修飾5-羥甲基胞嘧啶的組合物和方法
2023-06-02 15:17:51 2
專利名稱：修飾5-羥甲基胞嘧啶的組合物和方法
技術領域：
本發明大體上涉及分子生物學領域。更具體地，本發明涉及用於檢測、評價和/或定位核酸分子中的5-羥甲基-修飾的胞嘧啶鹼基的方法和組合物。
背景技術：
5-甲基胞嘧啶(5-mC)佔人類基因組DNA中總胞嘧啶的約2_8%，其具有多種生物學功能，包括基因表達、基因組完整性的維持、親本印記、X-染色體失活、發育、衰老和癌症的調節。最近，在胚胎和神經幹細胞中、某些成人腦細胞中以及一些癌細胞中發現了氧化的 5-mC、5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)。需要用於檢測和評價真核生物基因組中的5-hmC的方法和組合物。
發明內容
對5-羥甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶不能加以區分，這給更好地研究和理解基因組DNA中5-甲基胞嘧啶的內源性羥基化的意義帶來了挑戰。能夠檢測或定位羥甲基狀態的解決方案對於診斷和治療應用具有意義。因此，提供並描述了方法和組合物。在一些實施方式中，提供了用於區分核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的方法，用於修飾包含至少一個5-羥甲基胞嘧啶的核酸分子的方法，用於鑑定基因組 DNA中5-羥甲基胞嘧啶的方法，和基於第一核酸樣品中是否存在5-羥甲基胞嘧啶來比較第一核酸樣品與至少一個第二核酸樣品的方法。所述方法可以包括以下描述的任意步驟。在一些實施方式中，所述方法包括將核酸分子與葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子一起溫育，從而使核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的葡萄糖(Glu)分子糖基化。在其它實施方式中， 所述方法可以包括將核酸與β-葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子在促進核酸中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的葡萄糖(Glu)分子糖基化的條件下混合。特別考慮到該反應涉及任何可以被時間、酶濃度、底物濃度和/或模板濃度限定或限制的酶。 例如，可以對核酸分子進行部分限制性酶消化或部分糖基化。可以調整反應條件，從而使反應在完成大約、至少大約或至多大約20，30，40，50，60，70，80，90，95，96，97，98，99，100%， 或其中的任意範圍的條件下進行。在一些實施方式中，所述方法還可以在核酸的糖基化之前和/或同時包括關於核酸的以下一項或多項操作獲取核酸分子；從生物樣品中獲取核酸分子；從受試者獲取包含核酸的生物樣品；分離核酸分子；純化核酸分子；獲取包含待糖基化的核酸的陣列或微陣列；剪切或切割核酸；使核酸分子變性；使核酸分子雜交；將核酸分子與β -葡萄糖基轉移酶之外的酶溫育；將核酸分子與限制性酶溫育；將一種或多種化學基團或化合物連接到核酸上；將一種或多種化學基團或化合物綴合到核酸上；將核酸分子與酶溫育，所述酶通過添加或刪除一個或多個元件、化學基團或化合物而對所述核酸分子進行修飾。所述方法還可以在核酸的糖基化的同時和/或之後包括以下一個或多個步驟分離被修飾的葡萄糖糖基化的核酸；基於對葡萄糖的修飾分離糖基化的(和修飾的)核酸； 基於對葡萄糖的修飾純化糖基化的(和修飾的)核酸；將糖基化的核酸暴露於酶、與酶一起溫育或與酶混合，所述酶將使用糖基化的核酸作為底物，但不依賴於對葡萄糖的修飾；將糖基化的核酸暴露於酶、與酶一起溫育或與酶混合，所述酶將使用糖基化的核酸作為底物，除非對葡萄糖的修飾會修飾、改變、阻止或阻礙所述的酶；將糖基化的核酸暴露於酶、與酶一起溫育或與酶混合，所述酶將使用糖基化的核酸作為底物，除非修飾會對該酶造成空間阻礙或抑制；富集包含修飾的和糖基化的核酸的核酸；使用修飾的葡萄糖分子鑑定核酸中的 5-羥甲基胞嘧啶；通過將糖基化的核酸與未糖基化的核酸進行對比來鑑定核酸中的5-羥甲基胞嘧啶；定位核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶；使糖基化的核酸進行引物延伸測定並將結果與對照核酸進行比較；使糖基化的核酸進行雜交測定並將結果與對照核酸進行比較； 和/或對糖基化的核酸進行測序並將結果與對照核酸進行比較。所述方法還可以包括以下步驟克隆β-葡萄糖基轉移酶；合成β-葡萄糖基轉移酶或其功能片段；分離β -葡萄糖基轉移酶；純化β -葡萄糖基轉移酶；合成β -葡萄糖基轉移酶；將葡萄糖基轉移酶置於無菌容器中；運輸處於容器中的純化的或分離的
葡萄糖基轉移酶；和/或提供關於使用葡萄糖基轉移酶的說明書；將葡萄糖基轉移酶與UDP-葡萄糖分子和核酸底物在促進核酸被葡萄糖分子(其可以是修飾的或未修飾的)糖基化的條件下溫育，並產生在一個或多個5-羥甲基胞嘧啶上糖基化了的核酸。本發明的方法和組合物可以涉及純化的核酸、修飾的UDP-GlU和/或酶，例如 β-葡萄糖基轉移酶。這些程序對本領域技術人員是已知的。在一些實施方式中，純化可以使分子的純度相對於任何汙染成分是大約或至少大約70，75，80，85，90，95，96，97，98，99， 99. 1,99. 2,99. 3,99. 4,99. 5,99. 6,99. 799. 8,99. 9%或更高，或其中的任何範圍(w/w 或 w/
V) O在其它方法中，可以有以下步驟，包括但不限於，獲取關於核酸樣品中的一個或多個5-羥甲基胞嘧啶的信息(定性和/或定量)；定製測定、鑑定和/或定位核酸樣品中的5-羥甲基胞嘧啶的測試法；報告關於核酸樣品中的一個或多個5-羥甲基胞嘧啶的信息 (定性和/或定量)；將該信息與對照的或相當的樣品中關於5-羥甲基胞嘧啶的信息進行對比。除非另有指明，否則在提及樣品時的術語「測定」、「分析」、「測試」和「評價」是指轉化該樣品以收集關於該樣品的定性和/或定量的數據。在一些實施方式中，核酸分子可以是DNA、RNA或二者的組合。核酸可以是重組的、 基因組的或合成的。在其它實施方式中，所述方法涉及分離的和/或純化的核酸。在一些實施方式中，所述核酸可以從細胞或生物樣品中純化。一些實施方式包括從真核細胞、哺乳動物或人類細胞中分離核酸。在一些實施方式中，核酸分子是真核的。在一些情況下，核酸是哺乳動物的，所述哺乳動物可以是人。這意味著核酸分子可以分離自人類細胞和/或具有將其鑑定為人的序列。在具體的實施方式中，考慮到核酸分子不是原核的核酸，例如細菌核酸分子。在其它實施方式中，分離的核酸分子位於陣列上。在具體的情況下，所述陣列是微陣列。在一些情況下，核酸分子通過本領域技術人員已知的任何技術分離，包括但不限於， 使用凝膠、柱、基質或過濾器來分離核酸。在一些實施方式中，所述凝膠是聚丙烯醯胺或瓊脂糖凝膠。本發明的方法和組合物還可以包括修飾的UDP-Glu。在一些實施方式中，所述修飾的UDP-Glu包含修飾部分(modification moity)。在一些實施方式中，包括一種以上的修飾部分。術語「修飾部分」是指添加到UDP-Glu分子上的化學化合物或元件。修飾的 UDP-Glu是指具有下列的UDP-Glu分子i)修飾部分，或ii)替換UDP-Glu中的分子的化學化合物或元件，從而得到的修飾的化合物具有不同於未修飾的UDP-Glu的化學式。特別考慮到修飾的UDP-Glu不包括，僅僅將UDP-Glu中的分子或化合物替換為相同的分子或化合物(例如僅僅是具有放射活性的分子或化合物)而產生的具有放射性的UDP-Glu。在一些實施方式中，考慮到不使用修飾的UDP-Glu，而是使用一種或多種化學化合物，其為相同分子的有放射活性的版本。在一些實施方式中，修飾的UDP-Glu或修飾部分可以包含一個或多個可檢測部分。所述可檢測部分是指能夠被檢測的化學化合物或元件。在具體的實施方式中，修飾的 UDP-Glu不是具有放射活性的UDP-Glu版本，在具體的實施方式中，修飾的UDP-Glu不含放射活性的碳。在一些實施方式中，所述可檢測部分是螢光、放射活性、酶學的、電化學的或比色法的。在一些實施方式中，所述可檢測部分是螢光團。在具體的實施方式中，FRET可以用於檢測糖基化的核苷酸。在一些實施方式中，修飾部分可以是官能部分。在一些實施方式中，修飾部分包括疊氮接頭(azide linker)或巰基接頭(thiol linker)。在其它實施方式中，官能部分可以是分離標籤，意思是標籤可用於分離與該標籤連接的分子。在一些實施方式中，分離標籤是生物素或組氨酸標籤。在一些情況下，標籤是修飾的，例如以可檢測的部分修飾。在其它實施方式中，修飾部分包含抑制或阻斷酶的分子或化合物，使所述酶不能使用核酸分子中的糖基化的5-羥甲基胞嘧啶作為底物。在一些實施方式中，抑制足以完全阻止檢測涉及糖基化的5-羥甲基胞嘧啶的酶促反應。考慮到阻斷酶的分子或化合物可以通過對酶進行空間阻礙來進行。特別考慮到這樣的空間阻斷部分作為修飾部分。在具體的實施方式中，空間阻斷部分包含1、2或3個環式結構，包括但不限於芳香環結構。在一些實施方式中，所述阻斷部分是聚乙二醇。在其它實施方式中，在其它實施方式中，阻斷部分是核酸、胺基酸、碳水化合物或脂肪酸(包括單、二或三脂肪酸)。除了葡萄糖基轉移酶之外，本發明的方法和組合物還可以涉及一種或多種酶。在一些實施方式中，所述酶是限制性酶或聚合酶。在一些情況下，實施方式涉及限制性酶。所述限制性酶可以是甲基化不敏感的。在其它實施方式中，所述酶是聚合酶。在一些實施方式中，在核酸分子被修飾的UDP-Glu糖基化之前、與之同時或之後，核酸與限制性酶接觸。可以在核酸暴露於限制性酶之前或之後使糖基化的核酸與聚合酶接觸。本發明的方法和組合物涉及在修飾5-羥甲基胞嘧啶、但不修飾甲基胞嘧啶之後， 區分5-羥甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶。所述方法可以包括，通過將糖基化的核酸與未糖基化的核酸或與糖基化狀態已知的核酸進行比較來鑑定核酸中的5-羥甲基胞嘧啶。修飾的檢測可以包括多種重組核酸技術。在一些實施方式中，將糖基化的核酸分子與聚合酶、至少一種引物和一種或多種核苷酸在允許糖基化的核酸聚合的條件下溫育。在其它實施方式中， 所述方法可以包括對糖基化的核酸分子進行測序。在其它實施方式中，糖基化的核酸用於引物延伸測定。本發明的核酸和組合物可以包括對照核酸。所述對照可以用於評價是否正在發生糖基化或其它酶促反應。或者，所述對照可用於比較糖基化狀態。對照可以是陰性對照或陽性對照。對照可以不與糖基化反應中的一種或多種試劑一起溫育。或者，對照核酸可以是參照核酸(reference nucleic acid)，意思是其糖基化狀態(基於5_羥甲基胞嘧啶上的糖基化的定性和/或定量信息，或者，其不存在)用於比較待評價的核酸。在一些實施方式中，來自不同來源的多個核酸提供對照核酸的基礎。此外，在一些情況下，對照核酸來自正常的樣品(就某特性而言，例如疾病或病況，或其它表型)。在一些實施方式中，對照樣品來自不同的患者群、不同的細胞類型或器官類型、不同的疾病狀態、不同的疾病狀態的時期或嚴重性、不同的預後、不同的發育階段等。在具體的實施方式中，提供了區分核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的方法，包括將核酸分子與葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu) 分子一起溫育，從而使核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的葡萄糖分子糖基化。其它方法涉及對包含至少一個5-羥甲基胞嘧啶的核酸分子進行修飾，包括將所述核酸分子與葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子一起溫育， 從而使核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的葡萄糖分子糖基化。具體的實施方式涉及鑑定基因組DNA中的5-羥甲基胞嘧啶，其包括a)分離基因組DNA ；b)將所述基因組DNA剪切或切割成片段；c)將所述基因組DNA片段與β -葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子在促進基因組DNA中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的UDP-Glu分子糖基化的條件下溫育；和d)使用修飾的UDP-Glu分子鑑定基因組DNA中的5-羥甲基胞嘧啶。在其它實施方式中，提供了鑑定核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶的方法，其包括 a)將核酸分子與葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子在促進核酸中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的UDP-Glu分子糖基化的條件下溫育；b)將糖基化的核酸與甲基化敏感的限制性酶混合，其中所述修飾的UDP-Glu分子包括這樣的分子或化合物，它們能夠阻止核酸分子在某位點被切割，所述位點是如果所述核酸分子未被修飾的 UDP-Glu糖基化，則會在該位點被切割；和c)使用修飾的UDP-Glu分子鑑定核酸分子中的 5-羥甲基胞嘧啶。其它實施方式可以包括定位核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶的方法，其包括將核酸分子與葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子一起溫育，從而使核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的UDP-Glu分子糖基化；然後定位核酸分子中的 5-羥甲基胞嘧啶。如上所述，可以通過多種方法進行核酸中的5-羥甲基胞嘧啶的定位，包括通過對糖基化的核酸進行測序並將結果與對照核酸進行比較，或者，使糖基化的核酸進行引物延伸測定並將結果與對照核酸進行比較。在一些實施方式中，通過使糖基化的核酸進行雜交測定並將結果與對照核酸進行比較來定位核酸中的5-羥甲基胞嘧啶。其它實施方式包括可用於實現本發明方法的試劑盒。在一些實施方式中，提供了包含純化的β-葡萄糖基轉移酶和一種或多種修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子的試劑盒。所述分子可以包括或涉及多種不同類型的修飾。在其它實施方式中，所述試劑盒可以包括一種或多種緩衝液，例如用於核酸的緩衝液或用於涉及核酸的反應的緩衝液。，試劑盒中可以包括除了葡萄糖基轉移酶之外的其它酶，或替代葡萄糖基轉移酶的酶。 在一些實施方式中，所述酶是聚合酶。試劑盒還可以包括與聚合酶一起使用的核苷酸。在一些情況下，除了葡萄糖基轉移酶之外，試劑盒中可以包括限制性酶，或替代葡萄糖基轉移酶的限制性酶。本發明使用的「一個」當與術語「包含」 一起用於權利要求和/或說明書中時，其表示單數的「一個」或者表示複數「一個或多個」、「至少一個」和「一個或多個」。本文描述的任何實施方式可以根據本發明的任意方法和組合物實施，反之亦然。 此外，本發明的組合物和試劑盒可用於實現本發明的方法。在本申請中，術語「大約」表示數值包括用於測定該數值的設備或方法的標準偏差或誤差。除非明確指明權利要求中的術語「或」僅僅是指替代物或替代物相互排斥，否則 「或」的意思是「和/或」，雖然說明書中有僅僅提及替代物和「和/或」的定義。還考慮到通過術語「或」連接的任何物質也可以被特異性地排除。本說明書和權利要求書中使用的術語「包含」和「包括」以及「具有」、「含有」是包含式的開放式的，其不排除其它的、未提及的元件或方法步驟。以下具體描述了本發明的其它目標、特徵和優點。但是應該理解，僅僅是通過舉例方式描述具體實施方式
和具體實施例，它們指明了本發明的具體的實施方式。本領域技術人員在閱讀本說明書之後可以獲知本發明精神和範圍內的各種改變和修飾。
以下附圖構成本說明書的一部分，其進一步說明了本發明的某些方面。可以根據以下具體實施方式
的詳細描述並通過參考一個或多個附圖更好地理解本發明。圖1A-1B.修飾和鑑定5-hmC的一般策略。圖IA 使用β -葡萄糖基轉移酶(β GT) 修飾雙鏈DNA中的5-hmC，β -葡萄糖基轉移酶將UDP-葡萄糖(UDP-Glu)中的葡萄糖分子共價連接至羥甲基修飾的鹼基以產生5-gmC。可以使用合成修飾的UDP-Glu向5_hmC引入官能標籤基團(X)。圖IB 核酸分子內的5-hmC的官能標籤化(例如使用巰基或疊氮反應基)允許共價連接另外的官能團，例如生物素，其已用於多種分子生物學技術。圖 2.含有 COGG 的 40mer DNA(其中 C* = C、5-meC、5_hmC 或 5-gmC)的限制性酶切檢測。雙鏈DNA中的5-gmC修飾完全阻斷了限制性酶MspI的活性。圖3.疊氮基取代的UDP-Glu的合成圖示。圖4.檢測基因組DNA中的5_hmC修飾的高通量方法。圖4A 可以利用5-meC、 5-hmC和5-gmC與亞硫酸氫鹽反應的差異來區分5_hmC或5-gmC與5_meC。圖4B 5-gmC上的光敏劑可以引起標記的(5-gmC)pG的光敏氧化，以及隨後對該區域選擇性的鹼介導的鏈切割。圖5.模型實驗中含有5-hmC、5-N3-gmC和生物素-5_N3-gmC的11-mer DNA的質譜 (MS)表徵。A.含有 5-hmC、5-N3-gmC 和生物素-5_N3-gmC 的 11-mer DNA 的 MALDI-TOF 圖譜，顯示了計算分子量和觀測分子量。B. 0 61~催化的形成5-隊1!11(的反應，以及隨後的無銅點擊化學以產生雙鏈DNA中的生物素-5-N3-gmC。在具有互補鏈的雙鏈DNA中進行反應； 但是，MS監測含有修飾的單鏈DNA。圖6.生物素U3-gmC的鏈黴親和素加合阻礙引物的延伸。A.用於引物延伸的 40-merDNA的序列，其包含胞嘧啶修飾(*C)。箭頭代表用於引物延伸的反向PCR引物。B.用於測定包含不同胞嘧啶修飾的40-mer DNA的引物延伸測試，旁邊顯示了 Sanger測序梯。*C位置上的常規胞嘧啶、5-mC、5-hmC或生物素-5_N3-gmC都不阻礙引物延伸。當使用6至48 當量的鏈黴親和素處理含有生物素_5-N3-gmC的DNA時，引物延伸被完全阻斷。最顯著的阻斷位置是修飾鹼基前的一個鹼基，在修飾的位置(位置25，箭頭)也觀察到了顯著阻礙。 延伸實驗使用REDTaq DNA聚合酶(Sigma)，在72°C進行1分鐘。
具體實施例方式具體實施方式
涉及修飾、檢測和/或評價核酸中的5-hmC的方法和組合物。在一些方面，5-hmC被糖基化。在其它方面，5-hmC偶聯至標記的或修飾的葡萄糖部分。使用本文描述的方法，可以將眾多可檢測基團(生物素、螢光標籤、放射性基團等)通過葡萄糖修飾偶聯至5-hmC。可以使用β-葡萄糖基轉移酶(0GT)或類似的酶進行5-hmC的修飾，這些酶催化葡萄糖部分從二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)轉移至5-hmC的羥基，從而產生β-糖基-5-羥甲基-胞嘧啶(5-gmC)。本發明人發現，這種酶促糖基化提供了引入修飾的葡萄糖分子從而對真核核酸中的5-hmC進行標記或加標籤的策略。例如，經化學修飾為包含疊氮基(-N3)的葡萄糖分子可以通過這種酶催化的糖基化反應共價連接至5-hmC。然後，可以通過與疊氮物的反應向糖基化的5-hmC中特異性地引入磷化氫激活的試劑，包括但不限於，生物素-磷化氫、螢光團-磷化氫、NHS-磷化氫，或其它親和標籤。化學標籤可用於通過高通量方式測定5-hmC的精確位置。本發明人已經表明， 5-gmC修飾賦予了標記的DNA對限制性酶切和/或聚合化的抗性。在一些方面，可以使用限制性酶處理糖基化的和未修飾的基因組DNA，然後進行各種測序以揭示阻礙消化的各個胞嘧啶修飾的精確位置。本發明人表明，可以使用本文描述的方法向DNA中引入官能團(例如疊氮基)。官能團的引入允許使用生物素和其它標籤進一步對胞嘧啶殘基進行標記或標籤化。5-hmC的標記或標籤化可以使用例如點擊化學(click chemistry)或本領域技術人員已知的其它官能團/偶聯基團。可以分離包含5-bmC的標記的或標籤化的DNA片段並使用目前使用的評價包含5-mC的核酸的方法來對其進行評價。此外，本發明的方法和組合物可用於向5-hmC引入空間上的大基團。DNA模板鏈上大基團的存在會干擾DNA聚合酶或RNA聚合酶合成核酸鏈，或者幹擾限制性核酸內切酶對 DNA的有效切割，或者抑制對含有5-hmC的核酸的其它酶促修飾。結果是，可以應用例如引物延伸或其它測定法來評價一定長度的部分延伸的引物，並且可以通過對部分延伸的引物進行測序來揭示修飾位點。還考慮到其它的利用這種化學標記方法的方案。在一些方面，可以評價兩個或更多個樣品之間不同的核酸修飾。以心、肝、肺、腎、 肌肉、睪丸、脾和腦進行的研究表明，在正常條件下，5-hmC主要存在於正常腦細胞中。其它的研究表明，5-hmC也存在於小鼠胚胎幹細胞中。已經鑑定出Ten-eleven translocation 1 (TETl)蛋白是將5-mC轉化為5_hmC的催化劑。研究表明，TETl的表達與5_mC的表達逆向相關。細胞中TETl的過表達似乎與5-hmC表達的增加相關。另外，已知TETl參與小兒和成人急性骨髓性白血病和急性淋巴細胞性白血病。因此，評價並比較5-hmC的水平可以用於評價各種疾病狀態並比較各種核酸樣品。有多種酶對5-hmC的糖基化是敏感的。這些酶包括但不限於，Klenow片段(3' —5'外切)、Pfu、kquenase Version 2. ODNA 聚合酶(usb)和 Taq 聚合酶。I. 5-hmC 的修飾一些實施方式涉及修飾包含5-hmC的真核核酸的方法和組合物。在一些方面，將目標核酸與β -葡萄糖基轉移酶和包含修飾的或可修飾的葡萄糖部分的UDP底物接觸。Α· β -葡萄糖基轉移酶(β GT)葡萄糖基-DNA β -葡萄糖基轉移酶(EC 2. 4. 1.28, β -葡萄糖基轉移酶(β GT)) 是催化這樣的化學反應的酶將β-D-葡萄糖基殘基從UDP-葡萄糖轉移至核酸中的葡萄糖基羥甲基胞嘧啶殘基。從這個方面而言，該酶類似於DNA 葡萄糖基轉移酶。該酶屬於糖基轉移酶、尤其是己糖基轉移酶家族。該類酶的系統命名法名稱是UDP-葡萄糖D-葡萄糖基-DNA β -D-葡萄糖基轉移酶。其它通用名包括Τ6-葡萄糖基-HMC- β -葡萄糖基轉移酶、Τ6-β -葡萄糖基轉移酶、二磷酸尿苷葡萄糖-葡萄糖基脫氧核糖核酸(uridine dipho sphoglucose-glucosyldeoxyribonucleate)禾口 β -葡萄糖基轉移酶。在一些方面，所述β-葡萄糖基轉移酶是His標籤融合蛋白。例如，根據ftOtein Expr. Purif. 2006，47，446-454的描述通過連接非依賴性克隆(LIC)方法將β GT克隆進入靶載體PMCSG19。將得到的質粒通過熱擊法轉化進入包含pRK1037 (Science Reagents, Inc.)的BL2lstar (DE3)感受態細胞。使用150μ g/ml氨比西林和30 μ g/ml卡那黴素選擇陽性菌落。使來自1 100稀釋的過夜培養物的1升細胞生長於37°C。當0D600達到 0. 6-0. 8時，使用ImM的IPTG誘導細胞。在16°C在搖床培養過夜後，通過離心收集細胞，懸浮於 30mLNi-NTA 緩衝液 M20mOTris-HCl pH 7. 5,150mM NaCl，30mM 咪唑，和 IOmM β -ME) 與蛋白酶抑制劑PMSF中。裝載上Ni-NTA柱，使用0-100%梯度的Ni-NTA緩衝液B(20mM Tris-HCl pH 7. 5,150mM NaCl，400mM 咪唑，和 IOmM β_ΜΕ)洗脫蛋白。通過 MonoS(緩衝液A =IOmM Tris-HCl pH 7. 5 ；緩衝液B :10mM Tris-HCl pH 7. 5，和 IM NaCl)進一步純化含 3GT的級份以除掉DNA。最後，將收集的蛋白級份裝載至Superdex 200 (G^凝膠-過濾柱 (使用 50mM Tris-HCl pH 7. 5，20mMMgCl2，和 IOmM β -ME 平衡)。SDS-PAGE 凝膠顯示了高純度的0GT。將β GT濃縮至45 μ M並儲存於-80°C，添加30%的甘油。B.修飾的葡萄糖分子官能化的或經標記的葡萄糖分子可以和β GT聯合用於修飾核酸聚合物例如DNA 或RNA中的5-hmC。在一些方面，β GT UDP底物包含官能化的或經標記的葡萄糖部分。在其它方面， 可以使用點擊化學或本領域已知的其它偶聯化學法對所述葡萄糖部分進行修飾或官能化。 點擊化學是由K. Barry Sharpless於2001年開發的化學理論，描述了通過小單元的拼接來快速可靠地生成物質的化學法。標記物可以是任何被檢測的或能夠被檢測的標記。適當的標記物的例子包括例如，發色標記物、放射性標記物、螢光標記物和生物素化的標記物。因此，標記物可以是例如，螢光葡萄糖、生物素標記的葡萄糖、放射性標記的葡萄糖等。在一些方面，標記物是發色標記物。術語「發色標記物」包括所有具有獨特顏色或可檢測標誌物的試劑。除了具有內在的、可見光範圍內易觀察的顏色的化學結構之外，使用的其它標誌物包括螢光基團、生物素標籤、酶(可用於生成有色產物的反應)、磁性和同位素標誌物等等。上述可檢測標誌物的列舉僅僅是示例性的目的，絕非限制性的或窮舉式的。
可以使用本領域已知的方法將標記物連接至試劑。所述標記物包括連接至葡萄糖分子的任何可檢測基團，或不幹擾其功能的檢測劑。另外的可用的標記物包括螢光標記物，例如螢光素、Texas Red、LuciferYellow、若丹明、Nile-red、四甲基-若丹明_5_異硫氰酸鹽、1，6_ 二苯基-1，3，5-己三烯、順式-十八碳四烯酸、藻紅蛋白、別藻藍蛋白 (Allophycocyanin)、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst 33258、2_ 氨基苯甲醯胺等。另外的標記物包括電子密集金屬例如金，配體，半抗原例如生物素，放射性標記物。1.點擊化學Huisgen 1，3_雙偶極環加成反應，特別是Cu⑴-催化的逐步變體，通常被簡稱為 「點擊反應」。Cu(I)-催化的變體首先由來自丹麥Carlsberg Laboratory的Morten Meldal 及其同事報導，用於在固體載體上合成P印tidotriazole。Fokin和Sharpless獨立地將其描述為可信賴的催化過程，其提供了「空前的選擇性、可信賴性水平和那些依賴於在不同模塊之間產生共價鍵的有機合成的範圍」，其為滿足點擊標準的最可信賴的過程之一。點擊化學理論中最常見的反應之一是在室溫使用Cu催化劑進行的疊氮炔 Huisgen環加成，其由K. Barry Sharpless和Morten Meldal的研究組同時獨立地發現。這相對於RolfHuisgen在1970年代最初推廣的相同反應(其在較高溫度、無水、無銅催化劑的情況下進行)是一種改進。疊氮物和炔都是動力學上穩定的。銅和釕是反應中經常使用的催化劑。銅催化的點擊反應基本上在末端炔上進行。銅經過金屬插入反應進入末端炔。常用的溶劑是極性的質子惰性的溶劑，例如THF、DMS0、CH3CN、DMF,以及非極性的質子惰性的溶劑，例如甲苯。可以使用單獨的溶劑或其混合物。點擊化學具有廣泛的應用。其中有製備型有機合成1，4_取代的三唑；使用三唑修飾肽功能；修飾天然產品和藥物；藥物發現；使用Cu(I)催化的三唑偶聯進行巨環化；通過三唑連接進行DNA和核苷酸的修飾；超分子化學；杯芳烴、輪烷、索烴；樹狀大分子 (dendrimer)的設計；使用Cu(I)催化的三唑連接反應進行碳水化合物成簇和碳水化合物綴合；聚合物；材料科學；和納米技術。2.攜帶巰基或疊氮基的修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)的合成5-hmC糖基化的最初成功產生了以下假設巰基或疊氮基修飾的葡萄糖可以類似地被轉移至雙鏈DNA中的5-hmC。因此，本發明人預期合成巰基_或疊氮基_取代的UDP-Glu 以用於5-hmC的標記。疊氮標籤是優選的，因為該官能團不存在於細胞內。用於標記該基團的點擊化學是完全生物正交的(bio-orthogonal)，意思是沒有來自生物樣品的幹涉。圖 3中顯示了疊氮基取代的UDP-Glu。疊氮基取代的葡萄糖可以被轉移至5-hmC，如下所示。
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權利要求
1.用於區分核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的方法，所述方法包括將核酸分子與β-葡萄糖基轉移酶和具有修飾部分的修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子一起溫育，從而使核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的葡萄糖分子糖基化。
2.用於修飾包含至少一個5-羥甲基胞嘧啶的核酸分子的方法，所述方法包括將核酸分子與葡萄糖基轉移酶和具有修飾部分的修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子一起溫育，從而使核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的葡萄糖分子糖基化。
3.鑑定基因組DNA中的5-羥甲基胞嘧啶的方法，所述方法包括a)分離基因組DNA；b)將所述基因組DNA剪切或切割成片段；c)將所述基因組DNA片段與葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖 (UDP-Glu)分子在促進基因組DNA中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的UDP-Glu分子糖基化的條件下溫育；和d)使用修飾的葡萄糖分子鑑定基因組DNA中的5-羥甲基胞嘧啶。
4.鑑定核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶的方法，所述方法包括a)將核酸分子與β-葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子在促進核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的葡萄糖分子糖基化的條件下溫育；b)將糖基化的核酸與甲基化敏感的限制性酶混合，其中所述修飾的UDP-Glu分子包括這樣的分子或化合物，它們能夠阻止核酸分子在某位點被切割，所述位點是如果所述核酸分子未被修飾的葡萄糖分子糖基化，則會在該位點被切割；和c)使用修飾的葡萄糖分子鑑定核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶。
5.定位核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶的方法，所述方法包括將核酸分子與β-葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子一起溫育，從而使核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶被修飾的葡萄糖分子糖基化；然後定位核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶。
6.比較第一核酸樣品與至少一個第二核酸樣品的方法，所述方法基於第一核酸樣品中是否存在5-羥甲基胞嘧啶，所述方法包括a)將第一核酸樣品與β-葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu)分子一起溫育，其中修飾的葡萄糖通過酶促方式地連接至第一核酸樣品中的核酸分子的5-羥甲基胞嘧啶；b)基於UDP-Glu的存在檢測或測定5-羥甲基胞嘧啶，從而確定第一核酸樣品中5-羥甲基胞嘧啶的狀態；和c)比較第一核酸樣品的5-羥甲基胞嘧啶狀態與至少一個第二核酸樣品的5-羥甲基胞嘧啶狀態。
7.比較第一核酸樣品與至少一個第二核酸樣品的方法，所述方法基於第一核酸樣品中是否存在5-羥甲基胞嘧啶，所述方法包括從生物樣品獲取第一核酸樣品；獲取鑑定第一核酸樣品中是否存在5-羥甲基胞嘧啶的信息；和，將該信息與鑑定所述至少一個第二核酸樣品中是否存在5-羥甲基胞嘧啶的信息進行比較，從而鑑定兩個樣品之間5-羥甲基胞嘧啶方面的任何差異。
8.試劑盒，其包含純化的葡萄糖基轉移酶和修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glu) 分子。
全文摘要
本發明涉及修飾5-羥甲基胞嘧啶的組合物和方法。更具體地，本發明涉及用於檢測、評價和/或定位核酸分子中的5-羥甲基胞嘧啶鹼基的方法和組合物。
文檔編號C12Q1/68GK102533941SQ20101058121
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月10日 優先權日2010年12月10日
發明者金贇懿 申請人:金贇懿