一株高產天然蝦青素的紅法夫酵母菌株及其選育方法和應用的製作方法
2023-06-02 15:30:11 1
專利名稱：一株高產天然蝦青素的紅法夫酵母菌株及其選育方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵工程技術領域，具體涉及ー株高產天然蝦青素的紅法夫酵母菌株及其選育方法和應用。
背景技術：
蝦青素(3，3' -ニ羥基-4，4' ニ酮基-β，β'胡蘿蔔素)是ー種酮式類胡蘿蔔素，天然呈紅色。蝦青素最初被用做水產業的飼料添加剤，後來藥理學和生理學研究表明蝦青素有極強的抗氧化、淬滅自由基的功能，井能促進抗體的產生，增強宿主的免疫功能，在食品、醫藥和化妝品等領域有廣闊的應用前景，具有很高的經濟價值。
紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)是卩隹一天然可產奸青素的酵母,其反式奸青素已於2000年獲得FDA批准，用於食品添加剤。它是真菌界、真菌門、半知菌亞門、隱球酵母科、紅法夫酵母屬的唯一種。作為蝦青素的生產菌，紅法夫酵母具有許多優勢可利用多種糖進行快速異養代謝，培養時間短，不需光照及可以實現高密度培養等。但野生型紅法夫酵母(DCW)的蝦青素含量低(300 450 μ g/g幹細胞)，發酵成本高，無法與化學合成競爭，無法滿足エ業化生產，因此需要對蝦青素產菌株進行選育和改良，以提高產品質量，降低成本。由於紅法夫酵母的遺傳背景並不清楚，蝦青素的合成路徑也很複雜。因此，目前多採用傳統的誘變和原生質體融合等方法對其進行改造。申請號為200910188300. 6的中國發明專利文獻公開ー種紅法夫酵母菌株的複合誘變方法，首先將紅法夫酵母菌株進行兩次紫外誘變，得到一株五代內遺傳性狀穩定的突變株，然後又將此突變株低溫處理，經低溫處理的突變株，又經過單線態氧誘變處理，得到一株在10代內有良好遺傳穩定性的突變株，將突變株進行發酵培養，測定器生物量和色素含量，均高於原始菌株。申請號為91105886. 9的專利文獻公開了ー種紅法夫酵母細胞的球狀體融合技術及由球狀體融合得到的幾株新的紅法夫酵母菌株，比親本菌株的蝦青素產量聞。但是誘變育種具有盲目性、隨機性，導致工程量巨大，時間漫長，菌株突變面臨回復現象的難題。原生質體融合技術可以扮演類似於有性生殖途徑基因信息交流的作用，但是有性生殖途徑只能允許在雙親本之間的基因重組。因此，尋找ー種簡單、高效的育種方法尤為重要。目前，國外已有利用紅法夫酵母進行蝦青素生產的企業，如美國的紅星公司、Igene生物有限公司、Tate&Lyle發酵產品有限公司和Igene生物技術有限公司合資エ廠等。但國內還沒有蝦青素的生產企業，因此研究一種適於エ業生產的蝦青素生產途徑具有很好的研究意義和很大的發展空間。
發明內容
本發明提供了一株高產天然蝦青素的紅法夫酵母菌株及其選育方法和應用。以紅法夫酵母為親本菌株，採用基因組重排技術，選育出一株高產蝦青素的紅法夫酵母菌株，無需了解其基因組學、代謝組學等具體背景，操作簡單，見效快，適於エ業生產。一株紅法夫酵母菌株,命名為紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZ10,保藏號為CGMCC No. 6355。本發明所選育出的紅法夫酵母菌株於2012 年7月12日保藏於位於北京市朝陽區北辰西路I號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,命名為紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)CZ10，保藏號為CGMCC No. 6355。本發明還提供了ー種利用所述的紅法夫酵母菌株生產蝦青素的方法，包括將所述的紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO接種到發酵培養基中進行發酵培養,發酵完成後，提取所述蝦青素。所述的發酵培養基(g/L) :10. O葡萄糖，5. O蛋白腖，5. O濃縮酵母浸出粉，
0.2CaCl2 · 2H20, 2. 75MgS04 · 7H20,1. 5KH2P04, 3. 0 (NH4)2S04, pH 5. 0所述發酵條件為22±1で，1501'/11^11，培養48-7211。蝦青素提取的方法有很多種，本發明中所述提取蝦青素的方法為取發酵液，第一次離心、收集菌體，將菌體破碎，萃取、第二次離心，獲得蝦青素。優選地，所述萃取採用的萃取劑為丙酮；所述第二次離心的轉速為4500 5000r/m ;所述菌體破碎的方法為將所述菌體懸浮在預熱後的ニ甲基亞碸中，振蕩。具體操作步驟為取5mL發酵液於5000r/m下離心IOmin,去離子水洗漆兩次，收集菌體，加入ImL 55°C預熱的ニ甲基亞碸(DMSO)，振蕩懸浮，加入丙酮4mL，漩渦震蕩20_30s, 4°C, 5000r/m 離心 IOmin 去沉澱。採用紫外分光光度方法檢測蝦青素的產量，本發明選育出的紅法夫酵母菌株發酵產生蝦青素，其蝦青素的產量可達到68mg/L。本發明還提供了一種所述的紅法夫酵母菌株的選育方法，包括(I)選取親本菌株，分為兩組，分別進行LiCl-紫外複合誘變和6tlCo-Y射線誘變，篩選後分別得到經LiCl-紫外複合誘變的若干株誘變株I和經6tlCo- Y射線誘變的若干誘變株II。所述的LiCl-紫外複合誘變的條件為菌懸液中加入10% LiCl溶液，30cm、15W紫外燈照射。所述的菌懸液濃度為IO6個/mL，所述的LiCl溶液與菌懸液的體積比為3 50。具體操作過程為將親本菌株用無菌生理鹽水配製成菌懸液，菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至一定濃度，優選為IO6個/mL,然後取5ml菌懸液於帶磁力轉子的培養皿中,加入300 μ L 10% LiCl混勻後開蓋進行紫外線照射。誘變條件30cm，15W紫外燈。照射7min，黑暗處理後適當稀釋塗板，在22°C恆溫培養箱中暗培養4-6d。同時，以未經誘變的菌懸液同樣操作作為對照，計算致死率。致死率的計算方法如下
未經誘變平板上的菌落數-經誘變後平板上的菌落數
未經誘變平板上的菌落數060Co-Y射線誘變可採用現有技術中常規的方法，本發明中送至浙江省農科院鈷室進行誘變，誘變的條件為菌懸液濃度為IO6個/mL，誘變劑量為3500Gy。
(2)將所述的誘變株I和誘變株II進行原生質體融合、再生和篩選，得到若干株蝦青素產量高於誘變株I和誘變株II的F-I代融合菌株。(3)將步驟(2)所得的F-I融合菌株進行遞歸式原生質體融合，至少進行5輪，得到所述的紅法夫酵母菌株。遞歸式原生質體融合(recursive protoplast fusion),也稱多輪循環原生質體融合技術，即將各種親本製成原生質體-融合-再生-再製成原生質體-融合-再生的技木。本發明中通過LiCl-紫外複合誘變和6tlCo-Y射線誘變分別篩選出其蝦青素產量高於親本菌株的誘變株。將上述分別經過LiCl-紫外複合誘變和6ciCo-Y射線誘變的誘變株脫去細胞壁，進行原生質體融合、再生，得到第一輪融合後的融合菌株。通過現有技術中常規的篩選方法篩選出蝦青素產量高於所述誘變株的融合菌株進入下ー輪融合，每ー輪融合結束後篩選出蝦青素產量高於該輪融合的親本菌株的融合菌株進入下ー輪融合，如此進行遞歸式原生質體融合，至少進行5輪，得到所述的紅法夫酵母菌株。 所述的篩選為採用含不同濃度梯度的YM- ニ苯胺篩選培養基進行篩選。本發明所需的親本菌株，沒有特別的要求，一般可獲得的紅法夫酵母菌株都可以，優選的親本菌株為紅髮夫酵母(Phaffia rhodozyma) 02,其來源為浙江エ商大學食品與生物工程學院保藏，由梁新樂(浙江杭州)贈送。本發明的有益效果本發明的選育方法採用基因組重排技術，即結合了傳統誘變技術和細胞融合技木，是ー項對整個微生物基因組重排的新型育種技木。基因組重排技木通過多親本原生質體遞歸融合，可以使工程菌快速獲得多祥複雜優良表型，並且無須了解其基因組學、代謝組學等具體背景。此外，基因重組技術操作簡單，容易推廣，不需要昂貴的試驗儀器，而且見效快。因此，基因組重排育種很適合エ業菌株的改造，不僅體現成本經濟效應，還具備高效性。選育出來的新菌株其蝦青素產量比親本菌株高14. 3倍。
具體實施例方式YM培養基(g/L) :10. O葡萄糖，5. O濃縮酵母浸出粉，5. O蛋白腖，pH 5. O0若為固體培養基需加入2. 5%瓊脂粉。發酵培養基(g/L) 10. O葡萄糖，5. O蛋白腖，5. O濃縮酵母浸出粉，0. 2CaCl2 · 2H20, 2. 75MgS04 · 7H20,1. 5KH2P04, 3. 0 (NH4)2S04, pH 5. 0。YM- ニ苯胺選擇性培養基待YM培養基冷卻至50°C時加入一定量的無菌ニ苯胺溶液。再生培養基KT溶液配置的YM固體培養基。選擇性再生培養基待再生培養基冷卻至50°C加入一定劑量的無菌ニ苯胺溶液。PTC溶液的配製分別準確稱取70g PEG-4000,0. 22g無水CaCl2, KT溶液溶解並定容至200mL。KT 緩衝液的配製0. 8mol/L KCl,0. 01mol/L Tris-HCl 緩衝液(pH 7. 4)配製。溶壁酶混合液分別稱取0. 6g溶菌酶，0. 6g蝸牛酶，I. 2g纖維素酶，分別溶於30mLKT緩衝液中，分別用0.2μπι的無機微孔膜過濾滅菌，4°C保存，使用時按纖維素酶溶菌酶蝸牛酶=2:1:1混合。
實施例I(I) LiCl-紫外複合誘變育種親本菌株為紅髮夫酵母(Phaffia rhodozyma) 02,其來源為浙江エ商大學食品與生物工程學院保藏，由梁新樂(浙江杭州)贈送，活化後用無菌生理鹽水配製成菌懸液，菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至IO6個/mL，取5mL菌懸液於帶磁力轉子的培養皿中，加入300 μ L 10% LiCl混勻後開蓋進行紫外線照射。誘變條件30cm，15W紫外燈。照射時間為7min,黑暗處理後稀釋IO3倍，YM培養基塗板，在22°C恆溫培養箱中暗培養4_6d。同吋，以未經誘變的菌懸液同樣操作作為對照，計算致死率為83%。(2) 60Co- Y射線誘變育種將製備好的菌懸液濃度調整為IO6個/mL，取菌懸液於無菌試管中，送浙江省農科院鈷室進行6ciCo-Y射線誘變，誘變劑量為3500Gy。 (3)原生質體製備對經過步驟(I)和步驟(2)誘變後的誘變株進行劃板篩選(篩選方法同步驟(5))，分別篩選出蝦青素產量高於親本菌株的若干誘變株，然後分別在新鮮液體培養基(YM培養基)中培養，從培養成熟的新鮮液體培養基中取細胞懸液10mL，5000r/m離心lOmin，棄上清液。細胞沉澱物用無菌生理鹽水洗滌兩次，離心後即得菌體。將親本細胞(即經過誘變得到的產量較高的菌株)懸浮於IOmL溶液(25mL
O.05mol/L EDTA和ImL O. 5mol/L β-疏基こ醇混合液)中，22°C振蕩處理lOmin。離心收集菌體，用KT緩衝液洗滌2次，離心後再次得菌體。將所得菌體中加入SmL溶壁酶混合液之後放於22°C下90r/m的搖床中輕微振蕩，以使菌體充分懸浮在酶液中。隨時使用ImL槍頭反覆吸取酶解液促使原生質體的釋放，同時用顯微鏡觀察細胞形成原生質體的情況。酶解結束後5000rpm離心lOmin，用KT緩衝液洗滌2次收集菌體後，用KT緩衝液配置成IO7個/mL原生質體懸液I (LiCl-紫外複合誘變株)。對6tlCo- Y射線誘變的誘變株進行相同的操作，配製成IO7個/mL原生質體懸液II (60Co- Y射線誘變株)。(4)原生質體融合與再生實驗中採用PEG誘導融合法，即原生質體懸液I和原生質體懸液II中各取2mL濃度為IO7個/mL的原生質體懸浮液,混勻後,3000r/m離心IOmin,棄上清。在原生質體沉澱中加入4mL PTC溶液後，用移液槍吸吹混勻，22°C保溫15min後，3000r/m離心lOmin，棄上清，之後KT緩衝液洗滌兩次。最後重懸於2mL KT緩衝液中，稀釋104後塗布於再生培養基選擇平板上。22°C在恆溫培養箱中培養6d。原生質體形成率和再生率的計算
原生質體形成率=hxioo%
原生質體再生率=·^χ οο%
A-BA :酶解前菌落總數；B :酶解後未脫壁細胞形成的菌落數；C :酶解後未脫壁細胞形成的菌落數加上原生質體再生細胞菌落數。本實施例中原生質體形成率和再生率分別為90. 41%和4. 93%。
(5)篩選將融合菌株分別劃線於含有不同濃度的ニ苯胺的YM- ニ苯胺選擇性培養基平板上，22°C培養後觀察不同平板上菌落的生長情況，記錄顔色由紅到淺黃或無色菌落的ニ苯胺濃度，即為ニ苯胺對該菌的最小抑制濃度(MIC)，同時以親本菌株(步驟(I)中所用的親本菌株)做對照，最小抑制濃度(MIC)相對親本菌株增加較大的幾株即為我們需要的菌株。(6)遞歸融合將步驟(5)中篩選出的蝦青素產量相對高的幾株融合株菌株繼續進行步驟(3) (5)的操作，每ー輪操作結束後篩選出蝦青素產量相對較高的融合菌株重複步驟(3)
(5)，進行5輪遞歸融合，最後篩選出蝦青素產量相對較高的幾株，進行穩定性測試。(7)穩定性測試 將步驟(6)選育出的蝦青素產量較高的幾株，進行穩定性試驗，在裝有發酵培養基的三角瓶中連續搖瓶發酵3次得發酵液，發酵條件22 土 1°C，150r/m，培養48h。每次均以出發菌株(步驟(I)中的親本菌株)作為對照，提取發酵液中的蝦青素，測定其蝦青素產量，蝦青素產量較穩定。編號為CZlO的融合菌株其蝦青素產量提高到68mg/L，而親本菌株的蝦青素產量僅為4. 75mg/L。該菌株即為我們需要的的蝦青素高產菌株。將該蝦青素高產菌株于于2012年7月12日保藏於位於北京市朝陽區北辰西路I號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，命名為，紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZ10，保藏號為 CGMCC No. 6355。蝦青素的提取及測定方法紫外分光光度測定法測定蝦青素含量。取5mL發酵液於5000rpm下離心lOmin，去離子水洗滌兩次，收集菌體，用濾紙吸乾管壁水滴，加入ImL 55°C預熱的ニ甲亞碸(DMSO)，振蕩懸浮，加入丙酮4mL，漩渦振蕩20-30s，4°C，5000r/m離心lOmin，上清液用分光光度計測0D474。如菌泥仍有色可重複抽提至白色為止，蝦青素含量計算公式如下
(P(10000)
蝦青素 Ungl L) = ~^--
2150K式中A——OD474mm值V1——有機溶劑的總體積(L)；2150——比消光係數V2——發酵液體積(L)；100 :單位換算後的作數(mg/L)實施例2利用實施例I選育出的紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO進行發酵培養生產
蝦青素。取實施例I中選育的紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO接種至裝有發酵培養基的三角瓶中連續搖瓶發酵3次，22± I°C，150r/m,培養48h，提取發酵液中的蝦青素，測定蝦青素的含量，重複試驗，其蝦青素產量均穩定在68mg/L(每L發酵液產蝦青素的量)。發酵液中蝦青素的提取和測定方法同實施例I。
權利要求
1.一株紅法夫酵母菌株,其特徵在於,命名為紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)CZ10,保藏號為 CGMCC No. 6355。
2.ー種利用如權利要求I所述的紅法夫酵母菌株生產蝦青素的方法，其特徵在於，包括將所述的紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO接種到發酵培養基中進行發酵培養，發酵完成後，提取所述蝦青素。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的發酵培養基以IL計含有以下組分.10.Og 葡萄糖，5. Og 蛋白腖，5. Og 濃縮酵母浸出粉，O. 2g CaCl2 · 2H20，2.75g MgSO4 · 7H20，I.5g KH2PO4, 3. 0g(NH4)2504, pH 5.0。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述發酵培養的溫度為21 23°C。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述發酵培養的時間為48-72h。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述提取蝦青素的方法為取發酵液，第一次離心、收集菌體，將菌體破碎，萃取、第二次離心，獲得蝦青素。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述萃取採用的萃取劑為丙酮。
8.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述第二次離心的轉速為4500 5000r/m0
9.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述菌體破碎的方法為將所述菌體懸浮在預熱後的ニ甲基亞碸中，振蕩。
10.一種如權利要求I所述的紅法夫酵母菌株的選育方法，其特徵在於，包括 (1)選取親本菌株，分為兩組，分別進行LiCl-紫外複合誘變和6tlCo-Y射線誘變，篩選後分別得到經LiCl-紫外複合誘變的若干株誘變株I和經6ciCo- Y射線誘變的若干誘變株II; (2)將所述的誘變株I和誘變株II進行原生質體融合、再生和篩選，得到若干株蝦青素產量高於誘變株I和誘變株II的F-I代融合菌株； (3)將步驟(2)所得的F-I融合菌株進行遞歸式原生質體融合，至少進行5輪，得到所述的紅法夫酵母菌株。
全文摘要
本發明公開了一株高產天然蝦青素的紅法夫酵母菌株及其選育方法和應用，該菌株命名為紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)CZ10，保藏號為CGMCC No.6355。通過如下方法選育選取親本菌株，分為兩組，分別進行LiCl-紫外複合誘變和60Co-γ射線誘變，篩選後若干株誘變株I和若干誘變株II；將誘變株I和誘變株II進行原生質體融合、再生和篩選，得到若干株蝦青素產量高於誘變株I和誘變株II的融合菌株；將步驟(2)所得的融合菌株進行遞歸式原生質體融合，至少進行5輪，得到所述的紅法夫酵母菌株。本發明的菌株應用於工業上生產蝦青素，其蝦青素產量達到68mg/L，相對選育前的親本菌株提高了14.3倍。
文檔編號C12P23/00GK102864087SQ201210321949
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月3日 優先權日2012年9月3日
發明者胡向東, 朱靜, 梁新樂 申請人:浙江皇冠科技有限公司