一種促生長的植物內生球孢白僵菌菌株及應用的製作方法
2023-06-02 12:14:21 2
一種促生長的植物內生球孢白僵菌菌株及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種促生長的植物內生球孢白僵菌菌株及應用，所述的植物內生球孢白僵菌菌株為球孢白僵菌菌株(Beauveria bassiana)Bb4，已於2014年4月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No.9097；將該菌株接種於玉米、小麥等，可在宿主體內定殖，能促進宿主植物的生長，對玉米螟幼蟲有一定的毒性。將該菌株用於生產微生物肥料製劑，有助於減少農藥殘留，保護生態環境。
CGMCC No.9097
20140428
【專利說明】-種促生長的植物內生球孢白僵菌菌株及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種促生長的植物內生球孢白僵菌菌株及應用。
【背景技術】
[0002] 內生真菌可通過自身的代謝產物或存在本身藉助於信號作用對植物施加影響，從 而在"內生菌一植物一動物一環境"的複合生態系統中扮演重要角色。很多研究表明， 感染了內生真菌的宿主往往具有生長快速、抗逆境、抗病害、抗動物危害等優勢，比未感染 植株更具有生存競爭力；並且由於內生真菌分布廣、種類多，因而近年來植物內生真菌已引 起了微生物學家、生態學家、植物保護學家的廣泛興趣，逐漸成為國內外研究的熱點；目前 發現，內生菌對宿主植物至少有以下幾個方面的有益作用：促進宿主植物的生長發育、增強 宿主植物的抗乾旱、抗高溫耐性、抗動物（昆蟲、線蟲、食草哺乳動物等）攝食、抗病原真菌 和細菌以及他感作用等。
[0003] 很多的植物內生真菌具有促生長作用，Diene等發現內生真菌 侵染宿主後能夠明顯增加甜高粱的生物量；Malinowski等發現感染了內生真菌 的酥油草根系有更強的吸收P的能力，同時根系內Ca、Mg含量也較高；高微微等研究發現 3種小菇屬內生真菌能夠促進鐵皮石斛幼苗生長、促進金線蓮側芽及側根的萌發，對鐵皮石 石斛和金線蓮的成功栽培具有實際應用價值。
[0004] 球孢白僵菌是一種昆蟲病原真菌，廣泛分布於全世界，可寄生鞘翅目、半翅目、鱗 翅目等共15目、149科、521屬、707種昆蟲以及蜱蟎目的6科、10餘種蟎和婢。具有致病力 強，寄主範圍廣，對人、畜無毒害，不傷害天敵，不汙染環境等優點，廣泛應用於有害生物的 綜合防治。
[0005] 球孢白僵菌不僅是一種昆蟲病原真菌，也是植物的內生真菌。從上個世紀90年代 開始，國內學者已陸續在西紅柿、馬鈴薯、棉花、咖啡、香蕉等植物體內分離到球孢白僵菌。 不過目前仍然沒有見到內生球孢白僵菌促進宿主植物生長的報導。據國家統計局發布的統 計數字表明，2012年玉米已成為我國第一大糧食作物品種，如果內生球孢白僵菌具有促生 效應，將為玉米的豐產高產提供參考依據。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在於提供一種促生長的植物內生球孢白僵菌菌株及應用。
[0007] 本發明的技術方案如下： 促生長的植物內生球孢白僵菌菌株，所述的植物內生球孢白僵菌菌株為球孢白僵菌菌 株（Beauveria bassiana)Bb4,已於2014年4月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No. 9097,保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西 路1號院3號。
[0008] 促生長的植物內生球孢白僵菌菌株，所述球孢白僵菌菌株（ifeawreria Aa1S1Siaaa) Bb4的菌落粉狀，呈白色，稍後逐漸變為淡黃色；所述的菌株菌絲有隔膜和分枝；分生孢子 近球形或球形，透明，光滑；產孢細胞瓶梗形，生於菌絲、分生孢子梗或柄細胞上，在分生孢 子梗或膨大的泡囊上會形成產孢軸，呈膝狀彎曲，即之字形。
[0009] 將保藏的植物內生球孢白僵菌菌種按5%接種量到SDAY固體培養基中，活化培育 10-14天即可製備得到孢子懸浮液。
[0010] 將保藏的植物內生球孢白僵菌菌種按2-3%接種量到液體SDAY培養基中，活化培 育7-15天得到菌液。
[0011] 所述的促生長的植物內生球孢白僵菌菌株在玉米、小麥等作物的種子或幼苗中的 應用。
[0012] 用真菌通用引物ITS1/ITS4對該菌株進行rDNA ITS的PCR擴增，並對ITS PCR擴 增產物進行測序，將測序結果去除載體引物序列後拼接成完整的核苷酸序列，其大小均為 569 bp，將所得序列在GenBank核酸序列資料庫中進行BLAST搜索，發現測試菌株的ITS區 域與已報導的球孢白僵菌漢知和有性型Cb辦ce/75· Aa1S1Siaaa的同源性最高，多數 達100% ;利用軟體分析，採用鄰接法構建了進化樹，結合其形態學特徵，因此確定該菌株為 球抱白僵菌（漢。
[0013] 通過常規的微生物固體發酵或液體發酵方法可以培養本發明所述的植物內生真 菌，並製得以本發明所述的植物內生真菌----內生球孢白僵菌為主要成分的微生物肥料； 該菌的最適生長溫度為25°c，最適pH為6. 0-7. 0,可用一般發酵工業中固體發酵罐和機械 攪拌發酵罐進行培養，在製造以本發明所述的內生球孢白僵菌為微生物肥料時，可以使用 該【技術領域】中已知球孢白僵菌生防菌劑通用的培養基，配製成水劑、粉劑等劑型。
[0014] 本發明的有益效果： 本發明的菌種接種於玉米、小麥等，可在宿主體內定殖，能促進宿主植物的生長，對玉 米螟幼蟲有一定的毒性；將該菌株用於生產微生物肥料製劑，有助於減少農藥殘留，保護生 態環境。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1內生球孢白僵菌浸種法處理20d後玉米不同器官內目標菌回收結果； 圖2內生球孢白僵菌對玉米發芽的影響； 圖3內生球孢白僵菌對玉米出苗率的影響； 圖4內生球孢白僵菌對玉米幼苗根系活力的影響； 圖5內生球孢白僵菌對玉米幼苗葉綠素含量的影響。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1 :內生球孢白僵菌通過浸種法在玉米體內的定殖情況，如圖1所示： 挑選產孢良好的球孢白僵菌各菌株平板，用接種環刮取孢子加入50ml無菌水中，漩 渦振蕩儀振蕩混勻後，過濾，計數，調整孢懸液濃度為5X IO7個/ml，挑選顆粒飽滿的玉米 種子，放入孢懸液中浸泡8h，將浸泡處理的玉米種子種下，做好標記，對照用無菌水處理。 20d後不僅從根內分離得到接種菌，從莖、葉、葉柄內同樣可以分離得到接種菌，說明菌體 能夠通過玉米的種皮入侵植株，並且菌體可以從根部向莖部、葉部轉移。
[0017] 實施例2 :內生球孢白僵菌促玉米發芽實驗，如圖2所示： 挑選產孢良好的球孢白僵菌各菌株平板，製備濃度為IXio6個/ml的孢懸液；分別將 種粒飽滿,大小均勻的玉米種子浸入75%乙醇中浸泡IOmin,無菌水衝洗後浸入內生球孢 白僵菌孢子懸浮液中，室溫下浸泡12h後取出，以用無菌水浸泡的種子為對照。
[0018] 用滅過菌的吸水紙吸乾多餘的懸浮液，置於鋪有用無菌水潤溼過濾紙的培養皿 中，每皿20粒，每個處理5個皿，5次重複，置於25°C光照培養箱中培養3d，每隔12h 記錄發芽數，計算發芽勢和發芽率。結果顯示，使用內生球孢白僵菌浸種處理玉米後，可顯 著提高玉米的發芽勢、發芽率。
[0019] 實施例3 :內生球孢白僵菌促玉米幼苗生長實驗； 隨機挑選玉米種子，表面消毒後，用濃度為IXio7個/ml的球孢白僵菌孢子懸浮液浸 泡12h後種於滅菌蛭石中，25°C溫室條件，澆適量無菌水，30d後調查出苗數、株高、生物量 和根系活力，每個處理100株，共設5次重複。以無菌水浸泡處理的種子作為對照。結果顯 示內生球孢白僵菌出苗率、生物量、株高、根系活力、植株葉片總葉綠素含量，對玉米具有一 定的促生長作用，如表1、圖3、4、5所示。
[0020] 表1內生球孢白僵菌對玉米幼苗生物量和株高的影響
【權利要求】
1. 一種促生長的植物內生球孢白僵菌菌株，其特徵在於，所述的植物內生球孢白僵菌 菌株為球孢白僵菌菌株（Beauveria bassiana)Bb4,已於2014年4月28日在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No. 9097。
2. 根據權利要求1所述的促生長的植物內生球孢白僵菌菌株，其特徵在於，所述球孢 白僵菌菌株（Beauveria bassiana)Bb4的菌落粉狀，呈白色，稍後逐漸變為淡黃色；所述的 菌株菌絲有隔膜和分枝；分生孢子近球形或球形，透明，光滑；產孢細胞瓶梗形，生於菌絲、 分生孢子梗或柄細胞上，在分生孢子梗或膨大的泡囊上會形成產孢軸，呈膝狀彎曲，即之字 形。
3. -種如權利要求1所述的促生長的植物內生球孢白僵菌菌株的培育方法，其特徵在 於，將保藏的植物內生球孢白僵菌菌種按5%接種量到SDAY固體培養基中，活化培育10-14 天即可製備得到孢子懸浮液。
4. 一種如權利要求1所述的促生長的植物內生球孢白僵菌菌株的培育方法，其特徵 在於，將保藏的植物內生球孢白僵菌菌種按2-3%接種量到液體SDAY培養基中，活化培育 7-15天得到菌液。
5. 如權利要求1所述的促生長的植物內生球孢白僵菌菌株在玉米、小麥等作物的種子 或幼苗中的應用。
【文檔編號】A01P21/00GK104498363SQ201410437440
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年8月30日 優先權日:2014年8月30日
【發明者】陳曉琳, 韓國民, 曹媛媛, 倪敬田, 孫樂妮, 常豔, 楊恩東, 鄧瑞寧 申請人:安徽農業大學