特異性靶向人類胚胎幹細胞的量子點－噬菌體複合物的製作方法

2023-06-28 21:22:06 2

專利名稱：特異性靶向人類胚胎幹細胞的量子點－噬菌體複合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種特異性靶向人類胚胎幹細胞的量子點一噬菌體複合物。
背景技術：
胚胎幹細胞(embryonic stem cell, ES)是研究胚胎早期發生、細胞增殖與分化及基因表達調控等發育生物學基礎研究的良好細胞模型系統，是細胞治療和組織工程的理想來源(Wobus AM, Boheler KR. Embryonic stem cells:prospects for developmentalbiology and cell therapy. Physiol Rev.2005，85:635-678 ;Vats A，Bielby RC, TolleyNS，Nerem R，Polak JM. Stem cells. Lancet. 2005，366:592-602.)，並可用於藥物篩選(Pouton CW, Haynes JM. Embryonic stem cells as a source of models for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2007，6:605-616)。近年來一直是生物學研究的熱點。ES細胞的高度自我更新能力和分化全能性是它區別於其它細胞的重要特徵。目前對0ct4、Nanog. Sox2等胞核內轉錄因子的大量研究揭示這些ES細胞特異性標誌分子對維持ES細胞的自我更新和分化的全能性發揮著重要的作用(Nichols J, Zevnik B，Anastassiadis K，et al. Formation of pluripotent stem cells in the mammalianembryo depends on the POU transcription factor 0ct4. Cell. 1998，95(3):379-391 ;Avilion AA，Nicolis SK,Pevny LH,et al. Multipotent cell lineages in early mousedevelopment depend on S0X2 function. Genes Dev. 2003，17 (I) : 126-140)。ES 細胞膜表面蛋白質則主要包括信號通路受體、黏附分子、轉運蛋白和蛋白水解酶類(Nunomura K etal. Cell Surface Labeling and Mass Spectrometry Reveal Diversity of Cell SurfaceMarkers and Signaling Molecules Expressed in Undifferentiated Mouse EmbryonicStem Cells. Mol Cell Proteomics. 2005，4:1968-1976. )，LIF、TGFb、BMP、FGF-PI3K 信號通路對ES細胞的自我更新起到重要作用(Rebecca Stewart，Miodrag Stojkovic andMajlinda Lako. Mechanisms of self-renewal in human embryonic stem cells.Eur JCancer. 2006，42:1257-1272)。這些研究鬥表明ES細胞表面特異性標誌分子可通過介導外源信號來調節ES細胞的增殖和分化行為。由於目前發現的ES細胞標誌分子數量有限，而且與其他的成體幹細胞或腫瘤細胞有共同的表達，因此更多更特異的ES細胞標誌分子仍有待發現。釆用有效的手段發現特異性的、新的細胞表面標誌物對於研究幹細胞保持自我更新和分化的信號通路、實現細胞增殖、定向誘導分化具有重要意義，並將有助於ES細胞的鑑定、分離純化、質量控制，加快ES的基礎研究和臨床應用。目前國際上對ES細胞表面特異性標誌分子的研究現主要釆用蛋白質組學技術進行(Adewumi，0.，et al. Characterization of human embryonic stem cell lines bythe International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 2007. 25(7) :803-816 ；Dai,B. and T. P. Rasmussen. Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stemcells from differentiated cells. Stem Cells，2007. 25(10) :2567-2574 ;Shin，S.，etal. Whole genome analysis of human neural stem cells derived from embryonicstem cells and stem and progenitor cells isolated from fetal tissue. StemCells. 2007. 25(5) :1298-1306 ；3.Wang, D. and L. Gao. Proteomic analysis of neuraldifferentiation of mouse embryonic stem cells.Proteomics. 2005. 5(17):4414-4426.)。由於ES細胞膜表面標誌分子豐度低，其細胞免疫原性差，難於採用傳統的單克隆抗體技術來獲得特異抗體。蛋白組學採用二維電泳結合質譜技術雖可高通量篩選ES細胞標誌分子，但其結果還需要進一步驗證，其方法本身也較為費時費力和價格昂貴。2007年國際幹細胞研究所對全球17個實驗室的59株人ES細胞的基因表達研究表明這些細胞株之間存在差異(Adewumi, 0. , et al. Characterization of human embryonic stem cell linesby the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 2007. 25(7):803-816)，很多研究均表明ES細胞具有群體異質性，不同的培養條件會有不同的特異性標誌分子的異質表達，加之ES細胞膜蛋白的提取相對困難，豐度低及疏水性使得不易用質譜分析這些蛋白；這些因素使得目前發現的ES細胞表面標誌分子數量及其功能研究較為有限。噬菌體展示技術是一項簡單、成熟的，能夠將所需性質的多肽從具有大量變 異體的集落中提取出來的高效篩選技術。自從Smith首次闡述該方法以來(Smith,G. P. Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display clonedantigens on the virion surface. Science. 1985. 228 (4705) : 1315-1317.)，嗷菌體展示技術已經發展成為了一種發現新特性多肽以及改變已有多肽性質的強大工具(15.Barry, M. A.，W. J. Dower, and S. A. Johnston. Toward cell-targeting gene therapyvectors:Selection of cell-binding peptides from random peptide-presenting phagelibraries. Nature Medicine. 1996. 2(3) :299-305 ；16. Paschke，M. Phage display systemsand their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 2006. 70(1):2-11 ；17. Petty, N. K.，et al. Biotechnological exploitation of bacteriophage research.Trends in Biotechnology. 2007. 25(1) :7-15. )□傳統的篩選方法多釆用純化抗原或重組抗原進行固相篩選，而篩選未知分子卻是許多研究工作所需要的，因此近年來使用噬菌體展示技術直接對細胞進行篩選發展非常迅速。釆用細胞篩選不需要預先知道細胞表面相關分子信息，直接用細胞進行篩選可保留其膜表面分子的原初信息，並更為真實地模擬配體和受體間的結合狀態。但由於細胞膜表面成分及其複雜，而所需要篩選的膜表面抗原往往又豐度低、免疫原性差，容易導致噬菌體的非特異結合，使得用細胞進行篩選難度較大。近年來發展的扣除篩選法，即用陰性細胞先行進行篩選，以去除非特異結合的噬菌體，再用陽性細胞進行多輪富集篩選即可較好地解決這類問題。在噬菌體展示技術用於篩選幹細胞表面特異性標誌分子方面，已經有報導將噬菌體展示技術應用到對單一的成體幹細胞進行篩選，獲得了許多特異性的，功能性的多肽(Nowakowski, G. S., et al. A specific heptapeptide from a phage display peptidelibrary homes to bone marrow and binds to primitive hematopoietic stem cells.Stem Cells.2004. 22 (6):1030—1038 ; 19.Letchford，J.，et al.Isolation of C 15:Anovel antibody generated against mesenchymal stem cell-enriched adult humanmarrow. Journal of Immunological Methods. 2006. 308(1-2) :124-137 ;20.Morita，Y.，etal. Selection and properties for the recognition of P19embryonic carcinoma stemcells. Biotechnology Progress. 2006. 22(4) :974-978)，但將嗷菌體庫篩選技術應用到人類胚胎幹細胞以及胚胎幹細胞分化的研究中尚未見報導。在幹細胞及其它細胞生物學涉及細胞信號轉導研究，膜蛋白配體受體研究，利用表面特殊標識分子進行定位、鑑定、分離篩選等方面的工作時，均需要藉助相應的生物探針。其中基於特異性靶蛋白導向的螢光細胞影像分析是目前使用最為廣泛的技術手段。在突光生物標記技術中日益廣泛使用的材料「量子點(Quantum Dots,QDs)」，尤其是低毒、高效的新型量子點材料，可謂是螢光探針中的佼佼者(Wang，F. , etal.，Luminescent nanomaterials for biological labelling. Nanotechnology,2006. 17:p. Rl ；Jamieson, T.，et al.，Biological applications of quantum dots. Biom aterials, 2007. 28(31) :p. 4717-4732.)。量子點是由數目極少的原子或分子組成的原子或原子團簇。主要由主族irVI如CdSe、Iirv如InP、InAs和GaSe副族化合物以及Si等元素組成，特別是irvi和nrv副族化合物。由於光譜禁阻的影響，當這些半導體納米晶體的直徑小於其玻爾直徑(一般小於IOnm)時，這些小的半導體納米晶體就會表現出量子特性(類似箱中運動的粒子)，當半導體納米粒子的尺寸在5 10nm時，由於電子波函數的量子限制效應，半導體納米粒子能帶的有效帶隙隨粒子的半徑減小而增加，導致吸收光譜和螢光光譜的藍移，光譜性質主要取決於其半徑大小而與組成無關(Bruchez，M.，etal. , Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science, 1998.281 (5385):p. 2013-2016 ；Mardyani, S. , et al. , Interfacing peptides, identifiedusing phage-display screening, with quantum dots for the design of nanoprobes.Nanobiophotonics and Biomedical Applications 11,2005.5705: p. 217-224;Alivisatos, A. P. , Semiconductor clusters, nanocrystals, and quantum dots.Science, 1996. 271 (5251) :p. 933-937.)。傳統上這些材料多應用於平面顯示器、光電子元件、量子點雷射器等技術領域，直到1998年伯克利大學的Alivisatos (Bruchez Jr, M. , etal. , Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science, 1998.281 (5385) :p. 2013-2016)的小組提出量子點可用在生物標記，這一發現開始了量子點在生物技術中應用的序幕。作為新型的螢光標記物，量子點的優點主要體現在以下幾個方面I) QDs是無機半導體材料，體積小，適合生物體，細胞的標記。2)單色性好、發光效率高、不易被光漂白；所得到的螢光圖像清晰度好。3)對激發光源要求低，普通特定波長的LED即可；激發光源波長範圍較寬(紫外到藍光範圍均可)。4)不同粒徑的QDs，用同一波長光源均可激發，可同時呈現多色影像，能對多個不同標記物質同時進行成像分析。自從 Smith (Smith, G. P. , Filamentous fusion phage : novelexpression vectors that display cloned antigens on the virion surface.Science, 1985. 228(4705) :p. 1315-7)首次闡述噬菌體展示技術以來，該方法已經發展成為了一種發現新特性多肽或抗體以及改變已知多肽性質的有效手段。其中，對於篩選得到的特異肽段需要進行相應的螢光標記，從而對篩選結果做出確認。比較普遍的做法是生物素化篩選得到的多肽片段，再用親和素偶聯螢光素探針進行標記。這樣的方式存在下面幾個問題
I)篩選得到的肽段需要測序、量化合成，方可進行生物素標記。帶來了觀察、確認與細胞培養進程的滯後。2)由於引入了生物素-親和素體系，加上本身標記用螢光材料的理化性質，增加了標記反應的非特異性。帶來了降低標記反應本底的麻煩。3)標記用的螢光素都是一些常見的有機螢光染料，如0￥3，0￥5，？11'(，羅丹明，等。分子量大，穩定性不高，伴有「光漂白」現象，一次標記反應完成後，無法進行連續、實時的觀測。4)如果需要進行多靶標同時標記，不但需要單獨完成每一組「生物素-親和素」標記，徹底洗脫後，再進行其它位點標記。而且，往往不同的螢光素可能需要使用不同波長和強度的激發光源，觀測時，需要切換不同的光路通道，最後進行圖層疊加才能得到同一細胞視野中多色標記的圖像。增加了顯微成像的操作難度。5)螢光素標記材料本身的螢光強度所限，發射光半峰寬都較寬，最終螢光影響 銳度較低。而且多色標記時發射光容易疊加，形成幹擾雜色區域，不利於對目標位點進行準確分析。由於噬菌體穩定易保存，易擴增等的特點，已經有一些研究小組利用螢光標記卩遼菌體來檢測細菌(Mosier-Boss, P. A.，et al. , Use of f luorescently labeledphage in the detection and identification of bacterial species. Appl Spectrosc, 2003. 57(9) :p. 1138-44.)，化學改造噬菌體來標記癌細胞(Li, K.，et al.，Chemicalmodification of M13bacteriophage and its application in cancer cell imaging.Bioconjug Chem, 2010. 21 (7) :p. 1369-77.)，利用噬菌體納米材料複合物，如膠體金一噬菌體複合物來進行細菌的檢測(Edgar, R.，et al.，High-sensitivity bacterial detectionusing biotin-tagged phage and quantum-dot nanocomplexes. Proc Natl Acad SciU S A, 2006. 103(13) :p. 4841-5.)，利用量子點標記噬菌體來檢測細菌(Yim，P. B.，etal. , Quantitative characterization of quantum dot-labeled lambda phage forEscherichia coli detection. Biotechnol Bioeng, 2009. 104(6) :p. 1059-67.),但利用偶聯的方法來獲取胚胎幹細胞特異性的噬菌體一量子點複合物，並用在幹細胞檢測中尚未見報導。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種特異性靶向人類胚胎幹細胞的量子點一噬菌體複合物，是將量子點與攜帶特異性靶向人類胚胎幹細胞的外源多肽的噬菌體偶聯獲得的複合物。所述攜帶特異性靶向人類胚胎幹細胞的外源多肽的噬菌體為次要包膜蛋白pill的N端連接有外源多肽的Ml3單鏈噬菌體。所述特異性靶向人類胚胎幹細胞的外源多肽的大小為12個胺基酸殘基；所述攜帶特異性靶向人類胚胎幹細胞的外源多肽的噬菌體為通過Ph. D. -12噬菌體肽庫篩選獲得的含有特異性靶向人類胚胎幹細胞的噬菌體克隆；所述篩選使用人類胚胎幹細胞系X-Oi篩選；所述篩選的方法包括I)負篩將Ph. D. -12噬菌體肽庫先加入到自由分化的人類胚胎幹細胞系X-Ol細胞懸浮液中，晃動使噬菌體與自由分化的人類胚胎幹細胞系X-Oi充分結合，然後離心獲得含有未結合噬菌體的上清液，將上清液加入到P3輻照處理過的小鼠成纖維細胞PMEFsCF-1中，晃動使噬菌體與P3輻照處理過的小鼠成纖維細胞PMEFsCF-1充分結合，獲得含未結合噬菌體的上清液；2)正篩將步驟I)獲得的上清液轉入人類胚胎幹細胞系X-Ol懸浮液中，晃動使噬菌體與人類胚胎幹細胞系X-Oi充分結合，收集人類胚胎幹細胞系X-01，然後用含終質量百分濃度為3%的BSA和終質量百分濃度為0. 1%的Tween-20的pH7. 4的PBS洗滌細胞，然後用含0. IM glycine-HCl，終質量百分濃度為0. 1%的BSA，pH 2. 2的溶液洗脫，獲得含有特異性靶向人類胚胎幹細胞的噬菌體。所述外源多肽的胺基酸殘基序列為序列表中序列I所示的胺基酸殘基序列。所述量子點為激發波長為580nm，ZnS殼包被CdSe核，並用羧基修飾的量子點；所述量子點與攜帶特異性靶向人類胚胎幹細胞的外源多肽的噬菌體之間的偶聯是通過羧基 與外源多肽的NH2連接。本發明還提供的特異性靶向人類胚胎幹細胞的肽段，其胺基酸殘基序列為序列表中序列I所示的胺基酸殘基序列。上述特異性靶向人類胚胎幹細胞的肽段的編碼核苷酸片段。所述編碼核苷酸片段的序列為序列表中序列2所示的核苷酸序列。本發明通過對噬菌體庫的篩選，獲得攜帶特異性靶向胚胎幹細胞的肽段的噬菌體，實驗證明，該肽段可以與胚胎幹細胞特異性結合，將該攜帶特異性靶向胚胎幹細胞的肽段的噬菌體與量子點進行偶聯，獲得特異性靶向胚胎幹細胞的噬菌體和量子點的複合物，本發明的肽段或其編碼基因以及特異性靶向人類胚胎幹細胞的量子點與噬菌體的複合物可以用於胚胎幹細胞的識別，標記，分選和藥物靶向中的應用。


圖I為篩選與製備方法總覽圖2為人類胚胎幹細胞的培養及AP (鹼性磷酸酶)鑑定圖3為噬菌體克隆(可展示本發明特異性靶向人類胚胎幹細胞的胺基酸肽段的噬菌體)的ELISA檢測結果圖4為噬菌體克隆(可展示本發明特異性靶向人類胚胎幹細胞的胺基酸肽段的噬菌體)的免疫螢光檢測檢測結果。圖5為量子點的選擇和偶聯示意圖。圖6為噬菌體一量子點複合物電鏡檢測,黑色小點為量子點。圖7為噬菌體一量子點複合物標記胚胎幹細胞的螢光檢測結果圖，圖中a為序列I所示多肽的標記胚胎幹細胞的螢光檢測，b為噬菌體一量子點複合物標記胚胎幹細胞的螢光檢測，c為FITC標記的噬菌體，d為量子點標記M13噬菌體(對照)。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑商店購買得到的。實施例I、特異性靶向人類胚胎幹細胞的胺基酸序列的篩選特異性靶向人類胚胎幹細胞的胺基酸肽段的篩選流程圖如圖I所示，為了除去非特異性的多肽，本實驗用自由分化的人類胚胎幹細胞作為負篩材料，除去那些非特異性的噬菌體多肽，然後再用未分化的胚胎幹細胞作為正篩材料，得到能與其特異性結合的多肽。具體步驟如下所述I、細胞的培養和準備正向篩選細胞懸浮液的製備人類胚胎幹細胞系X-01(中國科學院幹細胞庫(StemCell Bank, ChineseAcademy ofSciences)贈送)培養於P3福照處理過的小鼠成纖維細胞(PMEFsCF-1)(簡稱CF-I細胞，上海斯丹賽生物技術有限公司，貨號0303-200)上。培養用培養基為含體積百分含量為79%DMEM(Hycl0ne，Logan，紐西蘭)，體積百 分含量 1% 的非必需胺基酸(nonessential amino acid, Gibco BRL，USA 美國),ImM L-穀氨醯胺(Gibco BRL,美國)，4ng/L bFGF (Invitrogen,廣州)，0. ImM b-mercaptoethanol (Amresco, Solon, Ohio美國)，和體積百分含量為20%血清替代物(KSR) (Gibco BRL，美國)的培養基，培養時間為14天(復甦後第一代)，傳代後培養8天。AP (鹼性磷酸酶)檢測採用Alkaline Phosphatase Detection Kit (milipore, German 德國)。AP (鹼性磷酸酶)檢測的結果如圖2所示，兩個孔均為胚胎幹細胞克隆，紅色的顯示結果表明胚胎幹細胞AP結果為陽性，幹細胞生長狀況正常，圖2中，ES為復甦後第7天的胚胎幹細胞，平鋪細胞為滋養層CF-I細胞，聚團克隆為胚胎幹細胞，由形態學可以看出，胚胎幹細胞克隆緊湊生長，有清晰的邊緣，生長情況正常。dES為分化後的人類胚胎幹細胞，細胞為鋪散狀態，失去清晰邊緣。在使用噬菌體展示肽庫篩選之前，胚胎幹細胞用0. 5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化，用磷酸緩衝液(PBS, pH7. 4)洗兩次,然後懸浮於封閉液中(含終質量百分含量為3%FBS於PH7. 4的PBS中)，得到的細胞懸浮液用於做正向篩選。負向篩選細胞懸浮液的製備負向篩選使用自有分化的胚胎幹細胞X-Ol和P3輻照處理過的小鼠成纖維細胞PMEFsCF-1。這兩種細胞懸浮液的製備方法如下所述將上述培養胚胎幹細胞X-Ol形成克隆的核心挑除，留存周圍胚胎幹細胞，用胎牛血清培養基(培養基成分為由體積百分含量為10%胎牛血清(Gibco BRL，美國)和體積百分含量為90%DMEM(HyClOne，Logan，紐西蘭)組成的培養基)，連續培養20天直至細胞失去胚胎幹細胞特徵，用於做負向篩選的分化後胚胎幹細胞，將分化後胚胎幹細胞也用0. 5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化並懸浮於封閉液中。小鼠成纖維細胞(PMEFsCF-1)用胎牛血清培養基(培養基成分為由體積百分含量為10%胎牛血清(Gibco BRL，美國)和體積百分含量為90%DMEM(Hyclone，Logan,紐西蘭)組成的培養基)培養後，用0. 5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化並懸浮於封閉液中。2、噬菌體肽庫篩選本實施例所用的噬菌體庫是Ph. D. -12噬菌體展示肽庫試劑盒中的Ph. D. -12噬菌體展示肽庫，該試劑盒購自NEW ENGLAND BI0-LABS,美國，該試劑盒中Ph. D.-12噬菌體展示肽庫使用的噬菌體載體為M13單鏈噬菌體，肽庫表達的隨機肽均在噬菌體次要包膜蛋白PlII的N端。M13噬菌體是絲狀噬菌體，是一種溫和型噬菌體，不裂解宿主菌，成熟的噬菌體可分泌到培養基中，通過離心收集培養上清，再向其中加入沉澱劑即可將上清中大量噬菌體粒子沉澱下來，從而富集得到含外源基因產物的重組噬菌體。採用負篩/正篩的方法來進行篩選，具體包括下述步驟I)負篩接近 I. 56 X IO11 的噬菌體(Ph.D.-12 噬菌體肽庫，NEW ENGLANDBIO-LABS,美國)被加入到Iml的懸浮的上述用作負向篩選的分化的人類胚胎幹細胞懸浮液中，在室溫中輕微晃動I小時，3000rpm離心3分鐘。上清液中含有沒有結合分化細胞的噬菌體，將上清液轉入P3輻照處理過的小鼠成纖維細胞PMEFsCF-1懸浮液中，室溫輕微晃動I小時，3000rpm離心3分鐘，收集上清液。2)正篩將步驟I)獲得的上清轉入步驟I製備的人類胚胎幹細胞系X-Ol懸浮液中，室溫輕微晃動I. 5小時，棄上清，所獲細胞與噬菌體的混合物用洗脫液I (含終質量百分濃度為3%的BSA和終質量百分濃度為0. 1%的Tween-20的pH7. 4的PBS)洗5次。接下來用I. 6ml洗脫液2 (含0. IM glycine-HCl，終質量百分濃度為0. 1%的BSA，pH 2. 2的溶液)洗脫與細胞結合的噬菌體，然後加入0. 3ml中和液(pH 9. 1,1M Tris-HCl溶液)，目標噬菌體即在液體中。3)將上述所獲噬菌體於宿主細菌大腸桿菌ER2738 (Ph. D. -12噬菌體展示肽庫試劑盒中提供)中擴增後並進行滴定計數。通過2輪與上述步驟I)和步驟2)同樣的篩選，計算每一輪的噬菌體得率。噬菌體得率(Phage yield rate)=篩選後噬菌體量/加入噬菌體量表I.兩輪篩選後噬菌體的得率
權利要求
1.一種特異性靶向人類胚胎幹細胞的量子點一噬菌體複合物，是將量子點與攜帶特異性靶向人類胚胎幹細胞的外源多肽的噬菌體偶聯獲得的複合物。
2.根據權利要求I所述的量子點一噬菌體複合物，其特徵在於所述攜帶特異性靶向人類胚胎幹細胞的外源多肽的噬菌體為次要包膜蛋白PlII的N端連接有外源多肽的M13單鏈噬菌體。
3.根據權利要求I所述的量子點一噬菌體複合物，其特徵在於所述特異性靶向人類胚胎幹細胞的外源多肽的大小為12個胺基酸殘基； 和/或，所述攜帶特異性靶向人類胚胎幹細胞的外源多肽的噬菌體為通過Ph. D. -12噬 菌體肽庫篩選獲得的含有特異性靶向人類胚胎幹細胞的噬菌體克隆；所述篩選使用人類胚胎幹細胞系X-Ol篩選； 和/或，所述篩選的方法包括 1)負篩將Ph.D. -12噬菌體肽庫先加入到自由分化的人類胚胎幹細胞系X-Ol細胞懸浮液中，晃動使噬菌體與自由分化的人類胚胎幹細胞系X-Ol充分結合，然後離心獲得含有未結合噬菌體的上清液，將上清液加入到P3輻照處理過的小鼠成纖維細胞PMEFsCF-1中，晃動使噬菌體與P3輻照處理過的小鼠成纖維細胞PMEFsCF-1充分結合，獲得含未結合噬菌體的上清液； 2)正篩將步驟I)獲得的上清液轉入人類胚胎幹細胞系X-Ol懸浮液中，晃動使噬菌體與人類胚胎幹細胞系X-Ol充分結合，收集人類胚胎幹細胞系X-01，然後用含終質量百分濃度為3%的BSA和終質量百分濃度為0. 1%的Tween-20的pH7. 4的PBS洗滌細胞，然後用含0. IM glycine-HCl，終質量百分濃度為0. 1%的BSA，pH 2. 2的溶液洗脫，獲得含有特異性靶向人類胚胎幹細胞的噬菌體。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的複合物，其特徵在於所述外源多肽的胺基酸殘基序列為序列表中序列I所示的胺基酸殘基序列。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的複合物，其特徵在於所述量子點為激發波長為580nm，ZnS殼包被CdSe核，並用羥基或羧基修飾的量子點；所述量子點與攜帶特異性靶向人類胚胎幹細胞的外源多肽的噬菌體之間的偶聯是通過羥基或羧基與外源多肽的NH2連接。
6.一種特異性靶向人類胚胎幹細胞的肽段，其胺基酸殘基序列為序列表中序列I所示的胺基酸殘基序列。
7.權利要求I所述特異性靶向人類胚胎幹細胞的肽段的編碼核苷酸片段。
8.根據權利要求2所述的編碼序列，其特徵在於所述編碼核苷酸片段的序列為序列表中序列2所示的核苷酸序列。
9.權利要求6所述的肽段或其編碼基因在製備人類胚胎幹細胞的識別和/或標記和/或分選和/或藥物靶向的產品中的應用。
10.權利要求1-5中任意一項所述特異性靶向人類胚胎幹細胞的量子點與噬菌體的複合物在製備用於胚胎幹細胞的識別和/或標記和/或分選和/或藥物靶向的產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種特異性靶向人類胚胎幹細胞的量子點－噬菌體複合物。該複合物，是量子點與攜帶外源多肽的噬菌體的複合物；所述外源多肽的胺基酸殘基序列為序列表中序列1所示的胺基酸殘基序列。本發明的特異性靶向人類胚胎幹細胞的量子點－噬菌體複合物可以用於胚胎幹細胞的標記和分選。
文檔編號C12Q1/02GK102731622SQ20121018595
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月7日 優先權日2012年6月7日
發明者袁航, 趙文秀, 馬嵐 申請人:清華大學深圳研究生院