了現有技術的缺點。
附圖I是載體pMD-18T圖譜。附圖2是載體pBI221圖譜。附圖3是載體pCAMBIA1301圖譜。附圖4 是載體 pl301-bkt-crtR-B 的 T-DNA 結構圖。
附圖5是轉基因與非轉基因組培苗的光合放氧速率，新復極差法(SSR)分析，不同字母表不差異水平P < 0. 05。附圖6是轉基因與非轉基因組培苗的Opsii，新復極差法(SSR)分析，不同字母表示差異水平P < 0. 05。
具體實施方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。以下實施例所用材料有培養基(1) YEB培養基，配方為牛肉浸膏5g/L，酵母膏lg/L，蛋白腖5g/L，蔗糖5g/L，MgSO4 7H200. 4g/100ml,pH7. 4，固體培養基加入瓊脂 I. 5g/100ml。(2) LB 培養基配方為酵母提取物5g，蛋白腖10g，NaC110g，pH7. 2，固體培養基加入瓊脂I. 5g/100ml。(3)培養基M1、M2、M3、M4、M5、M6配方如下
權利要求
1.一種編碼￠-胡蘿蔔素羥化酶的DNA序列，其特徵在於，所述的DNA序列包括a)SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列，或 b)與(a)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.一種重組表達載體，其特徵在於，所述的載體是由權利要求I所述的DNA序列與SEQID NO. 6所示的編碼￠-胡蘿蔔素酮化酶的DNA序列以及質粒或病毒所構建的重組表達載體。
3.根據權利要求2所述的重組表達載體，其特徵在於，所述的質粒是pCAMBIA1301。
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特徵在幹，所述的載體是通過下列步驟構建的 a)把權利要求I所述的DNA序列和SEQID NO. 6所示的DNA序列分別連入載體PMD-18T，得到載體 pMD-18T-bkt 和 pMD-18T_crtR-B ； b)以pMD-18T-bkt為模板，以SEQID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示的DNA序列為引物擴增得到含有BamH I和Sac I酶切位點的bkt基因片段，用BamHI和SacI雙酶切後與BamHI、SacI雙酶切pBI221回收的大片段連接，得到中間載體pBI221-bkt ； c)中間載體pBI221-bkt經HindIII和EcoRI雙酶切後的小片段與表達載體PCAMBIA1301經HindIII和EcoRI雙酶切的大片段連接，獲得中間載體pCAMBIA1301_bkt ； d)以pMD-18T-crtR-B 為模板，以 SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10 所示的 DNA 序列為引物擴增得到含有BglII和BstEII酶切位點的約879bp的crtR-B基因片段，用BglII和BstEII雙酶切回收後與BglII和BstEII雙酶切pCAMBIA1301-bkt回收的大片段連接，獲得載體 pCAMBIA1301-bkt-crtR-B。
5.ー種基因工程化的宿主細胞，其特徵在幹，所述的宿主細胞是用權利要求2-4任一所述的重組表達載體轉化或轉導的宿主細胞及其後代細胞。
6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特徵在於，所述的宿主細胞是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞或動物細胞，或這些宿主細胞的後代。
7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其特徵在於，所述的宿主細胞是農桿菌細胞。
8.—種使蘋果樹合成蝦青素提高其抗光氧化能力的方法，其特徵在幹，所述的方法包括以下步驟 a)構建如權利要求4所述的重組表達載體； b)利用步驟a)所述的重組表達載體轉化感受態農桿菌，獲得工程菌； c)利用步驟b)獲得的工程菌轉化蘋果組培苗。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的蘋果組培苗是「Brookfield嘎啦」組培苗。
全文摘要
本發明提供一種編碼β-胡蘿蔔素羥化酶的SEQ ID NO.5所示的DNA序列、該DNA序列與編碼β-胡蘿蔔素酮化酶的SEQ ID NO.6所示的DNA序列以及質粒所構建的重組表達載體、經上述重組表達載體轉化的宿主細胞；本發明還提供一種使蘋果樹合成蝦青素提高其抗光氧化能力的方法，所述的方法包括以下步驟a)構建重組表達載體pCAMBIA1301-bkt-crtR-B；b)重組表達載體pCAMBIA1301-bkt-crtR-B轉化感受態農桿菌EHA105；c)農桿菌轉化蘋果組培苗獲得轉基因植株。本發明通過遺傳轉化，將蝦青素合成關鍵酶基因bkt和crtR-B轉入蘋果基因組中，通過調控代謝途徑培育出富含蝦青素的蘋果，從而提高其光合效率、預防日燒的發生，從根本上克服了現有技術的缺點。
文檔編號C12N1/15GK102766641SQ201210277739
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月2日 優先權日2012年8月2日 公開號201210277739.8
發明者劉成連, 原永兵, 李富超, 秦松, 賈東傑 申請人:青島農業大學