功能化納米微粒及其使用方法
2023-06-29 01:00:46
專利名稱：功能化納米微粒及其使用方法
技術領域：
本發明一般涉及納米微粒和製備及使用納米微粒的方法。更具體地說，本發明涉及塗敷生物活性物質的納米微粒，以及使用這種納米微粒的方法。
背景技術：
納米微粒是非常小的顆粒，其直徑通常小達1納米到大達數百納米。因為尺寸小，納米微粒有待用來生產各種產品，例如許多不同的生物和醫藥應用中的有用工具。
發明概述本發明基於開發與一種或多種生物活性分子，如核酸、抗體和酶結合的納米微粒。本發明的納米微粒可用作信號探針和分離工具，用於超靈敏細胞標記和核酸的分析及分離。
因此，本發明的特徵是將納米微粒定向靶分子的方法。該方法包括如下步驟提供具有氧化矽表面的納米微粒，氧化矽表面與至少一個能與靶分子特異性結合的官能團偶聯；然後在至少一個官能團與靶分子結合的條件下，納米微粒和靶分子混合在一起。
所用納米顆粒可具有被氧化矽表面包封的一個芯。所述芯可以是金屬(例如磁性金屬)或染料(例如有機或無機染料)。偶聯氧化矽表面的官能團可以是蛋白質，如抗體、酶、抗生物素蛋白或生物素，也可以是核酸，如DNA。核酸可呈分子信標的形式，例如與螢光團和螢光團的淬滅劑偶聯的分子信標。官能團可以通過生物素-抗生物素蛋白與氧化矽表面偶聯。
與納米微粒定向結合的靶分子可以是細胞內、細胞表面上的分子或在細胞內部。細胞可以是真核細胞，如哺乳動物細胞(例如癌細胞)，也可以是原核細胞，如細菌。靶分子也可以包含在液體中。
本發明方法還包括檢測納米微粒與靶分子結合的步驟，例如通過觀察納米微粒的性質(例如光發射)的改變來檢測納米微粒與靶分子的結合。如果靶分子包含在混合物內，則該方法可包括將含有納米微粒的複合物從混合物中分離出來的步驟，其中納米微粒結合在靶分子，還包括將靶分子從複合物中分離出來的步驟。
這裡所用詞彙「納米微粒」是指直徑在約1-1000nm之間的微粒。納米微粒的「尺寸」是指納米微粒最大的直線尺寸的長度。例如，完整的球形納米微粒的尺寸是其直徑。
這裡所用「核酸」或「核酸分子」是指兩個或多個核苷的鏈，如RNA(核糖核酸)和DNA(脫氧核糖核酸)。「純化的」核酸分子是指細胞或生物體的其他核酸序列中基本分形或分離的核酸分子，其中核酸是天然產生的(例如30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99、100％無汙染物)。
這裡所用「蛋白質」或「多肽」是同義詞，指由胺基酸的任何肽連接的鏈，不管長度或翻譯後修飾，例如糖基化或磷酸化。
當涉及一種核酸與另一種核酸的雜交時，「低嚴格條件」指在42℃10％甲醯胺、5X Denhart溶液、6X SSPE、0.2％SDS中，接著在50℃1X SSPE、0.2％SDS中洗滌；「中等嚴格條件」指在42℃50％甲醯胺、5X Denhart溶液、5X SSPE、0.2％SDS中，接著在65℃0.2X SSPE、0.2％SDS中洗滌；「高嚴格條件」指在42℃50％甲醯胺、5X Denhart溶液、5X SSPE、0.2％SDS中，接著在65℃0.1X SSPE、0.1％SDS中洗滌。「嚴格雜交條件」指低、中等或高嚴格條件。
這裡所用「序列同一性」是指當兩個序列對齊使亞基配對最大化時，在兩個序列中的對應位置上相同亞基的百分數，即要考慮到間隙和插入。當兩個序列中的亞基位置被同樣核苷或胺基酸所佔據時，存在序列同一性，例如，如果一個特定位置被各自的兩個DN中的腺嘌呤佔據時，分子在該位置上是相同的。例如，如果10個核苷酸長度的序列中17個位置與另一10個核苷酸序列中的對應位置相同，則兩個序列的同一性為70％。序列同一性通常用序列分析軟體測定(例如，威斯康辛大學生物技術中心基因計算組開發的序列分析軟體包，學府大道1710，麥迪遜，W威斯康辛53705)。
這裡所用「抗體」包括完整多克隆和單克隆抗體，以及抗體片段。
「詞組特異結合」指樣品中的一個分子識別並粘附於特定的另一個分子上，但不充分識別或粘附於樣品中的其他分子。一般地，與第二個分子「特異結合」的第一個分子是指結合具有結合親和力大於約105-106mol/l的和二個分子的分子。
這裡所用詞組「官能團」指化學基團，它能賦予含有化學基團的物質(例如納米微粒)一種特定功能。例如，官能團可以包括生物活性物質，如抗體、寡核苷酸、生物素或鏈黴抗生物素蛋白，已知它們與特定分子結合；或者小的化學基團，如胺、羧酸鹽等。
詞組「與……偶聯」指共價或非共價鍵鍵合，或相反例如通過直接或間接連接穩定地緊靠著相連。例如，塗敷有抗生的素蛋白的納米微粒可通過抗生物素蛋白-生物素連接與生物素化抗體偶聯。
除非另有說明，這裡所用的全部技術術語與作為本發明所有領域中普通技術人員通常理解的含義相同。儘管與本文描述的方法和材料類似或相等的方法和材料也可以用於本發明的實踐或測試中，但下面介紹合適的方法和材料。這裡提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻都納八本文作參考。在衝突的情況下，則以本說明書，包括定義為準。此外，下面所討論的具體實施方式
僅是說明性的，不是對本發明的限制。
附圖簡述
圖1是本發明所用納米微粒的剖面圖。
圖2是製備本發明所用納米微粒的方法中涉及的一般步驟的流程圖。
圖3是用納米微粒標記細胞的方法的兩個示意圖(A和B)。
圖4是檢測核酸分子存在的方法的示意圖。
圖5是用分子信標(MB)特異結合併檢測具有特定核苷酸序列的靶核酸分子的高度簡化示意圖。
圖6是從核酸與蛋白質的複雜混合物中分離感興趣的多核苷酸(DNA1』)中涉及的步驟的示意圖。
圖7是用於檢測本發明核酸的一鹼基錯配選擇性方法的兩個圖。(A)是來自完全互補核酸的信號與來自單鹼基錯配核酸的信號；(B)是來自A-T單鹼基錯配核酸的信號與來自G-C單鹼基錯配核酸的信號。
圖8是在MB固定於基因磁性納米俘獲劑(MB-GMNC)或游離於溶液的條件下，顯示MB與靶DNA雙聯的熔化溫度曲線的一系列圖。
圖9是顯示MB-GMNC從複雜DNA-蛋白質混合物中俘獲痕量DNA靶的能力的圖。
圖10是顯示MB-GNMC從細胞裂解液中俘獲痕量靶mRNA的能力的圖。
發明詳述生物活性的氧化矽塗層納米微粒是用油包水微乳液方法製備的，該方法產生大小均勻的顆粒，所述顆粒由被氧化矽殼包封的芯組成。微乳液的製備方法是，組合相對極性液體(如水)、相對非極性液體(如液態烷烴)和一種或多種表面活性劑，形成各向同性、熱力學穩定的單相體系。此體系包含許多很小的球形水池(即反膠團)，作為產生納米微粒芯的反應器。芯產生後，用矽化劑，如原矽酸四乙酯(TEOS)塗敷氧化矽。為了使這些氧化矽塗層的納米微粒具有生物活性，氧化矽塗層與一個或多個生物活性官能團偶聯，如核酸或多肽。下面描述的優選實施方式說明了本發明的各種適應。儘管如此，從這些實施方式的描述中，通過對下面討論的部分稍作調整或改進，容易地適合本發明的其他方面。
納米微粒的特點在簡要描述中，用圖1表示，本發明的優選納米微粒10包含芯12、塗覆芯12的殼14和衍生到殼14上的一種或多種官能團16。儘管納米微粒10的直徑可在約1-1000nm或更大的範圍，對於許多應用，優選在約10-300nm(例如，約10、15、20、25、30、35、50、75、100、150、200、250或300nm)之間。在大量納米微粒10的分散液中，尺寸分布的標準偏差最好不超過納米微粒10的平均直徑(或最大直線尺寸)的約25％(例如1、2、3、5、10、15、20或25％)。
圖1所示納米微粒10是實心的(即基本上沒有孔隙)。儘管此形式是許多應用的優選形式，但本發明的納米微粒也可以是多孔的。實心形式可以按下述方法，用殼14均勻塗敷芯12來製備。可通過用腐蝕劑(例如，當殼14由氧化矽組成時，一種強鹼性溶液)降解實心納米微粒來製備多孔形式，並任選用氧化矽重新塗敷芯12。一般地，當希望芯12與外界隔絕時，最好採用實心形式；當希望增加殼14與外界接觸的表面積時(例如，當用納米微粒10作催化劑時)，或者有時用納米微粒10隔離各種物質時(例如用來「捕獲」孔內物質時)，最好採用多孔形式。納米微粒10中的孔可以具有小於納米微粒10的直徑的任何合適尺寸。例如，這些孔的平均尺寸可以是約0.1、0.5、1、2、3、5、10、20、50或100nm。
芯12可由任何與殼14相容的物質組成。由於芯12將功能特徵賦予納米微粒10，本領域的技術人員可根據組分的已知特點選擇芯12的組成，以適合納米微粒10的特定用途。例如，在希望納米微粒10具有磁性的優選實施方式中，芯12由磁性金屬如磁鐵礦(Fe3O4)、磁赤鐵礦(γFe2O3)或硫復鐵礦(Fe3S4)組成。在此實例中，芯12的組成將磁性賦予納米微粒10，這樣納米微粒10可用在基於磁性的應用中，例如細胞分離/純化。
對於其他應用，芯12可由非磁性金屬或金屬鹽(例如金、銀、硫化鈣等)組成。例如，具有、塗有氧化矽的CdS芯的納米微粒可用作高螢光性或發光性探針。作為另一個例子，為生產染料或色素納米微粒，芯12可包括用於製備「無色素」色素的無機鹽，例如銪鹽、三(2，2』-二吡啶基)二氯釕(Ru/Bpy)、高錳酸鉀、重鉻酸鉀、硫酸鎳、氯化鈷、氯化鐵(III)、硝酸銅等。
芯12也可以由螢光或發光有機染料組成，許多有機染料是已知的。例如，參見《螢光探針和研究產品手冊》(Handbook of Fluorescent Probes and ResearchProducts)，第8版，分子探針公司(Molecular Probes Inc.)。有用的染料的具體例子包括若丹明6G(R6G)、羧基-四甲基-若丹明(TMR)和螢光素。光穩定性實驗顯示，純R6G的強度快速下降，而納米微粒內的同樣R6g的螢光強度在相同條件下沒有明顯變化。由於這種摻雜染料的納米微粒的光穩定性改進，使光褪色減少到最低程度，並能提高使用這種螢光團的測定的精確度。芯12也可由不同物質的混合物構成。例如，如果希望製備一種磁性摻雜染料的納米微粒，芯可由磁性金屬和染料構成。
芯12可以具有小於納米微粒10大小的任何尺寸。因此，芯12的直徑在小於1nm至1000nm之間。對於許多應用，芯12的直徑優選約為1-200nm。作為一個例子，由於動物能排洩尺寸小於約100nm的納米微粒，但保留大於100nm的微粒(主要在肝臟和脾臟中)，所以小到足以摻入在尺寸小於100nm的納米微粒中的芯子優選用於不希望納米微粒留在受試者中的診斷或治療用途。
當用微乳液納米微粒生產技術製備(見下面)時，芯12一般是球形的(常規的反膠團為球形)。但芯12不限於球形。例如，納米微粒10可以是橢圓形或管形，這種形狀優選適用於許多磁性用途，而不是完全的圓形。如果芯12是晶體形式，則納米微粒10可以具有規則或不規則的多面體形狀，如立方形。
殼14是塗敷芯12的物質，它可由可以用本發明方法施塗到芯12上的任何可相容材料組成。例如，殼14可由聚合物(例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、丙烯酸聚合物等)、多糖(如糊精)、無機氧化物(如氧化鋁或氧化矽)或它們的混合物組成。在目前的優選實施方式中，殼14可部分或全部由氧化矽組成。氧化矽優選用於各種應用，因為它在許多環境中是相對不活潑的，是生物相容的，可避免在分散液中與其他納米微粒成團，並且易用許多不同的官能團衍生。儘管圖1所示殼14是單層構型，它也可以是多層構型。例如，殼14可包括塗敷且緊靠芯12的第一個氧化矽塗層，然後是塗敷氧化矽層的第二個層。第二層可由能塗敷到第一層上的任何物質組成。例如，第二層可由浸漬了藥物的可生物降解材料(例如糖或聚合物)組成。當導入動物中時，可生物降解材料和藥物將逐步溶解到動物體內。在其他應用中，殼14可由3、4、5或更多個獨立層組成。
在圖1所示優選實施方式中，殼14完全包封芯12，因此將芯12與外界隔斷。當要求防止芯12與外部因素相互作用時，最好採用這種形式。例如，氧化矽塗層可防止鐵基芯的腐蝕。類似地，完全氧化矽塗層可增強納米微粒基色素的儲存期限，通過防止顏料在溶劑中降解或溶解，並通過氧化作用。在一些變動中，納米微粒10不包括殼14，或者僅部分塗敷殼14(例如當外14已從芯12上部分溶解或降解時)。
殼14可具有任何厚度(即從芯12的外表面到外殼14的外表面的長度)，此厚度與本發明製備納米微粒10的方法相容。利用本發明的優選方法，製成的殼14的厚度可以從小於約1nm到大於約300nm。殼14的優選厚度可隨納米微粒10的特定應用而變化。例如，如果希望減少納米微粒的聚集(此時芯彼此吸引)或殼的降解(例如在苛性溶劑中)，則一般優選相對厚的殼。另一方面，如果希望放大芯的性質(例如色素的顏色)，則一般優選相對較薄的殼。
如圖1所示，官能團16可衍生到殼14的表面上。通過殼14連接於納米微粒10的任何化學或生物基團的形式獲得官能團16。例如，官能團16可以是一種生物活性物質，例如蛋白質，如抗體(單克隆，多克隆)、酶、生物素和鏈黴抗生物素蛋白；核酸分子(例如RNA、DNA)；生化基團，如胺和羧酸鹽。
製備納米微粒的方法現在參看圖2，製備納米微粒的優選方法包括提供微乳液的步驟50；提供反應物水溶液的步驟52；將水溶液加入各等分微乳液中的步驟54；混合等分液以形成產生納米微粒芯的反應混合物的步驟56；在芯中加入塗層劑以形成塗敷納米微粒的步驟58。
步驟50中製備微乳液的方法是，在至少一種表面活性劑的存在下，將至少兩種不溶混的液體混合在一起，形成熱力學穩定的光學各向同性的分散液，此分散液是另一種液體中一種或兩種液體的納米大小液滴。分散液藉助表面活性劑得到穩定，因為表面活性劑可減少兩種液體界面上的表面張力。微乳液可以是油包水型(即反膠團或水滴分散在油中)、水包油型(即膠團或油滴分散在水中)，或者含類似量的兩種不溶混流體的雙連續體系。在某些情況下，微乳液可通過將兩種極性不同、互溶解度可忽略不計的非水液體混合在一起來製備。本發明目前優選採用油包水型微乳液，因為它們與許多已知的化學反應相容，用來在水溶液中沉澱固體。
步驟50中所用不溶混液體一般包括相對極性(即疏水)液體和相對非極性(即親水)液體。儘管可採用各種極性/非極性液體混合物形成用於本發明的微乳液，但具體所用液體的選擇取決於所製備的納米微粒的類型。熟練技術員通過製備本發明所用微乳液的已知方法，可以選擇具體應用的特定液體。儘管其他極性液體也是有用的，但目前優選的相對極性液體是水。優選水是因為它廉價、易得，沒有毒性，便於搬運和儲藏，與大量不同的沉澱反應相容，不溶混於大量非極性溶劑。合適的非極性液體的例子包括烷烴(例如任何液體形式的己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷等)、環烷烴(例如環戊烷、環己烷等)、芳烴(例如苯、甲苯等)和它們的混合物(例如石油和石油衍生物)。一般地，任何這種非極性液體均可採用，只要它與用於形成微乳液的其他組分相容，並且不幹擾所涉及的沉澱反應。
步驟50至少需要一種表面活性劑形成微乳液。表面活性劑是在熱力學上穩定微乳液中很小分散膠團或反膠團的表面活性物質。表面活性劑通常具有兩性結構，可在油相和水相之間形成具有界面張力很低的膜。因此，能減少相對極性和相對非極性液體的界面上的表面張力，並且與本發明其他方面相容的任何物質都可用來形成微乳液，進而用來製備納米微粒。表面活性劑的選擇取決於所用具體液體和要製備的納米微粒的類型。適合特定用途的具體表面活性劑可根據製備微乳液的已知方法或表面活性劑的已知特徵進行選擇。例如，當微乳液的過程中採用離子反應物，並且離子洗滌劑或許與離子反應物結合或相反幹擾離心反應物時，通常優選採用非離子表面活性劑。
已知有許多合適的表面活性劑。不詳盡的名單包括皂類，如油酸鉀、油酸鈉；陰離子洗滌劑，如AerosolOT、膽酸鈉、辛酸鈉等；陽離子洗滌劑，如十六烷基氯化吡啶鎓、烷基三甲基溴化銨、苯扎氯銨、十六烷基二甲基乙基溴化銨等；兩性洗滌劑，如N-烷基-N，N-二甲基氨丙磺酸鹽和CHAPS；非離子洗滌劑，如聚氧乙烯酯、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯山梨聚糖酯、山梨聚糖酯和各種Triton(例如TX-100、TX-114等)。
步驟50中所用表面活性劑的濃度取決於許多因素，包括所選的具體表面活性劑、所用液體和要製備的納米微粒的類型。合適的濃度可根據經驗確定，即嘗試不同濃度的表面活性劑，直到發現在特定應用中表現最好的濃度。合適的濃度範圍也可根據已知的臨界膠團濃度確定。
在優選實施方式中，用二(2-乙基己基)磺基琥珀酸鈉鹽(AerosolOT、AOT)產生水和異辛烷的微乳液；用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)產生正己烷、正己醇和水的微乳液；用Triton X-100(TX-100)產生環己烷、正己醇和水的微乳液。雖然在本發明的大多數應用中，步驟50隻用一種表面活性劑穩定微乳液，但也可以用一種或多種共表面活性劑。使用共表面活性劑有時有利於穩定反膠團體系。例如，在油和水的混合物中加入表面活性劑(如肥皂)的水溶液產生牛奶狀乳化。加入共表面活性劑，如中等鏈長的醇，可使牛奶狀乳液自然澄清，由於在油中形成很小的球形分散水滴。這種共表面活性劑功能進一步降低相間的界面張力，從而促進分散相的很小顆粒的形成。用於本發明的合適的共表面活性劑包括己醇、丁醇、戊醇、辛醇等中等鏈長的醇。步驟50的微乳液可通過簡單地混合相對極性液體、相對非極性液體和一種或多種表面活性劑製備。對於製備油包水微乳液(含有水性反膠團)，相對非極性液體的體積大大超過相對極性液體的體積(例如，非極性液體極性液體體積比在約10000∶1-100∶1之間)。儘管加入表面活性劑有時在不另外攪拌的情況下形成微乳液，但一般對混合物進行機械攪拌(例如用磁力)或超聲處理。以形成微乳液。用於本發明的許多微乳液可在室溫製備(即約20℃)，不需要加熱。在其他情況下，通過提高表面活性劑在液體中的溶解度而加快微乳液的形成，有時要將成分的混合物加熱(例如用加熱板)到約25-80℃。
再來參看圖2，在提供反應物的水溶液的步驟52和可將步驟52的水溶液加入步驟54中以分離微乳液的等分，採用上述方法製備油包水微乳液。步驟52和54可以這樣完成，首先提供第一水溶性反應物(反應物A)和第二水溶性反應物(反應物B)，然後將反應物A加入第一等分的油包水微乳液中，將反應物B加入第二等分的油包水微乳液中。分別混合兩等分微乳液，直到反應物A在第一等分微乳液的每個反膠團(在微乳液中連續形成、聚結和分裂的反膠團，從而使包含在其中的任何反應物在反膠團中等量分布)中達到平衡分布，反應物B在第一等分微乳液的每個反膠團中達到平衡分布。在步驟56中，溶解物種分布到平衡後，混合兩等分微乳液。由於反膠團的碰撞和聚結，反應物A的陽離子和反應物B的陰離子彼此接觸，反應形成作為納米微粒芯的沉澱。
一般選擇反應物A和b，這樣它們可在微乳液的反膠團內反應形成沉澱。它們通常溶解在水性反膠團中，可以是固體、液體或氣體。在優選實施方式中，反應物A是一種鹽(例如具有假設的通式A+X-)，在第一等分微乳液的反膠團中溶解放出可溶陽離子(例如A+)，而反應物B是另一種鹽(例如具有通式B+Y-)，在第二等分微乳液的反膠團內溶解到可溶性陰離子(例如Y-)中。所選反應物A的陽離子和反應物B的陰離子在二者在水溶液中混合時可形成沉澱(A+Y-)。儘管前面說明了本發明的一個優選方法，但用微乳液製備納米微粒芯的其他方法也包括在本發明範圍之內許多只需對前述優選方法稍作改變即可使用。例如，形成芯的反應可以在單一等分的微乳液中進行，而不是將兩個不同等分的微乳液混合在一起。在這種情況下，可將反應物加入單一等分中，在微乳液的反膠團中溶解和平衡。隨後，在單一等分中加入液體或氣體形式的沉澱(例如還原或氧化)劑(例如氫、肼、NH4OH)，使溶解在反膠團中的反應物沉澱。
在微乳液中加入溶劑，如丙酮或乙醇，可以從微乳液中分離納米微粒芯，然後對混合物過濾並/或離心，分離納米微粒。在過濾時，過濾器的孔徑小於納米微粒的尺寸。在離心時，混合物可在微離心機中以10000RPM或更大的速度離心15分鐘或更長時間，使納米微粒形成小球，然後傾出上清液。用丙酮或乙醇/水溶液將分離的納米微粒洗滌一次或多次，以除去任何表面活性劑或其他微乳液組分。分離和洗滌的納米微粒可通過丙酮乾燥。在使用或功能化之前，納米微粒可重懸浮在合適的液體中。
在使用油包水微乳液技術時，納米芯的尺寸是高度可控的。雖然芯尺寸通常與反膠團尺寸有關，但不一定是嚴格的關係，因為芯尺寸並不總是與最初存在於每個反膠團中的反應物的量有相關性。例如，即使是小納米微粒芯(例如直徑為2-5nm)，也包含約300-1000個原子，這在大多數情況下都比反應之前存在於每個膠束中的反應物分子的數目大得多。這表明，納米微粒芯核首先在小部分膠團中形成，然後通過碰撞-聚吉過程消耗其他膠團中的反應物。
因此，製備納米微粒芯時需要考慮的一個因素是納米微粒芯形成的速率。納米微粒芯形成的速率與反膠團聚結的速率直接相關。因此，選用的具體表面活性劑強烈也影響著芯的形成速率，控制著反膠團聚結的速率。也就是說，使微乳液的兩個不溶混液體之間形成相對剛性界面的表面活性劑降低芯形成的速率，而形成流體界面的表面活性劑則提高速率。操作微乳液的其他性質，如離子強度、pH和溫度以控制芯形成的速率。
通過經驗調整初始反應物濃度和微乳液的組成參數，可得到大小分布均勻的納米微粒芯(例如，芯尺寸的標準偏差百分數在約1-5％之間(例如，1、2、3、4和5％))，其平均直徑約為1-300nm或更大。較大尺寸的芯(例如約1微米)可這樣製備(1)在反應介質(例如微乳液的反膠團)中加入濃度較高的試劑，和/或(2)通過聲化學方法(即超聲法)將分離的芯分散在合適的溶劑而不是微乳液中，製成均勻的芯懸浮液，然後在分散液中加入其他試劑。在後一種方法中，單獨的芯常融合。
在大多數情況下，根據上述油包水微乳液技術製備的納米微粒芯具有球狀體形狀(常規反膠團常是球狀體)。通過改變芯形成過程中的各種參數，有可能產生其他形狀的芯。例如，通過在微乳液中加入濃度很高的十二烷基硫酸鈉，可製成橢圓形或管形的芯。作為另一個例子，如果選擇反應物可形成具有晶體結構的芯，可製備具有規則或不規則多面體形狀的納米顆粒芯。
可採用磁性材料，如磁鐵礦、磁赤鐵礦和硫復鐵礦作為芯子的部分製成磁性納米微粒。通過改變這種磁性芯的整體尺寸和形狀，它們可製成超順磁性或穩定的單域(從磁場中移走後保持穩定磁矩的粒子)。芯子尺寸與磁性納米微粒是不是超順磁性的還是單域有關。因此，相對等大的超順磁性粒子的芯尺寸一般小於50-80nm。對於尺寸超過此上限的粒子，粒子的磁化分成不同磁化矢量區，以便最大程度減小內磁能。再來參看圖2，本發明製備納米微粒的方法的一個特徵是包含步驟58，此步驟加入塗層劑，形成塗層納米微粒。步驟58所用塗層劑可以是使氧化矽(或其他物質)沉積到納米微粒芯表面上的任何塗層劑。目前優選的試劑包括活性矽酸鹽，如原矽酸四乙酯(TEOS)或氨基丙基三甲氧基矽烷(APTS)(均購自Sigma，St.Louis)。為塗敷芯，可在納米微粒芯的溶液(例如，在其中製備芯的微乳液)中簡單加入這種活性矽酸鹽和諸如氫氧化銨或NaOH的還原劑。對混合物可攪拌適當長的時間，使芯氧化矽塗敷。
氧化矽塗層的厚度和形成氧化矽塗層的反應速率取決於加入活性矽酸鹽的量、反應時間、加入還原劑的量和反膠團的尺寸(當在油包水微乳液中進行塗敷時)。提高還原劑(例如[NH4OH])與活性矽酸鹽(例如[TEOS])的濃度通常導致在指定反應時間後形成較厚的塗層。提高極性液體(例如水)與活性矽酸鹽的濃度通常導致在指定反應時間後形成較薄的塗層。控制塗層厚度的精確反應條件可隨所用特定試劑、芯材料等而變化。但是，這些條件可根據經驗，通過簡單的實驗改變試劑濃度和反應時間及條件來確定。
本發明方法還包括對如上所述製備的塗層納米微粒進行功能化的步驟(即用一個或多個化學官能團衍生)。在氧化矽上連接官能團的許多已知方法都適用於本發明。(例如，參見Iler，R.，《氧化矽的化學溶解度、聚合作用、膠體和表面性質及生物化學》(The Chemistry of SilicaSolubility，Polymerization，Colloid and Surface Properties，and Biochemistry)，Wiley-Interscience，NY，1979；VanDerVoort，P.和Vansant，E.，Journal of Liquid Chromatography and RelatedTechnologies，192723-2752，1996；Weetall，H.編，《固定化酶、抗原、抗體和肽製備和鑑定》(Immobilized Enzymes，Antigens，Antibodies，and PeptidesPreparation and Characterization)，M.Dekker，NY，1975.)在塗有氧化矽的納米微粒上添加官能團的典型過程包括用矽烷化劑處理納米微粒，矽烷化劑與納米微粒的氧化矽表面反應並使一個化學基團與納米顆粒的氧化矽表面結合。化學基團本身可以是官能團，或可以作為可結合官能團的基底。
例如，在一個示範性方法中，可上述製備塗有氧化矽的納米微粒，用三甲基甲矽烷基丙基二亞乙基三胺(DETA)對微粒表面進行矽烷化，DETA是將伯胺基連接到氧化矽表面上的矽烷化劑。然後，可用溴化氰(CNBR)法將抗體或其他蛋白質共價地與矽烷化表面結合。例如，以CNBR介導的結合可這樣完成，即將事先用DETA矽烷化的氧化矽塗層納米微粒懸浮在2M碳酸鈉緩衝液中，對混合物進行超聲處理，產生微粒懸浮液。然後在微粒懸浮液中加入CNBR溶液(例如2g CNBR/1ml乙腈)，以活化納米微粒。用中性緩衝液(例如PBS，pH＝8)洗滌納粹微粒後，在活化納米微粒懸浮液中加入抗體溶液，使抗體結合到納米微粒上。在塗有抗體的納米微粒中還可加入甘氨酸溶液，以屏蔽任何剩餘的未反應位置。
在其他方法中，用生物素-鏈黴抗生物素蛋白連接對納米微粒進行官能化。例如，首先用戊二醛交聯法以抗生物素蛋白塗敷納米微粒的氧化矽殼，以穩定氧化矽表面上的抗生物素蛋白。然後用常規方法使官能團(例如抗體或核酸分子)生物素化。生物素化的官能團然後與塗有抗生物素蛋白的納米微粒混合，形成塗有官能團的納米微粒。
使用納米微粒的方法本發明的納米微粒可用於各種用途。例如，塗有抗體的螢光納米微粒可用來有特異地標記細胞。塗有核酸的螢光納米微粒可用來檢測特異的多核苷酸。此外，塗有核酸的磁性納米微粒可用來從混合物中分離並收集特異的多核苷酸，包括DNA和RNA。
標記細胞本發明的納米微粒可用來標記細胞(例如真核細胞或原核細胞)，其中一種方法如圖3所示。在圖3A中，抗體衍生的摻雜了染料的納米微粒10在容器30中與靶細胞20(例如癌細胞、哺乳動物細胞、人類細胞、細菌細胞等)和非靶細胞21混合。靶細胞20在其表面上表達靶抗原22，而非靶細胞21則沒有。在所示納米微粒中，芯12包含螢光/發光材料，如R6G、螢光素、Ru/Bpy或TMR，官能團16包含可特異地結合靶抗原22的抗體。現在看圖3B，納米微粒10通過官能團16與靶抗原22的相互作用和靶細胞20用物理方法結合。當容器30中的納米微粒10與靶細胞20在允許抗體-抗原結合的條件下(例如約室溫，中性至稍鹼性pH的低鹽緩衝液)混合時，這種結合自發地形成。非靶細胞21不特異地結合納米微粒10，因為它們不表達靶抗原22。
核酸檢測本發明還提供了檢測樣品中具體靶核酸分子存在的方法。一種方法採用結合了官能團(例如，與部分或全部靶核酸互補的寡核苷酸)的發光或螢光納米微粒，所述官能團在指定反應條件下(例如嚴格的雜交條件)雜交到具體靶核酸分子的特定核苷酸序列中。在此方法中，可將發光/螢光納米微粒加入含有靶核酸分子的樣品中，所述靶核酸分子具有特定核苷酸序列，通過(例如)分析發光或螢光，檢測納米微粒與具有特定核苷酸序列的靶核酸分子之間的結合。
參見圖4，檢測樣品中核酸分子存在的另一種方法是採用在基底上固定核酸分子。在此方法中，將俘獲核酸分子固定在合適的基底上，如塗有氧化矽的石英表面。然後將樣品加入基底，這樣，如果樣品包含具有核苷酸序列的靶核酸分子，該分子雜交到俘獲核酸上，則靶核酸將結合俘獲核酸。為檢測這種相互作用，可使基底與探針核酸接觸，探針核酸分子與發光或螢光納米微粒結合。探針核酸分子有雜交到靶核酸上的核苷酸序列，但沒有俘獲核酸。如果樣品中存在靶核酸，在基底上將檢測到螢光/發光的增加(例如通過光譜)。
用MB檢測核酸檢測核酸存在和/或從核酸混合物中分離核酸的另一個方法是利用固定在基底上的MB，所述基底如玻璃板或納米微粒。MB是設計的單鏈寡核苷酸探針，在它們的靶DNA序列不存在的情況下，這些分子具有莖環結構(Tyagi S和Kramer FR，Nature Biotechnology，14，303-308，1996)。分子的環部分是用來與特異性互補靶核酸雜交的。信標兩端的鹼基形成莖，且彼此互補。莖的一端與螢光團結合，另一端與淬滅劑結合。在靶DNA不存在的情況下，分子的髮夾形使螢光團與淬滅劑非常接近。在這種構型中，螢光團捕獲的光能轉移到淬滅劑上。淬滅劑優選為非螢光發色團，它將從螢光團接收的能量以熱的形式擴散，結果使髮夾形構型中探針的螢光強度經探針呈開放或線性構型時的螢光強度小得多。
在莖的兩端上標記了螢光團和淬滅劑的MB用示意圖如圖5所示。當探針遇到合適的靶DNA分子時，其環部分形成比莖更長、更穩定的雜交體。由於與靶DNA序列形成的雜交體的剛性和長度，莖雜交體的繼續存在是不可能的。因此，與靶DNA序列雜交時，MB經歷自發的構型重組，迫使莖分開，並使螢光團和淬滅劑離開。螢光團從淬滅劑中分離然後逆轉淬滅，從而通過螢光團檢測發射的螢光。因此，MB與靶分子雜交時發出的螢光信號比不雜交時更強。MB已經成功地用於DNA雜交研究(Tyagi S和Kramer FR，Nature Biotechnology，14，303-308，1996；Tyagi S，Bratu D，Kramer FR，Nature Biotechnology，16，49-53，1998；Kostrikis LG，Tyagi S，Mhlanga MM，Ho DD，Kramer FR，Science 279，1228-1229，1998；Giesendorf BAJ，Vet JAM，Tyagi S，Mensink EJMG，TrijbelsFJM，Blom HJ，Clinical Chemistry；44482-486，1998)。環的尺寸及其含量可通過設計不同的MB來改變。此外，淬滅劑和螢光團可視具體用途而改變。
參見圖5，本發明提供了固定在基底上的MB如固體板或納米微粒，以特異地結合具有特定核苷酸序列的靶核酸分子。如圖5所示，用於本方法的優選MB包括探針寡核苷酸(示於莖-環結構中)。寡核苷酸具有能與靶核酸分子雜交的核苷酸序列。它還結合到螢光團(例如螢光素或若丹明基染料)和螢光團的淬滅劑(例如DABCYL)上。可使用任何合適的螢光團-淬滅劑組合，例如TMR和DABCYL(見下面的實施例部分)，只要當螢光團靠近淬滅劑時，發生螢光能共振轉移(FRET)，這樣可檢測到螢光團的發射光譜中的變化。非螢光發色團DABCYL[4-(4』-二甲基氨基苯基偶氮苯甲酸)]優選用於許多用途，因為它可用作MB中任何螢光團的通用淬滅劑(Tyagi S，Bratu D，Kramer FR，NatureBiotechnology，16，49-53，1998)。
在圖5所示模型中，螢光團結合到探針寡核苷酸的一端(例如5』端)，淬滅劑結合到寡核苷酸的另一端(例如3』端)。在靶核酸分子不存在的情況下，探針寡核苷酸呈莖-環結構的構型(由於自身雜交)，其中螢光團靠近淬滅劑——在該構型中，FRET引起螢光團發射的螢光減少。設計可形成這種莖-環結構的寡核苷酸的方法是眾所周知的。當存在靶核酸分子時，它雜交到探針上，使探針重新配置成線性結構，由於螢光團和淬滅劑分離時FRET減少或消失，螢光發射增加。因此，靶核酸的存在可通過觀察螢光的增加來確定。
MB的固定MB可用已知化學方法固定到基底上，如納米微粒或載玻片。例如，可用生物素-抗生物素蛋白體系將生物分子固定到固體表面上(Anzai，J.，Hoshi，T.和Osa，T.Trends in Analytical Chemistry，13，205-210，1994；Narasaiah，D.，Nowall，W.B.和Kuhr，W.G.Anal.Chem.69，2619-2625，1997)。例如，在本發明的一個實施方式中，生物素分子摻入MB的結構內。然後可將生物素化的MB通過生物素-抗生物素蛋白連接到塗有抗生物素蛋白的表面上。
將生物素官能團連接到MB上需要定位連接位點，使靶DNA分子與MB的單鏈環區中的互補DNA最佳雜交。測試生物素連接的不同位置環序列、莖的螢光團一側的第二鹼基對位置和莖的淬滅劑一側的相同位置。生物素連接到莖的淬滅劑一側的結構將生物素對MB發螢光、淬滅和雜交能力的影響減少到最低程度。利用具有18個鹼基對環序列的MB，在生物素和序列之間插入間隔物。用生物素-dT使靶DNA分子容易與環序列雜交，並使它們足夠的分離，以便將抗生物素蛋白與DNA序列之間潛在的相互作用減少到最低程度。
基因磁性納米微粒本發明還有一種方法是使用MB結合的納米微粒從樣品中分離特定靶核酸分子，如包括不同於僅有一個鹼基的靶寡核苷酸的樣品，或者含有DNA和蛋白質混合物的樣品。在此方法的一種型式中，磁性納米微粒與MB結合，而MB與靶核酸結合(例如，在嚴格的雜交條件下)。這些結合的磁性納米微粒已稱為基因納米俘獲劑(GMNC)。參見圖6，可在樣品中加入MB-GMNC，在MB與靶核酸(即DNA1』)和相差一個鹼基的靶(即DNA2』)雜交的條件下，用螢光成像檢測雜交的序列(見下面的具體實施例)。在本發明的另一個實施方式中，可用MB-GMNC從複雜混合物中分離痕量RNA(例如mRNA)，包括細胞裂解液。MB與選擇的DNA或RNA靶雜交後，然後用磁鐵從樣品中取出MB-GMNC與靶核酸結合。然後可用分離雜交核酸的常規方法，例如提高含MB-GMNC的溶液的溫度或鹽濃度，將靶核酸從MB-GMNC中分離出來。儘管前述方法可用沒有結合螢光團或淬滅劑的MB進行，使用這種結合的MB，可通過螢光分析監控分離過程。
實施例實施例1製備摻雜的納米微粒(A)在十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)/正己烷/正己醇(共表面活性劑)/水組成的油包水微乳液中製備Eu/Bpy(Eu3+/2，2』-二吡啶基)-摻雜的氧化矽納米微粒。使用磁攪拌器混合2.916g CTAB、75ml正己烷、15ml正己醇和880μl水，製備90ml油包水微乳液貯存液。10ml貯存液等分成兩份5ml等分液。在其中一份5ml等分液中加入50μl TEOS和5μl 0.1M Eu/Bpy(水溶液)，攪拌混合物1小時，形成TEOS/Eu/Bpy溶液。在另一份5ml等分液中加入137μl NH4OH，攪拌混合物1小時，形成NH4OH溶液。然後將NH4OH溶液滴加到TEOS/Eu/Bpy溶液中，所得混合溶液攪拌過夜。混合溶液中水與表面活性劑的摩爾比為15(水∶表面活性劑)。在混合溶液形成的微乳液中加入25ml丙酮，使Eu/Bpy摻雜的氧化矽納米微粒以粉末形式分離出來，在微離心機中以10000RPM對所得混合物離心15分鐘，沉澱納米微粒，除去上清液，用丙酮或乙醇/水溶液將剩餘的納米微粒洗滌數次，以進一步除去表面活性劑和其他微乳液組分。然後用丙酮乾燥洗滌過的納米微粒。
(B)製備Ru/Bpy[RuII(Bpy)3]摻雜的納米微粒。用磁攪拌器混合7.5ml環己烷、1.8ml正己醇、1.77ml TX-100、340μl水和140μl 0.1M RuII(Bpy)3(水溶液)1小時，製備10ml油包水微乳液。然後將所得溶液分成兩份5ml等分液。在一份等分液中加入100μl TEOS，攪拌混合物30分鐘，形成TEOS溶液。在另一份5ml等分液中加入60μl NH4OH，攪拌混合物30分鐘，形成NH4OH溶液。然後在10分鐘內將NH4OH溶液滴加到TEOS溶液中，所得混合溶液攪拌過夜。用上面實施例1A所述方法分離Ru/Bpy摻雜的氧化矽納米微粒。
(C)製備四甲基羅丹明(TMR)摻雜的納米微粒。
混合1.77ml Triton X-100(表面活性劑)、1.8ml正己醇(共表面活性劑)、7.5ml環己烷(油)和0.48ml 1.2mM TMR的乙酸(水)溶液，製備油包水微乳液。在微乳液中加入前體(100μl TEOS)，接著攪拌30分鐘。再攪拌24小時，完成氧化矽聚合反應。為打破微乳液體系，進一步從溶液中分離納米微粒，在微乳液中加入20ml丙酮。超聲處理和渦動攪拌後，對溶液進行離心，得到TMR摻雜的納米微粒。所得納米微粒用95％乙醇洗滌4次，用丙酮洗滌1次。每次洗滌後，使用超聲處理和攪拌納米微粒完全分散在溶液中。
為闡明在形成納米微粒的過程中乙酸在摻雜TMR分子中的作用，用一種無機酸，即鹽酸(HCl)與乙酸作了比較。在不同濃度的HCl中加入恆量的TMR，形成水滴(Water Pool)。就像用純水一樣，在水滴中用HCl得到不含TMR的氧化矽納米微粒。此結果表明，TMR在氧化矽基體內捕獲不是由pH變化引起的，而是TMR在有機酸中的溶解度引起的。
在微乳液體系中合成TMR摻雜納米微粒的過程中，乙酸還用作TEOS水解的催化劑。在微乳液體系中加入60μl NH4OH改進了聚合過程。為進一步降低大顆粒形成的可能性，在合成過程後，用乙醇和丙酮洗滌所得納米微粒。用TEM觀察由微乳液法製備的TMR摻雜的氧化矽納米微粒，表明納米微粒的最終尺寸很大程度上取決於球形水滴的大小。通過改變水與表面活性劑的比值(W0)，可得到不同尺寸的納米微粒。作為一個實例，使用W0值為10，得到直徑為60±4nm的納米微粒。
乙酸濃度對TMR摻雜的影響。水滴中乙酸的濃度極大地影響納米微粒內捕獲的TMR分子的量。當乙酸濃度低於10.0M時，摻雜的TMR分子很少，如納米微粒的低螢光強度所示。當水滴中乙酸的濃度高於10M時，摻雜的TMR量極大地增加。
TMR濃度對納米微粒的螢光強度的影響。TMR摻雜的納米微粒的螢光強度取決於氧化矽基體內摻雜的TMR分子的數目。由於自淬滅，納米微粒的螢光強度並不與染料摻雜的分子的數目成正比。對於特定尺寸的納米微粒，存在一個最佳染料濃度，在此濃度下可獲得最大螢光強度。為確定最佳TMR濃度，在0-4mM(相對於水滴總體積)改變染料濃度的條件下，合成TMR摻雜的氧化矽納米微粒。所得納米微粒的螢光強度用分光螢光計在550nm激發波長和575nm發射波長下檢測含有0.1mg/ml納米微粒的溶液。結果顯示，TMR濃度為1.2mM時，TMR摻雜的納米微粒的螢光強度最高。另外，TMR分子負載減少納米微粒的螢光強度，因為TMR分子的自身淬滅。
TMR摻雜的納米微粒的螢光信號的放大。測定了TMR摻雜的納米微粒相對於無機染料摻雜的納米微粒的可達到的信號增強的程度。用上述相同的微乳液法合成了RuBpy摻雜的納米微粒。用顯微鏡和高靈敏分光螢光計檢測溶液中和固定在固體表面上的納米微粒的螢光信號。兩類納米微粒樣品用相同的方法處理。
對於在溶液中檢測，用分光螢光計分析了幾種濃度的納米微粒，範圍在0.1-1μg/ml。根據納米微粒的密度，計算每個樣品中納米微粒的數目，得到單個納米微粒的平均螢光信號。結果顯示，一個TMR納米微粒的螢光強度比一個RuBpy納米微粒的螢光強度高40倍。
又用類似的方法比較了TMR摻雜的納米微粒和TMR分子。結果表明，TMR納米微粒比TMR分子的信號增強了15000倍。用不同實驗方法進一步證實所得放大作用。根據用顯微鏡觀察到的玻璃表面上的螢光成像，檢測單個納米微粒的螢光強度。在頻繁的超聲處理和渦流攪拌下，納米微粒溶液稀釋到樣品中很少有納米微粒聚集的程度(此結果由SEM證實)。因此，顯鏡成像中的每個螢光斑點對應於單個納米微粒。一個TMR納米微粒的平均螢光強度可用ImageJ軟體通過統計方法獲得，所得結果與分光螢光計測得的結果有好的相關性。
TMR摻雜的納米微粒的穩定性。為證實納米微粒的光學穩定性，比較了純TMR分子和溶液中的TMR摻雜的氧化矽納米微粒。用550nm的光連續輻射20分鐘後，純染料分子的螢光強度減少85％，而納米微粒的螢光強度保持恆定。
TMR摻雜的納米微粒在水溶液中的長期穩定性。此分析集中於染料分子從長期浸泡在溶液中的氧化矽基體中滲漏出來的可能性。TMR摻雜納米微粒在水溶液中分別浸泡3天和7個月，隨後檢測溶液的螢光強度。對樣品進行離心，將TMR摻雜的納米微粒從含有任何TMR分子的上清液中分離出來，TMR分子是從納米微粒中瀝出的。將沉澱重懸浮在水中到其原來的體積，並檢測螢光強度。離心前後螢光強度的對比表明，在水溶液中3天後，TMR分子沒有從基體中洩漏。貯存7個月後，只有8.5％TMR從氧化矽基體中洩漏。這些結果清楚表明，TMR一旦在氧化矽基體內捕獲，它們仍牢固地包埋在納米微粒內。
(D)製備R6G摻雜的納米微粒。3ml染料的乙醇溶液(濃度為1mM)與1.0ml苯基三乙氧基矽烷(PTES)混合。向所得溶液中加入鹽酸或氫氧化胺，使PTES開始水解。幾個小時後，通過形成單相體系表明反應完成。然後在水解溶液(0.5ml)加入100μl溶解在5.0ml乙醇中的TEOS，進一步通過Stber過程與氫氧化胺反應(Stber等，J.Colloid and Interface Sci.2662，1968)。在連續超聲處理和頻繁渦流攪拌下，反應在0℃進行1小時。在混合物中加入過量的丙酮，終止納米微粒形成。
TEM和SEM表明，上述過程導致產生直徑大約100nm的有機染料摻雜的納米微粒。反應進行12小時以上時，得到微米級微粒。
PTES的量對於在納米微粒中俘獲R6G來說是一個重要因素。增加PTES的量，相應地增加摻雜的染料分子的產量，從螢光強度的增加可看出。比較了不同PTES∶TEOS體積比的樣品的螢光強度，這些體積比是(1SR1)0.25∶1，(1SR2)0.5∶1，和(1SR3)1∶1。據測定，沉澱開始形成時，有一個限制比。PTES濃度太高，產生的納米微粒的疏水性高。發現2∶1或較低比例產生水溶性納米微粒產物。在PTES和TEOS恆定量的條件下，測定了溶液中R6G的濃度的影響。R6G的標稱濃度增加，觀察到螢光強度也增加。比較了分散在1ml溶液中的1mg樣品和各種濃度純R6G的螢光強度。根據用純R6G分子建立的校正曲線，在納米微粒中捕獲的R6G的量計算小於1％。如果納米微粒內R6G的濃度為1％，則納米微粒顯示的螢光強度高於染料的最佳含量20％的RuBpy摻雜的納米微粒。
一旦氧化矽基體內捕獲染料分子，就用丙酮和水洗滌納米微粒。摻雜的染料分子在水溶液中顯示出最小的洩漏。將樣品浸泡在溶液中3天，比較了離心前後溶液的螢光強度。對3天的水溶液進行離心，將染料摻雜的納米微粒從上清液中分離出來。將沉澱再次重懸浮在水到原來的體積，並比較了原來溶液和再懸浮沉澱的螢光強度。沒有觀察到螢光強度的明顯差異，這表明大多數染料分子保留在納米微粒的基體中，推測是由於PTES的疏水物性。
為測定光褪色，比較了純染料和染料摻雜的納米微粒的光穩定性。連續輻照樣品1000秒，用固態分光螢光計照測螢光強度。為最大程度減少實驗的不穩定性，在鑑定中將樣品夾在兩個蓋玻片之間。結果表明，純R6G的強度迅速下降，而納米微粒內R6G的螢光強度在相同條件下沒有明顯改變。有機染料在納米微粒中的光穩定性大幅度提高，這最大程度減少了生物鑑定的光褪色，從而提高了用這些納米微粒進行生物分析的準確性。
實施例2用抗體結合的納米微粒進行細胞檢測在幾個應用中使用塗有氧化矽的納米微粒表明它們在細胞識別和標記中的用途。在一種實施方式中，塗有氧化矽的納米微粒與抗體結合。如實施例1(A)所述方法製備的納米微粒與抗體衍生的方法是，首先用DETA對微粒表面進行矽烷化，DETA是將伯胺基連接到氧化矽表面上的矽烷化劑。用螢光胺證實納米微粒表面上存在氨基，螢光胺是非螢光分子，但與伯脂族胺基反應時強螢光(Cordek等，1999；Chung，1997)。用DETA進行表面矽烷化後，用溴化氰(CNBR)法將抗體(鼠抗人CD10)固定到矽烷化氧化矽表面上。如上述方法製備染料摻雜的微粒，乾燥，用超聲法懸浮在9.0ml 2M碳酸鈉溶液(活化緩衝液)中。然後在攪拌和室溫下，於5分鐘內將CNBR的乙腈溶液(1.0mg CNBR溶解在0.5ml乙腈中)滴加到納米懸浮液(10mg/ml)中。所得CNBR活化的微粒用冰涼的水洗滌兩次，用PBS緩衝液(pH 8.0)洗滌兩次。然後在表面修飾的微粒中加入40μl在PBS緩衝液(pH 8.0)中稀釋的抗體，在4℃下繼續攪拌24小時。然後用10ml0.03M甘氨酸溶液處理所得抗體衍生的納米微粒30分鐘，以屏蔽任何剩餘的活性位點。洗滌最終產物，將其再懸浮在PBS緩衝液(pH 8.0)中，貯存在4℃備用。沒有觀察到納米微粒的光學和光譜性質的變化。
將單核淋巴細胞懸浮在細胞培養基中(約200萬個細胞/ml)。用抗CD10固定納米的微粒培養細胞懸浮液2小時。培養後，用光學顯微鏡和螢光顯微鏡對細胞懸浮液成像。顯微鏡分析表明，大多數細胞得到標記(染料摻雜的微粒發出亮光)。光學圖像與螢光圖像的相關性很好。在用非抗體衍生的染料摻雜微粒進行的對照實驗中，沒有觀察到標記的細胞。在標記的細胞中，信噪比(即螢光圖像中亮區和暗區的強度比)超過500。
實施例3採用蛋白質結合的納米微粒的方法PDGF結合的納米微粒。為評價納米微粒在檢測血小板源性生長因子(PDGF)受體中的用途，使PDGF與TMR納米微粒(如實施例1所述製備)結合，通過共價固定到納米微粒上。首先對TMR摻雜的氧化矽納米微粒的表面進行化學修飾。為了在納米微粒表面上形成胺官能化基團，在室溫下使氧化矽納米微粒與1％DETA在1mM乙酸中反應30分鐘，連續攪拌。用去離子蒸餾水將胺官能人的納米微粒徹底洗滌3次。用DMF洗滌後，在N2氣下，納米微粒與10％琥珀酸酐於DMF溶液中反應6小時，連續攪拌。納米微粒用水徹底洗滌後，在室溫用100mg/ml EDC和100mg/ml NHS在MES緩衝液(pH 8.0)中活化25分鐘，連續攪拌。用水洗滌的納米微粒分散在0.1M PBS(pH 7.3)中。為了將PDFG共價固定在納米微粒表面上，在連續攪拌下，使納米微粒與10nM PDGF在室溫反應3小時，形成納米微粒-蛋白質的結合物，接著用PBS緩衝液洗滌。為減少後續反應中非特異性結合的效應，在使用之前蛋白質結合的納米微粒與1％BSA反應，並用0.1M PBS(pH 7.3)洗滌。
用乳房癌細胞秒HTB-26測試PDGF-納米微粒的結合。在37℃5％CO2下，用PDGF-TMR-納米微粒培養HTB-26細胞懸浮液30分鐘。用光學和螢光顯微鏡分析表明，明亮標記的細胞表示在用PDGF-TMR-納米微粒培養的細胞中在HTB-26細胞上存在PDGF受體。相反，用不含PDGF的TMR-納米微粒培養的細胞沒有螢光。這些結果表明，細胞的螢光標記是由於PDGF-TMR-納米微粒與細胞表面上的PDGF受體結合。對於TMR摻雜的納米微粒在細胞研究中可用作強螢光和光穩定的生物標記、涉及受體結合，上述結果提供了一個清楚的應用例子。在此方法的另一個例子中，用PDGF結合的TMR摻雜納米微粒培養表達PDGF受體的腺癌細胞(MDA-MB-231)。螢光顯微鏡再次表明，細胞表面連接PDGF結合的TMR摻雜納米微粒。
GDH結合的納米微粒。測試了R6G摻雜的納米微粒在穀氨酸鹽檢測中作為生物傳感器，通過將一種酶，即穀氨酸鹽脫氫酶(GDH)固定到納米微粒表面。採用已述方法的改變形式將GDH固定到納米微粒上(Cordek J.等，Anal.Chem.711529，1999；Qhobosheane S.等，Analyst 1261274，2001)。簡單地說，為與酶生物結合，用2％氨基矽烷N1-[3-(三甲氧基矽烷基)丙基]二亞乙基三胺的1mM乙酸溶液進行修飾。所得納米微粒進一步用雙功能交聯劑戊二醛處理，然後與穀氨酸鹽脫氫酶(GDH)結合。每步之後都進行充分洗滌。在測定固定在納米微粒上的GDH分子的活性時，採用酶反應。檢測NADH的螢光，以分析穀氨酸鹽。
用塗有BSA的納米微粒檢測固定的分析物。用物理方法將抗生物素蛋白吸附到塗有氧化矽、R6g摻雜的納米微粒和玻璃板上。然後抗生物素蛋白與戊二醛交聯，並儲存在Tris-HCl緩衝液中。用兩種不同濃度的生物素化牛血清白蛋白(BSA)處理塗層玻璃板。每個BSA分子平均含9個生物素分子。生物素-抗生物素蛋白的相互作用如下檢查，即使塗有抗生物素蛋白的納米微粒與玻璃板上的生物素分子結合。用螢光顯微鏡進行實驗，所選濾光器組適合羅丹明6G的520nm激發和550nm發射。含生物素標記BSA的濃度最高(2mg/ml)的玻璃表面粘附的納米微粒的數量增加最多，而含未修飾的BSA的對照玻璃上觀察到結合很少。
實施例4核酸的檢測用Ru/Bpy摻雜的氧化矽納米微粒用作檢測特定DNA分子的探針。此方法的概要於圖4，其中三個不同的寡核苷酸(即DNA1、DNA2和DNA3)用於夾心測定。一種生物素捕獲DNA-DNA1固定在塗有抗生物素蛋白的玻璃基底上。靶DNA-DNA2在促進雜交的條件下在基底上接觸。與DNA3結合的染料摻雜的氧化矽納米微粒也加入基底中。DNA1和DNA3包含與靶DNA-DNA2不同部分互補的核苷酸序列。用倒置顯微鏡檢測發光信號，用SEM確定納米微粒探針與基底表面的結合。
DNA固定在石英玻璃基底上。將蓋玻片浸泡在10M NaOH中清潔過夜，然後在含1mg/ml抗生物素蛋白(Molecular Probes，Eugene，OR)的10mM磷酸鹽溶液緩衝液(pH 7.0)溶液中溫育12小時。抗生物素蛋白層通過與戊二醛(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)交聯(戊二醛濃度為1％，室溫下在100mM磷酸鉀緩衝液中1小時)得到穩定，隨後在1M Tris-HCl(pH 7.5)溫育。將250nL 20μM生物素DNA1(5』TAA CAA TAA TCC T3』；SEQ ID NO1)(IDT，Coralville IA)等分液點在基底上，然後在增溼室中溫育12小時。
DNA固定在納米微粒探針上。將10mgRu/Bpy摻雜、塗有氧化矽的納米微粒在1ml抗生物素蛋白溶液中溫育(Fang等，Anal.Chem.72747A，2000)。抗生物素蛋白塗層與1％戊二醛交聯，納米微粒在Tris-HCl溶液中溫育。然後將納米微粒在1ml 20μM DNA3中溫育12小時，將DNA3(5』TAT CCT TAT CAA TATT3』；SEQ ID NO2)固定在納米微粒的表面上。每步之後嚴格洗滌和離心。當溫育用DNA3的濃度為1μM時，再懸浮所得微粒，最終濃度為0.5mg/ml。
DNA雜交。將等分靶溶液，即DNA2溶液(5』GGA TTA TTG TTA AAT TTAGAT AAG GAT 3』；SEQ ID NO3)(IDT，Coralville IA)加熱到50℃，放到固定在基底上的DNA1的斑點上，溫育4小時。用緩衝液嚴格洗滌後，將DNA3結合的納米微粒加到基底上，在增溼室中雜交4小時。每步之後嚴格洗滌。然後進行溫育。分析了10-12-10-6範圍不同濃度的靶DNA2。在所有實驗中，所用探針DNA和俘獲DNA的濃度相等。
光學測試和成像。用裝有增強電荷偶聯裝置(ICCD)的倒置螢光顯微鏡(Olympus，IX708F型)獲得發光圖像。SEM圖像用Hitachi S-4000 FE-SEM獲得。濃度依賴的發光強度數據用來估計檢測限度。選擇性實驗用類似方法進行。比較了來自互補靶和單鹼基錯配DNA的發光信號。
用上述方法可將DNA1固定在塗有抗生物素蛋白的玻璃基底上。然後使固定的DNA1與DNA2的一端雜交。然後使DNA2的未雜交的15個鹼基與連接到Ru/Bpy摻雜的、塗有氧化矽的納米微粒上的生物素DNA3雜交。洗滌掉任何未雜交DNA探針和物理吸附的納米微粒後，對基底表面進行成像。螢光和SEM圖像證實，納米微粒連接到基底表面上，表明三種不同的DNA發生雜交。
為檢驗溫度對雜交過程的影響，分別在25℃、35℃、45℃和55℃重複前述測定。用恆溫控制使溫度達到平衡。發光強度隨著溫度的升高而增加達到45℃，高於此溫度觀察到強度下降。在下面討論的大多數實驗中，為方便起見，採用25℃。
DNA靶的高靈敏度分析。還用螢光成像技術測試了不同範圍的靶DNA(DNA2)，即10-12-10-6M濃度的信號的濃度依賴性。繪製了10-11-10-9M和10-9-10-6M的校正曲線。用成像軟體得到了每個樣品的平均信號強度。除了最高濃度範圍(1μM及以上)外，靶DNA濃度與發光信號之間總體上有極好的線性關係。在5×10-7M和1×10-6M觀察到可能的飽和。這種濃度依賴性在螢光發光圖像和SEM圖像上是明顯的。SEM圖像表明，納米微粒的密度隨著靶DNA濃度的增加而增加。俘獲DNA和探針DNA的濃度在這些實驗中保持不變。引人注意的是，此測定的檢測限度為3×10-12M。
區分A-T和G-c錯配。上述方法如此靈敏，以致可區分27bp線性DNA中單個鹼基的錯配。如圖7A所示，由相等濃度的互補DNA(即DNA2)和單鹼基錯配的靶DNA，即xDNA2(5』GGA TAA TTG TTA AAT TTA GAT AAG GAT 3』；SEQ ID NO4)得到的發光強度之間有大的差異。而且，染料摻雜的納米微粒提供的信號放大如此強，以至於A-T錯配能夠與G-c錯配不同，參見圖7B。
實施例5用固定分子信標檢測和分離核酸化學製品和設備。所有生化製品購買來即可使用。溶菌酶(Lyz)、血紅蛋白(Hb)和BSA購自Sigma(St.Louis，MO)。氯化鐵、氯化亞鐵、Triton X-100、異辛基苯基醚、4-(C8H17)C6H4(0CH2CH3)nOH(n～10)和TEOS購自Aldrich ChemicalCo.Inc.(Milwaukee，WI)。環己烷、正己醇、氫氧化鈉購自Fisher ScientificCo.(Pittsburgh，PA)。在合成磁性納米微粒時，所有水溶液均用去離子蒸餾水(Easy Pure LF)製備。FS20超聲儀(Fisher Scientific Co.)、離心機5810R(Eppendorf)、Hitachi H-7000透射電子顯微鏡(日本)和MPMS-5S超導量子幹涉儀(SQUID)磁力儀用於合成和表徵磁性納米微粒。用Fluorolog TAU-3分光螢光計(Jobin Yvon-Spex，Instruments S.A.，Inc.)檢測不同溫度下的螢光強度。
(A)製備連接到表面上的生物素MB。
合成生物素MB。適合連接到表面上的MB的設計基於抗生物素蛋白-生物素連接。設計的MB的核苷酸序列總共28個鹼基對，其中18個鹼基對是感興趣的環序列。5個鹼基對彼此互補形成莖。所選螢光團是TMR，淬滅劑是DABCYL(均購自Molecular Probes，Eugene，OR)。靶DNA具有如下序列5』-TTCCTT CCT GGG CAT GGA-3』(SEQ ID NO5)。設計與靶DNA雜交的生物素MB的分子量為10076，其序列如下5』-GCA CGT CCA TGC CCA GGA AGG AACG(生物素dT)G C-3』(SEQ ID NO6)，分別在其5』和3』端與TMR和DABCYL結合。
生物素MB用DABCYL-CPG(可控孔度玻璃)為原料合成。合成涉及4個重要步驟。第一，CPG固相支持體與DABCYL衍生，用於啟動3』端的合成。用標準氰乙基亞磷醯胺化學法依次加入剩餘的核苷酸，包括生物素-dT殘基，它含有與環的C5碳連接的生物素(Glen Research)。生物素的目的是提供與抗生的素蛋白分子連接，該分子與表面結合。第二，核苷酸的5』端與(CH2)6-NH連接臂連接，在5』端產生伯胺基。5』端的伯胺基通過6碳間隔臂與磷酸二酯相連。最後的5』端有一個三苯甲基保護基團，用於保護氨基。第三，用反相HPLC純化寡核苷酸，並轉化為鈉鹽形式。最後，在碳酸氫鈉/DMF緩衝液中用TMR標記純化後的寡核苷酸過夜。用乙酸處理1小時，除去5』三苯甲基，接著真空乾燥過夜。標記後，用凝膠過濾色譜在Sephadex G-25上除去過量的染料。然後用反相HPLC純化代表設計的生物素MB的寡核苷酸，並收集主峰。
用生物素MB在溶液中進行雜交研究。用新合成的生物素MB測定其在溶液中的DNA雜交性質。雜交性質用螢光測定法在SPEX Industries F-112A分光光度計上進行測定。雜交實驗中採用亞微石英池。製備了三種溶液，它們包含單獨MB；超過其互補靶DNA5倍摩爾的MB；超過非互補DNA5倍摩爾的MB。所有三種溶液中MB的最終濃度均為50nM。在緩衝液中培育上述溶液(200μl)20分鐘，緩衝液包含20mM Tris-HCl、50mM KCl和5mM MgCl2(pH＝8.0)。在室溫下記錄515nm處激發的發射光譜。
在溶液中雜交的生物素MB顯示，與靶DNA分子反應時，螢光信號增強了10倍以上。具有非互補DNA的溶液顯示，在相同條件下螢光信號沒有增強。比較了生物素MB與沒有生物素的MB的雜交動力學，兩種情況下得到了類似結果。
(B)製備和使用固定在固體板上的MB。
生物素MB固定在氧化矽板上。為製備氧化矽塗層表面，先用1∶1的HCl∶水溶液清潔氧化矽玻璃蓋玻片2小時。用水徹底清洗後，將蓋玻片放在10MNaOH溶液中過夜，再次用水清洗。然後在抗生的素蛋白溶液(0.1mg/ml，10mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.0)中培育處理過的蓋玻片12小時。在1％戊二醛緩衝液中交聯1小時使物理吸附的抗生物素蛋白穩定，接著在1M Tris-HCl(pH 6.5)中培育3小時。然後用磷酸鹽緩衝液洗滌塗有抗生物素蛋白的蓋玻片，在氮氣下乾燥。為產生塗有MB的表面，將一滴生物素MB溶液(1×10-6M，在緩衝液中)加到塗有抗生物素蛋白的蓋玻片上。抗生物素蛋白-生物素結合時間從幾分鐘到半小時。然後用雜交緩衝液(20mM Tris-HCl，50mM KCl，5mM MgCl2，pH 8.0)洗滌蓋玻片，以除去任何未結合的MB。結合過程快速且高效，在數分鐘之內就達到覆蓋平衡。甚至在緩衝液中浸泡幾天後，固定的MB仍連接在塗有抗生物素蛋白的表面上。
用固定在板上的生物素MB進行雜交研究。在不同雜交條件下監測MB螢光強度。用螢光顯微鏡、ICCD、氬離子雷射器和將光傳導到顯微鏡載物臺的光纖探針監測螢光信號，如前面所述(Fang，X和Tan，W，Anal.Chem.71，3101-3105，1999)。先將514nm的激發雷射光束導入具有50μm芯子的光纖探針，然後偶聯於顯微鏡載物臺上的稜鏡。稜鏡表面上產生了漸消場，稜鏡夾在MB固定的氧化矽板玻璃上，並用於激發固定的MB。這樣產生的螢光信號用物鏡收集，並導向ICCD。
當固定在氧化矽板上的MB與其互補DNA靶分子相互作用時，形成雙鏈DNA雙鏈體，從而使連接在MB上的螢光團發出的螢光信號增加。MB探針的測試用不同濃度的互補DNA分子進行，濃度範圍為5-600nM。結果表明，MB固定的板可用於檢測納摩爾範圍內的靶DNA分子。當用非互補DNA分子時，螢光信號沒有增加。其他實驗表明，固定在板上的MB在雜交後可再生，因而這種板可反覆用於DNA的檢測和相互作用的研究。
(C)固定在納米微粒表面上的MB的製備。
生物素MB的設計與合成。為用於研究固定在納米微粒表面上的MB，用上述方法設計併合成了MB，它具有15個核苷酸環和5個核苷酸臂。環序列5』-ATC AAT ATT TAA CAA-3(SEQ ID NO7)與編碼炭疽致死因子的DNA互補。為研究DNA與MB的雜交，製備了四個不同的DNA靶序列DNA1』5』-TTGTTA AAT ATT GAT-3(SEQ ID NO8)；DNA2』5』-TTA TTA AAT ATT GAT-3』(SEQ ID NO9)；DNA3』5』-TAG TTA TAA ATT GTT-3』(SEQ ID NO10)和DNA4』5』-TAG TTA TAA ATT ATT-3』(SEQ ID NO11)。在此生物素MB中，用螢光素作螢光團，用DABCYL作淬滅劑。用根據上述設計合成的MB固定在磁性納米微粒的表面上。
MB在磁性納米微粒表面上的固定。塗有氧化矽的磁性納米微粒用上述油包水微乳液法合成。微乳液用Triton X-100表面活性劑製備。用FeCl2和FeCl3形成氧化鐵納米微粒。在微乳液中加入TEOS，形成氧化矽層。MB通過抗生物素蛋白-生物素連接固定在磁性納米微粒的表面上。簡言之，先在冰箱中抗生物素蛋白溶液(2mg/ml，在10mM磷酸鹽緩衝液中，pH＝7.3)培育塗有氧化矽的磁性納米微粒14小時，將抗生物素蛋白塗敷在納米微粒表面上。隨後用0.5ml緩衝液將塗有抗生物素蛋白的納米微粒洗滌三次。室溫下，在100mM磷酸鉀緩衝液中使塗層納米微粒與1％戊二醛交聯1小時，從而穩定抗生物素蛋白層。塗有抗生物素蛋白的納米微粒用0.5ml 1M Tris-HCl緩衝液(pH＝7)洗滌三次後，在冰箱中於Tris-HCl緩衝液中培育3小時。
為將MB固定的塗有抗生物素蛋白的磁性納米微粒的表面上，在冰箱中用含有1.0×10-6M生物素MB的溶液培育12小時。每個抗生物素蛋白分子有四個生物素結合位點。為保證每個外露生物素基團與抗生物素蛋白分子結合，使用過量的抗生物素蛋白。納米微粒用20mM Tris-HCl/5mM MgCl2緩衝液(pH＝8)洗滌三次，將具有表面結合的MB的磁性納米微粒(MB-GMNC)儲存在冰箱中備用。
為研究MB固定方法的有效性，比較了MB培育上清液、洗液和MB-GMNC的螢光強度。向三種溶液中各加入6倍過量的互補DNA』。由於螢光素與DABCYL分子之間螢光能量轉移，向MB中添加DNA1』減少了螢光淬滅。GMNC樣品的螢光強度比上清液或洗液都高得多，這表明大多數MB(在一個實驗中為92.2％)都與GMNC結合，MB與GMNC結合保留了結合靶DNA的能力。
(D)用MB-GMNC分離和收集靶DNA。
分離程序的設計和步驟。測定了按上述方法製備的MB-GMNC從多核苷酸複雜混合物中選擇性地俘獲靶DNA的能力，某些情況下存在蛋白質。圖6以圖解形色說明分離過程的總體設計和步驟。在混合物中摻入DNA和蛋白質的試驗中，所選混合物包含痕量靶DNA1』和DNA2』、大量隨機DNA3』和DNA4』(100倍濃度)和1000倍濃度的幾種蛋白質，即BSA、Hb和Lyz。DNA1』是MB環序列的完整互補靶，而DNA2』是單鹼基錯配序列。
在30分鐘內，在18℃向DNA-蛋白質複雜混合物中加入MB-GMNC，使DNA靶與MB-GMNC結合，從而開始實驗。分離過程涉及三個步驟。第一步是從複雜混合物中分離並回收靶序列(DNA1』和DNA2』)。DNA1』和DNA2』在GMNC表面上與MB有特異地雜交，而隨機DNA序列和蛋白質則沒有。當混合物暴露於磁鐵時，從混合物中收集並分離含有痕量DNA1』和DNA2』的GMNC。
第二步是從DNA2』中分離DNA1』。DNA1』和DNA2』的分離基於用MB形成的雙鏈體的熔化溫度中的差異。在GMNC中加入20μl 20mM Tris-HCl/5mMMgCl2緩衝液。在15分鐘內將GMNC緩衝液的溫度升到32℃，從而分離DNA1』和DNA2』。在此溫度下，DNA2』完全從GMNC中解離，而DNA1』仍結合在GMNC表面上。然後溶液重暴露於磁場，將結合DNA1』的GMNC除去。上清液含有DNA2』。因此，DNA1』和DNA2』從混合物中分離出來，也彼此分離開來。
分離過程的最後一步是從MB-GMNC回收DNA1』。在結合DNA1』的MB-GMNC中加入20μl 20mM Tris-HCl/5mM MgCl2緩衝液。在15分鐘內將溶液的溫度升到並固定於52℃，導致DNA1』從MB-GMNC中完全解離。然後採用施加磁場將MB-GMNC從溶液中除去。
選擇熔化溫度分離和收集DNA。如圖6所示，分離過程的第二步涉及緊密相關的DNA序列的分離，藉助於MB和靶DNA序列間形成的DNA雙鏈體的熔化溫度中的差異。進行測試驗確定差別分離完全匹配，即互補的DNA序列(例如DNA1』)和結合MB-GMNC表面的單鹼基錯配DNA序列(例如DNA2』)的合適溫度。這需要測定MB與互補序列(DNA1』)能穩定雜交而與單鹼基錯配序列(DNA2』)不能穩定雜交的溫度範圍。用具有與MB相同環序列的線性DNA探針發現，互補序列和單鹼基錯配DNA之間的熔化溫度差異為7℃。相反，用與MB的環的相同序列，則溫度差導為21℃。
在溫度範圍內進一步研究了溫度對DNA1』和DNA2』與MB結合的影響，有和沒有固定在GMNC上。結果示於圖8。圖8a顯示固定在GMNC上的MB的結果。在含有MB-GMNC的溶液中加入過量6倍的DNA1』(0.6μM，曲線1)或DNA2』(0.6μM，曲線2)。檢測了溶液的螢光強度隨溫度而變化。將溫度從8℃緩慢增加到75℃，為達到平衡，每次測試間隔2℃，持續時間5分鐘。如圖8A所示，在低溫下，GMNC表面上的DNA1』-MB和DNA2』-MB雙鏈體發出螢光良好，這表明MB因雜交作用而呈開放(線性)構型。隨著溫度的升高，兩種樣品中發射的螢光下降。但是，即使在最低溫度下，單鹼基錯配樣品(DNA2』)的螢光強度也大大低於互補DNA(DNA1』)。錯配雙鏈體在18℃以上就變得不穩定，在32℃完全解離。相反，32℃僅3％解離的DNA1′雙鏈體的穩定。因此，將溫度升到32℃有可能從DNA2′中分離DNA1′。在此溫度下，用解離到溶液中的3％DNA1′分離了100％的DNA2』。
還測定了未結合到GMNC上(即在溶液中)的MB雙鏈體的熔化溫度曲線。圖8b顯示溶液中的游離MB與其靶序列之間的雜交結果。實驗條件和過程同圖8A。DNA1』溶液包含0.6μM DNA1』和0.1μM MB(曲線1)，DNA2』溶液包含0.6μM DNA2』和0.1μM MB(曲線2)。曲線3顯示溶液中只有MB的對照。比較圖8A和8B的結果，可以看到由MB固定在GMNC表面上形成的雙鏈體(圖8A)和溶液中的雙鏈體(圖8B)的熔化曲線間有明顯差異。很明顯，當MB固定在GMNC表面上時，具有DNA1』和DNA2』的MB雙鏈體的熔化溫度曲線均向較高溫度偏移。這一點大圖8c中進一步說明，該圖直接比較了MB與DNA2』在兩種條件下形成的雙鏈體的熔化曲線，即MB固定在GMNC表面上(曲線1)和MB在緩衝液中(曲線2)。如圖8C所示，DNA2』-MB雙鏈體開始解離的溫度從MB在溶液中的10℃偏移到MB結合GMNC的18℃。
(E)用MB-GMNC從DNA-蛋白質複雜混合物中回收痕量靶DNA。
為進一步探測MB-GMNC的性能，研究了從蛋白質/多核苷酸複雜混合物中回收痕量靶DNA的效率。分析了三種普通蛋白質Hb、BSA、Lyz和兩個15個鹼基隨機多核苷酸(DNA3』和DNA4』)與MB-GMNC相互作用，與其靶DNA(即DNA1』和DNA2』)結合的能力。製備一種含10-7M Hb、BSA、Lyz，10-8M DNA3』和DNA4』，3fmol(3.13×10-10M)DNA1』和DNA2』的溶液，向其中加入0.1ml含MB-GMNC的等分溶液。根據上述步驟進行分離。
DNA1』和DNA2』與GMNC表面上的MB特異地雜交，而隨機DNA序列和蛋白質則不能。對MB-GMNC進行磁分離後，測定了DNA1』和DNA2』的螢光信號。如圖9所示，MB-GMNC能夠從多核苷酸和蛋白質的複雜混合物中俘獲痕量，即3fmol靶DNA1』和DNA2』。在這些研究中，收集的互補DNA1』的濃度低至3×10-15M，而收集的單鹼基錯配DNA2』的濃度低至約9×10-15M。在此情況下，只需用常規分光計進行研究。用更靈敏的分析方法(例如，見Fang和Tan，Anal.Chem.71，3101-3105，1999；Zhang和Tan，Chem.-Eur.J.6，1087-1092，2000)，俘獲甚至更低濃度的靶應可檢測到。
(F)用MB-GMNC俘獲DNA靶的效率比。
用上述DNA-蛋白質複雜混合物中的DNA1』和DNA2』進一步研究了用MB-GMNC收集和分離它們的互補DNA和單鹼基錯配DNA的效率。在一組試驗中，濃度均為25nM的DNA1』和DNA2』溶液與過量MB-GMNC雜交，用分光計測定兩種溶液的螢光光譜。同時，製備25nM DNA1』和25nM DNA2』的混合物，根據上述過程和步驟從混合物中分離DNA1』和DNA2』。分離並收集DNA1』和DNA2』後，分別在分離的DNA1』和DNA2』溶液中加入過量MB-GMNC，其濃度與分離前所用的相同，然後測定螢光。分離和收集前後，DNA1』和DNA2』的量沒有差異。結果顯示，用濃度為25nM(2.5×10-10M)的DNA靶分離和收集的效率高於97％。
為確定該方法在其他靶濃度的收集效率，用MB-GMNC測試了具有DNA1』和DNA2』濃度較低(即在皮摩爾範圍內)的複雜樣品。結果取每個條件下5個重複實驗的平均值，示於表1。在每個混合物中，潛在幹擾物的濃度相同。即使靶DNA1』和DNA2』的濃度低至8.25×10-12M，收集效率也接近或高於95％。
表1從複雜混合物中分離DNA1』和DNA2』的效率*
*在每個樣品中，Hb、BSA、Lyz的濃度為1×10-7M，DNA3的濃度為1×10-8M。靶DAN1』和DNA2』的濃度範圍分別在8.25-25×10-12M和8.25-100×10-12M。#由於測定的體積較小而產生的誤差。
G.用MB-GMNC從混合物中俘獲mRNA。
合成分子信標。如上所述設計第一分子信標(MB1；SEQ ID NO7)，它具有15個核苷酸環和5個核苷酸臂。選擇螢光素作為螢光團，用DABCYL[4-(4』-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸]作淬滅劑。設計第二MB(MB2)，它具有18個鹼基環和5個鹼基臂。此環序列與部分鼠204核苷酸(nt)γ-肌動蛋白mRNA互補。為比較線性DNA探針和分子信標，設計了15個鹼基線性DNA探針，它的序列與MB1的環序列相同，以螢光素為螢光團。線性DNA探針的靶向用DABCYL作為淬滅劑標記。設計幾種不同的靶DNA序列用於以MB和線性探針研究DNA雜交。所有的DNA序列示於表2。
表2DNA探針和靶的序列
製備γ-肌動蛋白mRNA。從鼠肺組織中分離RNA，然後用cDNA循環試劑盒(Introgen BV)反向轉錄到具有Oligo(dT)引物的cDNA上。引物對5』-GCGCTT CCG GTG TCC AGA-3』(SEQ ID NO18)和5』-GCC AGG GCT GTG ATCTCC-3』(SEQ ID NO19)用於PCR擴增。反應進行25次循環。用PCR2.1載體(TA Cloning Kit，Invitrogen)克隆204-bp DNA片段的PCR產物。然後將重組質粒轉人入大腸桿菌INVα細胞。製備DNA的微量製品，並用BamHI線性化。為產生γ-肌動蛋白RNA，在Ambion Megascript中將1.0μg線性化質粒DNA模板用於T7轉錄反應。純化後，產生204nt鼠γ-肌動蛋白mRNA。
從混合物中俘獲痕量mRNA。為測定MB-GMNC從混合物中收集mRNA和PCR產物的能力，製備含有204nt鼠γ-肌動蛋白mRNA片段(與MB2環序列互補的鹼基782-985，鹼基815-832)的人工混合物。混合物中蛋白質和隨機DNA序列與上述實施例5E中的相同。
DNA分離過程。用純MB2和mRNA繪製螢光強度隨mRNA的濃度變化的校正曲線。在室溫下雜交後，MB的螢光強度增加，其方式類似於MB2與完全互補的靶DNA5雜交的方式。此結果表明，即使靶的序列比MB長10倍，MB也能與靶mRNA雜交。這些實驗的結果也表明，當mRNA的濃度很低時，mRNA與其靶雜交的時間較長。
校正後，將包含不同濃度mRNA的混合物加入MB-GMNC溶液。對於mRNA濃度低的樣品，採用60分鐘的雜交時間，以確保檢測到所有的mRNA。按照上述DNA分離研究所用分離程序，用施加磁場將MB-GMNC從混合物中分離出來。MB-GMNC與mRNA雜交後，通過檢測溶液的螢光強度，研究了收集的mRNA的量。用MB-GMNC收集mRNA的效率列於表3。
表3從混合物中分離DNA1和DNA2的效率
*在每個樣品中，Hb、BSA、Lyz的濃度為1×10-7M，DNA3的濃度為1×10-8M。#由於測定的體積較小而產生的誤差。
H.用MB-GMNC從細胞中俘獲mRNA。
用MB-GMNC從培養的HTB-26細胞中收集156個鹼基的mRNA序列。按供應商的說明在90mm燒瓶中培養乳房癌細胞系HTB-26(購自美國模式培養物保藏所)。在細胞中加入萃取液/BME緩衝液，進行細胞裂解，連續渦流攪拌1分鐘。為使細胞碎片的勻漿液澄清並沉澱蛋白質，室溫下以12.000xg對裂解物10離心分鐘。將含mRNA的上清液傾出，在70℃變性5分鐘。在含1％β-巰基乙醇的稀釋緩衝液中使MB-GMNC與細胞裂解物混合。然後對混合物施加磁場，將MB-GMNC從溶液中分離出來，然後直接檢測螢光強度。mRNA序列中的18個鹼基與MB2環序列完全互補。在HTB-26細胞內沒有具有相同的18個鹼基的另外mRNA。
從培養的細胞中俘獲mRNA。從細胞中萃取mRNA後，用MB-GMNC特異地俘獲mRNA分子。從細胞溶解物(圖10，曲線a)分離的MB-GMNC中可檢測到明顯的螢光信號可證明這一點。兩個對照實驗的結果證實，螢光信號實際上由於MB與靶mRNA的雜交。一種對照實驗是在裂解細胞之前加入MB-GNMC，接著磁場分離並洗滌。如曲線b所示，在與曲線a相同的條件下分析時，在MB-GMNC溶液中可檢測到沒有螢光。此外，在相同條件下用HTB-26細胞裂解物培養具有來自MB2的不同序列的MB時，在MB-GMNC溶液中觀察到沒有可檢測的螢光信號(圖10，曲線c)。
實施例6細菌的標記染料摻雜的納米微粒與對大腸桿菌菌株O157:H7特異的抗體結合。這些抗體結合的納米微粒和未結合的納米微粒(作為負對照)分別與含有大腸桿菌菌株O157:H7的溶液混合，混合時間要足以使抗體與結合抗原。然後過濾混合物，用掃描電鏡(SEM)和螢光顯微鏡進行分析。SEM和螢光顯微鏡均顯示，抗體結合的納米微粒與細菌相連，而未結合的納米微粒則沒有。
其他實施方式雖然上述說明書包含許多細節，但不應認為對本發明範圍的限制，而只是優選實施方式的例子而已。其他許多變化是可能的。因此，本發明的範圍不由所述實施方式決定，而由附加權利要求書和它們的合法同等物決定。
序列表110W.譚(Tan，Weihong)J.壽光(Jin，Shouguang)X.趙(Zhao，Xiaojun)R.T.戴蒂奧科(Dytioco，Rovelyn)T.J.德拉克(Drake，Timothy)L.R.西拉德(Hilliard，Lisa)120功能化納米微粒及其使用方法1305853-252WO16019170PatentIn version 3.1210121113212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸4001taacaataat cct 13210221116212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸4002tatccttatc aatatt16210321127212DNA213人工的
220
223人工合成的寡核苷酸4003ggattattgt taaatttaga taaggat27210421127212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸4004ggataattgt taaatttaga taaggat27210521118212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸4005ttccttcctg ggcatgga 18210621128212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(26)..(26)223Biotin dT4006gcacgtccat gcccaggaag gaacgtgc 28
210721115212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸4007atcaatattt aacaa 15210821115212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸4008ttgttaaata ttgat 15210921115212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸4009ttattaaata ttgat 152101021115212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸40010tagttataaa ttgtt 15
2101121115212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸40011tagttataaa ttatt 152101221128212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(1)..(1)223羧基-四甲基-若丹明(TMR)(-C6Am)220
221misc_feature222(26)..(26)223Biotin dT220
221misc_feature222(28)..(28)223DABCYL40012gcacgtccat gcccaggaag gaacgtgc 282101321118212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸
40013ttccttcctg ggcatgga 182101421118212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸40014ttccttcctg ggcatgga 182101521116212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(1)..(1)223螢光素40015catcaatatt taacaa162101621116212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(16)..(16)223DABCYL
40016ttgttaaata ttgatg162101721116212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(16)..(16)223DABCYL40017ttattaaata ttgatg162101821118212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸40018gcgcttccgg tgtccaga 182101921118212DNA213人工的220
223人工合成的寡核苷酸40019gccagggctg tgatctcc 18
權利要求
1.一種使納米微粒定向靶分子的方法，該方法包括如下步驟(a)提供具有氧化矽表面的納米微粒，所述氧化矽表面與至少一個能與靶分子特異結合的官能團結合；(b)在所述至少一個官能團能結合靶分子的條件下，混合納米微粒和靶分子。
2.權利要求1所述方法，其特徵在於納米微粒還包含由氧化矽表面包封的芯。
3.權利要求2所述方法，其特徵在於所述芯包含金屬。
4.權利要求3所述方法，其特徵在於所述金屬是磁性金屬。
5.權利要求2所述方法，其特徵在於所述芯包含染料。
6.權利要求5所述方法，其特徵在於所述染料是有機染料。
7.權利要求5所述方法，其特徵在於所述染料是無機染料。
8.權利要求5所述方法，其特徵在於染料選自Ru II/2，2』-二吡啶基、Eu3+/2，2』-二吡啶基、羅丹明6G、四甲基羅丹明和螢光素。
9.權利要求1所述方法，其特徵在於所述官能團是蛋白質。
10.權利要求9所述方法，其特徵在於蛋白質是抗體。
11.權利要求9所述方法，其特徵在於蛋白質是酶。
12.權利要求9所述方法，其特徵在於蛋白質是抗生物素蛋白。
13.權利要求9所述方法，其特徵在於蛋白質是生物素。
14.權利要求1所述方法，其特徵在於官能團是核酸。
15.權利要求14所述方法，其特徵在於核酸是DNA。
16.權利要求14所述方法，其特徵在於核酸呈分子信標的形式。
17.權利要求16所述方法，其特徵在於分子信標與螢光素結合。
18.權利要求17所述方法，其特徵在於分子信標還與螢光團的淬滅劑結合。
19.權利要求1所述方法，其特徵在於官能團通過生物素-抗生物素蛋白連接與氧化矽表面結合。
20.權利要求1所述方法，其特徵在於靶分子在細胞內。
21.權利要求20所述方法，其特徵在於靶分子在細胞表面上。
22.權利要求20所述方法，其特徵在於靶分子位於細胞內部。
23.權利要求20所述方法，其特徵在於所述細胞是真核細胞。
24.權利要求23所述方法，其特徵在於真核細胞是哺乳動物細胞。
25.權利要求24所述方法，其特徵在於哺乳動物細胞是癌細胞。
26.權利要求20所述方法，其特徵在於細胞是原核細胞。
27.權利要求26所述方法，其特徵在於原核細胞是細菌。
28.權利要求1所述方法，其特徵在於靶分子包含在液體中。
29.權利要求1所述方法，其特徵在於它還包含檢測納米微粒與靶標分子的結合的步驟(c)。
30.權利要求29所述方法，其特徵在於納米微粒與靶分子的結合通過觀察納米微粒的性質變化來檢測。
31.權利要求30所述方法，其特徵在於所述性質是發光。
32.權利要求1所述方法，其特徵在於靶分子包含在混合物內，該方法還包含從混合物中分離出包含與靶分子結合的納米微粒的複合物的步驟(c)。
33.權利要求32所述方法，其特徵在於它還包含從複合物中分離靶分子的步驟(d)。
全文摘要
用生物活性的分子，如抗體和核苷酸對塗有氧化矽的納米微粒進行官能化，並用於標記細胞，檢測和分離具有特定核苷酸序列的核酸分子，分離不同核酸分子的混合物。
文檔編號G01N33/542GK1662815SQ03814488
公開日2005年8月31日 申請日期2003年4月22日 優先權日2002年4月22日
發明者W·譚, J·壽光, X·趙, R·T·戴蒂奧科, T·J·德拉克, L·R·西拉德 申請人:佛羅裡達州立大學