一種抗手足口病特異性雞卵黃抗體的製備方法
2023-06-02 15:17:56 1
專利名稱：一種抗手足口病特異性雞卵黃抗體的製備方法
技術領域：
本發明屬於免疫學技術領域，具體涉及一種抗手足口病特異性雞卵黃抗體的製備 方法。
背景技術：
手足口病(Hand-Footand Mouth Disease, HFMD)於 1957 年在紐西蘭首次報導， 1958年分離出柯薩奇病毒，1959年提出HFMD命名，60年代以後，許多國家和地區多次報導 該病的流行。早期發現的手足口病的病原體主要是CoxAie型，1969年分離出EV71病毒並 首次被確認。此後CoxAie感染和EV71感染交替出現，成為手足口病的主要病原體。20世 紀70年代中期，保加利亞、匈牙利相繼暴發以中樞神經系統為主要臨床特徵的EV71流行。 20世紀90年代後期，EV71開始在東南亞地區流行。我國於1981年在上海首次報導本病。 此後，北京、河北、天津、福建、吉林和廣東等10幾個省市均有報導。1995年武漢病毒研究 所從手足口病人中分離出EV71，1998年深圳市衛生防疫站從患者標本中分離出EV71病毒。 近年來EV71病毒的流行呈上升趨勢，不斷引起嚴重的中樞神經系統症狀，導致兒童死亡。手足口病是由多種腸道病毒引起的急性傳染病，最主要的病原體是EV71和柯薩 奇病毒A16型(CoxAie)，多發生於嬰幼兒，成人也偶見發生，可引起發熱和手、足、口腔等部 位的皮疹或皰疹，具有很強的傳染性，可以通過玩具、食具、鼻咽分泌物、飛沫等多種途徑傳 染。其症狀表現為急性起病，發熱，手掌或腳掌部出現斑丘疹和皰疹，臀部或膝蓋也可出現 皮疹。皮疹周圍有炎性紅暈，皰內液體較少；口腔黏膜出現散在的皰疹，疼痛明顯。部分患 兒伴有咳嗽、流涕、食欲不振、噁心、嘔吐和頭疼等症狀。手足口病的症狀較重，而且可並發 無菌性腦膜炎、腦炎、癱瘓等與神經系統相關的疾病以及心肌炎、肺水腫等嚴重併發症，個 別重症患兒病情進展快，易發生死亡。所以，積極治療HFMD，防止其繼發感染、暴發流行均具 有重要價值，而且研發一種有效預防、治療手足口病的新型藥物成為世界醫藥衛生領域的 一個新的課題和挑戰。目前，雖然已有針對預防HFMD的疫苗，但是尚無特異性藥物，臨床用藥主要有抗 病毒藥、中藥和抗菌藥等，治療效果不理想，而且有副作用，影響兒童健康，預防傳染和治療 HFMD成為醫學上的難題。本發明所製備的抗手足口病IgY是治療手足口病的特異性生物制 品，不但能有效治療手足口病，而且沒有副作用，不會損害兒童身體健康，同時還有鑑別診 斷和緊急預防接種等作用，當免疫缺陷、疫苗缺乏及免疫失敗時，可利用卵黃抗體注射、口 服替代主動免疫接種，發揮抗病作用，因此抗手足口病IgY的發明具有重大的社會意義。
發明內容
到目前為止，尚未出現應用IgY技術治療手足口病的研究報導，本發明首次提供 一種新的治療手足口病的特異性方法，即應用抗手足口病特異性IgY。本發明涉及一種抗手足口病特異性雞卵黃抗體的製備方法，其特徵在於通過超 聲波粉碎法將滅活純化的EV71的B型、C型以及CoxAie三個病毒株製備成可溶性抗原，獲得針對手足口病的複合抗原；用該抗原注射免疫產蛋母雞，獲得抗手足口病免疫蛋；提取 抗手足口病特異性卵黃抗體粗品，並對其進行純化處理後，獲得抗手足口病特異性IgY純 品；對所述抗手足口病特異性IgY純品進行過濾處理，以濾除各種細菌和病毒，得到抗手足 口病特異性IgY成品。本發明所製備的雞卵黃抗體，具有安全方便、簡單易得、產率高、成本低、特異性 強、不與IgG發生交叉血清學反應；且耐熱、耐酸，巴氏滅菌溫度下不會失活且在PH值小於 3時也能保持穩定活性，這些獨特的優點使雞卵黃抗體在臨床和基礎科學的應用中起著重 要的作用。因此雞卵黃抗體在醫學領域的應用越來越受到人類的關注，抗手足口病特異性 雞卵黃抗體的研製對手足口病的預防與治療具有重要意義。
具體實施例方式下面的實施實例進一步說明本發明。實施方式一抗手足口病特異性雞卵黃抗體的製備(1)手足口病抗原的製備通過超聲波粉碎法將滅活純化的EV71的B型、C型以及CoxAie三個病毒株製備 成可溶性抗原，獲得針對手足口病的複合抗原。將冷凍乾燥的抗原用O.Olmol/L磷酸鹽緩 衝液PBS(pH = 7.2)稀釋成lmg/ml，並且與福氏佐劑按照1 1 (V/V)充分乳化後製得免疫 抗原。(2)用手足口病複合抗原免疫產蛋母雞取20周齡產蛋母雞15隻，將乳化好的手足口病複合抗原經雞雙翼或胸肌處多點 注射；首次免疫採用福氏完全佐劑，其餘採用福氏不完全佐劑；首次免疫前收集未免疫蛋 作為陰性對照品，9天後免疫第二次，以後每隔8天免疫一次，每次免疫劑量為0. 5ml/只； 第二次免疫22天後收集雞蛋，連續收集3個月(收集的雞蛋編號)，存放於4°C。(3)抗手足口病特異性IgY的提純敲破獲得的抗手足口病免疫蛋，去除蛋清及蛋黃膜，留取蛋黃部分，測定所收集的 蛋黃體積，邊磁力攪拌邊加入16%的氯化鈉，體積為蛋黃體積的9倍，充分攪拌後，4°C條件 下靜置過夜，9000r/min離心30min，取上清液，並用紗布過濾，測定濾液的體積；在上述濾液中稍慢速度攪拌下加入40%的PEG6000，體積為濾液體積的0. 5倍，充 分攪拌半個小時後，將此混合物分裝於IOml離心管中，置於高速冷凍離心機中，在10°C下 以9690r/min，離心30min，傾去上清液，沉澱部分即為抗手足口病特異性IgY粗提物；用0. 8 %磷酸鹽緩衝液PBS溶解沉澱至上清液初體積，再在緩慢攪拌下加入初 體積一半的飽和度為33 %的硫酸銨溶液，靜置3h，再次離心，棄去上清液，將沉澱部分 在-60°C下真空冷凍乾燥12h，乾粉成品即為製得的抗手足口病特異性雞卵黃抗體純品；將抗手足口病特異性IgY純品進行過濾處理，以濾除各種細菌和病毒，得到抗手 足口病特異性IgY成品，將所製得的IgY成品分裝後於-20°C保存。實施方式二 抗手足口病特異性IgY的效價檢測採用ELISA(酶聯免疫吸附試驗)法檢測本發明工藝製取的抗手足口病特異性IgY 的效價。檢測結果表明，抗手足口病特異性IgY的效價達到了 1 6400。實施方式三抗手足口病特異性IgY的純度鑑定
採用SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠)電泳法，使用5%濃縮膠， 12%分離膠，對以上工藝所製取的抗手足口病特異性IgY的粗提物進行檢測，結果含IgY 52-60 %。IgY粗提物經過飽和度為33 %的硫酸銨鹽析純化後，經SDS-PAGE分析，純度達到 92-95%。實施方式四體外抑菌試驗取5支裝有IOmL液體培養基的試管，分別加入ImL指示菌懸液，使細菌濃度為 108cfu/mL。向其中4支試管各加入ImL不同濃度的抗手足口病IgY，使抗體的終濃度分別 為2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和16mg/mL，剩下的一支作為對照，加入ImL無菌的PBS。將5支 試管置於37°C的恆溫培養箱中培養，分別在第2h、4h和6h取培養液，用稀釋平板法計算活 菌數。結果證明，製備的抗手足口病IgY的濃度達到8mg/mL時，對手足口病的生長具有明 顯的抑制作用。實施方式五抗手足口病特異性IgY的應用利用抗手足口病特異性IgY，可以製成各種預防、治療手足口病的製劑，包括乾粉 製劑、液態製劑、顆粒製劑、膠囊或片劑等，可應用於製備預防和治療手足口病感染的藥物、 保健品、飲品。另一種應用是在製備免疫檢測試劑中的應用，具體包括免疫電泳、ELISA、免疫沉 澱、免疫印跡、抗體晶片、時間分辨螢光免疫分析和免疫細胞學等一系列免疫診斷技術，用 以檢測相應的手足口病抗原。
權利要求
一種製備抗手足口病特異性IgY的方法，其特徵在於，採用超聲波粉碎法將將滅活純化的EV71的B型、C型以及CoxA16三個病毒株製備成可溶性抗原，獲得針對手足口病的複合抗原。
2.將上述步驟(1)中所獲得的抗原用O.Olmol/L磷酸鹽緩衝液(PhosphateBuffered Saline,PBS pH = 7. 2)稀釋，並且與福氏佐劑按照1 1 (V/V)充分乳化後製得免疫抗原。 用乳化好的抗原雙翼或胸肌處多點注射免疫20周齡產蛋母雞；首次免疫採用福氏完全佐 劑，其餘採用福氏不完全佐劑；首次免疫前收集未免疫蛋作為陰性對照品，8-10天後免疫 第二次，以後每隔7-9天免疫一次，每次免疫劑量為0. 4-0. 6ml/只；第二次免疫22天後收 集雞蛋，連續收集2-3個月(收集的雞蛋編號)，於4°C保存。
3.將獲得的抗手足口病免疫蛋，去除蛋清及蛋黃膜，留取蛋黃部分，通過14-16% 氯化鈉稀釋獲得水溶性組分，並用40-50%聚乙二醇6000(polyethyleneglycol 6000， PEG6000)提取獲得卵黃抗體粗提物，上述粗提物用飽和度為30-33%的硫酸銨溶液或 140g/L的硫酸鈉溶液進行純化後，得到抗手足口病特異性IgY純品，將IgY純品進行過濾處 理，以濾除各種細菌和病毒，得到抗手足口病特異性IgY成品，將所製得的IgY成品分裝後 於-20°C保存。
全文摘要
本發明公開了一種抗手足口病特異性雞卵黃抗體的製備及其提純方法，該抗體可以由下述方法製備1.採用超聲波粉碎法將滅活純化的EV71的B型、C型以及CoxA16三個病毒株製備成可溶性抗原，獲得針對手足口病的複合抗原；2.用製得的手足口病複合抗原對產蛋母雞進行注射免疫，獲得抗手足口病免疫蛋；3.提取抗手足口病特異性雞卵黃抗體粗品，並對其進行純化、過濾處理後，即製得抗手足口病特異性雞卵黃抗體(Immunoglobulin of Egg Yolk，IgY)成品。所得的抗手足口病卵黃抗體成本低、產量高，具有高特異性，利用這些特異性IgY可以製成各種預防、治療手足口病的製劑。
文檔編號C07K16/10GK101880323SQ201010191490
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月31日 優先權日2010年5月31日
發明者劉端, 趙肅清, 鄭輝, 陳文彪 申請人:廣東京豪醫藥科技開發有限公司;廣東工業大學