一種以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法
2023-06-02 05:52:21
一種以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法
【專利摘要】本發明公開了一種以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法，是以廉價的棉籽糖蜜及棉籽油替代價格昂貴的葡萄糖和油酸實現發酵生產槐糖脂。本發明方法具有原料價格低廉，工藝簡便，產槐糖脂能力高的特點，為提高棉籽利用率，減少能源消耗以及推廣槐糖脂工業大規模生產提供了基礎。
【專利說明】一種以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種槐糖脂生產的方法，尤其涉及一種以棉籽糖蜜及棉籽油為底物由擬威克酵母變種(Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipid)發酵生產槐糖脂的方法。
【背景技術】
[0002]槐糖脂是一種重要的表面活性劑，其和化學表面活性劑相比，具有生物可降解性，低毒性及良好的環境兼容性等優點，而被廣泛應用於石油、食品、醫藥、環境保護、化妝品等工業領域。
[0003]槐糖脂目前主要是通過微生物發酵獲得。製備成本較高是制約槐糖脂應用的一個重要因素。因此，設法降低槐糖脂的生產成本，提高槐糖脂的產量是其在各領域中廣泛應用的先決條件。
[0004]中國是世界產棉大國，種植面積在500萬公頃左右(約合7500萬畝)，棉花產量大約700萬噸，棉籽佔棉花比例的35-40%。棉籽糖蜜為利用棉籽生產棉籽糖的下腳料，價格低廉，但是其目前主要作為飼料，利用效率低；棉籽油由於其含有難以去除的棉酚，食品安全要求較高，作為食用油市場前景並不明朗，因此造成由棉籽壓榨得到的棉籽油及生產棉籽糖而產生的副產物棉籽糖蜜具有產量大，價格低，行業使用率低的現狀，成為行業負擔。基於此，以棉籽糖蜜及棉籽油為進行槐糖脂發酵的原料發酵生產槐糖脂在實際應用方面具有重要的價值。經文獻和專利檢索，利用棉籽糖蜜及棉籽油作為廉價底物生產槐糖脂的研究國內外還未見報導。
【發明內容】
[0005]針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法。
[0006]本發明所述以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法，步驟是:
[0007](I)製備發酵培養基:
[0008]取含水量〈20%的棉籽糖蜜，以w/v計配製成10~15%的水溶液，在35~55°C水浴10~30min至棉籽糖蜜完全溶解,然後向溶液中加入棉籽油並使其濃度以v/v計為5~9%，得適於發酵生產槐糖脂的發酵培養基，115°C滅菌30~40min後，冷卻備用；
[0009](2)發酵生產槐糖脂:
[0010]將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamierlladomercqiae var.sophorolipid)CGMCCN0.1576以體積百分比為I~4%的接種量接種於含上述發酵培養基的搖瓶中，於25±2°C、150~300rpm，搖床振蕩發酵培養7~9天，得到含槐糖脂的發酵液；
[0011]或者，
[0012]將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamierlladomercqiae var.sophorolipid)CGMCCN0.1576以體積百分比為I~4%的接種量接種於含上述發酵培養基的發酵罐中，發酵罐的發酵參數設定為:溫度25 ±2°C，通氣量0.5~2.0L/min，初始轉速200~500rpm、12~24h後升至600~900rpm，發酵時間7~9天，得到含槐糖脂的發酵液；
[0013](3)槐糖脂的粗提:
[0014]取含槐糖脂的發酵液加入其2~6倍體積的乙酸乙酯萃取，6000~SOOOrpm離心5~15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮後烘乾，得內酯型槐糖脂粗品；
[0015]或取含槐糖脂的發酵液加入其3~6倍體積的乙醇，渦旋混合，6000~1000Orpm離心5~15min，收集上清，減壓濃縮後烘乾，得總槐糖脂粗品。
[0016]上述以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法中:步驟(1)所述棉籽糖蜜優選購自濟南中棉生物科技有限公司，所述棉籽油優選購自山東省恆興有限公司。
[0017]上述以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法中:步驟(1)所述棉籽糖蜜優選以w/v計配製成11.5~12%的水溶液；所述棉籽油濃度優選以v/v計為6~7%。
[0018]最優的適於發酵生產槐糖脂的發酵培養基為棉籽糖蜜120.0g/L，棉籽油7.0% (v/ V)。
[0019]上述以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法中:步驟(2)所述搖瓶發酵的溫度優選是25°C、搖床振蕩轉數優選為200rpm。
[0020]上述以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法中:步驟(2)所述發酵罐的發酵參數優選為:溫度25°C，通氣量1.0L/min，初始轉速400rpm、12後升至700rpm。
[0021]對利用棉籽糖蜜及棉籽油發酵得到的槐糖脂進行HPLC-MS鑑定:
[0022]1.HPLC 成分分析:
[0023]制樣:將製得的槐糖脂提取樣品分別溶解於色譜純甲醇，0.22μπι有機膜過濾後用於分析。
[0024]條件:分析柱為Venusil MP C18 分析柱(4.6 μ mX 250mmX4.6mm, AgelaTechnologies Inc., USA);流動相為乙腈/水，採用梯度洗脫(v/v),總流速I~3ml/min,程序如下:0~15min,乙臆含量從40 ±5%升聞至60 ±5% ； 15~30min,乙臆含量從60 ±5%升高至70±5% ；30~40min乙腈含量從70±5%升高至90±5%，並在90±5%保持5min ;檢測波長:200~210nm。
[0025]2.使用 API4000 質譜儀(Applied Biosystems, USA)對 HPLC 各峰進行 MS 分析:
[0026]離子源:ESI ;噴霧電壓:-4500V;離子源溫度:100°C ;霧化氣:25psi ;輔助氣:20psi ;正離子或者負離子模式，掃描範圍在50~800amu。
[0027]本發明方法利用棉籽糖蜜及棉籽油為碳源培養基發酵生產槐糖脂，通過HPLC-MS檢測鑑定，發現7種主要的槐糖脂組分，和利用葡萄糖、油酸為底物發酵所得槐糖脂成分基本一致，證明棉籽糖蜜和棉籽糖完全可以起到很好的替代作用。實驗還證實本發明方法比利用葡萄糖油酸培養基的進行發酵槐糖脂產量基本一致，且無需添加無機鹽及較為昂貴的酵母粉，明顯降低了生產成本，同時本發明方法工藝簡便，提高了棉籽的利用率，減少了能源消耗，非常利於進行工業大規模生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1棉籽糖蜜與棉籽油的二因子響應面實驗的結果曲面圖(A)，等值線圖(B)。
[0029]圖2利用葡萄糖與油酸作為底物㈧和棉籽糖蜜與棉籽油作為底物⑶進行發酵生產槐糖脂，7天後發酵液槐糖脂HPLC成分比較。
【具體實施方式】
[0030]下面結合實施例對本
【發明內容】
作進一步的說明。
[0031]實施例1:[0032](I)第一碳源與第二碳源替換:配製四組發酵培養基(g/1):a葡萄糖80.0，油酸6% (v/v) ；b葡萄糖80.0,棉籽油6% (v/v) ；c棉籽糖蜜133.33 (含糖80.0)，油酸6% (v/V)，d 棉籽糖蜜 133.33 (含糖 80.0)棉籽油 6% (v/v),每組均加 KH2PO4L O, Na2HPO4L 0，MgSO4.7Η200.50，酵母粉 3.0，pH 自然。
[0033](2)發酵生產槐糖脂:將(I)中四組發酵培養基115°C，30min滅菌後，冷卻。將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid) CGMCC N0.1576以體積百分比為2%的接種量接種於上述四種發酵培養基中於25°C、200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得到槐糖脂的發酵液。
[0034](3)槐糖脂的粗提:取含槐糖脂的發酵液加入其2倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮後烘乾，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮後烘乾，得總槐糖脂粗品。
[0035](4)槐糖脂粗品HPLC比較:將不同的槐糖脂處提取樣品分別溶解於色譜純甲醇，0.22 μ m有機膜過濾後用於分析型HPLC分析。上柱前，超純水與有機溶劑菌要經過0.22 μ m濾膜過分別過濾。分析柱為 Venusil MP C18 分析柱(4.6 μ mX 250mmX 4.6mm, AgelaTechnologies Inc., USA);流動相為乙腈/水，採用梯度洗脫(v/v),總流速lml/min,程序如下:0~15min,乙腈含量從40%升高至60% ；15~30min,乙腈含量從60%升高至70% ；30~40min乙腈含量從70%升高至90%，並在90%保持5min ;檢測波長:207nm。
[0036]結果表明，利用葡萄糖與油酸作為碳源的培養基進行槐糖脂發酵實驗，得到槐糖脂45.75g/l，內酯型槐糖脂為21.10g/l，對第一碳源和第二碳源用棉籽糖蜜及棉籽油替換時，產量均略為下降。
[0037]實施例2:
[0038](I)氮源梯度設計:配製五組發酵培養基(g/Ι):其中以酵母粉添加量分別為
0,1.0g/l,2.0g/1,3.0g/1,4.0g/l 五個梯度，並均加入棉籽糖蜜 133.33 (含糖 80.0)，KH2PO4L O, Na2HPO4L O, MgSO4.7Η200.50，棉籽油 6% (v/v), pH 自然。
[0039](2)發酵生產槐糖脂:將(I)中五組發酵培養基115°C，30min滅菌後，冷卻。將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid) CGMCC N0.1576以體積百分比為2%的接種量接種於上述發酵培養基中於25°C、200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得到槐糖脂的發酵液。
[0040](3)槐糖脂的粗提:取含槐糖脂的發酵液加入其2倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮後烘乾，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮後烘乾，得總槐糖脂粗品。
[0041](4)槐糖脂粗品HPLC比較:將不同的槐糖脂處提取樣品分別溶解於色譜純甲醇，0.22 μ m有機膜過濾後用於分析型HPLC分析。上柱前，超純水與有機溶劑菌要經過0.22 μ m濾膜過分別過濾。分析柱為 Venusil MP C18 分析柱(4.6 μ mX 250mmX 4.6mm, AgelaTechnologies Inc., USA);流動相為乙腈/水，採用梯度洗脫(v/v),總流速lml/min,程序如下:0~15min,乙腈含量從40%升高至60% ；15~30min,乙腈含量從60%升高至70% ；30~40min乙腈含量從70%升高至90%，並在90%保持5min ;檢測波長:207nm。
[0042]實驗結果表明，隨著發酵液的酵母粉含量降低，其槐糖脂產量升高，當不添加酵母粉時，槐糖脂的產量達到最大值，此時產量為利用葡萄糖基本發酵培養基產量的95%。因此，單獨不添加氮源既簡化了配方，降低了成本，又提高了產量。
[0043]實施例3: [0044](I)無機鹽影響:配製兩組發酵培養基(g/Ι): —組添加KH2PO4L O, Na2HPO4L 0，MgSO4.7H200.50,另一組不添加無機鹽離子，兩組均加棉籽糖蜜133.33 (含糖80.0)，棉籽油 6% (v/v), pH 自然。
[0045](2)發酵生產槐糖脂:將(I)中兩組發酵培養基115°C，30min滅菌後，冷卻。將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid) CGMCC N0.1576以體積百分比為2%的接種量接種於上述發酵培養基中於25°C、200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得到槐糖脂的發酵液。
[0046](3)槐糖脂的粗提:取含槐糖脂的發酵液加入其2倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮後烘乾，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮後烘乾，得總槐糖脂粗品。
[0047](4)槐糖脂粗品HPLC比較:將不同的槐糖脂處提取樣品分別溶解於色譜純甲醇，0.22 μ m有機膜過濾後用於分析型HPLC分析。上柱前，超純水與有機溶劑菌要經過0.22 μ m濾膜過分別過濾。分析柱為 Venusil MP C18 分析柱(4.6 μ mX 250mmX 4.6mm, AgelaTechnologies Inc., USA);流動相為乙腈/水，採用梯度洗脫(v/v),總流速lml/min,程序如下:0~15min,乙腈含量從40%升高至60% ；15~30min,乙腈含量從60%升高至70% ；30~40min乙腈含量從70%升高至90%，並在90%保持5min ;檢測波長:207nm。
[0048]實驗表明，不添加無機鹽離子與添加無機鹽離子的培養基對槐糖脂最終產量基本沒有變化，在2%以內。因此考慮成本與培養基簡化可以不添加無機鹽。
[0049]實施例4:
[0050](I)單因子梯度設計:配製兩組發酵培養基:一組設置棉籽糖蜜梯度(w/v)為8.33%, 10.0%, 11.67%, 13.33%, 15.0%,棉籽油濃度為 6% (v/v);另一組設置糖蜜為 11.67%(w/v)，棉籽油梯度(v/v)為 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0%，pH 自然。
[0051](2)發酵生產槐糖脂:將(I)中兩組發酵培養基115°C，30min滅菌後，冷卻。將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid) CGMCC N0.1576以體積百分比為2%的接種量接種於上述四種發酵培養基中於25°C、200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得到槐糖脂的發酵液。
[0052](3)槐糖脂的粗提:取含槐糖脂的發酵液加入其2倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮後烘乾，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮後烘乾，得總槐糖脂粗品。
[0053](4)槐糖脂粗品HPLC比較:將不同的槐糖脂處提取樣品分別溶解於色譜純甲醇，0.22 μ m有機膜過濾後用於分析型HPLC分析。上柱前，超純水與有機溶劑菌要經過
0.22 μ m濾膜過分別過濾。分析柱為 Venusil MP C18 分析柱(4.6 μ mX 250mmX 4.6mm, AgelaTechnologies Inc., USA);流動相為乙腈/水，採用梯度洗脫(v/v),總流速lml/min,程序如下:0~15min,乙腈含量從40%升高至60% ；15~30min,乙腈含量從60%升高至70% ；30~40min乙腈含量從70%升高至90%，並在90%保持5min ;檢測波長:207nm。
[0054]實驗結果表明，通過對棉籽糖蜜進行梯度實驗，發現棉籽糖蜜在11.67%(w/v，含糖7%)槐糖脂產量最高，棉籽油濃度在7%時，在5個棉籽油梯度中，槐糖脂產量達到最大值。
[0055]實施例5:
[0056](I) 二因子響應面優化:以棉籽糖蜜及棉籽油濃度為二因子，以10% (w/v)的棉籽糖蜜，及6%(v/v)棉籽油為基點，設計13組實驗，2%為一個單位，分組情況見表1。
[0057](2)發酵生產槐糖脂:將(I)中13組發酵培養基115°C，30min滅菌後，冷卻。將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid) CGMCCN0.1576以體積百分比為2%的接種量接種於上述發酵培養基中於25°C、200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得到槐糖脂的發酵液。
[0058](3)槐糖脂的粗提:取含槐糖脂的發酵液加入其2倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮後烘乾，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮後烘乾，得總槐糖脂粗品。
[0059](4)槐糖脂粗品HPLC比較:將不同的槐糖脂處提取樣品分別溶解於色譜純甲醇，0.22 μ m有機膜過濾後用於分析型HPLC分析。上柱前，超純水與有機溶劑菌要經過
0.22 μ m濾膜過分別過濾。分析柱為 Venusil MP C18 分析柱(4.6 μ mX 250mmX 4.6mm, AgelaTechnologies Inc., USA);流動相為乙腈/水，採用梯度洗脫(v/v),總流速lml/min,程序如下:0~15min,乙腈含量從40%升高至60% ；15~30min,乙腈含量從60%升高至70% ；30~40min乙腈含量從70%升高至90%，並在90%保持5min ;檢測波長:207nm。
[0060]通過預實驗，以10% (w/v)的棉籽糖蜜,及6%(v/v)棉籽油為基點，設計的13組變量組合，發酵結果如表1所示。
[0061]表1棉籽糖蜜與棉籽油的二因子響應面實驗分組及產量情況
[0062]
【權利要求】
1.一種以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法，步驟是: (1)製備發酵培養基: 取含水量〈20%的棉籽糖蜜，以w/v計配製成10~15%的水溶液，在35~55°C水浴10~30min至棉籽糖蜜完全溶解,然後向溶液中加入棉籽油並使其濃度以v/v計為5~9%,得適於發酵生產槐糖脂的發酵培養基，115°C滅菌30~40min後，冷卻備用； (2)發酵生產槐糖脂:
將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid)CGMCCN0.1576以體積百分比為I~4%的接種量接種於含上述發酵培養基的搖瓶中，於25±2°C、150~300rpm，搖床振蕩發酵培養7~9天，得到含槐糖脂的發酵液； 或者， 將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid)CGMCCN0.1576以體積百分比為I~4%的接種量接種於含上述發酵培養基的發酵罐中，發酵罐的發酵參數設定為:溫度25±2°C，通氣量0.5~2.0L/min，初始轉速200~500rpm、12~24h後升至600~900rpm，發酵時間7~9天，得到含槐糖脂的發酵液； (3)槐糖脂的粗提: 取含槐糖脂的發酵液加入其2~6倍體積的乙酸乙酯萃取，6000~SOOOrpm離心5~15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮後烘乾，得內酯型槐糖脂粗品； 或取含槐糖脂的發酵液加入其3~6倍體積的乙醇，渦旋混合，6000~1000Orpm離心5~15min，收集上清，減壓濃縮後烘乾，得總槐糖脂粗品。
2.如權利要求1所述以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法，其特徵在於:步驟(1)所述棉籽糖蜜購自濟南中棉生物科技有限公司，所述棉籽油購自山東省恆興有限公司。
3.如權利要求1所述以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法，其特徵在於:步驟(1)所述棉籽糖蜜以w/v計配製成11.5~12%的水溶液；所述棉籽油濃度以v/v計為6~7%。
4.如權利要求1所述以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法，其特徵在於:步驟(2)所述搖瓶發酵的溫度是25°C、搖床振蕩轉數為200rpm。
5.如權利要求1所述以棉籽糖蜜及棉籽油為底物發酵生產槐糖脂的方法，其特徵在於:步驟(2)所述發酵罐的發酵參數為:溫度25°C，通氣量1.0L/min，初始轉速400rpm、12後升至700rpm。
【文檔編號】C12R1/645GK103540631SQ201310500652
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月22日 優先權日:2013年10月22日
【發明者】宋欣 申請人:山東大學