一種誘導2型糖尿病靈長類動物動物模型的高糖高脂半流質膳食及其誘導方法與流程
2023-06-02 08:47:11 2
本發明屬於糖尿病研究領域，具體涉及一種誘導2型糖尿病靈長類動物動物模型的高糖高脂半流質膳食及其誘導方法。
背景技術：
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隨著人類生活水平的提供，糖尿病的發病率也越來越高，糖尿病及其併發症已經成為威脅人類健康的一類重要疾病。因為糖尿病的發病率居高不下，所以降糖藥的研發一直是藥物研發中的熱點，而降糖藥物的研發離不開良好的動物疾病模型。目前用於降糖藥研發的動物疾病模型主要有轉基因疾病模型和發化學法誘導的高血糖動物模型，轉基因動物模型如小鼠糖尿病模型(db/db、KK小鼠等)、大鼠糖尿病模型(GK、ZDF大鼠等)。化學藥物(四氧嘧啶、鏈脲佐菌素)誘導的高血糖模型包括單獨誘發和/或配合高脂飼料誘發的小鼠、大鼠、猴糖尿病模型。由於人類糖尿病的成因多數與飲食不節(與生活條件提高後高糖、高脂大量攝入有關)有關，但上述模型多數為嚙齒類動物疾病模型，雖然與人類的同源性較高，但其疾病形成原因以及基因組與人類還是存在較大差異，在生物技術藥物迅猛發展的今天，由於藥物的特異性(如生物藥有動物種屬的選擇特異性)上述模型已經不能滿足藥物研發的需求。嚙齒類疾病動物模型的應用領域正逐漸轉向降糖藥物的篩選方面。而化學藥物誘發的靈長類動物糖尿病模型是成因也與人類糖尿病成因具有明顯的差別，如人類2型糖尿病患者多數伴有胰島素抵抗、高胰島素血症等特點，而化學藥物誘發的靈長類動物糖尿病模型無上述該特徵，其成因為化學藥物損傷胰島細胞後導致的胰島素絕對不足。因此，建立與人類糖尿病發病相似的靈長類動物模型對新型降糖藥物的研發具有非常重要的意義。
高糖高脂膳食，指的是通過人工的行為，將人類飲食結構中最常見的糖類和脂肪按一定比例混合所得的混合物。
通過高糖高脂飼料誘發靈長類動物糖尿病模型已有報導，但其製作方法為將高糖高脂加入到猴飼料中，猴通過攝入飼料而將高糖高脂成分攝入體內，日久成模。該法的不足之處為未充分考慮到靈長類動物喜愛用飼料玩耍的生活習性，飼養過程中，多數的飼料被其玩耍丟棄而浪費，不能準確的計算每個動物每天攝入高糖高脂的數量，無法量化。且由於飼料含熱量較高、油膩感強，且飼料本身的口感發生了較大的變化，動物在攝入一定量的飼料後會有飽漲感，出於自我保護的作用，動物會停止攝入更大量的高糖高脂飼料，導致高糖高脂的攝入量會相對減少，從而使得造模時間大大延長。
技術實現要素：
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本發明的第一個目的是提供一種能量化、快速誘導出2型糖尿病靈長類動物動物模型的高糖高脂半流質膳食。
本發明的誘導2型糖尿病靈長類動物動物模型的高糖高脂半流質膳食，其特徵在於，是通過以下方法製備的：按質量比將蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0進行混合，加熱攪拌均勻乳化製備成半流質狀膳食，即為誘導2型糖尿病靈長類動物動物模型的高糖高脂半流質膳食。按照各成分的最大質量比配製的高糖高脂其流動性已達極限，即再增加各成分的質量所配製的膳食將不具備流動特性，難以通過灌胃器具送達動物的胃部。按照低於各成分最小質量比配製的高糖高脂膳食流動性較好，長期將其灌胃給予靈長類動物理論上可複製2型糖尿病靈長類動物造模，但需要耗費的時間也將會明顯延長。
本發明的第二個目的是提供一種2型糖尿病靈長類動物的誘導方法，其特徵在於，將上述誘導2型糖尿病靈長類動物模型的高糖高脂半流質膳食灌入靈長類動物胃部，誘導靈長類動物產生2型糖尿病，而得到2型糖尿病模型靈長類動物模型。
優選，是將誘導2型糖尿病靈長類動物模型的高糖高脂半流質膳食按照9.2-17.2g/kg靈長類動物的體重的量通過鼻飼管灌胃給予，每天一次，每周6天，連續給予25個月。
優選，所述的靈長類動物優選為食蟹猴。
本發明的第三個目的是提供一種用於篩選和評價抗2型糖尿病類藥物篩選和評價研究的方法，其特徵在於，根據候選藥物的特點，按照一定的劑量和頻率給予上述2型糖尿病靈長類動物模型，根據效果評價候選藥物是否具有抗2型糖尿病作用，從而為候選藥物提供篩選和/或評價研究結果。
本發明的誘導2型糖尿病靈長類動物模型的高糖高脂半流質膳食中使用的糖類和脂肪分別為人類日常生活中攝入量比較大的蔗糖、豬油、膽固醇和膽酸鹽，將上述四種物質按一定的比例混合，製備成半流質膳食，將其通過鼻飼管將其灌入靈長類動物胃部，這樣就可以使得靈長類動物按照體重、被動地按照一定的時間和頻率精準的攝入上述高糖高脂混合物，模擬人類因物質生活條件提高而導致的飲食失節而產生的2型糖尿病。
本發明可以量化每個動物每天攝入高糖高脂的數量，並且無口感變化造成動物攝入量不足的擔憂，能定時定量的攝入高糖高脂，從而大大加快了2型糖尿病模型的發病進程。本發明製作的2型糖尿病靈長類動物模型具有齧齒動物、化學藥物誘發的猴糖尿病模型無法比擬的優勢，可用於各種類型降糖類藥物(特別是生物技術類抗糖尿病藥物)的研發及評價。
具體實施方式：
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
實施例1：
1.實驗材料
1.1蔗糖：500g/瓶，分析純，西隴化工。
1.2豬油：15kg/桶，食品級，海南省鼎升食品有限公司。
1.3膽固醇：500g/瓶，分析純，上海博奧生物科技有限公司。
1.4膽酸鹽：500g/瓶，分析純，天津市恆興化學試劑製造有限公司。
1.5葡萄糖：500g/瓶，分析純，天津市北聯精細化學品開發有限公司。
1.6食蟹猴：3-7歲10隻，8-20歲，26隻雄性，普通級，從廣東藍島生物技術有限公司購入。
1.7胰島素ELISA測定試劑盒，猴血漿/血清專用，從大連泛邦試劑有限公司購入，96T，原裝進口。
1.8胰高血糖素ELISA測定試劑盒，，猴血漿/血清專用，從大連泛邦試劑有限公司購入，96T，原裝進口。
1.9血糖測定試劑：浙江伊利康生物技術有限公司。
1.10糖化血清白蛋白測定試劑：50T/48樣，南京建成生物工程研究所。
1.11胰島素：諾華公司產品。
2.主要儀器
2.1 7020生化分析儀：7020型，日本日立公司。
2.2糖化血紅蛋白測定儀：NycoCard Reader II型，挪威NycoCard公司
2.3血糖儀：強生公司產品。
2.4分光光度計：722N型，上海菁華科技儀器有限公司。
2.5恆速泵：SN-50C6型，深圳聖諾醫療設備有限公司。
2.6酶標儀：ELX808型，美國伯騰儀器有限公司
3.實驗方法
3.1半流質高糖高脂膳食的製備：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽按質量百分比為下述比例混合：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0進行混合，加熱至約70攝氏度，攪拌均勻乳化，即製備成半流質狀膳食，即為本發明的誘導2型糖尿病靈長類動物橫下的高糖高脂半流質膳食。
3.2選取正常的8-20歲的雄性中老年食蟹猴26隻，按體重隨機分為5組，分別為高糖高脂組、高糖低脂組、低糖高脂組、低糖低脂組，每組6-7隻，另外選用10隻年齡為3-7歲的成年雄性猴，5隻為陰性對照組，5隻為高糖高脂成年組。高糖高脂組膳食質量比配方為：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝10：10：1：0.5，將各組份按其含量混合均勻，加熱至約70攝氏度，攪拌均勻乳化即得，膳食給予量為17.2g/kg；高糖低脂組膳食質量比配方為：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝10：5：1：0.5，將各組份按其含量混合均勻，加熱至約70攝氏度，攪拌均勻乳化即得，膳食給予量為13.2g/kg；低糖高脂組膳食質量比配方為：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝5：10：1：0.5，將各組份按其含量混合均勻，加熱至約70攝氏度，攪拌均勻乳化即得，膳食給予量為13.2g/kg；低糖低脂組膳食質量比配方為：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝5：5：1：0.5，將各組份按其含量混合均勻，加熱至約70攝氏度，攪拌均勻乳化即得，膳食給予量為9.2g/kg；各試驗組動物分組後按照設定的方案灌胃給予高糖高脂膳食，每天一次，每周6天，連續19個月。按要求測定食蟹猴空腹血糖、糖化血清白蛋白、糖化血紅蛋白、糖耐量、胰島素、胰高血糖素、胰島素抵抗等指標。
血糖測定方法：(1)食蟹猴使用氯胺酮麻醉後，從頭靜脈和/或隱靜脈採血約1.0ml，離心後取血清，用日立7020生化分析儀測定。(2)食蟹猴保定後，手指常規消毒，用針頭扎破後擠掉第一滴血液後，用血糖試紙條蘸取血液，然後強生血糖儀測定血糖和/或靜脈採血後用生化分析儀測定血糖含量。造模期間0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19個月猴的空腹血糖情況。
糖化血清白蛋白測定方法：食蟹猴麻醉後從頭靜脈和/或後肢隱靜脈取出血液，離心後取血清，用南京建成生物研究所研發的測定試劑盒測定，測定流程嚴格執行試劑盒說明書。造模前、造模期間7、13、19個月猴的血清糖化白蛋白情況。
糖化血紅蛋白測定方法：食蟹猴麻醉後從頭靜脈和/或後肢隱靜脈取血，EDTA抗凝，用挪威小旋風血紅蛋白測定儀測定，測定過程嚴格執行試劑盒說明書。測定造模前、造模期間7、13、19個月猴的糖化血紅蛋白含量。
口服糖耐量測定(OGTT)方法：食蟹猴禁食不禁水過夜，保定後按體重灌胃給予50％的葡萄糖溶液(5g/kg)10ml/kg。測定給藥後30min、60min、120min各試驗組猴的血糖變化情況並計算曲線下面積。測定造模前、造模期間7、13、19個月猴的口服糖耐量。
胰島素、胰高血糖素測定方法：食蟹猴麻醉後從頭靜脈和/或後肢隱靜脈取血，EDTA抗凝，分離血漿，按照ELISA試劑盒說明書嚴格執行，然後使用酶標儀進行測定。測定造模期間13、19個月猴的血清胰島素、胰高血糖素情況。
胰島素抵抗測定方法：食蟹猴空腹12h後測定空腹血糖和胰島素水平，然後建立兩條靜脈輸注通道，靜脈輸注胰島素和葡萄糖，5min測定血糖一次，並依靠此數據調節胰島素的輸注量，使血糖維持在正常水平，維持1.5小時，該狀態下胰島素輸注量越少，胰島素抵抗就越小。測定造模期間13、19個月猴胰島素抵抗情況。
4.實驗結果
4.1血糖研究結果(具體見表1)：研究結果表明，高糖高脂成年組、低糖低脂中老年組、低糖高脂中老年組、高糖低脂中老年組、高糖高脂中老年組在造模第11月開始血糖均明顯升高，並隨著造模時間的延長血糖上升的更高。各試驗組血糖上升的幅度大小為：高糖高脂中老年組>低糖高脂中老年組>低糖高脂中老年組>低糖低脂中老年組>高糖高脂成年組，雖然高糖高脂成年組在成模速度方面最慢，但其使用的為正常成年動物，因此，其應用價值也最大。
表1-1食蟹猴血糖含量變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
表1-2食蟹猴血糖含量變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
4.2糖化血清白蛋白研究結果(具體見表2)：研究結果表明，陰性組糖化血清白蛋白(GSP)含量試驗期間相對平穩，未見明顯異常。與陰性對照組相比，高糖高脂成年猴組、低糖低脂中老年組、低糖高脂中老年組、高糖低脂中老年組、高糖高脂中老年組造模第13月至19月GSP均明顯升高。
表2食蟹猴糖化血清白蛋白變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
4.3糖化血紅蛋白研究結果(具體見表3)：陰性對照組試驗期間糖化血紅蛋白(HbA1c)含量穩定，未見明顯異常。與陰性對照組相比，高糖高脂青年組、低糖低脂組中老年組、低糖高脂組中老年組、高糖低脂組中老年組、高糖高脂組中老年組動物造模第13月至19月HbA1c含量均明顯升高，有統計差異(P<0.01)；低糖低脂中老年組和低糖高脂中老年組造模第19月HbA1c含量明顯升高，有統計差異(P<0.01)，造模19月後各試驗組HbA1c平均含量均到達6.3％以上。
表3食蟹猴糖化血紅蛋白變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
糖耐量研究結果(具體見表4)：實驗結果表明，陰性對照組動物試驗期間動物口服糖耐量(OGTT)未見明顯異常。高糖高脂青年組造模第13月至19月糖耐量明顯降低，曲線下面積明顯增加，有統計學差異(P<0.01)；低糖低脂中老年組、低糖高脂中老年組、高糖低脂中老年組、高糖高脂中老年組造模第13月至19月糖耐量明顯降低，曲線下面積明顯增加，有統計學差異(P<0.01)。
表4食蟹猴糖耐量變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
胰島素、胰高血糖素研究結果(具體見表5)：實驗結果表明，陰性對照組血漿動物胰島素、胰高血糖素水平實驗期間穩定，未見明顯異常。高糖高脂青年組動物造模、低糖低脂中老年組、低糖高脂中老年組、高糖低脂中老年組、高糖高脂中老年組動物造模第13月、19月後血漿胰島素和胰高血糖素水平均明顯升高，均有統計學差異(P<0.01)。
表5食蟹猴胰島素和胰高血糖素變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
胰島素抵抗研究結果(具體見表6)：實驗結果表明，陰性對照組動物胰島素抵抗實驗期間穩定，未見明顯異常。高糖高脂青年組、低糖低脂中老年組、低糖高脂中老年組、高糖低脂中老年組、高糖高脂中老年組動物造模第13月、19月後胰島素抵抗水平均明顯升高，均有統計學差異(P<0.05或0.01)。
表6食蟹猴胰島素抵抗變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
由此可見，本發明的高糖高脂組、高糖低脂組、低糖高脂組、低糖低脂組都成功的誘導出2型糖尿病靈長類動物模型。
實施例2：使用多種降糖作用機制的藥物驗證高糖高脂誘發的2型糖尿病食蟹猴模型及降糖藥篩選和評價平臺的建立
本發明製備的2型糖尿病食蟹猴模型與人類2型糖尿病模型非常相近，其主要特點為血糖升高，糖耐量受損、胰島素水平升高和胰島素抵抗。因此，根據其特點，選用了3種作用機制的藥物對模型動物進行幹預。第一種為雙胍類的代表藥物二甲雙胍，其作用機制為促使外周細胞加速葡萄糖的攝取；第二類為胰島素製劑門冬胰島素30，通過外源性直接給予胰島素，增加血漿胰島素水平，從而達到降糖的目的；第三類為胰島素增敏劑類藥物的代表藥物羅格列酮，其作用為促進胰島素和受體結合，具體實驗方法如下：
挑選造模成功的食蟹猴20隻(2型糖尿病食蟹猴模型)，按空腹血糖值和糖耐量值分為4組，分別為模型對照組、二甲雙胍組、胰島素組、格列本脲組，每組5隻。分組後分別進行給藥，連續8周。分別測定動物的空腹血糖、糖耐量、糖化血清白蛋白、糖化血紅蛋白等指標以評價藥物的降糖作用。
首次給藥、中期給藥、末次給藥後動態測定動物的隨機血糖值，測定時間給藥前、給藥後30min、1、2、4、8、12、24h。
每2周測定一次動物給藥後1h的隨機血糖值。
每4周測定一次動物的糖耐量和糖化血紅蛋白、糖化血清白蛋白。
試驗結果，二甲雙胍、胰島素、羅格列酮對2型糖尿病食蟹猴模型均具有明顯的降糖作用，能夠明顯降低模型動物的血糖、糖化血清白蛋白、糖化血紅蛋白，提高動物的糖耐量。但胰島素的作用最為明顯，羅格列酮和二甲雙胍，該結果與上述三種藥物的作用機制完全相符。
綜上所述，本發明通過高糖高脂膳食誘導2型糖尿病靈長類動物模型研發成功，可用於各類抗糖尿病藥物，特別是嚙齒類動物無法完成的、具有物種選擇性的生物技術類抗糖尿病藥物的篩選和評價。