熊果酸衍生物的合成及其在藥物製備中的應用的製作方法

2023-06-02 14:05:11 2

專利名稱：：熊果酸衍生物的合成及其在藥物製備中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及熊果酸偶聯衍生物及其藥物用途，具體為不同類型的一氧化氮(簡稱NO，下同)供體通過酯鍵或醯胺鍵與具有保肝等作用的熊果酸偶聯的化合物，及其在製備誘導肝腫瘤細胞凋亡藥物中的應用。
背景技術：
：熊果酸(ursolicacid,UA)又名烏蘇酸，屬於五環三萜類化合物，廣泛分布於植物界，顯示出多種生物活性。UA具有較明顯的抗腫瘤作用，其抗瘤譜廣。研究表明，UA主要通過誘導腫瘤細胞凋亡、分化、抗始發突變、細胞毒作用、抗血管生成及抗促癌、抗氧化等多種機制發揮抗腫瘤作用。但其溶解度差，生物利用度低，影響了其臨床療效。UA惡性腫瘤(通稱癌症)是當前危害人類健康的重要疾病之一。據世界衛生組織WHO統計，全世界每年死亡人數中有13%是死於癌症(約760萬例)，這一數字在未來幾年中仍將持續增加。癌症同樣威脅著我國人民的生命健康，近年來，我國每年新增癌症病人多達160~170萬人。癌症已成為僅次於心血管病的第二大殺手。近年來，大量研究表明NO在腫瘤的發生及發展中顯示雙向調節作用體內持續低濃度的NO(無論是內源性的還是外源性的)可抑制細胞凋亡，對細胞(包括腫瘤細胞)具有保護和促其生長的作用；體內高濃度的NO可產生細胞毒性，誘導腫瘤細胞凋亡，阻止腫瘤細胞的擴散和轉移。體內NO生成不足或NO信號傳導異常與多種疾病的形成和發展密切相關，外源性地補充體內NO不足、恢復NO正常信號傳導使NO供體(NO-donor)及其相關藥物應運而生。NO供體是一類在體內經酶和非酶作用釋放一定量NO的化合物。目前大多數有關NO釋放藥物的抗腫瘤效應的認識都是基於NO供體型非甾體抗炎藥(NSAIDs)的研究結果，NO供體型非甾體抗炎藥是由一個傳統的非甾體抗炎藥和NO供體通過一個間隔分子共價結合而成的。NO-NSAIDs不僅顯示出極少的胃腸道副作用，且比單一使用NSAIDs作為抗腫瘤藥更有效果。本發明要解決的技術問題是基於NO的雙向調節作用，如何應用藥物設計的基本理論，設計、合成結構類型新穎、釋放NO機制多樣化的NO供體型UA衍生物，並對它們進行生物活性篩選，以獲得具有選擇性地誘導肝腫瘤細胞凋亡作用的新型抗肝癌藥物。本發明還用於提供一種新型肝癌治療藥物的可工業化生產的製備方法。為解決上述問題本發明提供如下技術方案。通式I化合物Ri。，p<、其中，！^代表H-，CF3CO-;R2代表陽(CH2)n-，n=2~8，-CH2CH=CHCH2-，-CH2OCCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(012)11-(鄰，間，對)，n=l~4。通式II化合物其中，R,代表H-，CF3CO-;R2代表H-,HO-，CH30-;R3代表-CO-，-CH=CHCO-;R4代表-(CH2)n-，n=2~8，-CH2CH=CHCH2-，-CH2CsCCH2-，-012-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(12)11-(鄰，間，對)，n=l~4。通式ni化合物
發明內容A^~R30R4ON02R2formulaseeoriginaldocumentpage6其中，R,代表H-,CF3CO-;R2代表H-，HO-，CH30-;R3代表-CO-,-CH=CHCO-;R4代表-(cH2)no-，n=i~6,-<^1((:^)0120120-或-((:112)11-苯基-0012-(間，對)，-(<:&[2)-苯基-0-(間，對)，n=0~4;Rs代表苯基-，苯磺醯基-;X代表-O-，-NH-。通式IV化合物其中，Ri代表H-,C2H5-，苄基-,Na;R2代表-(012)2國，-CH=CH-，-苯基-(鄰)；R3代表-0(CH2)n-，n=l~6，-OCH2CH=CHCH2-，-OCH2CH2CH(CH3)-或-OCH2-苯基-(CH2)n-(間、對)，-0-苯基(012)[1-(間、對)，n=0~4;R4代表苯基-，苯磺醯基-;X代表-O-，-NH-。通式I化合物的製備方法UA與相應的二溴垸烴反應生成酯la;或者UA與三氟乙酸酐反應製得混合酸酐，再與羥基苄溴(鄰、間、對)反應，生成酯lb，la或lb再與硝酸銀反應。其中，Ri代表H-,CF3CO-;R2代表墨(CH2)n"n=2~8，-CH2CH=CHCH2-，-CH2C=CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2V(鄰、間、對)，n=l~4。具體反應步驟為COOR2Brla或lbformulaseeoriginaldocumentpage7通式II化合物的製備方法UA與三氟乙酸酐反應生成混合酸酐，與中間體2a經酯化得2b，2b再與硝酸銀反應製得部分II類化合物；其中一些在碳酸氫鈉(鉀)存在下脫三氟乙醯基得其它II類化合物。formulaseeoriginaldocumentpage7其中，Ri代表H-，CF3CO-;R2代表H-,HO-，CH30-;R3代表-CO-，-CH=CHCO-;R4代表-(CH2)n-，n=2~8，-CH2CH=CHCHr,-CH2OCCH2-，-<:112-吡咬(2，6)-CH2-，-苯基(《12)-(鄰、間、對)，n=l~4。具體反應步驟為formulaseeoriginaldocumentpage7通式III化合物的製備方法UA與三氟乙酸酐反應生成混合酸酐，再與中間體3a(參見莫若瑩，邵國賢，朱麗蓮，等.阿魏酸衍生物的合成[J].藥學學報，1985，20(8):584-591)反應製得部分in類化合物；其中一些在碳酸氫鈉(鉀)存在下脫三氟乙醯基得其它m類化合物。R3COXR4&VN、o3a其中，R2代表H-，HO-，CH30-;R3代表-CO-，-CH=CHCO-;R4代表-(CH2)nO-，n=l~6，陽CH(CH3)CH2CH20-或-(CH2)n苯基OCH2-(間、對)，-(CH2)n苯基O-(間、對)，n=0~4;Rs代表苯基-，苯磺醯基-;X代表-O-，-NH-。具體反應步驟為1)(CF3CO)202)3a3)NaHC03通式IV化合物的製備方法UA與相應的溴代烷(R!Br)反應成酯，再與二酸酐類在4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化下得4a，4a與含羥基或氨基的呋咱氮氧化物4b(參見:l.李瑞文，張奕華，季暉，等.苯磺醯基呋咱氮氧化物與雙氯酚酸偶聯化合物的合成及抗炎活性[J].藥學學報，2001，36(11):821-826;2.李瑞文，張奕華，季暉，等.苯基呋咱氮氧化物與雙氯酚酸偶聯化合物的合成及抗炎鎮痛活性[J].藥學學報，2002，37(1):27-32)在二環己基碳二亞胺(DCC)及DMAP催化下縮合；其中一些(R產H)與碳酸鈉成鹽得其它IV類化合物(R屍Na)。HOOCR2COO'4a4b其中，R！代表H-,C2H5-，苄基-，Na;R2代表-(CH2)2-，-CH=CH-，-苯基-(鄰)；R3代表-0(CH2)n-，n=l6，-OCH2CH=CHCH2-，-001201201((:113)-或-0(:}12苯基(€;112)11-(間、對)，-O苯基(CH2)n-(間、對)，n=0~4;R4代表苯基-，苯磺醯基-;X代表-O-,-NH-。具體反應步驟為4a+4bDC畫AP'|V前述任一項通式化合物在製備誘導肝腫瘤細胞凋亡藥物中的應用，具體為在製備抗肝腫瘤藥物中的應用。具體實施方式以下為本發明化合物的實施例，這些實施例並不意味著對本發明的限制。實施例1熊果酸-3-硝氧丙酯(12)UA(500mg，1.05mmo1)懸浮於15ml丙酮中，加三乙胺(2ml)使完全溶解，室溫攪拌下加入l，3-二溴丙烷(0.5ml，6mmo1)，攪拌回流反應12小時，得中間體熊果酸-3-溴丙酯，再與硝酸銀避光回流6h濾除不溶物，濾液濃縮，矽膠柱層析[乙酸乙酯石油醚(60M°C)=1:4(V:V)]，得白色固體150mg，收率65%，m.p.7678。C。ESI-MS:568[M+Na]+IR(KBr，cm-1):3474(OH)，1720(C=O)，1637(0N02)!HNMR(300MHz，CDC13)，S:0.71(s，3H，CH3)，0.78(s，3H，CH3)，0.88(s，6H，2xCH3)，0.90(d，3H，CH3)，0.97(d，3H，CH3)，1.00(s，3H，CH3)，3.20(m，1H，3a國H)，4.13(t，2H，OCH2，J=6Hz)，4.54(t，2H,OCH2，J=6Hz)，5.25~5.27(m，1H,C12-H)Anal.C33H53N06Found:(%)N2.19C68.33H9.60Calcd:(%)N2.43C68.63H9.53同法，可由UA與其它二溴烷烴、二溴烯烴、二溴炔烴，二溴芳烴等製得I類化合物。實施例2(1)4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸-2-溴乙酯(2ai)阿魏酸(5g，25.8mmol)溶於50ml丙酮中，加入1，2-二溴乙烷(22.26g，lOOmmol)，三乙胺10ml，外溫5(TC加熱反應，反應4h,冷卻至室溫，有大量白色固體析出，過濾，將濾液濃縮，柱層析[乙酸乙酯石油醚(6090°C)=1:4(V:V)]，得針狀固體7.8g，收率67%，m.p.l02104。C。同法，可由阿魏酸、香草酸、對羥基桂皮酸與其它二溴烷烴、二溴烯烴、二溴炔烴等製得另一些中間體如2a。(2)3-0-三氟乙醯基-熊果酸-2-甲氧基-4-[2-(2-溴-乙氧羰基)-乙烯基]-苯酯(2b!)UA(456mg，lmmol)懸浮於甲苯，攪拌下加入三氟乙酸酐(lml，7,42mmo1)，反應液澄清，室溫攪拌10分鐘，加入2a^456mg，1.5mmo1)，外溫反應〈卯。C反應12小時，冷卻，反應液用10^NaOH洗至中性，有機層分別用水，飽和食鹽水洗，無水Na2S04乾燥，過濾，減壓回收溶劑，柱層析[乙酸乙酯石油醚(60卯。C)-1:4(V:V)],得淡黃色油狀物0.75g，收率70%。(3)3-0-三氟乙醯基-熊果酸-2-甲氧基-4-[2-(2-硝氧基-乙氧羰基)-乙烯基]-苯酯(11!)2bK230mg，0.31mmol)溶於乙腈(6ml)及四氫呋喃(2ml)的混合液中，加入AgN03(77.6mg，0.47mmol)，避光回流反應4小時，濾除不溶物，濾液減壓濃縮，柱層析[乙酸乙酯石油醚(6090。C)二l:4(V:V)]得淡黃色固體85mg，收率33.7%。m.p.l05107。C。ESI陽MS:835[M+Na]+IR(KBr，cm-1):1776(C=0)，1745(00)，1717(C=0)，1631(0N02)!HNMR(300MHz，CDC13)，S:0.86(s，3H，CH3)，0.92(s，3H，CH3)，0.94(s，3H，CH3)，0.94(d,3H，CH3)，0.97(t，6H，2xCH3)，1.12(s，3H，CH3)，3.83(s，3H，OCH3)，4.32(t，2H，OCH2，J=6Hz)，4.61(t，2H，OCH2，J=6Hz),4.68~4.73(m，1H，3a-H),5.33(brs，1H，C12-H)，6.36(d，1H,=CH，J=16Hz)，6.95~6.67(m，1H,Ar-H)，7.077.12(m，2H，Ar-H)，7.65(d，1H，=CH，J=16Hz)AnalC44H58F3N01Found:(%)N1.67C63.23H6.95Calcd:(%)N1.68C63.23H6.95實施例3(1)4-輕基-3-甲氧基苯丙烯酸-2-溴丙酯(2a2)參照2ai的製備方法，由阿魏酸與l，3-二溴丙烷製得，收率68%，m.p.lO(M02。C。(2)3-0-三氟乙醯基-熊果酸-2-甲氧基-4-[2-(3-溴-丙氧羰基)-乙烯基]-苯酯(2b2)參照的製備方法，由UA與8b製得，柱層析[乙酸乙酯石油醚(6090。C)-1:4(V:V)]得黃色油狀物，收率74%。(3)3-0-三氟乙醯基-熊果酸-2-甲氧基-4-[2-(3-硝氧基-丙氧羰基)-乙烯基]-苯酯(113)參照IIi的製備方法，由2b!與AgN03避光反應製得，柱層析[乙酸乙酯石油醚(6090°C)=1:4(V:V)]得白色固體，收率71.8%，m.p.l00102°C。ESI-MS:849[M+NH4]+IR(KBr，cm"):1778(C=0)，1754(C=0)，1720(00)，1634(0N02)'HNMR(300MHz,CDC13)，5:0.86(s,3H，CH3)，0.92(s，3H，CH3)，0.94(s，3H，CH3)，2xCH3)，1.12(s，3H,CH3)，3.83(s，3H，OCH3)，4.32(t，2H，OCH2，J=6Hz)，4.61(t,2H，OCH2，J=6Hz)，4.68~4.73(m，1H，3a-H)，5.33(brs，1H，C12-H)，6.36(d，1H，=CH，J=16Hz)，6.95~6.67(m，1H，Ar-H)，7.07~7.12(m，2H，Ar-H)，7.65(d，1H，=CH，J=16Hz)AnalC45H6oF3NOkjFound:(%)N1.54C64/78H7.23Calcd:(%)N1.68C64.97H7.27實施例43-0-三氟乙醯基-熊果酸-4-{2-[3-(2-氧-4-苯磺醯基-1，2，5-噁二唑-4-氧)-l-甲基-丙氧羰基]-乙烯基}-2-甲氧基苯酯(mo將UA(456mg，lmmol)懸浮於甲苯(8ml)中，加入三氟乙酸酐(0.83ml，5.87rnrno1)，十分鐘後加入3-(3-甲氧基-4-羥基)-苯丙烯酸-3-(3-苯磺醯基-2-氧化-呋咱-4-氧)-l-甲基-正丙酯(670mg，1.4mmol)(參照文獻l.李瑞文，張奕華，季暉，等.苯磺醯基呋咱氮氧化物與雙氯酚酸偶聯化合物的合成及抗炎活性[J].藥學學報，2001，36(11):821-826;2.莫若瑩，邵國賢，朱麗蓮，等.阿魏酸衍生物的合成[J].藥學學報，1985，20(8):584-591)，攪拌回流反應。反應結束後用10^NaOH洗至中性，水洗。有機層渾濁，加入乙酸乙酯使其溶解，無水Na2S04乾燥，過濾，濾液濃縮，濃縮物矽膠柱層析[乙酸乙酯石油醚=1:4(V:V)]，得乳白色固體451mg，產率60%。m.p.U2114。C。ESI-MS:1047[M+Na]+IR(KBr，cm"):1778(C=0)，1753(C=0)，1711(C=0)，1163，1373(S02)'HNMR(300MHz，CDC13)，S:0.76(s，3H，CH3)，0.77(s，3H，CH3)，0.83(t，6H，2xCH3)，0.88(d，3H，CH3)，0.90(d，3H，CH3)，1.00(s，3H，CH3)，4.68(m，1H，3a-H)，3.80(s，3H，OCH3)，4.51(t，2H，OCH2，J=16Hz)，5.24~5.28(m,1H,OCH)，5.31(brs，1H，C12-H)，6.34(d，1H，=CH，J=16Hz)，6.92(d，1H，ArH)，7.067.09(m，2H，ArH)，7.60(d，1H，=CH，J=16Hz)，7.58~7.63(m，2H，ArH)，7.71~7.76(m，1H，ArH)，8.04~8.07(m，2H，ArH)Anal.C54H67F3N2012SFound:(%)N2.94C63.18H6.33Calcd:(%)N2.73C63.27H6.59同法可製得R5代表Ph;X代表NH的其它III類化合物。實施例5(1)3-0-琥珀醯基-熊果酸(4a!)將UA(2.50g，5.48廳o1)、丁二酸酐(2.19g，21.9mmo1)、DMAP(0.668g，5.48薩o1)、無水CH2C12(60ml)依次加入反應瓶中，加熱回流反應72h，反應液水洗3次，有機層無水Na2S04乾燥；過濾，濾液濃縮，濃縮物柱層析[乙酸乙酯石油醚(6090°。)=1:4(V:V)]得產品1.69g，產率53%。(2)(3p)-3-CK4-[2-(2-氧-3-苯磺醯基-l，2，5-噁二唑-4-氧)-乙氧基]-4-氧代丁醯基}-熊果酸將4a!(233g，0.42mmo1)、2-(3-苯磺醯基-l，2，5-噁二唑-2-氧化物-4-)氧乙醇(121mg,0.42mmol)、DCC(86.5mg，0.42mmo1)、DMAP(5.1mg，0.42mmo1)、無水CH2C12(15ml)依次加入反應瓶，室溫攪拌反應，約15min反應液由澄清變渾濁。反應結束後，濾除不溶物，濃縮物矽膠柱層析[乙酸乙酯石油醚=1:4(V:V)]得產品170mg,產率48%，m.p.l80182。C。ESI-MS:824[M]+IR(KBr，cm"):3326(COOH),1733(C=0)，1169，1362(S02)'HNMR(300MHz，CDC13)，S:0.73(s，3H，CH3)，0.77(s,3H，CH3)，0.81(s，6H，2xCH3)，0.89(d，3H，CH3)，0.91(d，3H，CH3)，1.11(s，3H，CH3)，2.65(s，4H，2xCOCH2)，4.4(brs,1H,3a-H)，4.5(t，2H,OCH2，J=6Hz)，4.65(t，2H，OCH2)，5.26(brs，，1H，C12-H)，7.58~7.63(m，2H,ArH)，7.707.75(m，1H，ArH)，8.05(d，2H，緒，J=8Hz)Anal.C44H6。即uSFound:(%)N3.38C64.29H7.12Calcd:(%)N3.40C64.00H7.33實施例6(1)3-0-鄰苯二甲醯基-熊果酸(4a3)參照4a,的製備方法，由UA和鄰苯二甲酸酐製得，收率67%。(2)(3p)-3-0-{2-[3-(2-氧-3-苯磺醯基-1，2，5-噁二唑-4-氧)-丙氧基羰基]-4-苯甲醯基}-熊果酸(IV3)參照IV!的製備方法，由4a3和4-(3-苯磺醯基-l，2，5-噁二唑-2-氧化物-4-)氧丁醇反應製得，收率44%，m.p.l7818(TCESI-MS:900[M〗+IR(KBr，cm"):3388(COOH)，1793(C=0)，1723(C=0)，1161,1367(S02)'HNMR(300MHz，CDC13)，S:0.78(s，3H,CH3)，0.81(s，3H，CH3)，0.86(s，3H，CH3)，0.92(s，3H，CH3),0.95(d，3H，CH3)，0.98(d，3H，CH3)，1.15(s,3H，CH3)，4.40(m，2H，CH20)，4.45(m，1H,3a-H)，4.75(m,1H,OCH)，5.30(brs，，1H，C12-H),7.50~7.80(m，5H，ArH)，7.70~7.80(m，4H,ArH)AnalCsoH^NzOuSFound:(%)N3.34C66.69H7.02Calcd:(%)N3.llC66.64H7.16IV4與稀碳酸氫鈉溶液在室溫下攪拌可製得其鈉鹽。同法可製得R4代表Ph;X代表NH的其它IV類化合物。實施例7通式I~IV化合物對人HepG2細胞毒性試驗研究1.受試藥物1IV類目標化合物，以上化合物均溶於DMSO,濃度為0.01M。以UA作為陽性對照藥。細胞系HepG2cells(人肝癌細胞)2.實驗方法(1)取處於指數生長期狀態良好的細胞一瓶，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細胞脫落，計數24xl0"個/ml，製成細胞懸液。(2)取細胞懸液接種於96孔板上，100pl/孔，置恆溫C02培養箱中培養24小時。(3)加入受試藥物，lOOial/孔，培養48小時。(4)將MTT加入96孔板中，20^1/孔，培養箱中孵育4小時。(5)吸去上清液，加入DMSO，100pl/孔，平板床上振搖5分鐘。(6)用酶聯免疫檢測儀在波長為570nm處測定每孔的吸光值，並計算細胞抑制率。陰性對照組OD值-化合物組OD值細胞抑制率°/。=-xl00%陰性對照組OD值3.篩選結果不同濃度下樣品對HepG2抑制率(參見說明書附圖)_表l.不同濃度下部分樣品對HepG2抑制率(％)_^^抑制率(％)~IC5o編號，終^",1x10—4lx10—5lx10—6lx10—7(mol)_(mol/L)_■註標*的為活性化合物4.結論-(1)NO-供體對活性的影響通過對人HepG2細胞毒性試驗研究，發現在藥物濃度為lxlO"mol/L時，所測試化合物中，niIb，IViIV6顯示出明顯的細胞毒活性，均強於母體藥物UA(ICso值為4.1xl(T4mol/L)。而UA在該濃度下並未顯示出較強的細胞毒活性。提示上述UA衍生物所顯示的活性與NO供體部分密切相關。(2)供體類型對活性的影響I、n類化合物為硝酸酯類NO供體與UA偶聯所合成的衍生物，ni、IV類化合物為呋咱類NO供體與UA偶聯所合成的衍生物，其中n、IV類化合物活性較強，並且IV類化合物表現出了比其他化合物強得多的細胞毒活性，提示呋咱氮氧化物對抗腫瘤作用比較重要，且與偶聯後的分子整體結構有關。附圖部分目標物對HepG2細胞的毒性作用。tableseeoriginaldocumentpage14權利要求1.通式I化合物其中，R1代表H-，CF3CO-；R2代表-(CH2)n-，n＝2～8，-CH2CH＝CHCH2-，-CH2C≡CCH2-，-CH2-吡啶(2，6)-CH2-，-苯基(CH2)n-(鄰，間，對)，n＝1～4。2.通式II化合物■R3OR4ON02其中，R,代表H-，CF3CO-;R2代表H-，HO-，CH30-;R3代表-CO-，-CH=CHCO-;R4代表-(CH2)n-，n=2~8，-CH2CH=CHCH2-，-CH2OCCH2-，-CH2-卩比澱(2，6)-CH2-，-苯基(<:112)11-(鄰，間，對)，n=l~4。3.通式III化合物其中，R!代表H-,CF3CO-;R2代表H-，HO-,CH30-;R3代表-CO-，-CH=CHCO-;R4代表-(CH2)no-,n=i~6，-1苯基0-(間，對)，n=04;Rs代表苯基-，苯磺醯基-;X代表-O-，-NH-。4.通式IV化合物formulaseeoriginaldocumentpage3其中，Ri代表H-，C2H5-，苄基-，Na;R2代表-(CH2)2-，-CH=CH-，-苯基-(鄰)；R3代表-0(CH2)n-，n=l~6,-OCH2CH=CHCH2-，.OCH2CH2CH(CH3)-或-OCH2-苯基(CH2)n-(間、對)，.0-苯基(CH2)n-(間、對)，n=0~4;R4代表苯基-，苯磺醯基-;X代表-O-，-NH-。5.權利要求14任一項權利要求通式化合物在製備誘導肝腫瘤細胞凋亡藥物中的應用。6.權利要求5化合物在製備抗肝腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發明熊果酸衍生物為不同類型的一氧化氮(NO)供體通過連接基團，以酯鍵或醯胺鍵與具有抗腫瘤活性的熊果酸(UA)相偶聯而合成的NO供體型UA衍生物；體外初篩結果顯示數個化合物對HepG2細胞的毒性作用明顯強於UA，具有抗肝腫瘤的應用前景。文檔編號C07J63/00GK101613393SQ20091002721公開日2009年12月30日申請日期2009年5月25日優先權日2009年5月25日發明者文仇,蕾張,佳湯,湯偉彬,王志鳳,莉陳申請人:中國藥科大學