多重固相核酸擴增測定的製作方法

2023-06-29 04:47:26 2

專利名稱：多重固相核酸擴增測定的製作方法
技術領域：
本發明屬於核酸檢測領域。
背景技術：
採用與具有5′核酸酶活性的酶聯合使用的液相雙標記的寡核苷酸探針檢測核酸序列的擴增是本領域公知的(參見，例如，美國專利Nos.5,210,015；5,487,972；5,804,375；和Holland，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1988)887276-80)。在本發明之前，還沒有在核酸擴增反應中使用攜帶可以由5′-核酸酶活性釋放的標記物部分的固定的雙標記的寡核苷酸探針，或者還沒有將其用於核酸擴增反應的實時監測。
仍然需要用於同時檢測多個核酸序列的擴增的更有效和更方便的方法。本發明滿足了該需要和其它需要。

發明內容
一方面，本發明提供了檢測靶核酸的方法，該方法包括以下步驟a)提供通過3』末端固定在固體基質上的寡核苷酸探針，該探針包含標記物部分；b)在探針的存在下在含有具有5′-3′核酸酶活性的酶的反應混合物中擴增懷疑含有靶核酸的核酸樣品，其中該探針與靶核酸特異性雜交，使得具有5′-3′核酸酶活性的酶從寡核苷酸探針釋放標記物部分，並且檢測到核酸樣品中是否存在靶核酸。
本發明進一步提供了同時檢測多個靶核酸序列的方法，該方法包括以下步驟a)提供大量寡核苷酸探針，每個探針通過其3』末端固定在固體基質上，每個探針包含相同的標記物部分；b)在探針的存在下在含有具有5′-3′核酸酶活性的酶的反應混合物中擴增懷疑含有靶核酸的多個核酸樣品，其中每個探針與多個靶核酸之一特異性雜交，使得具有5′-3′核酸酶活性的酶從寡核苷酸探針釋放標記物部分，並且檢測到核酸樣品中是否存在靶核酸。在該方法中，從空間上區分代表靶核酸的螢光的檢測。採用本方法，可以同時檢測至少8、10、12、14、15、16、18、20、50、75、100或更多個靶核酸序列。
在一種實施方案中，標記物部分是與探針的5』末端連接的螢光團部分，由此螢光團部分的釋放導致固定的探針上螢光的減少，從而檢測到核酸樣品中靶核酸的存在。
在一種實施方案中，標記物部分是連接於探針的5』末端的猝滅劑部分，並且，固定的探針進一步包含位於猝滅劑部分3』的、連接於探針的螢光團部分，其中當猝滅劑部分連接於探針時，螢光團部分不發出螢光，並且，固定的探針上螢光團部分的螢光隨著靶核酸擴增的增加而增加，這是因為猝滅劑部分釋放到溶液中。
在一種實施方案中，標記物部分是連接於探針的5』末端的猝滅劑部分，並且，固定在鄰近探針的位置的螢光團部分的螢光隨著靶核酸擴增的增加而增加。例如，螢光團部分可以固定在固體基質上，或固定在第二核酸(即，第二探針)上，所述第二核酸固定在固體基質上足以接近攜帶猝滅劑部分的探針的位置，以便掩蓋螢光團的螢光。
在一種實施方案中，擴增是通過聚合酶鏈反應。在一種實施方案中，具有5′-3′核酸酶活性的酶是具有5′-3′核酸酶活性的DNA聚合酶。
固體基質可以是任何能夠承受間歇和重複的核酸變性溫度(即，80℃-105℃，通常約95℃)，並且保持與固定的探針結合的材料。優選的基質允許同時檢測多個核酸序列。在本發明的不同實施方案中，固體基質可以是，例如，多孔板、顯微鏡載玻片、聚合酶鏈反應(PCR)管、或平皿。固體基質可以是任何多邊形，如圓形、橢圓形、正方形、矩形、三角形、六邊形等。
在一些實施方案中，擴增檢測是定量的。在一些實施方案中，擴增檢測與擴增是同時的(即，「實時」)。在一些實施方案中，擴增檢測是定量的並且擴增檢測是實時的。在一些實施方案中，擴增檢測是定性的(如是否存在靶核酸的終末檢測)。在一些實施方案中，擴增檢測在擴增後進行。在一些實施方案中，擴增檢測是定性的，並且擴增檢測在擴增後進行。
在一些實施方案中，螢光團部分選自螢光素家族染料、多滷螢光素家族染料、六氯螢光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料和BODIPY家族染料。
在一些實施方案中，猝滅劑部分選自螢光素家族染料、多滷螢光素家族染料、六氯螢光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料、BODIPY家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料、低螢光猝滅劑部分(即，「暗淡的供體」)和非螢光猝滅劑部分(如，稱作「暗猝滅劑」，包括Black Hole QuenchersTM(BHQ))。
在一種實施方案中，螢光團部分是螢光素家族染料，猝滅劑部分是花菁家族染料。在一種實施方案中，螢光團部分是螢光素家族染料，猝滅劑部分是六氯螢光素家族染料。在一種實施方案中，螢光團部分是六氯螢光素家族染料，猝滅劑部分是花菁家族染料。在一種實施方案中，猝滅劑是暗猝滅劑，例如，BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3(BiosearchTechnologies，Novato，CA)。在一種實施方案中，螢光團部分是螢光素家族染料或花菁家族染料，猝滅劑部分是暗猝滅劑。
另一方面，本發明提供了包含以下成分的反應混合物i)通過3』末端固定在固體基質上的寡核苷酸探針，該探針包含標記物部分，該標記物部分由具有5′-3′核酸酶活性的酶釋放；ii)用於擴增靶核酸的試劑，其中所述探針與靶核酸內的序列雜交。
另一方面，本發明提供了包含以下成分的試劑盒i)通過3』末端固定在固體基質上的寡核苷酸探針，該探針包含標記物部分，該標記物部分由具有5′-3′核酸酶活性的酶釋放；ii)用於擴增靶核酸的試劑，其中所述探針與靶核酸雜交。
本發明進一步提供了包含至少一個通過3』末端固定在固體基質上的寡核苷酸探針的固體基質，所述至少一個探針包含由具有5′-3′核酸酶活性的酶釋放的標記物部分。
本發明也涉及用於進行靶核酸擴增的裝置，該裝置包含至少一個通過3』末端固定在固體基質上的寡核苷酸探針，所述至少一個探針包含由具有5′-3′核酸酶活性的酶釋放的標記物部分。
本發明進一步涉及用於進行靶核酸擴增的裝置，該裝置包含用於容納固體基質的空間，所述固體基質包含至少一個通過3』末端固定在固體基質上的寡核苷酸探針，所述至少一個探針包含由具有5′-3′核酸酶活性的酶釋放的標記物部分。
反應混合物、試劑盒和裝置的實施方案與方法的實施方案相同。


圖1圖示了固體基質平皿陣列。(1)陣列組件；(2)流液口；(3)通道；(4)室；(5)體；(6)密封壁；(7)陣列基質；和(8)光學窗。
圖2圖示了密封壁上的固體基質平皿陣列。
圖3圖示了組裝的固體基質平皿陣列。
具體實施例方式
1.導言如此處所示，用固定的雙標記的探針得到擴增生長曲線，幾乎不需要或不需要聚合酶鏈反應(PCR)的修飾。此外，從固定的雙標記的探針得到的循環閾值(Ct)的測量值與用液相的雙標記的抗體獲得的那些相似。由固定的探針進行的靶核酸的捕獲速度可以與液相擴增反應的速度競爭。
如下文所示，寡核苷酸探針的固定使得能夠同時進行多個核酸擴增反應的實時分析。目前的多重分析需要使用多種染料和猝滅劑的組合，並且通常由單個儀器上可利用的激發和檢測系統限制到每個樣品約6個同時的反應。採用本發明，通過二維陣列上雙標記的寡核苷酸探針的空間分布，可以用單一的染料和猝滅劑組合實現多重測定。因此，每個樣品的分析數目受到進行多重擴增反應和設計具有足夠選擇性的探針的能力的限制。採用本發明，可以在單一反應中同時監測多個同時進行的反應。
2.縮寫在本說明書中通篇使用的縮寫是指包含特定核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列是常規的一字母縮寫。因此，當包含在DNA中時，天然存在的編碼核苷酸的脫氧核糖核苷的縮寫如下脫氧腺苷(dA)、脫氧鳥苷(dG)、脫氧胞苷(dC)和脫氧胸苷(dT)。核糖核苷的縮寫如下腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)和尿苷(U)。核苷酸鹼基的縮寫如下腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。同樣，除非特別指出，以一系列一字母縮寫表示的核酸序列是以5′-＞3′的方向列出的。
3.定義「擴增反應」是指任何導致模板核酸序列的拷貝數增加或導致表明模板存在的信號增加的反應(如化學、酶促或其它類型的反應)。擴增反應包括，例如，聚合酶鏈反應(PCR)和連接酶鏈反應(LCR)(參見，美國專利4,683,195和4,683,202；PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications(Innis et al.，eds，1990))、鏈置換擴增(SDA)(Walker，et al Nucleic Acids Res.20(7)1691-6(1992)；Walker PCRMethods Appl 3(1)1-6(1993))、轉錄介導的擴增(Phyffer，et al.，J.Clin.Microbiol.34834-841(1996)；Vuorinen，et al，J.Clin.Microbiol.331856-1859(1995))、基於核酸序列的擴增(NASBA)(Compton，Nature 350(6313)91-2(1991)、滾環擴增(RCA)(Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)75-99(1999))；Hatch et al.，Genet.Anal.15(2)35-40(1999))和Q-Beta複製酶(Lizardi et al.，Bio/Technology 61197(1988))。
本文用到的「用於擴增的試劑」或「擴增試劑」可互換使用，是指本領域技術人員通常在擴增反應的反應容器中包括的試劑。例如，典型的聚合酶鏈反應中位於引物上遊和下遊的試劑可以包括，但不限於，至少一個模板、脫氧核糖核苷三磷酸(包括dATP、dCTP、dGTP、TTP、dUTP)、聚合酶、緩衝液、金屬陽離子和鹽。基於核酸序列的擴增(NASBA)反應可以包括引物、逆轉錄酶、RNA酶H和DNA聚合酶。轉錄介導的擴增(TMA)反應可以包括引物、逆轉錄酶和RNA聚合酶。鏈置換擴增(SDA)反應可以包括修飾的核苷酸和限制性內切核酸酶。某些擴增反應也可以包括脫氧尿苷N-糖基化酶(UNG)作為輔助的擴增試劑(如Amperase，Roche Molecular Sciences，Alameda，CA)(參見，Kleiboeker，Virol J(2005)1129)。
本文使用的「樣品」是指任何含有或推斷含有靶核酸的物質。樣品可以是天然或合成來源，並且可以通過本領域技術人員公知的任何方法獲得。樣品可以是分離自一個或多個個體的組織或體液的樣品，所述組織或體液包括，但不限於，例如，皮膚、血漿、血清、全血、腦脊液、精子、精液、淋巴液、滑液、尿、淚、血細胞、器官、腫瘤、支氣管-肺泡灌洗液，所述樣品也指體外細胞培養成分(包括，但不限於細胞培養基中的細胞生長導致的條件培養基、重組細胞和細胞成分)的樣品。可以通過本領域公知的任何程序從生物樣品獲得核酸。
本文使用的術語「核酸」、「多核苷酸」和「寡核苷酸」指引物、探針、待檢測的寡聚物片段、寡聚物對照和未標記的封閉寡聚物，通常指多脫氧核糖核苷酸(含2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)的線性聚合物，以及嘌呤或嘧啶鹼基，或修飾的嘌呤或嘧啶鹼基的其它任何N-糖苷類似物。
核酸、多核苷酸或寡核苷酸可含有磷酸二酯鍵或經過修飾的鍵，包括，但不限於磷酸三酯、氨基磷酸酯、矽氧烷、碳酸酯、羧甲酯、acetamidate、氨基甲酸酯、硫醚、橋聯氨基磷酸酯、橋聯亞甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯、橋聯硫代磷酸酯或碸，以及這些鍵的組合。
核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包括5個生物學存在的鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)和/或除了這5個鹼基以外的其它鹼基。這些鹼基可能具有多種用途，例如，使雜交穩定或不穩定；促進或抑制探針降解；或者充當連接可檢測部分或猝滅劑部分的連接點。例如，本發明的多核苷酸可含有一個或多個修飾的、非標準或衍生的鹼基部分，包括但不限於N6-甲基-腺嘌呤、N6-叔丁基-苄基-腺嘌呤、咪唑、取代的咪唑、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-Dmannosylqueosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine，2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶(即胸腺嘧啶)、尿嘧啶-5-羥乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w，2，6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶。修飾的、非標準或衍生的鹼基部分的其它實例可參見被完整引入本文作為參考的美國專利Nos.6,001,611、5,955,589、5,844,106、5,789,562、5,750,343、5,728,525和5,679,785。
此外，核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包括一個或多個經過修飾的糖部分，包括但不限於阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
本發明不希望受限於核酸、多核苷酸或寡核苷酸的來源。核酸、多核苷酸或寡核苷酸可來源於人類或非人類的哺乳動物，或其它任意生物體，或者來源於體外合成或通過化學方法合成的任意重組來源。核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、鎖定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、雜合體或它們的任意混合物，並可能以雙鏈、單鏈或部分雙鏈形式存在。核酸還可以是美國專利5,696,248所描述的衍生核酸。本發明的核酸包括純化或未純化形式的核酸及其片段，包括諸如微生物，例如細菌、酵母、病毒、類病毒、黴、真菌、植物、動物、人類等的生物學材料的基因、染色體、質粒，基因組。
術語核酸、多核苷酸和寡核苷酸的長度無特定的差別，且這些術語均可互換使用。這些術語包括雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA。本發明的寡核苷酸可以用作引物和/或探針。
本文所用術語「殘基」指上文所定義核酸內的核苷酸或鹼基。不加限制的話，殘基可以是本領域技術人員已知的任意核苷酸，包括上述所有生物學存在的核苷酸和非生物學存在的核苷酸。
術語「引物」指能夠在特定條件下，沿模板核酸鏈充當多核苷酸合成起始點的寡核苷酸，所述特定條件即允許合成與所述模板鏈互補的引物延伸產物。該引物可從重組來源中獲得，形式為純化的限制片段，或者通過合成方法製備而得。引物延伸條件典型地包括在合適的溫度下，在合適的緩衝液(「緩衝液」可以包括本身是輔因子或影響pH、離子強度等的替代物)中含有四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸和具有聚合活性的試劑，諸如DNA聚合酶或逆轉錄酶。該引物優選在擴增中效率最高的單鏈。本發明的引物可能含有，例如5-500個核苷酸，在某些實施方案中，將含有至少10、20、30、25、30、40、50、75或100個核苷酸和/或含有少於500、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、25或20個的核苷酸。
術語「雜交」指單鏈核酸或雙鏈核酸的局部單鏈區域與具有互補序列的另一個單鏈核酸或雙鏈核酸的局部單鏈區域的結合。就本領域技術人員所知，兩條核酸鏈並不需要完全互補便可彼此雜交。根據雜交條件，核酸可與其互補序列雜交，即使兩條鏈或其中的一條鏈中存在較少、若干或許多錯配、缺失或添加的情況也可雜交。在某些實施方案中，正如下文所定義的，本發明的引物和探針可以選擇性地與至少部分互補的核酸雜交。在某些實施方案中，本發明的引物和探針可在下文定義的嚴格條件下與至少部分互補的序列雜交。
本文所用術語「嚴格」或「嚴格條件」正如本領域所熟知的，指低離子強度和高溫度的雜交條件；參見，例如Maniatis等人於1989年出版的第2版分子克隆實驗室手冊；J.Wiley Sons publ.，NewYork 1988年出版的Ausubel等人編輯的Current Protocols inMolecular Biology和Tijssen在1993的生物化學和分子生物學方面的技術-與核酸探針的雜交中的「雜交原理綜述和核酸試驗方案」。通常，所選嚴格條件比特定序列在定義的離子強度和pH條件下的熱解鏈溫度(Tm)低大約5-30℃。可選地，所選嚴格條件比特定序列在定義的離子強度和pH條件下的熱解鏈溫度(Tm)低大約5-15℃。Tm指在與靶互補的探針中，處於平衡狀態時有50％的探針與靶序列雜交的溫度(在定義的離子強度、pH和核酸濃度條件下)(即當靶序列過量存在時，在Tm條件下，處於平衡狀態時50％的探針被佔用)。例如，嚴格雜交條件可以如下，其中在大約pH 7.0到大約pH 8.3的條件下，鹽濃度小於大約1.0M鈉(或其它鹽)離子，典型地為大約0.01到大約1M鈉離子濃度，且對短探針(例如具有10-50個核苷酸)而言，溫度至少為大約25℃，對長探針(例如具有多於50個的核苷酸)而言，溫度至少為大約55℃。嚴格條件還可通過加入諸如甲醯胺的雜交去穩定劑而得以改變。
本文所用術語「選擇性」或「選擇性條件」指適用於本發明引物和/或探針的雜交條件，所述條件可實現對樣品中的可檢測的靶核酸進行的擴增、檢測和/或定量，所述樣品可能含有其它非靶核酸。
本文所用的核酸序列的「互補序列」指處於反平行結合狀態的寡核苷酸，即當其與所述核酸序列進行比對時，一個序列的5』末端可與另一個序列的3』末端配對。核酸序列的互補序列無需與該序列的每一個核苷酸都準確配對；穩定的雙鏈體可能含有錯配鹼基對或未配對鹼基。核酸技術領域的技術人員可根據經驗考慮許多變量，包括例如所述寡核苷酸的長度、該寡核苷酸的鹼基組成和序列、離子強度、錯配鹼基對的發生率的影響，確定雙鏈體的穩定性。
核酸雙鏈體的穩定性是通過解鏈溫度或「Tm」而得以確定的。特定核酸雙鏈體在特定條件下的Tm是一半的潛在鹼基對解離的溫度。
本文所用術語「探針」指可與靶核酸的一個區域形成雙鏈結構的寡核苷酸，而形成雙鏈結構的原因是該探針的至少一個亞序列與靶核酸中的亞序列具有互補性。優選的探針不包括與引物序列互補的序列。如下所述，該探針可以是標記或未標記的。該探針的3』末端可以被「封閉」，以阻止該探針摻入引物延伸產物中。「封閉」可通過利用非互補鹼基或通過將諸如生物素或磷酸基團的化學部分加入最後一個核苷酸的3』羥基中而得以實現，根據所選部分的不同，封閉可能具有雙重用途，即還充當標記，可用於後續檢測或捕獲與該標記相連的核酸。封閉還可通過除去上述3』羥基或通過利用無3』羥基的核苷酸，諸如雙脫氧核苷酸而得以實現。
「探針的5』末端」是指由具有5』核酸酶活性的酶消化的本發明的固定的探針的部分。
「探針的3』末端」是指在暴露於具有5』核酸酶活性的酶之後保持連接於固體基質的本發明的固定的探針的部分。
術語「標記物部分」是指在暴露於具有5』核酸酶活性的酶時可以從本發明的固定的探針釋放的化合物。如下文所述，標記物部分可以是螢光部分或猝滅劑部分。在某些實施方案中，標記物部分可以是非螢光可檢測部分，例如，放射性同位素(如3H、32P、125I)、生物素或生物素結合部分(如親和素、鏈親和素、neutravidin等)。
本文可互換使用的術語「螢光部分」或「螢光團部分」是指可在特定條件下發射光的化學部分，該條件即適用於該特定部分的條件。典型地，特定的螢光部分或螢光團部分可在吸收較短波長的光之後發射特定波長的光。由特定螢光部分發射的光的波長是該部分的特徵。因此，可在利用較短波長的光激發特定螢光部分之後，通過檢測合適波長的光，以檢出該螢光部分。可應用於本發明方法和組合物的螢光部分的實例包括，但不限於螢光素家族染料、多滷螢光素家族染料、六氯螢光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料和BODIPY家族染料。
本文所用術語「猝滅劑部分」指可在特定條件下吸收螢光部分所發射能量的化學部分，所述特定條件即當該猝滅劑部分充分接近螢光部分，例如當該猝滅劑和螢光部分與同一多核苷酸相連時。該現象在本領域通常被稱為螢光共振能量轉移(「FRET」)。猝滅劑部分可再次發射從螢光部分吸收的能量，形成該猝滅劑部分的特有信號，因此猝滅劑也可以是「螢光部分」。或者，猝滅劑部分可能在加熱時或其它非放射性過程中將從螢光部分吸收的能量散失。可應用於本發明方法和組合物的猝滅劑部分的實例包括，但不限於螢光素家族染料、多滷螢光素家族染料、六氯螢光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料、BODIPY家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料、低螢光猝滅劑部分(即，「暗淡的供體」)和非螢光猝滅劑部分(如，稱作「暗猝滅劑，包括Black HoleQuenchersTM(BHQ))。
本文所定義的「5』-3』核酸酶活性」或「5』核酸酶活性」指可以序貫方式將核苷酸從寡核苷酸5』末端除去的酶活性。該5』核酸酶活性優選是5』-3』外切核酸酶活性，但也可以是5』-3』內切核酸酶活性。例如，許多模板特異性核酸聚合酶表現的是通常與某些DNA聚合酶相關的5』-3』外切核酸酶活性，(即大腸桿菌DNA聚合酶I具有該活性，而大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段則無該活性)。5』-3』外切核酸酶活性還可從底物核酸的5』末端開始裂解多於一個的磷酸二酯鍵(核苷酸)。雖然無意受限於任何特定的操作理論，對導致探針釋放裂解的寡核苷酸片段這一方面而言，與DNA聚合酶相關的5』-3』外切核酸酶活性仍然被認為取決於所述探針的特定核苷酸組成。例如，在所述寡核苷酸與模板核酸二者的核苷酸之間，尤其是出現在所述寡核苷酸5』末端處的匹配或錯配數目可影響該活性，正如例如，Holland et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-80所描述的。5』核酸酶反應基於美國專利6,214,979、5,804,375、5,487,972和5,210,015的描述。
與靶核酸進行的探針和引物雜交內容中的術語「鄰近」指所述引物相對於所述探針在模板核酸的相同或互補鏈上的定位。所述引物和探針可能被多於大約150個的核苷酸、多於大約125個的核苷酸、多於大約100個的核苷酸、多於大約80個的核苷酸、多於大約60個的核苷酸、多於大約50個的核苷酸、多於大約40個的核苷酸、多於大約30個的核苷酸、多於大約20個的核苷酸、大約1到大約20個核苷酸、大約1到大約10個核苷酸分隔開，或者可能直接地彼此相鄰而不重疊。在某些實施方案中，探針與引物隔開大約1到大約10個核苷酸。通常，探針可能與待擴增序列任意位置，即引物下遊的可靶核酸雜交，從而使引物延伸可以確定聚合酶的位置，進而得以斷裂該探針。
在「在鄰近固定的探針的位置上固定的螢光團部分」的內容中使用的術語「鄰近」是指固定的螢光團部分的位置。在鄰近固定的探針的位置上固定的螢光團部分與連接於固定的探針的5』末端的猝滅劑部分足夠接近，使得螢光被掩蓋。在鄰近固定的探針的位置上固定的螢光團部分可以通常通過連接部分連接於例如另一核酸或固體基質本身，所述另一核酸連接於固體基質。
術語「熱穩定核酸聚合酶」指與例如大腸桿菌來源的核苷酸聚合酶相比，對熱相對穩定並可催化核苷三磷酸的聚合作用的酶。通常，這種酶是從被本領域技術人員認為嗜熱的生物體中獲得。該酶通常會在已退火至引物結合序列的引物的3』末端處開始合成，並將繼續向模板的5』末端合成新鏈。如果該聚合酶具有5』-3』核酸酶活性，它可以水解已退火至模板的間插探針，以釋放已標記和未標記的探針片段，直到聚合作用終止或所有探針片段與待檢測的核酸解離為止。美國專利4,889,818描述了分離自棲熱水生菌(Taq)的代表性熱穩定酶，Saiki etal.，1988，Science 239487-91描述了將其應用於常規PCR的方法。另一種代表性的熱穩定酶包括棲熱菌種Z05 DNA聚合酶。參見例如美國專利5,674,738。
Taq DNA聚合酶具有DNA合成依賴型鏈置換5』-3』外切核酸酶活性(參見Gelfand在Stockton Press，N.Y.(1989)出版和Erlich編輯的「PCR技術原理及其在DNA擴增方面的應用「第2章中的「TaqDNA聚合酶」)。因此，當探針未與模板DNA結合時，Taq DNA聚合酶不會降解該探針。
為確定兩個核酸序列的「互補性百分率」或「同一性百分率」，對這兩個序列進行比對，以獲得最優比較結果(例如，可將空位導入第一個核酸序列中，用於與第二個核酸序列進行最優比對)。接著比較相應核苷酸位置上的核苷酸。當第一個序列中的一個位置被與第二個序列中相應位置上的核苷酸互補的核苷酸佔據時，這兩個分子在該位置上是互補的。同樣，當第一個序列中的一個位置被與第二個序列中相應位置上的相同核苷酸佔據時，則這兩個分子在該位置上是一致的。這兩個序列的互補性百分率(或同一性百分率)是被比較的總位置數目除這兩個序列所共有的互補位置(或一致位置)數目後所獲結果的函數(即％互補性＝互補重疊位置數目/較短核苷酸的總位置數目×100％；和％同一性＝一致重疊位置數目/較短核苷酸的總位置數目×100％)。
對兩個序列之間的同一性百分率的測定還可利用數學算法實現。被用於比較兩個序列的數學算法的優選非限制性實例是Karlin和Altschul於1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.872264-2268公開的算法，以及Karlin和Altschul於1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.905873-5877公開的改良算法。這種算法被合併進Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215403所公開的NBLAST程序中。
如無另外指明，本發明的實踐將應用到屬於本領域技術範疇的常規分子生物學、微生物學技術和重組DNA技術。這些技術在文獻中得到了完整闡釋。參見例如Sambrook et al.，2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames S.J.Higgins，eds.，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)；和a series，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)。
「大量」是指兩個或多個。
4.寡核苷酸探針另一方面，本發明提供了包含用於檢測靶核酸的可以釋放的標記物部分的固定的探針。該探針可以不受限制地是能夠用於鑑定本領域技術人員公知的靶核酸的存在的核酸探針。典型地，探針包含與靶核酸的區域雜交的核苷酸序列，所述區域與引物雜交的區域不同。典型地，探針通過其3』末端固定於固體基質。
所述探針的核苷酸序列可具有任意長度，該長度足以特異性結合待檢測的靶核酸。在某些實施方案中，所述探針具有至少大約6個核苷酸。在某些實施方案中，所述探針具有少於大約140個的核苷酸。在某些實施方案中，所述探針的長度可以是大約18到大約45個、大約25到大約35個或大約25到大約30個核苷酸。可對該探針的長度和組成進行選擇，以提供充分的熱動力學穩定性，進而確保該探針與靶核酸在合適反應條件下的雜交，該反應條件則取決於待實施的檢測方法。通常設計的探針具有比引物的解鏈溫度(Tm)高的Tm。具有修飾的、非標準或衍生核苷酸的探針可能比具有常規核苷酸的探針長或短，卻仍具有類似的熱動力學雜交特性。這種非標準鹼基的實例可參見美國專利6,320,005、6,174,998、6,001,611和5,990,303。另一個實例是，與具有富含A/T序列且長度相似的探針相比，具有富含G/C序列的探針可能在較高溫度下退火至靶序列。
在所述探針的核苷酸序列中，與可檢測核酸雜交的部分典型地與該可檢測核酸中被所述探針雜交的區域一致或互補。不過，探針的該部分與可檢測的靶核酸中被該探針雜交的區域的序列同一性或互補性可小於100％。在本發明的某些實施方案中，所述探針中與可檢測的靶核酸雜交的部分的核苷酸序列可以與可檢測的靶核酸中被該探針雜交的區域具有大約99％、大約98％、大約97％、大約96％、大約95％、大約90％、大約85％或大約80％的互補性或同一性。本發明的固定的探針特別適於基因型分析、單核苷酸多態性和其它鹼基對錯配分析。採用固定的、標記的探針，使得能夠進行與常規線性陣列相比高度靈敏的單鹼基區分，這是因為錯配鹼基對和內部標記物部分的累積的去穩定作用。
本發明的核酸探針可額外包括並非來源於靶核酸並且/或者不與靶核酸雜交的其它核酸序列。本領域的技術人員可對這些額外核酸序列進行選擇，使所述探針具有預期的功能性。例如，所述核酸探針可包括能使檢測方法改進的額外序列。可包括額外核酸序列或可通過其它方法被調整用於本發明探針、方法和試劑盒的探針實例可參見美國專利6,323,337、6,248,526、6,150,097、6,117,635、6,090,552、5,866,336和5,723,591。
除了上述探針核苷酸序列，所述探針還可包括不抑制本發明方法的額外核苷酸序列或其它部分。在本發明的簡便實施方案中，所述探針可包括有助於實施本發明方法的額外核苷酸序列。所述探針內可存在特定部分，以使該探針或探針片段與所述核苷酸序列的雜交穩定或不穩定。例如，寡聚T接頭可以用於促進雜交。本發明的探針還可包括上文定義的修飾的、非標準或衍生的核苷酸。
可以通過本領域技術人員公知的任何方法製備本發明的核酸探針，不受任何限制。具體地，上文所述的製備本發明的核酸引物的方法也可以用於製備本發明的核酸探針。
可通過多種技術使一個或多個標記物部分與探針直接或間接相連。在一些實施方案中，標記物部分位於探針的5』末端(即，探針的被具有5』核酸酶活性的酶消化的末端)、位於探針的核苷酸序列內部、或連接於多種大小的間隔臂或組合物，以促進信號相互作用。典型地，標記物部分是通過非核苷接頭連接，而不是連接於核苷鹼基。利用通過商業渠道獲得的亞磷醯胺試劑，可藉助於經過適當保護的亞磷醯胺製備在任一末端具有官能團(例如硫醇或伯胺)的寡核苷酸，並可採用例如PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，ed.byInnis et al.，Academic Press，Inc.，1990中描述的方法使其連接標記物部分。
美國專利4,914,210描述了導入寡核苷酸官能化試劑的方法，可將一個或多個巰基、氨基或羥基部分導入所述寡核苷酸探針序列中，典型地導入在該序列的5』末端。使包括螢光部分在內的標記物部分猝滅劑部分或非螢光可檢測部分與探針相連的其它方法可參見美國專利5,118,802。當然，將標記物部分連接或綴合於探針的方法依賴於使用的標記物部分的類型和標記物部分在探針上的位置。
在某些實施方案中，一個或多個標記物部分可與探針的5』末端相連。在另一些實施方案中，一個或多個標記物部分可在探針的5』末端內，例如，距探針5』末端位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大約35或大約40個殘基內的殘基位置上與探針相連。在某些實施方案中，一個或多個標記物部分可與探針的3』末端相連。在另一些實施方案中，所述一個或多個標記物可在探針的5』末端內，例如，距探針3』末端位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大約35或大約40個殘基內的殘基位置上與探針相連。該一個或多個標記物部分可與探針殘基的任意部分相連。例如，一個或多個標記物部分可與探針中核苷酸的糖、磷酸或鹼基部分相連。在另一些實施方案中，所述一個或多個標記物部分可連接在探針的兩個殘基之間。
在本發明的某些實施方案中，可以用一個以上的標記物部分標記探針。在某些所述實施方案中，可以分別將每個標記物部分與探針的不同鹼基連接。在其它實施方案中，可以將一個以上的標記物部分與探針的相同鹼基連接。
在某些實施方案中，固定的探針包含螢光部分。不受限制地，螢光部分可以是本領域技術人員已知的任意螢光部分。通常優選具有寬斯託克斯頻移的螢光部分，從而可以應用具有濾波器的螢光計，而不是單比色計，並提高檢測效率。在某些實施方案中，所述螢光部分可選自螢光素家族染料(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA)、多滷螢光素家族染料(ABI，Foster City，CA)、六氯螢光素家族染料(ABI，Foster City，CA)、香豆素家族染料(Tnvitrogen-MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)、羅丹明家族染料(GE Healthcare)、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料和BODIPY家族染料(Molecular Probes，Inc.)。在一種實施方案中，所述螢光部分為6-羧基螢光素(FAMTM)。可應用於本發明探針、方法和試劑盒的其它螢光部分實例可參見美國專利6,406,297、6,221,604、5,994,063、5,808,044、5,880,287、5,556,959和5,135,717。用於本發明的螢光部分可以購自例如Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR。
在某些實施方案中，固定的探針包含猝滅劑部分。猝滅劑部分可選自螢光素家族染料、多滷螢光素家族染料、六氯螢光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料、BODIPY家族染料、低螢光猝滅劑部分和非螢光猝滅劑部分。在某些實施方案中，非螢光猝滅劑部分可以是BHQTM家族染料(包括WO01/86001所述的猝滅劑、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3)(BioSearchTechnologies，Novato，CA)、Iowa BlackTM或Dabcyl(Integrated DNATechnologies，Inc.)。其它特異性猝滅劑部分的實例包括但不限於，例如TAMRA(N，N，N』，N』-四甲基-6-羧基羅丹明)(Invitrogen-Molecular Probes，Inc.)、DABCYL(4-(4』-二甲基氨苯基偶氮)苯甲酸)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Technologies，Inc.)、Cy3TM(GEHealthcare)或Cy5TM(GE Healthcare)。在一種優選實施方案中，猝滅劑部分為BHQ-2。可應用於本發明探針、方法和試劑盒的其它猝滅劑部分的實例可參見美國專利6,399,392、6,348,596、6,080,068和5,707,813。用於本發明的猝滅劑部分可以購自例如Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR。
在本發明的某些實施方案中，探針可以包含螢光部分和猝滅劑部分。在這樣的實施方案中，螢光部分可以是上文所述的本領域技術人員公知的任何螢光部分。此外，猝滅劑部分可以是本領域技術人員公知的任何猝滅劑部分，不受任何限制。典型地，猝滅劑部分將連接於探針的5』末端，並且螢光部分將連接於探針上連接猝滅劑部分3』的位置。
雖然不想受限於任何特定的理論或作用機制，當探針完整時，螢光部分發射的光子仍被認為可以被猝滅劑部分吸收並猝滅。該猝滅劑部分接著以不同波長光子的形式或熱形式釋放光子的能量。因此，猝滅劑部分也可以是螢光部分。如上所述，該現象被稱為螢光共振能量轉移(「FRET」)。探針在螢光部分與猝滅劑部分之間的裂解導致猝滅劑部分對螢光部分所發射螢光的猝滅的減少。
通常，螢光部分與猝滅劑部分之間的能量轉移取決於該螢光部分與猝滅劑部分之間的距離和特定的螢光部分-猝滅劑部分對的臨界轉移距離。該臨界轉移距離是與已知猝滅劑部分配對的已知螢光部分的特徵和常數。此外，當螢光部分-猝滅劑部分對的臨界轉移距離接近該螢光部分與猝滅劑部分之間的距離時，便可更靈敏地確定螢光部分與猝滅劑部分的空間關係。相應地，熟練的實施者可以選擇螢光部分和猝滅劑部分，以具有特定的臨界轉移距離，該距離與探針上螢光部分和猝滅劑部分的分隔距離相近。特定的螢光部分-猝滅劑部分對的臨界轉移距離是本領域熟知的，可參見例如，Wu和Brand在1994，Anal.Biochem.2181-13中的論文。
對特定螢光部分-猝滅劑部分對而言的其它標準包括例如，螢光部分發射的螢光的量子產率；螢光部分發射的螢光的波長；猝滅劑部分的消光係數；猝滅劑部分發射的螢光的波長，如果有的話；以及猝滅劑部分發射的螢光的量子產率，如果有的話。此外，如果猝滅劑部分也是螢光部分，可優選地對該猝滅劑部分和螢光部分進行選擇，以易於將其中一個部分發射的螢光與另一個部分發射的螢光區分開。與選擇特定螢光部分-猝滅劑部分對有關的進一步指導可參見被完整引入本文作為參考的Klostermeier和Millar在2002，Biopolymers 61159-179中的綜述論文。
可應用於本發明的螢光部分和猝滅劑部分的典型組合包括，但不限於，6-羧基螢光素(FAM)螢光團部分和Cy5TM猝滅劑部分；選自FAM、TET、JOE、HEX、Oregon Green的螢光團部分和BHQ-1猝滅劑部分；選自FAM、TAMRA、ROX、Cy3、Cy3.5，、CAL Red、Red 640的螢光團部分和BHQ-2猝滅劑部分；選自Cy5和Cy5.5的螢光團部分和BHQ-3猝滅劑部分。可被應用於本發明探針、方法和試劑盒中的其它螢光部分-猝滅劑部分對實例可參見美國專利6,245,514。
可作為螢光和猝滅劑部分應用於FRET的分子實例包括螢光素、6-羧基螢光素、2』7』-二甲氧基-4』5′-二氯-6-羧基螢光素、羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基-X-羅丹明和5-(2』-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。螢光部分究竟是供體還是受體是根據其激發和發射光譜以及與其配對的螢光部分確定的。例如，FAMTM是由波長為494nm的光最為有效地激發的，並發射光譜為500-650nm的光，且最大發射波長為525nm。因此，FAMTM是適合與作為猝滅劑部分且最大激發波長為555nm的TAMRA一起應用的螢光部分。
在某些實施方案中，標記物部分是非螢光可檢測部分，例如，放射性同位素、生物素部分或生物素結合部分(如親和素、鏈親和素、neutravidin)。當非螢光可檢測部分是生物素或生物素結合部分時，可以用分別連接於第二生物素結合部分或生物素的本領域公知的可檢測標記物檢測靶核酸。例如，可以將放射性同位素、酶(如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶)或螢光團連接於第二生物素結合部分或生物素、
探針通常是通過其3』末端連接於固體基質。典型地，探針是共價結合的，但也可以非共價連接於基質。固定的探針和固體基質之間特定的鍵對本發明的成功不是關鍵的，只要該鍵可以承受擴增反應所需的條件。例如，在PCR反應中，鍵應該承受間歇和重複暴露於使核酸序列變性的溫度(80℃-105℃，通常約95℃)。在一些實施方案中，探針可以通過在探針3』末端位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大約35或大約40個殘基的範圍內的殘基上與固體基質連接。典型地，探針將通過其3』末端連接於固體基質。可以修飾探針，使其在3』末端含有親核基團(即，氨基)或親電基團。通常可以採用本領域公知的亞磷醯胺化學法修飾探針。例如，可以從GlenResearch of Sterling，Virginia購買核苷胺基酸修飾劑亞磷醯胺。或者，探針可以連接於與寡核苷酸結合的固體基質上的活化的化學基團，例如，羧酸酯、醛部分、環氧化物部分、包括N-羥基琥珀醯亞胺的NHS酯、氨基部分、硝基部分、羥基部分、異硫氰酸酯部分、二氯三嗪基部分。典型的活化的化學基團包括環氧化物部分、羧酸酯部分、NHS酯、醛部分。包含用於捕獲寡核苷酸的活化的化學部分的固體基質可以購自Telechem International，Inc.，Sunnyvale，CA，NalgeNunc，Intl.，Rochester NY和Exiqon，Vedbaek，Denmark。用於固定本發明的探針的額外的連接部分可以購自Pierce Biotechnology，Rockford，IL。
5.固體基質固體基質可以包括任何能夠承受擴增反應所需條件的材料。例如，在PCR中，固體基質應該承受間歇和重複暴露於使核酸序列變性的溫度(80℃-105℃，通常約95℃)。用於固體基質組成的示例的材料包括，但不限於，玻璃、矽組合物、塑料、合成聚合物(即聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯等)、金屬、陶瓷等。固體基質通常具有平坦的表面，在其上連接寡核苷酸探針，並且可以是適於用於實施本發明的方法的特定測定或裝置的任何性狀。固體基質的示例的形狀包括圓形、橢圓形、正方形、矩形、三角形，和任意其它多邊形。固體基質可以是平皿、多孔板、測定管(即PCR管)、顯微鏡載玻片的形式。用於本發明的方法的平皿的表面積通常是大約1.0mm2-1.0cm2，例如，大約1.0mm2、2.0mm2、3.0mm2、4.0mm2、5.0mm2、6.0mm2、7.0mm2、8.0mm2、9.0mm2、1.0cm2、2.0cm2、3.0cm2、4.0cm2、5.0cm2。本發明的平皿的厚度是大約0.5mm-大約1.0cm，更通常是大約1.0mm、2.0mm、3.0mm、4.0mm、5.0mm、6.0mm、7.0mm、8.0mm、9.0mm。適用於本發明的微孔板包括可以從例如Corning Lifesciences，Acton，MA(DNA binding Thermowell板)和Nalge Nunc，Intl.(ArrayCoteTM板)購買的那些。用於本發明的顯微鏡載玻片包括可以獲自例如Telechem International，Inc.，Sunnyvale，CA(即SuperEpoxide和SuperAldehyde載玻片)、Asper Biotech，Tartu，Estonia(即3-氨基丙基三甲氧基矽烷+1，4-亞苯基二異硫氰酸酯活化的載玻片)、Nalge Nunc，Intl.，Rochester NY(即NucleolinkTM微陣列載玻片)、Grace Bio-Labs，Bend，OR(即Hybriwell chamber載玻片)和Bio-Rad Laboratories，South San Francisco，CA(即Frame-Seal system)的那些。
具有平坦表面的固體基質通常具有反應室，例如，可密封的凹孔或可密封的凸出的容器，以容納用於擴增反應的擴增試劑。凹孔或凸出的容器應該密封，使得用於擴增反應的預定體積的液體不會蒸發。任選地，凸出的反應容器任選可以從具有平坦表面的固體基質上除去。反應室可以用例如適於密封的蓋子或用橡膠或矽墊圈密封。可以通過用膠水或填縫材料密封閉合處，或通過將反應室維持在壓力下而使漏液或漏氣最少或不發生。
6.檢測和/或定量靶核酸的方法概言之，本發明的方法包括在通過3』末端固定於固體基質並且在5』末端包含標記物部分的寡核苷酸探針的存在下，通過擴增靶核酸而檢測靶核酸。這些方法通常包括在擴增試劑存在下，使與靶核酸雜交的固定的探針與具有5』核酸酶的酶接觸。然後，具有5』核酸酶的酶在5』核酸酶反應中使與靶核酸雜交的固定的探針斷裂，從而釋放與5』末端連接的標記物部分。可用用於檢測探針斷裂的標記物部分標記該探針。這種方法是基於美國專利6,214,979、5,804,375、5,487,972和5,210,015所描述的方法。
不加限制，在5′核酸酶反應中，所述核酸、引物和固定的探針可與本領域已知具有5′-3′核酸酶活性的任意酶接觸。優選條件可使聚合酶裂解固定的探針的5』末端並從所述核酸釋放探針的多個片段。具有5′核酸酶活性的優選酶包括模板依賴型核酸聚合酶。已知天然和重組形式的這種聚合酶包括例如，大腸桿菌DNA聚合酶I(Fermentas，Inc.，Hanover，MD)、嗜熱脂肪芽胞桿菌DNA聚合酶和Thermococcuslittoralis DNA聚合酶。
在優選的實施方案中，具有5′核酸酶活性的酶是熱穩定性和熱活性的核酸聚合酶。這種熱穩定聚合酶包括但不限於來源於真細菌屬，即棲熱菌屬、棲熱袍菌屬和棲熱腔菌屬的多個菌種的天然和重組形式的聚合酶。例如，可應用於本發明方法的棲熱菌屬菌種的聚合酶包括美國專利5,405,774、5,352,600、5,079,352、4,889,818、5,466,591、5,618,711、5,674,738和5,795,762所述的水生棲熱菌(Taq)DNA聚合酶、嗜熱棲熱菌(Tth)DNA聚合酶、棲熱菌種Z05(Z05)DNA聚合酶和棲熱菌種sps17(sps17)。可應用於本發明方法的棲熱袍菌屬聚合酶包括例如海棲熱袍菌DNA聚合酶和那不勒斯棲熱袍菌DNA聚合酶，而可被採用的一個棲熱腔菌屬聚合酶實例是非洲棲熱腔菌DNA聚合酶。國際專利申請PCT/US91/07035其
發明者D·波拉特, S·G·威爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司