降低循環氧化低密度脂蛋白-β-2-糖蛋白1複合物以治療動脈粥樣硬化的方法

2023-06-02 15:42:21 2

專利名稱：降低循環氧化低密度脂蛋白-β-2-糖蛋白1複合物以治療動脈粥樣硬化的方法
降低循環氧化低密度脂蛋白-β-2-糖蛋白1複合物以治療
動脈粥樣硬化的方法相關申請的交叉引用本申請要求於2008年11月14日提交的美國臨時專利申請號61/114，823的權益。領域本發明的實施方案涉及用於動脈粥樣硬化的預防和治療的降低循環氧化低密度脂蛋白-β_2-糖蛋白1複合物的含有天然多不飽和脂肪酸(PUFA)的烹飪油組合物。背景升高的循環膽固醇在動脈粥樣硬化的發展中是已被證實的風險因子。動脈粥樣硬化可被描述為這些血管中動脈壁變弱和血流變窄的過程。這一系列的事件在冠狀動脈中頻繁發生，引起至心臟的血流的阻塞並導致心肌梗死(心臟損害)；其常被稱作冠心病(CHD)。治療劑，比如他汀類藥物，其控制血清膽固醇的濃度，在冠心病的治療中已顯示了一些有效性。這些劑通過抑制膽固醇自身合成來調節膽固醇運輸脂蛋白的循環水平，但對諸如膽固醇吸收或氧化的下遊事件沒有影響，膽固醇吸收或氧化是啟動動脈粥樣硬化的必要步驟。然而，由於動物脂肪的高膳食攝入，並考慮到當飲食供給被認為不足時在肝和其它組織中膽固醇的人體的合成，膽固醇水平時常在向上壓力下。脂蛋白的四種主要類別是已知的，其全部共有相似的由磷脂和載脂蛋白的兩親性表層所包圍的脂質核的基本結構。脂質核越大，脂蛋白顆粒的密度越小。按照它們的尺寸的遞增順序高密度脂蛋白(HDL)，其通過從外周組織中清除膽固醇而形成脂質核，並因此常被稱為「有益膽固醇」;低密度脂蛋白(LDL)，其在肝中由極低密度脂蛋白(VLDL)殘餘物形成；極低密度脂蛋白(VLDL)，其也在肝中生成並主要含有在小腸中形成的甘油三酯和乳糜微粒，且由甘油三酯和膳食脂肪組成。許多專利公開了作為有用的抗動脈粥樣硬化劑的化合物。例如，美國專利第 4，681，893 號，其公開 7 "Method of Inhibiting cholesterol biosynthesis in a patient (在患者中抑制膽固醇生物合成的方法)」和美國專利第5，846，966號，其公開了 "Combinations of hydroxy-substituted azetidinone compounds and HMG CoA Reductase Inhibitors (羥基取代的氮雜環丁酮化合物和HMG輔酶A還原酶抑制劑的組合)」。此專利(US 4681893)和本申請中提到的所有其它專利和專利申請在此通過引用併入。更新證據支持了以下觀點，即在動脈粥樣硬化發病之前LDL需要經歷一系列的轉化和複合。推斷的早期步驟是氧化LDL(oxLDL)的形成，其在動脈粥樣硬化的發病中起關鍵作用。LDL的氧化修飾改變了其生物學性質，導致除從內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞產生的生長因子和細胞因子的調節外，單核細胞或T淋巴細胞的趨化性(chemotaxis)。已清楚地證明來自培養的內皮細胞的oxLDL的細胞毒性是致動脈粥樣硬化的。這些研究清楚地顯示了動脈壁中LDL的氧化的致動脈粥樣硬化的機制，但後來的研究將更多重點放在患有冠心病的患者中的循環oxLDL水平的臨床重要性上。利用針對丙二醛修飾的LDL (MDA-LDL) 和針對銅oxLDL製備的小鼠單克隆抗體使用免疫測定來測量循環oxLDL。新試驗也顯示了患有冠心病的患者中存在增高的OXLDL的血漿水平。升高的血漿oxLDL水平已被建立為CHD的生物化學風險標誌物。oxLDL水平與諸如高血壓、高脂血症或吸菸的其它風險因子缺乏關聯表明提高的oxLDL水平是CHD的獨立風險因子，且當與諸如總膽固醇、甘油三酯、apoB或HDL水平的其它生物化學標誌物相比時，oxLDL水平和CHD 之間的關聯是CHD的顯著高級風險指標。通過內皮細胞的oxLDL的攝入也已被證明是動脈粥樣硬化的啟動和發展的關鍵步驟。粘附分子是炎性標誌物，其通過oxLDL上調並在動脈粥樣硬化形成中具有關鍵作用。 可能顯示oxLDL影響CHD的另一個方式是通過促進動脈粥樣硬化斑塊中凋亡細胞的累積。已顯示魚油且更具體地魚油的二十碳五烯酸(Eicosa Pentaenoic Acid) (EPA)、 二十二碳五煉酸(Docosa Pentaenoic Acid) (DPA)禾口二十二碳六煉酸(Docosa Hexaenoic Acid) (DHA)多不飽和脂肪酸(PUFA)成分具有作為強心興奮劑的潛在用途。一些在人冠狀動脈內皮細胞中進行的體外研究已表明EPA和DHA可減弱粘附分子的表達，這可能是魚和魚油的抗動脈粥樣硬化作用的一個途徑。在另一個實例中，已在大鼠模型中研究了膳食魚油對主動脈血栓形成、血小板聚集和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響，並顯示了可能通過減少血小板聚集和氧化應激相關的動脈損傷來延遲動脈血栓形成。在單相化學系統中也已證實高度不飽和的EPA和DHA應該比含有較少雙鍵的脂肪酸更易於氧化。先前的研究已顯示具有不連續的極性相和非極性相的LDL與這些脂肪酸的富集並不增加氧化。Wander的研究(Lipids，第37卷，第8期，第789頁，(2002))也已顯示在U937細胞中由富含EPA/DHA的oxLDL引起的凋亡的程度與非富含EPA/DHA的oxLDL誘導的凋亡的程度相比顯著較低，因此產生了以下結論，即，在PUFA補充後，富含EPA/DHA的oxLDL誘導的細胞凋亡減少且該減少與過氧化氫脂質的濃度無關。這結果表明EPA/DHA通過動脈壁中細胞凋亡的下降而並非通過氧化損傷的任何減少，提供對動脈粥樣硬化的保護性作用。動脈粥樣硬化還以由於脂質的過度累積，動脈壁逐漸增厚為特徵。如Steinberg D.，J. Biol. Chem. ·第 272(34)卷，第 20963 頁，(1997)和 Steinberg D.，Nature Med. 第8卷，第1211頁，000 中所描述，促炎因子和血脂障礙是其發展的主要貢獻者。低密度脂蛋白(LDL)是在動脈粥樣硬化損傷或動脈粥樣硬化斑塊中累積的膽固醇的主要形式，但LDL必須首先被修飾成氧化的結構(oxLDL)以開始該過程，且如McMurray H.等人.J. Clinical. Med.，第92卷.第1004頁.(1993)中所描述，修飾LDL成為oxLDL的最重要的促動脈粥樣硬化機制是氧化應激。與天然LDL不同，oxLDL結合β 2GPI_糖蛋白以最終形成穩定的不可解離的複合物。(oxLDL-i32GPI複合物，氧化低密度脂蛋白-β_2_糖蛋白1複合物)。這些穩定的複合物被認為是病原性的且是臨床上高度相關的，並作為促動脈粥樣硬化抗原被涉及，且代表動脈粥樣硬化血栓形成的血清學風險因子。MPO的作用髓過氧化物酶(MPO)是在嗜中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞中表達的血紅素過氧化物酶-環氧合酶。MPO通過形成殺微生物活性氧化劑而參與先天免疫防禦系統，所述殺微生物活性氧化劑比如有效的抗微生物劑次氯酸。但是，已報導次氯酸與核鹼基反應導致5-氯尿嘧啶的形成，5-氯尿嘧啶是炎症過程中DNA損傷的標誌物，其在人類動脈粥樣硬化
組織中富集。最近已出現證據，即MPO來源的氧化劑促進組織損傷以及急性和慢性血管炎症疾病的啟動和擴張。已顯示MPO的循環水平是主要有害心臟事件的預測風險，且MPO來源的氯化化合物的特定水平是動脈粥樣硬化疾病進程的已知的生物標誌物。(Takeshita J，Byim J, Nhan TQ, Pritchard DK, Pennathur S, Schwartz SM 等人(2006)。 Myeloperoxidase generates 5-chlorouracil in human atherosclerotic tissue -.a potential pathway for somatic mutagenesis by macrophages (在人類動脈粥樣硬化組織中髓過氧化物酶生成5-氯尿嘧啶通過巨噬細胞的體細胞突變發生的潛在途徑).J.Biol. Chem.，281 3096-3104)。用於MPO催化的脂質蛋白的氧化的另一個指標是由次氯酸攻擊和3-氯酪氨酸的形成所觀察到，3-氯代酪氨酸已在人類動脈粥樣硬化損傷和從這些損傷中提取的月旨蛋白中被鑑另lj (Hazen SL, Heinecke JW, 3-Chlorotyrosine, a specific marker of myeloperoxidase-catalyzed oxidation, is markedly elevated in low density lipoprotein isolated from human atherosclerotic intima(髓過氧化物酶催化的氧化的特定標誌物3-氯酪氨酸在由人類動脈粥樣硬化內膜中分離的低密度脂蛋白中顯著增高).J Clin Invest 99:2075-2081 (1997) ；Thukkani AK，McHowat J，Hsu FF， Brennan ML,Hazen SL,Ford DA,Identification of alpha—chloro fatty aldehydes and unsaturated lysophosphatidylcholine molecular species in human atherosclerotic lesions (人類動脈粥樣硬化損傷中α -氯脂肪醛和不飽和溶血卵磷脂膽鹼分子種類的鑑定)。Circulation 108:3128-3133(2003))。令人驚奇地，本發明人已發現在他們的日常飲食中使用含有富含混合PUFA的魚油和/或海藻油的烹飪油製品一段持續的時間的患者顯示了循環oxLDL-β 2GPI複合物的顯著降低。從已知的和所描述的文獻中不能得到烹飪油製品的積極作用。此外令人驚奇地，本發明人利用每天一次劑量的含PUFA混合物的魚油膠囊的第二個試驗追蹤該非預期的結果，顯示出與在烹飪油試驗中所觀察到的相同的循環 OXLDL-^2GPI複合物水平的令人驚奇的降低。在該結果的進一步擴展中，本發明人在主要含單一 PUFA(DHA)的油和含PUFA混合物(DHA、EPA、DPA)的油之間進行了對比試驗，並顯示了與主要含單一 PUFA的油相比混合的PUFA的令人驚奇的統計學上顯著的OxLDL- β 2GPI 複合物水平的額外降低。在第四個試驗中，本發明人發現，服用混合的PUFA的口服劑的患者與未治療的對照組相比，循環MPO水平的令人驚奇的，統計學上顯著的降低。概述本發明的實施方案包括通過供日治療有效劑量的配製成烹飪油組合物的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)多不飽和脂肪酸(PUFA)中的至少一種來減少循環oxLDL-β 2GPI複合物和髓過氧化物酶(MPO)的新方法提，其中將 EPA、DPA和DHA中的至少一種作為魚油和/或海藻油的成分添加，並與一種或多種已知的烹飪油混合成穩定的烹飪油組合物，所述已知烹飪油諸如落花生油(groundnut oil)、米糠油、大豆油、玉米油、芝麻油、低芥酸菜子油、紅花油、橄欖油、花生油(peanut oil)和/或其它植物油。本發明的一個實施方案包括通過每日向患者提供魚油和或海藻油的膠囊來遞送日治療有效劑量的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)多不飽和脂肪酸(PUFA)中的至少一種以降低循環OxLDL和MPO的方法。詳述動脈粥樣硬化以由於脂質的過度累積，動脈壁逐漸增厚為特徵。促炎因子和血脂障礙是其發展的主要貢獻者。低密度脂蛋白(LDL)是在動脈粥樣硬化損傷或動脈粥樣硬化斑塊中累積的膽固醇的主要形式，但LDL必須首先被修飾成氧化的結構(oxLDL)以開始該過程，並且修飾LDL成為oxLDL的最重要的促動脈粥樣硬化機制是氧化應激。與天然LDL不同，oxLDL結合i32GPI-糖蛋白1，以最終形成穩定的不可解離的複合物(oxLDL-i32GPI複合物)。起始反應是可逆的，且隨後形成被認為(Inoue K.等人， Oxidized LDL/-i32GPI complexes. New aspects in atherosclerosis (氧化 LDL/-β 2GPI 複合物。動脈粥樣硬化中的新方面).Lupus 14,736(2005))是病原性的且臨床上高度相關的穩定的不可解離複合物。巨噬細胞的oxLDL的攝入由清除受體CD36所調節，其導致了動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細胞的形成。(Podrez Ε. A.等人，Macrophage scavenger receptor CD36 is the major receptor for LDL modified by monocyte-generated reactive nitrogen species (巨噬細胞清除受體⑶36是被單核細胞生成的活性氮物質修飾的LDL的主要受體)· J. Clin. Invest. 105 (8)，1085 (2000))。因為oxLDL- β 2GPI的攝入在抗β 2GPI抗體存在時顯著增高，這種機制在解釋動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細胞的發展時是生理學上相關的。因此oxLDL-i32GPI複合物已作為促動脈粥樣硬化抗原被涉及，且代表血清學風險因子，和動脈粥樣硬化血栓形成的貢獻者。因此降低循環oxLDL-β 2GPI複合物是治療動脈粥樣化血栓形成的重要的藥理學目標，並且是本發明的目的。利用在人類血漿中檢測循環oxLDL-i32GPI複合物的基於雙抗體「夾心」技術 (ELISA)的免疫測定，可準確測量循環oxLDL-β 2GPI複合物。用抗人β 2GPI的單克隆抗體塗布96孔板的孔，所述單克隆抗體將與導入到孔中的任何i32GPI結合。利用針對人apoBlOO 的辣根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體檢測結合的oxLDL-β 2GPI。利用發色團試劑四甲基聯苯胺(TMB)通過測量HRP的酶活性，測定oxLDL-β 2GPI複合物的濃度，所述四甲基聯苯胺(TMB)形成在450nm處測得的獨特的黃色。利用分光光度計測量所產生的顏色的強度，其與結合oxLDL-β 2GPI複合物的量成正比。依據利用已知的複合物溶液製備的標準曲線標繪結果，以實現在測試的血漿中循環oxLDL-β 2GPI複合物的準確測量。可通過將標準烹飪油與7. 5% w/w海藻油混合而製備本發明的烹飪油，其含有混合的最少的35% EPA(20% )和DHA(80% )。試驗所選擇的標準烹飪油通常使用落花生油 (groundnut oil)和葵花籽油。混合過程在封閉系統中在氮氣下(以阻止氧化)進行，且溫度在20-40攝氏度之間。已進行了開放式標記隨機研究，以評估這種烹飪油與健康的蔬菜烹飪油(即落花生油和葵花籽油)相比，對患有血脂障礙的患者中的循環oxLDL-i32GPI複合物的作用。選擇年齡在18-60歲之間的、任意性別的、血清LDL膽固醇水平在130_250mg/DL 且血清甘油三酯水平在150-500mg/DL的患者。患有已知冠心病的患者，接受血脂障礙的飲食治療的患者，接受他汀類(statins)/貝特類(fibrates)或其它降低脂質藥物的患者， 患有嚴重肝病或腎臟損傷的患者或妊娠期/泌乳期女性，均從本研究的潛在庫(potential pool)中排除。每位患者都受到起始、中間(每月)和最終(三個月)的全面身體檢查，以能夠在試驗期間評估效力和副作用，所述全面身體檢查由測量血小板的RBC、心電圖、12小時空腹血脂特徵、空腹血糖、甲狀腺特徵、肝功能測驗和腎功能測驗組成。按照男性和女性的大致相等的比例募集了 48位健康患者，利用SAS 8. 2版隨機分成A、B和C三組，按如下開始治療A組-3x500ml用於普通烹飪目的的含有7. 5% w/w海藻油的烹飪油，經三個月時間。B組-3x500ml用於普通烹飪目的的標準落花生油，經三個月時間。C組-3x500ml用於普通烹飪目的的標準葵花籽油，經三個月時間。在第二個試驗中，將按如上新隨機選擇並篩選的48位健康患者分成兩組，A組為未治療的，且第二組B組每天一次被給予商業上可獲得的魚油膠囊(h500mg)，每天早晨與早餐一起服食，持續1個月。利用與以上第一個試驗相同的方法在第1天和第30天測量循環oxLDL-β 2GPI複合物的水平。在第三個試驗中，本發明人用補充量的主要為單獨PUFA和混合的PUFA對比餵養 24隻豚鼠4周，以測定每一種在降低循環oxLDL- β -2糖蛋白複合物中的效力。使用了 80% DHA,20 % EPA (AO)的 PUFA 組合對比其中 PUFA 濃度為；35 % DHA,35 % EPA 和 30 % DPA (SO) 的組合，且利用與以上第一個試驗所描述的相似的方法測量循環OxLDL-i32GPI。在第4個試驗中，將新隨機選擇並篩選的M位人類患者分成兩組，C組為未治療的，且第二組FO組每天一次被給予商業上可獲得的魚油膠囊(h500mg)，每天早晨與早餐一起服食，持續1個月。在第1天和儘可能接近第30天時測量循環MPO水平。利用檢測人血漿中循環MPO的基於雙抗體「夾心」技術(ELISA)的免疫測定準確測量循環ΜΡ0。實驗結果在第一個試驗中，其中患者使用含有7. 5% w/w海藻油的烹飪油對比葵花籽烹飪油和落花生烹飪油，採集血漿並測量循環oxLDL-i32GPI複合物，得到本文中所描述的結果。首先繪製oxLDL- β 2GPI複合物濃度曲線，系列稀釋對照標準溶液，對於每個濃度測量吸光度(在450nm處)並繪製校準曲線，同時重複兩次測量M個未知的血漿樣品，以測量這些樣品的oxLDL-i32GPI複合物的未知濃度，如下表1中所示。A1-F2孔中顯示的是標準溶液，而A3-H8孔中顯示的是重複兩次進行的患者血漿樣品。患者血漿樣品孔中的編號代表患者數碼，且字母I =起始血漿樣品，1M、2M= 1個月或2個月中間血漿樣品，且F =最終血漿樣品。然後將由表1所得的校準標準吸光度標繪成校準曲線，並從曲線中推導出二階多項式方程。y = 3. 6382x2+89. 54χ_0· 1227R2 = 0. 9999表 權利要求
1.作為動脈粥樣硬化的預防和治療的手段的減少人血清中循環oxLDL-β-2-糖蛋白1 複合物和循環髓過氧化物酶的方法，所述方法包括向人施用有效量的含有l-99wt%多不飽和脂肪酸(PUFA)的膳食油組合物。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述膳食油組合物還包括可食用烹飪油； 所述組合物包括以下的脂肪酸分布⑴飽和脂肪酸(SFA) 15-55wt% ；(ii)單不飽和脂肪酸(MUFA)40-80wt%；禾口(iii)多不飽和脂肪酸(PUFA)5-45wt%。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述膳食油組合物通過膠囊施用，所述膠囊含有包括以下的脂肪酸分布的膳食油組合物⑴飽和脂肪酸(SFA) 5-10wt% ；(ii)單不飽和脂肪酸(MUFA)5-10wt% ；和(iii)多不飽和脂肪酸(PUFA)20-90wt%。
4.如權利要求1所述的方法，其中優選的多不飽和脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)、 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳五烯酸(DPA)以分別為0. 5-1,0. 1-1,0. 1-0. 5的比例的混合物。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述PUFA組分包括至少一種選自由海油和海藻油組成的組的油，其中所述海油包括EPA、DHA, DPA和天然抗氧化劑的混合物。
6.如權利要求2所述的方法，其中所述可食用烹飪油包括植物油。
7.如權利要求2所述的方法，其中所述可食用烹飪油包括選自由落花生油、米糠油、大豆油、玉米油、芝麻油、低芥酸菜子油、紅花油、橄欖油和花生油組成的組的油。
8.如權利要求2所述的方法，其中所述可食用烹飪油還包括維生素A、維生素D、維生素 E或抗氧化劑植物提取物中的至少一種。
9.一種用於生產權利要求2的膳食油組合物的方法，所述方法包括a)將可食用的烹飪油裝入容器中；b)將至少一種選自由海油和海藻油組成的組的油添加到所述容器中；並c)攪拌所述油直到混合。
全文摘要
通過向受試者施用有效量的包括多不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的膳食油組合物來減少循環氧化低密度脂蛋白-β-2-糖蛋白I複合物和循環髓過氧化物酶水平以治療動脈粥樣硬化的方法。
文檔編號A61P9/10GK102202661SQ200980144263
公開日2011年9月28日 申請日期2009年11月10日 優先權日2008年11月14日
發明者博米·P·弗萊姆羅茲 申請人:博米·P·弗萊姆羅茲