一種枯草芽孢桿菌脂肪酶及製備方法和應用的製作方法

2023-06-28 23:47:01

專利名稱：一種枯草芽孢桿菌脂肪酶及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子酶工程學與生物技術，具體涉及一種高活力脂肪酶的編碼基因， 同時涉及該突變基因編碼的脂肪酶蛋白的製備方法。高酶活脂肪酶突變株蛋白可以廣泛應 用於食品、化工和醫藥等行業。
背景技術：
脂肪酶(LipaSe，E. C. 3. 1. 1. 3)是催化油脂水解的一類酶的總稱。按照國際生化聯 合會的原則，它的系統名稱為三脂醯甘油醯基水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)， 習慣稱為脂肪酶。脂肪酶在動植物的各種組織及微生物中普遍存在，是生物體內脂代謝不 可缺少的重要水解酶。脂肪酶屬於α/β摺疊酶家族，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶的催化 遵循絲氨酸水解酶的反應機制，能夠在油水界面上將甘油三酯完全水解成脂肪酸和甘油， 因而脂肪酶能夠催化脂水解、脂合成和脂交換等多種反應，被應用於油脂處理、洗滌劑、食 品加工、精細化工、製藥、造紙等多種行業。脂肪酶是研究得最早的酶類之一。人們於1834年首先在動物胰臟發現脂肪酶的 活性，至今已有近二百年的歷史。1871年報導了植物種子脂肪酶，而上世紀初人們從微生物 中也發現了脂肪酶。由於微生物脂肪酶種類多，具有比動植物脂肪酶更廣的反應PH值、反 應溫度以及對底物的反應專一性，又便於進行工業化生產和獲得高純度的酶製劑，再加上 微生物脂肪酶在理論研究和實際應用中都非常重要，因此它們在研究和應用上的進展相當 迅速。產脂肪酶的微生物種類很多，遍及細菌、酵母及黴菌各大類中，迄今已經報導的65個 屬中，細菌28個屬，放線菌4個屬，酵母菌10個屬，其它真菌23個屬。迄今為止，黑麴黴、 白地黴、毛黴、螢光假單胞菌等所產生的脂肪酶已經相繼獲得結晶。其它如無根根黴、圓柱 形假絲酵母、耶爾氏球擬酵母、粘質色桿菌等來源的脂肪酶也相繼得到高度提純，並對它們 的理化性質開展了進一步的研究。儘管產脂肪酶微生物容易發現，但尋找適合於工業規模生產的脂肪酶產生菌及其 發酵條件卻非常困難。在通過傳統誘變育種以及優化發酵條件提高脂肪酶產量方面已經開 展了大量的工作，並使得許多脂肪酶實現了工業化生產。近年來隨著基因操作技術的深入 發展和應用，人們能夠越來越多的通過直接對酶基因的改造，獲得更適合於生產實踐需求 的脂肪酶製劑。在眾多的脂肪酶中，枯草桿菌脂肪酶Lip A作為一種細菌來源的脂肪酶，具 備許多優良的性質，如分子量小，催化活力高，底物範圍廣，是一種嗜鹼性脂肪酶等，因此其 具有較好的食品工業及化學工業等方面的應用潛力。但是，由於枯草桿菌脂肪酶高濃度時 容易聚集，給其純化和應用帶來很大困難，所以通過改造Lip Α，得到高酶活突變株，使其在 低濃度範圍就具有高催化活性，具有重大意義。

發明內容
本發明的目的是在於提供了一種高酶活脂肪酶突變株蛋白的編碼基因LipA(R33W/L140F)，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列以及所述的序列編碼的突變酶，該突變酶具有SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列。通過重疊PCR引入突變，連接於表達載體，獲 得高活力脂肪酶產生菌(Escherichia coli) BL21/pET28a_Lip A f12_C2 (R33W/L140F)，生產 高活力突變體脂肪酶。該突變酶的酶活是野生型的四倍。本發明的另一個目的是在於提供了一種枯草芽孢桿菌脂肪酶的製備方法，該方法 是構建大腸桿菌表達系統，利用親和層析方法純化高酶活脂肪酶突變株蛋白。該方法簡便， 成本低廉。本發明的再一個目的是在於提供了一種高酶活脂肪酶突變株蛋白在皮革加工工 業中的應用。在皮革加工中的浸水和/或浸灰工藝中添加該蛋白可以水解並分散皮革中的 脂肪，使油脂分子變小、水溶性增強而達到皮革脫脂的目的。本發明提供的突變體蛋白對 不同碳鏈長度的底物的催化活性是野生型的4倍以上，應用於皮革脫脂時，在保證相同催 化功效的前提下，與野生型酶製劑相比可以有效減少酶製劑的使用量，不但可以節約成本， 同時可以避免脂肪酶高濃度應用容易發生聚集而降低催化效率的問題，提高皮革的脫脂效^ ο為了實現上述任務，本發明採用以下技術措施本發明的第一個目的是提供一種核苷酸序列，該序列編碼一種高酶活脂肪酶突變 株蛋白，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，其特徵是在於野生型脂肪酶結構基因上具有 97位的C突變為T (R33W)，420位的A突變為T (L140F)的點突變。一種高酶活脂肪酶突變 株蛋白的製備方法，其步驟是1.突變脂肪酶LipA(R33W/L140F)突變點的引入(1)設計誘變引物，採用重疊PCR法依次在脂肪酶基因上把野生型Lip A基因上 97位的C突變為T (R33W)，420位的A突變為T (L140F)；(2)上述PCR產物經膠回收純化後，用限制性內切酶BamHI和Hind III進行酶 切，與經過相同酶切的質粒pET28a(+)(購自Novagen公司)片段連接後，轉化大腸桿菌 BL21(DE3)(購自Novagen公司)感受態細胞，獲得大腸桿菌菌株(Escherichia coli)BL21/ pET28a-Lip A f12-C2 (R33W/L140F)；2.鑑定重組質粒pET28a-LipA(R33W/L140F)用酶切、PCR方法對重組質粒進行鑑 定，並測序檢驗，一種分離的蛋白質(一種高活性脂肪酶的編碼基因)，其編碼基因為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。由此得到具有SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列。本發明所述的編碼高酶活脂肪酶突變株蛋白的基因Lip A(R33W/L140F)，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，有以下特徵1.本發明所用的脂肪酶野生型基因來自枯草芽孢桿菌，結構基因長度為546bp。2.具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，與野生型相比在此結構基因上具有兩處 點突變，即97位的C突變為T (R33W)，420位的A突變為T (L140F)。3.基因Lip A R33W/L140F)編碼的脂肪酶蛋白對不同碳鏈長度的底物(C4-C16) 的催化活性是野生型的4倍以上，並與野生型酶具有相似的熱穩定性。本發明的高酶活脂肪酶突變株蛋白可用如下方法生產。以下具體的操作按照常規實驗條件，如《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學出版 社中所述的條件進行。一種高酶活脂肪酶突變株蛋白的製備方法，其步驟是
1.突變脂肪酶LipA(R33W/L140F)突變點的引入(1)設計誘變引物，採用重疊PCR法依次在脂肪酶基因上把野生型LipA基因上97 位的C突變為T (R33W)，420位的A突變為T (L140F)；(2)上述PCR產物經膠回收純化後，用限制性內切酶BamHI和Hind III進行酶切， 與經過相同酶切的質粒pET28a(+)片段連接後，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，獲得 大腸桿菌菌株 BL21(DE3)/Lip A (R33W/L140F)；2.鑑定重組質粒pET28a_Lip A (R33W/L140F)用PCR方法對重組質粒進行鑑定， 並測序檢驗，一種分離的蛋白質，由此得到具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。3.將大腸桿菌BL21(DE3)/Lip A (R33W/L140F)單克隆子轉到5ml含有卡那黴素的 液體LB培養基中培養過夜，次日取過夜培養物2.5ml以(ν/ν)的接種量轉接到250ml 的液體培養基中在37°C的條件下振蕩培養至0D600為0. 6，加入IPTG至終濃度為0. 4mM,控 制溫度在18°C進行突變蛋白的誘導表達；4.將誘導培養的菌體以SOOOrpm在4°C冷凍離心機中離心，棄掉上清，收集菌體。 以Mili-Q級水、平衡緩衝液分別洗滌菌體一次，洗去菌體上殘留的培養基。將250ml的菌體 以25ml的平衡緩衝液重懸，以超聲波處理菌液30min，至菌液澄清。在4°C冷凍離心機中， IOOOOrpm下離心菌液30min，取上清，棄雜質。將上清經0. 45 μ m的濾膜過濾，即得粗酶液；5. Lip A(R33W/L140F)突變體蛋白的純化採用金屬螯合的親和層析法，粗酶液經過親和純化，即可得到具有SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列的高酶活脂肪酶突變株蛋白，一 種分離的蛋白質，其序列為SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。6.採用SDS-PAGE方法檢測突變蛋白的純度；7.將脂肪酶底物融入異丙醇中配成25mM的母液，稀釋酶液至10μ g/ml。反應在 pH8. 0的磷酸緩衝液(部分長鏈底物需加0. 1% (ν/ν)阿拉伯膠作乳化劑)中進行，底物終 濃度為0. 5mM，反應溫度為37°C，200ul體系中含5μ 1稀釋酶液。用酶標儀監測0D405在 Imin內的變化，檢驗突變脂肪酶的活性。注以上提到的LB培養基配方如下LB液體培養基(w/w)胰蛋白腖，0. 5% (w/w)酵母抽提物，(W/W)NaCl，用 蒸餾水配置，調節pH至7. 0，在1. 034X105Pa高壓下蒸氣滅菌20分鐘。LB固體培養基在上述LB液體培養基的基礎上加入1. 5-2. 0% (w/w)瓊脂。發酵產酶培養基在LB培養基中加卡那黴素至終濃度為0. 4mM即可。本發明獲得的一種枯草芽孢桿菌脂肪酶在食品、化工和醫藥等行業有著廣泛的應 用。在食品工業中它可用於油脂改性、乳酪的熟化和後期風味的強化等；在化工工業中它可 用於絹紡、皮毛、皮革、明膠等的脫脂、添加到洗滌劑中增加洗滌劑的去汙能力等；在醫藥行 業中它可可作為幫助消化、降低血脂、治療局部炎症的藥物、作為臨床診斷脂血病、胰腺炎 等疾病的依據及進行消旋體藥物的生物法手性拆分等。一種高酶活脂肪酶突變株蛋白在皮 革加工中的應用過程是在皮革加工時，對脂肪含量低的原料皮(如牛皮、山羊皮)，將脂肪酶用於主浸水 和/或浸灰中；對於脂肪含量較高的原料皮(如豬皮、綿羊皮等)，將脂肪酶應用於主浸水 和/或浸灰，以及脫灰/軟化工序中。脂肪酶催化脂肪分子的水解，使皮內的天然脂肪細胞 受到破壞、油脂分子變小、水溶性增強而而達到皮革脫脂的目的。突變體蛋白對不同碳鏈長度的底物的催化活性是野生型的4倍以上，應用於皮革脫脂時，在保證相同催化功效的前 提下，與野生型酶製劑相比可以有效減少酶製劑的使用量，不但可以節約成本，同時可以避 免脂肪酶高濃度應用容易發生聚集而降低催化效率的問題，提高皮革的脫脂效果。所述大腸桿菌表達載體pET28a(+)和大腸桿菌菌株BL21 (DE3)均購自Novagen 公司。所述重組質粒pET28a-Lip A(R33W/L140F)為本發明所構建。所述重組大腸桿菌菌 株 BL21(DE3)/Lip A (R33W/L140F)是具有質粒 pET28a_Lip A (R33W/L140F)的大腸桿菌菌 株，保藏編號CCTCC NO :M2010057，保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址中國.武 漢.武漢大學，保藏日期:2010年3月15日，分類命名大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/ pET28a-Lip A f12_C2 (R33W/L140F)。所述編碼基因 Lip A (R33W/L140F)是具有 SEQUENCE NO. 1的核苷酸序列的高酶活脂肪酶突變株蛋白編碼基因。所述蛋白LipA(R33W/L140F)是 具有SEQUENCEN0. 2的胺基酸序列的高酶活脂肪酶突變株蛋白。本發明的優點和效果本發明中提供的脂肪酶突變株的核苷酸序列和蛋白質序列是一種脂肪酶高酶活 突變株的基因和蛋白質序列，未見報導。本株脂肪酶突變株蛋白對不同碳鏈長度的底物的 催化活性酶活是野生型酶活的4倍以上，同時45°C以下具有良好的熱穩定性，符合實際應 用的要求。而脂肪酶在食品、化工和醫藥等領域有著廣泛的應用，因此，獲得高酶活的脂肪 酶，具有很高的實用價值。特別是脂肪酶高濃度應用時容易聚集，影響催化效率。而該高酶 活突變株可以在低濃度範圍提供高催化活性，即達到相同催化效力，酶的添加量僅為野生 型的四分之一，有效避免高濃度應用酶發生聚集的問題。


圖1為一種重組質粒的構建示意圖(1)用PCR方法擴增出Lip A基因；(2)設計誘變引物，採用PCR定點突變法依次在脂肪酶基因上把野生型LipA基因 上97位的C突變為T (R33W)，420位的A突變為T (L140F)；(3)上述PCR產物經膠回收純化後，用限制性內切酶BamHI和Hind III進行酶切， 與經過相同酶切的質粒pET28a(+)片段連接後，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，獲得 獲得重組質粒 pET28a-Lip A (R33W/L140F)；圖2為一種重組表達質粒pET28a_Lip A(R33W/L140F)的PCR鑑定結果示意圖 (1%瓊脂糖凝膠電泳)。如圖2所示，以上下遊引物擴增出的條帶大小為546bp，與Lip A結構基因大小 一致。結果證明高酶活脂肪酶突變株蛋白編碼基因LipA(R33W/L140F)已克隆到表達載體 pET28a(+)，重組表達質粒 pET28a-Lip A (R33W/L140F)構建成功。圖3為一種純化後的重組大腸桿菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET28a_LipA f12-C2(R33ff/L140F)誘導表達產生的高酶活脂肪酶突變株蛋白(10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠 電泳檢測)脂肪酶分子量約為21kDa，與結果相符。圖4為一種突變酶與野生型的熱穩定性比較示意圖將野生型和突變株酶液分別置於45°C和50°C下，每隔十分鐘取樣測定剩餘酶活，評價了酶的熱穩定性。如圖4(a)所示，在45°C水浴中水浴保存1小時內，野生型和突變株酶活都沒有明顯損失。50°C中水浴保存10分鐘後，突變株Lip A(R33ff/L140F)酶活開始快 速下降，20分鐘後降至原來的20%左右；野生型在50°C水浴30分鐘後，酶活也開始下降， 但下降幅度較小，1小時後野生型仍可保留80%以上的活性，見圖4(b)。總體而言，高酶活 脂肪酶突變株蛋白Lip A(R33W/L140F)在45°C及以下具有良好的熱穩定性，能夠滿足實際 應用的需要。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。實施例中的實驗方法，均按常規 條件進行，具體參考《分子克隆實驗指南》(作者J.薩姆布魯克等，第三版，2003年，科學出 版社)中所述實驗方法。實施例1.高酶活脂肪酶突變株蛋白的獲得圖1顯示了重組突變脂肪酶基因的構建原理和過程。天然的脂肪酶為單體蛋白， 含181個胺基酸，基因長為546bp。一種高酶活脂肪酶突變株蛋白的製備方法，其步驟是1.突變酶LipA(R33W/L140F)編碼基因中突變點的引入(1)設計誘變引物，採用重疊PCR法在Lip A基因上依次把野生型Lip A基因上 97位的C突變為T (R33W)，420位的A突變為T (L140F)。設計脂肪酶定點突變所需引物序列上遊引物5『 -ATTAGGATCCGCTGAACACAATCCAGTCGTTATGG-3 『下遊引物5『 -TATA AAGCTTTTAATTCGTATTCTGGCCCCCG-3 『定點突變引物33W-1 5' -CATACAGCTTGTCCCACGACCAG-3『33W-2 5' -ATCTCAGGGCTGGTCGTGGGACAAG-3『140F-1 5' -CTAATCTTGAAAAGTAATTC-3『140F-2 5' -GTCATGAATTACTTTTCAAG-3『以野生型脂肪酶基因片段為模板，用上遊引物與引物33W-1為PCR引物，擴增出約 IlObp 的基因片段。PCR 循環條件-MV 5min ；94°C 30sec，52°C 40sec，72°C 40sec，30 個循 環；72°C5min。PCR擴增產物經1.8% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。用下遊引物與引物33W-2作為PCR反應的引物，以野生型脂肪酶基因片段為模板， 擴增出 450bp 的基因片段。PCR循環條件-MV 5min ；94°C 30sec，52°C 40sec，72°C 60sec, 30個循環；72°C 5min。PCR擴增產物經1. 2% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。將以上得到的兩種PCR產物混合，加入上、下遊引物再次進行PCR，PCR反應條件 為94°C 5min ；94°C 30sec,50°C 60sec，72°C 60sec，30 個循環；72°C IOmin0 PCR 擴增產物 經1.2% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點R33W的脂肪酶基因片段。以突變體R33W脂肪酶基因片段為模板，分別以上遊引物與引物140F-1作為一對PCR引物，下遊引物與引物140F-2作為一對PCR引物，通過兩次PCR操作，分別獲得大小約 為430bp和130bp的PCR產物。然後將兩種PCR產物混合，加入上、下遊引物再次進行PCR， 獲得含有突變位點R33W和L140F的脂肪酶基因片段Lip A (R33W/L140F)。(2)上述PCR產物經膠回收純化後，用限制性內切酶BamHI和Hind III進行酶切，用T4連接酶與經過相同酶切的質粒pET28a(+)片段連接，16°C連接過夜後連接產物轉 化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，用卡那黴素-LB平板篩選得到陽性菌落，經過鑑定(見 下一步驟)，命名為大腸桿菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET28a_Lip A f12-C2(R33W/ L140F)；2.質粒 pET28a_LipA(R33W/L140F)的鑑定用質粒抽提試劑盒從陽性菌落BL21 (DE3)/Lip A(R33W/L140F)培養物中分別提取 質粒pET28a-Lip A (R33W/L140F)，採用PCR方法對重組質粒進行鑑定。以上下遊引物進行 PCR，擴增出的條帶大小約為546bp，如圖2，與預期大小相符。與Lip A結構基因大小一致。質粒上LipA (R33W/L140F)基因的序列測定由英俊(invitrogen)生物技術有限公 司進行。測序引物是利用質粒pET28a(+)上的通用引物，測序結果表明獲得的Lip A(R33ff/ L140F)基因序列與預期設計完全一致，由此得到具有SEQ ID NO. 1所示序列的高酶活脂肪 酶突變株蛋白編碼基因Lip A(R33W/L140F)。Lip A(R33W/L140F)基因全長546nt，編碼181 個胺基酸的蛋白。將產生的質粒命名為pET28a-LipA(R33W/L140F)。4.重組質粒 pET28a_Lip A (R33W/L140F)的提取將BL21 (DE3)/Lip A (R33W/L140F)接種到LB培養基，37°C過夜培養，用質粒抽提 試劑盒提取質 pET28a-Lip A (R33W/L140F)。4.突變體蛋白Lip A(R33ff/L140F)的誘導表達；將大腸桿菌BL21 (DE3)/Lip A (R33W/L140F)單克隆子轉到5ml含有卡那黴素的液 體LB培養基中培養過夜，次日取過夜培養物2.5ml以(ν/ν)的接種量轉接到250ml的 液體培養基中在37°C的條件下振蕩培養至0D600為0. 6，加入IPTG至終濃度為0. 4mM,控制 溫度在18°C進行突變蛋白的誘導表達5.突變體蛋白LipA(R33W/L140F)酶液的提取；將誘導培養的菌體以SOOOrpm在4°C冷凍離心機中離心，棄掉上清，收集菌體。以 Mili-Q級水、平衡緩衝液分別洗滌菌體一次，洗去菌體上殘留的培養基。將250ml的菌體 以25ml的平衡緩衝液重懸，以超聲波處理菌液30min，至菌液澄清。在4°C冷凍離心機中， IOOOOrpm下離心菌液30min，取上清，棄雜質。將上清經0. 45 μ m的濾膜過濾，即得粗酶液；6.突變體蛋白 Lip A(R33ff/L140F)的純化；採用金屬螯合的親和層析法，具體採用GE公司的預裝柱His Trap FF 1ml，在 ATKA系統上進行。粗酶液經過親和純化，即可得到具有SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列的 高酶活脂肪酶突變株蛋白，一種分離的蛋白質，其序列為SEQID NO. 2所示的胺基酸序列。實施例2 突變體蛋白LipA(R33W/L140F)的活性檢測及其他酶學性質分析。將不同碳鏈長度的各種底物融入異丙醇中配成25mM的母液。將酶液用反應緩衝液稀釋成 ο μ g/ml。反應在pH8. 0的磷酸緩衝液(部分長鏈底物需加0. 1 % (ν/ν)阿拉 伯膠作乳化劑)中進行，反應溫度為37°C，200ul體系中含5μ 1稀釋酶液，底物終濃度為 0. 5mM，利用酶標儀監測0D405在Imin內的變化。酶活單位定義為在37°C下，每分鐘產生 1 μ mol對硝基苯酚所需要的酶量。用Bio-Rad公司生產的蛋白質濃度測定試劑盒測定，以BSA作標準曲線。計算酶比活
熱穩定性分析催化活性提高的突變體有時會伴隨熱穩定性的降低，將野生型和突變株酶液分別 置於45°C和50°C下，每隔十分鐘取樣測定剩餘酶活，評價了酶的熱穩定性。如圖4(a)所 示，在45°C中水浴中水浴保存1小時內，野生型和突變株酶活都沒有明顯損失。500C中水浴 保存10分鐘後，突變株Lip A(R33ff/L140F)酶活開始快速下降，20分鐘後降至原來的20% 左右；野生型在50°C水浴30分鐘後，酶活也開始下降，但下降幅度較小，1小時後野生型仍 可保留80%以上的活性，見圖4(b)。但總體而言，高酶活脂肪酶突變株蛋白Lip A(R33ff/ L140F)在45°C及以下具有良好的熱穩定性，能夠滿足實際應用的需要。實施例3 一種枯草芽孢桿菌脂肪酶在皮革加工中的應用。原料皮中含有不同程度的脂肪，這些脂肪主要以脂肪細胞形式存在於皮下組織和 皮纖維之間，而脂肪含量較多的豬皮、綿羊皮等還有大量脂肪細胞存在於毛囊周圍。根據原 料皮防腐儲存狀態及脂肪含量不同，將突變體蛋白Lip A(R33ff/L140F)以0. 04-0. 2%的添 加量添加到牛皮、羊皮或豬皮等皮革加工中主浸水和/或浸灰工藝，脂肪酶特異性催化脂 肪的水解，使皮內的天然脂肪細胞受到破壞、油脂分子變小、水溶性增強而達到皮革脫脂目 的。大量的應用研究表明，利用脂肪酶進行皮革脫脂，可以提高成革的抗撕裂強度和抗張強 度，磨削後具有很好的散絨效果，絨頭細緻、柔順。同時使用脂肪酶進行皮革脫脂可減少表 面活性劑的使用，無需再用溶劑脫脂，利於環境保護。本發明所述的突變體蛋白對不同碳鏈 長度的底物的催化活性是野生型的4倍以上，應用於皮革脫脂時，在保證相同催化功效的 前提下，與野生型酶製劑相比可以有效減少酶製劑的使用量，不但可以節約成本，同時可以 避免脂肪酶高濃度應用容易發生聚集而降低催化效率的問題，提高皮革的脫脂效果。
權利要求
一種枯草芽孢桿菌脂肪酶，其特徵在於該酶在大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21/pET28a-Lip A f12-C2(R33W/L140F)的表達，CCTCC NOM2010057。
2.一種分離的蛋白質，其編碼基因為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.一種分離的蛋白質，其序列為SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。
4.權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌脂肪酶在皮革加工中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種枯草芽孢桿菌脂肪酶及製備方法和應用，一種枯草芽孢桿菌脂肪酶，大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-Lip A f12-C2(R33W/L140F)，CCTCC NOM2010057。這種高活力脂肪酶突變體的編碼基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其編碼的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列，其步驟是第一是通過PCR擴增出枯草芽孢桿菌脂肪酶Lip A結構基因；第二是設計二對誘變引物，通過重疊PCR法將兩個突變位點依次引入脂肪酶Lip A基因；第三獲得高活力脂肪酶產生菌BL21(DE3)/Lip A(R33W/L140F)；第四是在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達目的蛋白；第五是純化蛋白。一種枯草芽孢桿菌脂肪酶在皮革加工中的應用。本發明方法易行，成本低廉，高酶活脂肪酶突變株蛋白在食品、化工和醫藥等行業具有重要應用價值。
文檔編號C12N9/20GK101838634SQ20101018710
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月25日 優先權日2010年5月25日
發明者危宏平, 周亞鳳, 崔宗強, 張先恩, 張治平, 王曉英, 王殿冰 申請人:中國科學院武漢病毒研究所