利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法

2023-06-28 09:49:51

專利名稱：：利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法
技術領域：
：本發明涉及利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法。
背景技術：
：馬鈴薯是世界上產量僅次於小麥、玉米和水稻的第四大糧食作物，其單位面積單位時間的產量高於前三種作物。馬鈴薯糧菜兼用，營養豐富，聯合國充分肯定了馬鈴薯在確保世界糧食安全和消除貧困中起的重大作用，並確定2008年為"國際馬鈴薯年"。但病毒侵染一直是導致馬鈴薯品種退化的主要因素，嚴重影響馬鈴薯的產量和品質。傳統的育種方式已經不能滿足馬鈴薯生產的需要，不能從根本上長期解決馬鈴薯病毒害問題。近年來，隨著基因工程的迅速發展和轉基因技術體系的日益完善，基因工程技術在提高馬鈴薯抗病性方面(尤其是抗病毒)顯示了極大的潛力，必將成為馬鈴薯抗病毒育種的主要手段。由於馬鈴薯是同源四倍體作物，用常規的方法去改良品種非常緩慢，一般育成一個品種至少需要8IO年，因此病毒病就成為馬鈴薯生產育種中一個非常棘手的問題。而傳統的控制和防治病毒的方法有莖尖脫毒組織培養和農藥噴施，其中莖尖脫毒組織培養技術有其成本高、受檢測條件制約、脫毒後栽培後易再感染病毒以及品種變異等局限性，而農藥噴施又嚴重汙染環境，所以這兩種方法都不能有效的解決馬鈴薯病毒害問題。Hamilton於20世紀80年代初首先提出了基因工程保護的設想，在轉基因植物中表達病毒基因組序列可能是防禦病毒侵染的途徑之一。於是1988年出現第一例成功抗PVX(馬鈴薯X病毒)轉基因馬鈴薯，使得以後的20年間馬鈴薯抗病毒基因工程研究在廣度和深度上都進展迅速，為防治馬鈴薯病毒病開闢了新途徑。儘管在馬鈴薯抗病毒基因工程中，轉基因的技術和方法已經進行了多次的改進和完善，轉入的抗病目的基因也在朝多樣化發展，國內外實驗研究也取得了很多可喜的成績，但還是存在一些問題亟待解決①在各種實驗報導中，農桿菌介導轉化馬鈴薯的體系都相對獨立，目前對大多數馬鈴薯品種和不同的外植體還沒有一個普遍適合的轉化模式，因此還需要研究者通過實驗去進一步優化篩選。②高抗病毒馬鈴薯植株再生率較低且不穩定，不同的研究報告中使用的轉化體系標準以及方法均不相同，這就讓其他研究者很難進行對比分析以及評價借鑑。③目前採取農桿菌介導轉化馬鈴薯的過程中，大多在導入目的基因的同時也導入了抗生素抗性基因，這種選擇標記在轉化過程中有可能會轉移到其他生物如微生物或馬鈴薯植株體內。④現今的許多實驗研究中導入的異源基因即病毒基因作為轉化馬鈴薯的抗病毒基因，這些來源病毒的基因有的具有一定的潛在危險性，如CP基因的異源包殼現象，轉病毒基因的馬鈴薯植株體內易發生與病毒RNA重組可能會產生新的病毒，病毒基因RNA產生突變等等從而引起生物安全性問題。目前很少有人用非病毒基因(如植物基因)轉化馬鈴薯。隨著分子生物學技術的快速發展，人們已經分離克隆出了一些植物抗病基因，尤其是與馬鈴薯親緣關係很近的茄科作物，如已經從番茄染色體上分離並克隆出來已經鑑定具有抗病毒能力的Tm-l、Tm-2以及Tm-f等基因。因為同源基因來源於作物本身或與之親源關係近的種，這樣可以排除環境風險和食用安全風險。同源轉基因的馬鈴薯更容易被公眾接受，將極可能會成為轉基因產業的一個突破口。在未來的馬鈴薯抗病毒基因工程研究中，轉入非病毒來源基因、設計RNA介導的抗病毒路線，並採取複合基因策略，以獲得具有廣譜病毒抗性並且對環境及食用的安全的高抗病毒馬鈴薯植株，必將是當前和將來的發展趨勢。
發明內容有鑑於此，本發明的目的是提供一種利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，根據已知番茄抗病基因Tm-22抗病機理及其對病毒(如TMV、ToMV等)的高抗特性，利用番茄與馬鈴薯親緣關係較近特點，採用基因工程技術將Tm-22基因轉入馬鈴薯，並通過篩選、鑑定已表達Tm-f基因的高抗病毒馬鈴薯植株，提高馬鈴薯植株對常見病毒的抗性，同時避免環境風險及食用安全風險。本發明的利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，包括如下步驟(1)製取番茄抗病基因Tm-22;根據番茄抗病基因Tm-22的序列設計兩對特異性引物並在上遊引物5'端加上限制性內切酶酶切位點，然後提取番茄RNA並分別以兩對特異性引物進行RT-PCR擴增，得到Tm-22基因前段和後段的擴增產物；將所得Tm-22基因前段和後段的擴增產物克隆入兩個pMD18-T載體，再進行酶切，酶切產物經純化後連接，得全長Tm-22基因DNA序列；(2)超表達載體的構建提取全長Tm-22片段並克隆到含CaMV35S啟動子和終止子的pDH51載體中，得pDH51-Tm-22質粒，酶切pDH51-Tm-22質粒並將所得片段克隆到pBIN19載體，得超表達雙元載體pBIN19-Tm-22;(3)農桿菌的侵染轉化將經過預培養獲得的馬鈴薯外植體置於含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌的菌液中浸染並經共培養、誘導生芽及選擇性生根培養，得轉基因馬鈴薯植株；(4)轉基因植株的檢測採用PCR、RT-PCR檢測方法從所得轉基因馬鈴薯植株中篩選陽性植株，所得陽性植株經活體抗病性接種鑑定獲得抗病性高抗病毒馬鈴薯植株。進一步，步驟(3)所述馬鈴薯外植體由以下步驟獲得a.將馬鈴薯脫毒試管苗單節段接種於培養基上，然後於溫度20士2t:、16h/d光周期和1000-20001x光照強度的條件下培養，所述培養基為MS培養基，培養基中包括的組分及相應組分在培養基中的質量分數分別為蔗糖3%、瓊脂0.6-0.8%，調節pH為5.8;b.待脫毒試管苗長至6-7個葉片後將生長健壯的馬鈴薯脫毒試管苗剪成1葉1節的莖段，將所述莖段接種至誘導固體培養基中並於20士2t:的全黑暗條件下誘導培養以獲得試管薯；c.所述試管薯切片，得馬鈴薯外植體；進一步，步驟b所述誘導固體培養基為MS培養基，誘導固體培養基中包括的組分及相應組分在誘導固體培養基中的質量分數分別為蔗糖8_10%，調節pH為5.8;進一步，所述誘導固體培養基還包括瓊脂和6-BA，瓊脂在誘導固體培養基中的質量分數為0.6%，6-BA在誘導固體培養基中的質量濃度為2mg/L;進一步，步驟(3)所述含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌的菌液按如下步驟製得①將含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌接種於YEB固體培養基中並於28士2t:條件下黑暗培養2-3d，得培養物；②按照0.01:1的體積比將所得培養物加入到YEB液體培養基中並培養至ODe。。為1.8-2.0後於4000-6000rpm條件下室溫離心並用新鮮YEB液體培養基重懸菌體，得菌懸液；③所得菌懸液於4000-6000rpm室溫離心後用MS鹽溶液重懸菌體，得含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌的菌液。所述YEB固體培養基包括的組分及相應組分在YEB固體培養基中的濃度分別為質量分數為1.5X的瓊脂、50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調節pH為7.0;所述YEB液體培養基包括的組分及相應組分在YEB液體培養基中的濃度分別為50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調節pH值為7.0;所述MS鹽溶液的pH為5.8;進一步，所述含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌菌液浸染時間為8-10min，所述共培養是將經過LBA4404農桿菌菌液浸染的馬鈴薯外植體於芽誘導培養基中在20士2t:下黑暗共培養2-3d，所述芽誘導培養基為MS培養基，芽誘導培養基中包括的組分及相應組分在芽誘導培養基中的濃度分別為質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8%的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA和0.5mg/L的BA，調節pH值為5.8;進一步，所述誘導生芽操作為將經過共培養的馬鈴薯外植體轉到抗性選擇培養基中，並在20-25t:光照16h、18-2(TC黑暗8h和1000-20001x光強的條件下培養直至抗性芽產生並形成新的植株，所述抗性選擇培養基為MS培養基，抗性選擇培養基中包括的組分及相應組分在選擇抗性培養基中的濃度分別為質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8%的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA、0.5mg/L的6-BA、500mg/L的CarB和65-80mg/L的Kan，調節pH值為5.8;所述選擇性生根培養操作為將經誘導生芽後形成的新的植株切段，再將所得莖段置於選擇生根培養基中於20-25。C光照16h、18-2(TC黑暗8h和1000-20001x光強的條件下培養並進行生根篩選，所述選擇生根培養基為MS培養基，選擇生根培養基中包括的組分及相應組分在選擇生根培養基中的濃度分別為質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8%的瓊脂、200mg/L的CarB和50mg/L的Kan，調節pH值為5.8;進一步，步驟(4)所述PCR和RT-PCR檢測方法包括如下步驟I根據超表達雙元載體pBIN19-Tm-22的NPTII報告基因序列設計特異性引物(F1、R1)，其序列如下Fl:5'-CTATGACTGGGCACAACAGACAAT-3'Rl:5'-CAATATCACGGGTAGCCAACG-3，；II將Tm-22與非轉基因馬鈴薯基因組進行對比，查找Tm-22中含有的與非轉基因馬鈴薯基因組同源性較低的片段區域，據此設計引物，其序列如下To-F:5'-CGCGCGTGTTATAGAGATTATGGAC-3'To-R:5'-ATAACCATTTGCCTCGCCCG-3'IIIPCR檢測分別提取所得轉基因馬鈴薯植株與非轉基因馬鈴薯植株的基因組DNA，然後以提取的DNA為模板，用所述特異性引物(F1、R1)(To-F、To-R)進行PCR擴增，得到目標帶後，分別連接pMD18-T載體並測序，篩選陽性植株；IVRT-PCR檢測分別提取步驟III所得陽性植株與野生型馬鈴薯植株的基因組RNA，用所述特異性引物(To-F、To-R)進行RT-PCR擴增，得到目標帶後，連接pMD18-T載體並測序，篩選陽性植株；進一步，步驟(1)所述特異性引物為兩對，分別為(TF2、TR2)和(T22F、T22R)，T22F引物的5'端加上限制性內切酶酶切位點(下劃線部位為限制性內切酶酶切位點)，其各自的序列如下TF2:5'-GCATGTTAAGGGCAAGAGAA-3'TR2:5'-GCGACAACTTGAAATTCTTCC-3'T22F:5，-GGATCCTTGGCCGTGGACTCCATCT-3'T22R:5'-GTCGACCACTACTACACTCACGTTGC—3'。本發明中各英文名稱的中文解釋如下6-BA為6-苄氨基嘌呤、Kan為卡那黴素、LSm為鏈黴素、Rif為利福平、IAA為吲哚乙酸、ZT為玉米素、CarB為羧苄青黴素、CaMV35S為花椰菜花葉病毒35S啟動子。本發明的有益效果是本發明的利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法具有如下優點1、根據已知番茄抗病基因Tm-22抗病機理及其功能，以及Tm_22轉化茄科植物菸草並對侵害茄科植物的病毒(如TMV、ToMV等)具高抗特性的報導，利用番茄與馬鈴薯親緣關係較近特點，採用基因工程技術將Tm-f基因轉入馬鈴薯，並篩選、鑑定已表達Tm-f基因的高抗病毒馬鈴薯植株，分析其對危害馬鈴薯常見病毒的抗性，得到具有較強病毒抗性的馬鈴薯植株，同時抗病毒譜廣。2、本發明利用與馬鈴薯親緣關係很近的番茄染色體上的Tm-22基因轉化馬鈴薯，排除了因病毒基因RNA重組或突變等給環境及食用帶來的風險，為馬鈴薯抗病的研究作出積極探索，有助於為外源抗病基因在馬鈴薯植株上成功表達提供參考。3、本發明方法提高了獲得試管薯的轉化效率。圖1及圖2為Tm-22基因的克隆流程圖；圖3和圖4為番茄總RNA經RT-PCR擴增後所得Tm_22基因前後兩段序列擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5為超表達雙元載體的構建流程圖6為pBIN19-Tm-22質粒PCR檢測結果圖；圖7為酶切pBIN19-Tm-22載體所得產物PCR檢測結果圖；圖8農杆工程菌浸染馬鈴薯外植體操作流程圖；圖9與圖10為鄂馬鈴薯3號轉基因植株與野生型馬鈴薯植株基因組DNA的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，圖9中l為野生型馬鈴薯株系對照，2為鄂馬鈴薯3號轉基因株系；圖10中1-4為鄂馬鈴薯3號轉基因株系，5-6為野生型馬鈴薯株系對照)；圖11為經PCR檢測所得鄂馬鈴薯3號轉基因陽性植株與野生型馬鈴薯植株的基因組RNA的RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，1-6為鄂馬鈴薯3號轉基因陽性株系，7-12為野生型馬鈴薯株系對照。具體實施例方式以下將結合附圖對本發明的優選實施例進行詳細的描述。應當理解，優選實施例僅為了說明本發明，而不是為了限制本發明的保護範圍。優選實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。供試材料番茄KBV品系幼葉、鄂馬鈴薯3號脫毒苗(重慶市脫毒種薯育種中心提供)。質粒pGEM-TEasyVector(Promega)，pDH51(攜帶CaMV35S啟動子和終止子)，pBIN19等由本實驗室保存。菌株大腸桿菌JM109由本實驗室保存試劑TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑盒、5-Fu11RACECoreSet試劑盒、限制性內切酶、Taq酶等購自大連TaKaRa公司；超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)為TIANGEN公司產品；X-gal和IPTG購自北京賽百勝公司；其餘試劑均為進口或國產分析純試劑。1、Tm-22基因的克隆，克隆流程如圖1和圖2;1.1引物設計根據已報導的番茄抗病毒的抗性基因Tm_22(AF536201)的序列設計兩對特異性引物，分別為(TF2、TR2)和(T22F、T22R)，在T22F引物的5'端加上BamHI酶切位點(下劃線部位)，三對特異性引物的序列如下①TF2:5'-GCATGTTAAGGGCAAGAGAA-3'②TR2:5'-GCGACAACTTGAAATTCTTCC-3，③T22F:5'-GGATCCTTGGCCGTGGACTCCATCT-3'④T22R:5，-GTCGACCACTACTACACTCACGTTGC—3'1.2RT-PCR①以KBV品系番茄幼葉總RNA為模板，根據TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0操作說明進行第一鏈cDNA的合成；②以cDNA第一鏈為模板，分別以特異性引物(T22F、TR2)和(TF2、T22R)進行PCR擴增，PCR產物採用瓊脂糖凝膠電泳鑑定，得大小為1321bp和1502bp的擴增片段，分別如圖3和圖4。反應體系如表1:表1tableseeoriginaldocumentpage10針對(T22F、TR2)和(TF2、T22R)的PCR擴增循環參數均為94"預變性4min;94°C變性30s，56。C退火30s，72。C延伸2min，共35個循環；72終延伸3min，結束PCR擴增。③PCR產物的回收和純化採用超薄/普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)(TIANGEN公司產品)按說明書操作。④重組質粒的轉化及鑑定，操作如下，將步驟③所得純化產物與pGEM⑧-TEasyVector連接，用大腸桿菌JM109感受態細胞進行轉化實驗，藍白斑篩選陽性克隆，然後用M13引物(英濰捷基(上海)貿易有限公司產品)進行單菌落PCR檢測，陽性重組子由英濰捷基(上海)貿易有限公司測序鑑定。1.3全長Tm-22基因片段的拼接測序驗證正確的擴增片段分別為1321bp和1502bp，其中1321bp的cDNA序列通過RACE使其5'端加上Pstl酶切位點，然後將兩個擴增片段連入pGEM⑧-TEasyVector載體，記為pMD18-Tm-f，用大腸桿菌JM109感受態細胞進行轉化實驗，藍白斑篩選陽性克隆。2、超表達雙元載體的構建2.1具體操作BamHI酶切pMD18-Tm-22質粒和含CaMV35S啟動子及終止子的空載體pDH51，將所得全長Tm-22片段導入pDH51中得到過渡質粒載體pDH51-Tm-22，然後再用EcoRI酶切質粒載體pDH51-Tm-22(所得片段包含CaMV35S啟動子，Tm_22片段和CaMV35S終止子)並克隆到表達載體pBIN19，獲得超表達雙元載體pBIN19-Tm-2^其流程如圖5。2.2結果的驗證EcoRI酶切pBIN19-Tm-22載體結果出現llOOObp左右和3400bp左右的2條電泳帶，如圖7;用M13通用引物以pBIN19-Tm-22質粒為模板進行PCR擴增，電泳結果出現3400bp左右的電泳帶，如圖6，證明結果與理論相符合。3、農桿菌的侵染轉化本步驟中轉接入誘導培養基的馬鈴薯莖段不經過光照培養直接進行黑暗處理，使短時間內能夠誘導出試管薯，因塊莖傷口面積最大，所以感染能力強，而且塊莖易操作，可以不經過愈傷過程直接誘導成苗，在適宜的培養基上使試管薯獲得較高頻率的轉化再生芽。操作流程如圖8，操作步驟如下3.1馬鈴薯外植體製備①馬鈴薯脫毒苗的繼代增殖培養基採用MS培養基，培養基中包括的組分及相應組分在培養基中的質量分數分別為蔗糖3%和瓊脂0.6%，培養基滅菌前調整pH為5.8，滅菌後將培養基按20-25ml分裝於組培玻璃瓶中；分別將所述兩個品種的馬鈴薯脫毒試管苗單節段接種於培養基上，置於溫度20±2°C、16h/d光照條件和10001x光照強度的光溫培養箱中培養，基礎苗每四周繼代一次，本步驟中，MS培養基中瓊脂的質量分數為O.6-0.8%、光照強度可以為1000-20001x均可。②試管薯的誘導待脫毒試管苗長至約6-7個葉片時，將生長健壯、來源一致的馬鈴薯脫毒試管苗剪成1葉1節的莖段，無菌條件下將每個品種的莖段分別接種至裝有25ml誘導固體培養基的培養皿中，每培養皿10-15個莖段，將接種後的培養皿置於20士2t:全黑暗條件下直接誘導結薯，得試管薯，所述誘導固體培養基為MS培養基，誘導固體培養基中包括的組分及相應組分在誘導固體培養基中的濃度分別為質量分數為10%的蔗糖、質量分數為0.6%的瓊脂，調節pH為5.8;本步驟所述的誘導固體培養基中，蔗糖質量分數在8-10%均可，同時還可添加6-BA，6-BA在誘導固體培養基中的濃度2mg/L即可，表2為誘導固體培養基單獨添加6-BA和KT後試管薯誘導率差異；表2分別對培養基中添加激素6-BA和KT後試管薯誘導率的差異tableseeoriginaldocumentpage11③待所述兩個品種生長兩周後誘導出的試管薯切成0.5cm左右的薄片，即為所需的馬鈴薯外植體。3.2農桿菌介導的試管薯的轉化3.2.1含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌菌液的製備①將含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌接種於YEB固體培養基中並於28士2t:條件下黑暗培養2d，得培養物，本步驟所述黑暗培養在2-3d之間均可；②挑取單菌落在20mlYEB液體培養基培養2d後，按照0.01:l的體積比將所得培養物加入到YEB液體培養基中過夜擴大培養至0D6。。為1.8-2.0，然後6000rpm條件下室溫離心並再次用新鮮YEB液體培養基重懸菌體，得菌懸液，本步驟中，離心轉速為4000-6000rpm均可；③所得菌懸液於4000rpm室溫離心後用MS鹽溶液重懸菌體，得含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌菌液，本步驟中，離心轉速為4000-6000rpm均可；所述YEB固體培養基包括的組分及相應組分在YEB固體培養基中的濃度分別為質量分數為1.5X的瓊脂、50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調節pH為7.0;所述YEB液體培養基包括的組分及相應組分在YEB液體培養基中的濃度分別為50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調節pH值為7.0;所述MS鹽溶液的pH為5.8。因農桿菌的濃度首先影響其菌體在植物細胞上的附著，在一定範圍內菌液濃度越大附著率越高，轉化率越大，但超過了一定範圍之後會因為菌的毒害作用或生長過快等，使外植體受到農桿菌過度傷害而導致外植體切口褐化腐爛嚴重，且不利於共培養後去除農桿菌；較低的菌液濃度致使T-DNA不能有效地整合進植物細胞基因組，大大降低轉化效果；本發明所得的農桿菌菌液濃度適宜，能夠有效保證含有Tm-22基因質粒的轉化率。3.2.2馬鈴薯外植體的浸染將所得兩個個品種的馬鈴薯外植體浸於含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌菌液中10min;對於浸染時間，如果過短，農桿菌不能充分吸附細胞上，影響轉化；時間太長，外植體的傷口會褐化且農桿菌汙染嚴重並在後續實驗難以控制，本步驟中，浸泡時間在8-10min之間均可充分保障浸染效果。3.2.3共培養將浸染後的馬鈴薯外植體置於芽誘導培養基中並於20士2t:下黑暗共培養2d，所述芽誘導培養基為MS培養基，芽誘導培養基中包括的組分及相應組分在芽誘導培養基中的濃度分別為質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8X的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA和0.5mg/L的BA，調節pH值為5.8;共培養是影響轉化的重要因素，時間過長會使外植體會因農桿菌汙染而死亡，時間過短會導致農桿菌感染和DNA轉化不充分，從而降低轉化率，同時也會增加假轉化體的出現，本發明中共培養的適宜時間為2-3d。3.2.4誘導生芽分別將共培養後的馬鈴薯外植體轉到抗性選擇培養基中，並在25士2。C光照16h、18士2t:黑暗8h和10001x光強的條件下培養至抗性芽產生並形成新的植株，所述抗性選擇培養基為MS培養基，抗性選擇培養基中包括的組分及相應組分在選擇抗性培養基中的濃度分別為質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8X的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA、0.5mg/L的6-BA、500mg/L的CarB和75mg/L的Kan，調節pH值為5.8;本步驟中，20-25t:光照16h、18-2(rC黑暗8h和1000-20001x光強均為本發明所得馬鈴薯外植體的適宜培養條件，假陽性植株一般會出現不生長或者生長緩慢現象，僅陽性植株正常生長。激素是影響再生頻率的主要因素之一，不同的激素水平及激素的組合對誘導不同外植體愈傷和出芽的影響不同，由於馬鈴薯苗對卡那黴素(Kan)很敏感，Kan的濃度低選擇壓不足，易產生非轉基因植株，反之則不利於芽分化，本實施例的抗性選擇培養基中Kan的濃度為75mg/L，本發明中Kan在抗性選擇培養基中的允許濃度為65-80mg/L之間。3.2.5選擇性生根培養將經誘導生芽後形成的新植株切段，再將所得莖段置於選擇生根培養基中於25士2t:光照16h、18士2t:黑暗8h和20001x光強的條件下培養並進行生根篩選，得轉基因馬鈴薯植株，所述選擇生根培養基為MS培養基，選擇生根培養基中包括的組分及相應組分在選擇生根培養基中的濃度分別為質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8%的瓊脂、200mg/L的CarB和50mg/L的Kan，調節pH值為5.8，採用本發明所述選擇生根培養基進行選擇性生根培養後，其生根率能夠達到60%以上。在農桿菌介導的外源基因轉化馬鈴薯中，除以上因素外，轉化效率也較易受馬鈴薯品種的影響，本實施實驗數據表明本發明方法優先適用於鄂馬鈴薯3號品種的轉化，其次還可適用於其它品種的脫毒馬鈴薯(如川薯27號)的基因轉化。4、所得轉基因植株的檢測4.l設計引物A根據本實施例所得超表達雙元載體pBIN19-Tm-22上NPTII基因序列設計一對特異性引物(F1、R1)，其序列如下Fl:5'-CTATGACTGGGCACAACAGACAAT-3'Rl:5'-CAATATCACGGGTAGCCAACG-3'B進行基因序列對比，依據Tm-f中含有的與非轉基因馬鈴薯基因組同源性較低的區域，設計引物To-F:5'-CGCGCGTGTTATAGAGATTATGGAC-3'To-R:5'-ATAACCATTTGCCTCGCCCG-3'4.2PCR檢測取步驟3.2.5所得轉基因馬鈴薯植株並擴繁移栽，分別取不同株系及野生型馬鈴薯植株的基因組DNA，然後以提取的DNA為模板，用上述設計的特異性引物(Fl、Rl)和(To-F、To-R)進行PCR擴增檢測，篩選得到陽性植株，PCR擴增的反應體系如表1，擴增的循環參數為針對(F1、R1)的PCR擴增循環參數為94t:預變性5min;94。C變性30s，63t:退火30s，72。C延伸40s，共35個循環;72終延伸10min，結束PCR擴增。針對(To-F、To-R)的PCR擴增循環參數為94"C預變性5min;94"C變性30s，54°C退火30s，72。C延伸40s，共35個循環；72終延伸10min，結束PCR擴增。圖9與圖10為鄂馬鈴薯3號轉基因植株與野生型馬鈴薯植株基因組DNA的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，所得目標條帶連接pMD18-T載體，經過測序證明轉化結果正確。(圖9中1為野生型馬鈴薯株系對照，2為鄂馬鈴薯3號轉基因株系；圖10中1-4為鄂馬鈴薯3號轉基因株系，5-6為野生型馬鈴薯株系對照)4.3RT-PCR檢測Tm-22在馬鈴薯植株中的表達情況分別提取步驟4.2中篩選得到的鄂馬鈴薯3號轉基因陽性植株與野生型馬鈴薯植株的基因組RNA，用特異性引物(To-F、To-R)進行RT-PCR擴增檢測，進一步篩選陽性植株。針對特異性引物(To-F、To-R)的擴增體系及參數與步驟4.2相同，圖11為經PCR檢測所得鄂馬鈴薯3號轉基因陽性植株與野生型馬鈴薯植株的基因組RNA的RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，得到目標帶後，分別用連接液連接pMD18-T載體並測序，證明結果正確。(圖11中，1-6為鄂馬鈴薯3號轉基因陽性株系，7-12為野生型馬鈴薯株系對照)4.4病毒侵染4.4.1植物材料、毒源植物材料所得鄂馬鈴薯3號轉基因植株，野生型馬鈴薯毒源番茄花葉病毒(ToMV)和菸草花葉病毒(TMV)由浙江大學提供；馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)由華中農業大學馬鈴薯實驗室暨湖北省馬鈴薯工程技術研究中心提供。4.4.2操作步驟①接種病毒的製備番茄花葉病毒(ToMV)菸草花葉病毒(TMV)毒源先接種在心葉煙上，20天後收集發病心葉菸葉片，按照lg病葉加入20ml的磷酸緩衝液(0.01mol/L，pH7.0)後在研缽中勻漿，然後用雙層紗布過濾，收集濾液備用，馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)通過試管續代培養；②接種方法來回輕輕摩擦葉片，然後用蒸餾水衝洗葉面；4.4.3實驗結果經過病毒侵染觀察，排除外界環境因素影響，得到的轉基因株系病毒抗性結果如下表。tableseeoriginaldocumentpage14最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。序列表〈110>重慶大學〈120〉利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法〈160>8〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223>TF2〈400〉1gcatgttemgggc朋g3g朋〈210>2〈211>21〈212>DNA人工序列〈220〉〈223>TR2〈400>2gcgacaacttgaaattcttcc〈210>3〈211〉25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉T22F〈400>3ggatccttggccgtggactccatct〈210>4〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉T22R〈400>4gtcgaccactactacactcacgttgc5〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈220>F1〈400〉5ctetgactgggc3c朋c3gac朋t〈210>6〈211>21廳〈213〉人工序列〈220〉〈223>R1〈400>6caatatcacgggtagccaacg21〈210〉7〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈223〉To-F〈400〉7cgcgcgtgttatagagattatggac25〈210>820〈212〉DNA〈213〉人工序列〈223>To_R〈400>8ataaccatttgcctcgcccg20權利要求一種利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)製取番茄抗病基因Tm-22；根據番茄抗病基因Tm-22的序列設計兩對特異性引物並在上遊引物5』端加上限制性內切酶酶切位點，然後提取番茄RNA並分別以兩對特異性引物進行RT-PCR擴增，得到Tm-22基因前段和後段的擴增產物；將所得Tm-22基因前段和後段的擴增產物克隆入兩個pMD18-T載體，再進行酶切，酶切產物經純化後連接，得全長Tm-22基因DNA序列；(2)超表達載體的構建提取全長Tm-22片段並克隆到含CaMV35S啟動子和終止子的pDH51載體中，得pDH51-Tm-22質粒，酶切pDH51-Tm-22質粒並將所得片段克隆到pBIN19載體，得超表達雙元載體pBIN19-Tm-22；(3)農桿菌的侵染轉化將經過預培養獲得的馬鈴薯外植體置於含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌的菌液中浸染並經共培養、誘導生芽及選擇性生根培養，得轉基因馬鈴薯植株；(4)轉基因植株的檢測採用PCR、RT-PCR檢測方法從所得轉基因馬鈴薯植株中篩選陽性植株，所得陽性植株經活體抗病性接種鑑定，獲得高抗病毒馬鈴薯植株。2.根據權利要求1所述的利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特徵在於步驟(3)所述馬鈴薯外植體由以下步驟獲得a.將馬鈴薯脫毒試管苗單節段接種於培養基上，然後於溫度20士2t:、16h/d光周期和1000-20001x光照強度的條件下培養，所述培養基為MS培養基，培養基中包括的組分及相應組分在培養基中的質量分數分別為蔗糖3%、瓊脂0.6-0.8%，調節pH為5.8;b.待脫毒試管苗長至6-7個葉片後將生長健壯的馬鈴薯脫毒試管苗剪成1葉1節的莖段，將所述莖段接種至誘導固體培養基中並於20士2t:的全黑暗條件下誘導培養以獲得試管薯；c.所述試管薯切片，得馬鈴薯外植體。3.根據權利要求2所述的利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特徵在於步驟b所述誘導固體培養基為MS培養基，誘導固體培養基中包括的組分及相應組分在誘導固體培養基中的質量分數分別為蔗糖8-10%，調節pH為5.8。4.根據權利要求3所述的利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特徵在於所述誘導固體培養基還包括瓊脂和6-BA，瓊脂在誘導固體培養基中的質量分數為0.6%，6-BA在誘導固體培養基中的質量濃度為2mg/L。5.根據權利要求4所述的利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特徵在於步驟(3)所述含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌的菌液按如下步驟製得①將含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌接種於YEB固體培養基中並於28士2t:條件下黑暗培養2-3d，得培養物；②按照0.01:1的體積比將所得培養物加入到YEB液體培養基中並培養至0D6。。為1.8-2.0後於4000-6000rpm條件下室溫離心並用新鮮YEB液體培養基重懸菌體，得菌懸液；③所得菌懸液於4000-6000rpm室溫離心後用MS鹽溶液重懸菌體，得含有pBIN19-Tm-22雙元載體的LBA4404農桿菌的菌液。所述YEB固體培養基包括的組分及相應組分在YEB固體培養基中的濃度分別為質量分數為1.5X的瓊脂、50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調節pH為7.0;所述YEB液體培養基包括的組分及相應組分在YEB液體培養基中的濃度分別為50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，調節pH值為7.0;所述MS鹽溶液的pH為5.8。6.根據權利要求5所述的利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特徵在於所述含有pBIN19-Tm-f雙元載體的LBA4404農桿菌菌液浸染時間為8-10min，所述共培養是將經過LBA4404農桿菌菌液浸染的馬鈴薯外植體於芽誘導培養基中在20士2t:下黑暗共培養2-3d，所述芽誘導培養基為MS培養基，芽誘導培養基中包括的組分及相應組分在芽誘導培養基中的濃度分別為質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8X的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA和0.5mg/L的BA，調節pH值為5.8。7.根據權利要求6所述的利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特徵在於所述誘導生芽操作為將經過共培養的馬鈴薯外植體轉到抗性選擇培養基中，並在20-25t:光照16h、18-2(TC黑暗8h和1000-20001x光強的條件下培養直至抗性芽產生並形成新的植株，所述抗性選擇培養基為MS培養基，抗性選擇培養基中包括的組分及相應組分在選擇抗性培養基中的濃度分別為質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8%的瓊脂、lmg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA、0.5mg/L的6-BA、500mg/L的CarB和65_80mg/L的Kan，調節pH值為5.8;所述選擇性生根培養操作為將經誘導生芽後形成的新的植株切段，再將所得莖段置於選擇生根培養基中於20-25。C光照16h、18-2(TC黑暗8h和1000-20001x光強的條件下培養並進行生根篩選，所述選擇生根培養基為MS培養基，選擇生根培養基中包括的組分及相應組分在選擇生根培養基中的濃度分別為質量分數為3%的蔗糖、質量分數為0.8%的瓊脂、200mg/L的CarB和50mg/L的Kan，調節pH值為5.8。8.根據權利要求1-7任一權利要求所述的農桿菌介導Tm-22基因獲得抗病性鈴薯植株的方法，其特徵在於步驟(4)所述PCR和RT-PCR檢測方法包括如下步驟I根據超表達雙元載體pBIN19-Tm-22的NPTII報告基因序列設計特異性引物F1、R1，其序列如下Fl:5'-CTATGACTGGGCACAACAGACAAT-3'Rl:5'-CAATATCACGGGTAGCCAACG-3，；II將Tm-22與非轉基因馬鈴薯基因組進行對比，查找Tm-22中含有的與非轉基因馬鈴薯基因組同源性較低的片段區域，據此設計引物，其序列如下To-F:5'-CGCGCGTGTTATAGAGATTATGGAC-3'To-R:5'-ATAACCATTTGCCTCGCCCG-3'IIIPCR檢測分別提取所得轉基因馬鈴薯植株與非轉基因馬鈴薯植株的基因組DNA，然後以提取的DNA為模板，用所述特異性引物(Fl、Rl)和(To-F、To-R)進行PCR擴增，得到目標帶後，分別連接pMD18-T載體並測序，篩選陽性植株；IVRT-PCR檢測分別提取步驟III所得陽性植株與非轉基因馬鈴薯植株的基因組RNA，用所述特異性引物To-F、To-R進行RT-PCR擴增，得到目標帶後，連接pMD18_T載體並測序，篩選陽性植株。9.根據權利要求8所述的利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，其特徵在於步驟(1)所述特異性引物為兩對，分別為(TF2、TR2)和(T22F、T22R)，T22F引物的5'端加上限制性內切酶酶切位點，其各自的序列如下TF2:5'-GCATGTTAAGGGCAAGAGAA-3'TR2:5'-GCGACAACTTGAAATTCTTCC-3'T22F:5'-GGATCCTTGGCCGTGGACTCCATCT-3'T22R:5'-GTCGACCACTACTACACTCACGTTGC-3，。全文摘要本發明公開了一種利用基因工程技術獲得高抗病毒馬鈴薯植株的方法，包括Tm-22基因的克隆及其超表達載體的構建、農桿菌的侵染轉化、高抗病毒馬鈴薯植株的檢測；本發明根據已知番茄抗病基因Tm-22抗病機理及其對病毒(如TMV、ToMV等)的高抗特性，利用番茄與馬鈴薯親緣關係較近特點，採用基因工程技術將Tm-22基因轉入馬鈴薯，並通過篩選、鑑定而獲得已表達Tm-22基因的高抗病毒馬鈴薯植株，提高了馬鈴薯植株對常見病毒的抗性；本發明通過植物基因轉化馬鈴薯，能夠避免環境風險及食用安全風險，有助於把馬鈴薯抗病研究推向一個新的臺階，為實際應用於農業生產作出了積極探索。文檔編號A01H5/00GK101717785SQ20091019195公開日2010年6月2日申請日期2009年12月16日優先權日2009年12月16日發明者吳祥華,張陳明,胡宗利,鄧磊,陳國平,高建閣申請人:重慶大學