一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑及其製備方法
2023-06-29 14:18:51
專利名稱：一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種粉劑及其製備方法。
技術背景
現今導致作物減產的最主要原因之一是農業蟲害，傳統的化學農藥雖然對害蟲 有一定的防治作用，但它所帶來的負面影響也日趨嚴重，使害蟲產生抗藥性從而降低藥 效，增加防治成本，毒性較大，不僅對人畜有害，而且會汙染環境，殺傷天敵，甚至破壞生態 平衡。而微生物殺蟲劑則克服了以上缺點，並且具有選擇性強、安全、原料簡單等優點，因 此成為農作物蟲害防治的研究熱點之一。目前研究過的微生物殺蟲劑中蘇雲金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis, Bt)是研究的最多也是最受青睞的生防製劑。
蘇雲金芽孢桿菌殺蟲劑自1938年法國問世以來，已取得了長足的發展，開發的劑 型也已經有很多種，包括粉劑、懸浮劑、可溼性粉劑、油劑、油乳劑、顆粒劑、片劑、緩釋劑、生 物包被劑等等，近100年的研究開發，使得以蘇雲金芽孢桿菌微生物源的微生物殺蟲劑逐 漸成熟完善。田間防治效果達到80%以上的在我國就有20多種。但在應用過程中還存在 主要起效成分不穩定，致使活性成分的保質期和持效期差等眾多問題。
蘇雲金粉劑所含伴孢晶體和芽孢以乾粉狀態存在，具有耐貯藏、運輸方便、使用性 強、效價高等特點。但由於粉劑不易被水溼潤，也不易分散和懸浮在水中，稀釋噴霧較困難。 蘇雲金芽胞桿菌粉劑含水量要求在4%以下，這樣才能較長時間保持有效成分處於穩定狀 態。
另外，蘇雲金芽孢桿菌粉劑的製備方法普遍存在單一、陳舊的問題，生產工藝也相 對落後，致使產品的生理檢測指標不確定、主要起效成分也不穩定，這使得微生物殺菌劑的 發展受到阻礙。
目前粉劑正朝著高效價、多功能(廣譜、增效、延緩抗性、降低成本)的方向發展， 劑型改進的工作主要針對這些不足進行。普魯蘭多糖具為白色非吸溼性的粉狀物，無毒、無 致畸性、無味，易溶於冷水，具有水溶性、成膜性、成纖維性、吸水性等獨特的性質，因此利用 普魯蘭多糖作為藥物釋放系統載體材料的研究越來越受到人們的重視；而在生產工藝中， 則需要選擇新劑型、新助劑和新的填加劑，以提高有效成分的分散性和附著性，延長活性成 分的保質期，也是目前亟待解決的一大難題。發明內容
本發明是為了解決現有蘇雲金芽孢桿菌粉劑主要有效成分不穩定，活性成分的保 存期和持效期差，製備工藝單一、陳舊的問題，而提供一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢杆 菌可溼性粉劑及其製備方法。
本發明一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑按重量百分比由 50% 70%的芽孢和伴孢晶體混合物、0. 5% 5%的載體、5% 20%的潤溼劑、5% 20%的分散劑和 5%的NaCl組成；其中芽孢和伴孢晶體混合物中芽孢與伴孢晶體的 數量比為0.8 1.2 1，分散劑為普魯蘭多糖。
本發明一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑的製備方法按以下步 驟實現一、取保藏的蘇雲金芽孢桿菌接種於LB固體斜面培養基上，在30°C條件下培養 Mh，然後再在LB固體斜面培養基上用接種環挑取菌苔轉接於5mL LB液體培養基中，在 30°C條件下，以200r/min的轉速搖菌12h，作為蘇雲金芽孢桿菌種子菌液；二、將種子菌液 按體積分數為2%接種於50mL發酵培養基中，在30°C條件下，以200r/min的轉速搖菌40 50h，直至芽孢脫落量為45% 55%，得到蘇雲金芽孢桿菌發酵液；三、用lmol/L HCl溶液 將發酵液調至PH值4. 5，然後分裝到2個離心管中，以5000 8000r/min轉速離心20min， 然後回收沉澱，得到芽孢和伴孢晶體混合物，芽孢和伴孢晶體的數量比為0. 8 1. 2 1 ； 四、按重量百分比加入50 % 70 %芽孢和伴孢晶體混合物、0. 5 % 5 %的載體和1 % 5 % 的NaCl，攪拌均勻；五、混勻後按重量百分比加入5% 20%的潤溼劑和5% 20%的分散 劑，攪拌均勻，在50 70°C條件下烘乾至含水質量百分數3% 4%時取出，然後研磨，再經 過75 μ m篩，得到一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑；其中，步驟五中分散 劑為普魯蘭多糖。
由於普魯蘭多糖良好的成膜特性，更有助於保持蘇雲金芽孢桿菌的活性。
本發明製備的含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑中蘇雲金芽孢桿菌 活芽孢含量8. 0 9. 2X IO9個/g，pH7. 2 ；通過75 μ m篩後細度為99. 9%，而目前國家標 準細度為98% ；懸浮率(即有效含量)72%，高於目前國家標準的懸浮率70% ；潤溼時間 為123s，明顯縮短於國家標準潤溼時間180s ；水分重量百分數3.8%，國家標準為4% ；保 存期6個月時用本發明得到的普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑處理，校正死亡率 為96%，蘇雲金芽孢桿菌的活性高，而使用其他分散劑製備的蘇雲金芽孢桿菌粉劑校正死 亡率僅為90%。
本發明將人造沸石、高嶺土或硅藻土作為載體、十二烷基苯磺酸鈉或十二烷基硫 酸鈉作為潤溼劑、普魯蘭多糖作為分散劑引入到蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑的製備過程 中，製備的含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑具有良好的保存期和持效期，添 加新劑型、新助劑和新的填加劑，彌補了現有技術製備工藝單一、陳舊的缺陷。
具體實施方式
本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑 按重量百分比由50% 70%的芽孢和伴孢晶體混合物、0. 5% 5%的載體、5% 20%的 潤溼劑、5% 20%的分散劑和 5%的NaCl組成；其中芽孢和伴孢晶體混合物中芽孢 與伴孢晶體的數量比為0.8 1.2 1，分散劑為普魯蘭多糖。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是所述的載體為人造沸 石、高嶺土或硅藻土。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是所述的潤溼劑為 十二烷基苯磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑 的製備方法按以下步驟實現一、取保藏的蘇雲金芽孢桿菌接種於LB固體斜面培養基上， 在30 V條件下培養Mh，然後再在LB固體斜面培養基上用接種環挑取菌苔轉接於5mL LB液 體培養基中，在30°C條件下，以200r/min的轉速搖菌12h，作為蘇雲金芽孢桿菌種子菌液； 二、將種子菌液按體積分數為2%接種於50mL發酵培養基中，在30°C條件下，以200r/min 的轉速搖菌40 50h，直至芽孢脫落量為45% 55%，得到蘇雲金芽孢桿菌發酵液；三、用 lmol/L HCl溶液將發酵液調至pH值4. 5，然後分裝到2個離心管中，以5000 8000r/min 轉速離心20min，然後回收沉澱，得到芽孢和伴孢晶體混合物，芽孢和伴孢晶體的數量比為 0. 8 1. 2 1 ；四、按重量百分比加入50% 70%芽孢和伴孢晶體混合物、0. 5% 5%的 載體和 5%的NaCl，攪拌均勻；五、混勻後按重量百分比加入5% 20%的潤溼劑和 5% 20%的分散劑，攪拌均勻，在50 70°C條件下烘乾至含水質量百分數3% 4%時取 出，然後研磨，再經過75 μ m篩，得到一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑； 其中，步驟五中分散劑為普魯蘭多糖。
本實施方式中蘇雲金芽孢桿菌購買自中國科學院微生物研究所。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟四中的載體為人 造沸石、高嶺土或硅藻土。其它步驟和參數與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
四或五不同的是步驟五中的潤溼 劑為十二烷基苯磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉。其它步驟和參數與具體實施方式
四或五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
六不同的是步驟二中蘇雲金芽孢杆 菌發酵培養基是將葡萄糖、黃豆餅粉、酵母粉、魚粉、蛋白腖、K2HPO4和CaCl2溶解於水中配 制培養基，其中葡萄糖20g/L，黃豆餅粉20g/L，酵母粉16g/L，魚粉20g/L，蛋白腖10g/L， K2HP0420g/L, CaCl230g/L,調pH值至6. 8 7. 0，裝入250mL三角瓶中，在0. 14Mpa壓力下滅 菌30min。其它步驟和參數與具體實施方式
六相同。
具體實施方式
八本實施方式一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑 的製備方法按以下步驟實現一、取保藏的蘇雲金芽孢桿菌接種於LB固體斜面培養基上， 在30 V條件下培養Mh，然後再在LB固體斜面培養基上用接種環挑取菌苔轉接於5mL LB液 體培養基中，在30°C條件下，以200r/min的轉速搖菌12h，作為蘇雲金芽孢桿菌種子菌液； 二、將種子菌液按體積分數為2%接種於50mL的發酵培養基中，在30°C條件下，以200r/min 的轉速搖菌48h，直至芽孢脫落量為50%，得到蘇雲金芽孢桿菌發酵液；三、用lmol/L HCl 溶液將發酵液調至PH值4. 5，然後分裝到2個離心管中，以6000r/min轉速離心20min，然 後回收沉澱，得到芽孢和伴孢晶體混合物，芽孢和伴孢晶體的數量比為0.8 1.2 1;四、 按重量百分比加入50% 70%芽孢和伴孢晶體混合物、0. 5% 5%的載體和 5%的 NaCl，攪拌均勻；五、混勻後按重量百分比加入5% 20%的潤溼劑和5% 20%的分散劑， 攪拌均勻，在55°C條件下烘乾證至含水量在4%時取出，然後用研缽研磨已經乾燥的混合 物，再經過75 μ m篩，得到一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑；其中，步驟 四中的載體為人造沸石、高嶺土或硅藻土 ；步驟五中的潤溼劑為十二烷基苯磺酸鈉或十二 烷基硫酸鈉，分散劑為普魯蘭多糖。
本實施方式中的載體人造沸石、高嶺土或硅藻土在使用時用研缽研磨多次，然後 經過75 μ m篩，得到細粉末。
具體實施方式
九本實施方式利用同一批蘇雲金芽孢桿菌的發酵液和三種不同載 體人造沸石、高嶺土或硅藻土分別混合製備成含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉 劑，如表1所示，乾燥後統計活芽孢含量，測定後得出載體對蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑中 的芽孢具有保護作用，且不同載體對蘇雲金芽孢桿菌的保護作用有差異，如高嶺土和硅藻 土在重量百分比1.0% 3.0%濃度時對蘇雲金芽孢桿菌的保護作用達到最高值，而人造 沸石則在重量百分比5. 0%的濃度下才能達到較高的保護作用。
另外，同一種載體在不同濃度下對蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑的保護也不盡相 同，表1為不同載體種類和含量對芽孢的影響。
表 權利要求
1.一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑，其特徵在於所述含有普魯蘭多 糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑按重量百分比由50% 70%的芽孢和伴孢晶體混合物、 0. 5 % 5 %的載體、5 % 20 %的潤溼劑、5 % 20 %的分散劑和1 % 5 %的NaCl組成； 其中芽孢和伴孢晶體混合物中芽孢與伴孢晶體的數量比為0.8 1.2 1，分散劑為普魯蘭多糖。
2.根據權利要求1所述的一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑，其特徵 在於所述的載體為人造沸石、高嶺土或硅藻土。
3.根據權利要求1或2所述的一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑，其 特徵在於所述的潤溼劑為十二烷基苯磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉。
4.製備權利要求1所述的一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑的方法， 其特徵在於它按以下步驟實現一、取保藏的蘇雲金芽孢桿菌接種於LB固體斜面培養基 上，在30°C條件下培養Mh，然後再在LB固體斜面培養基上用接種環挑取菌苔轉接於5mLLB 液體培養基中，在30°C條件下，以200r/min的轉速搖菌12h，作為蘇雲金芽孢桿菌種子菌 液；二、將種子菌液按體積分數為2%接種於50mL發酵培養基中，在30°C條件下，以200r/ min的轉速搖菌40 50h，直至芽孢脫落量為45% 55 %，得到蘇雲金芽孢桿菌發酵液； 三、用lmol/LHCl溶液將發酵液調至pH值4. 5，然後分裝到2個離心管中，以5000 8000r/ min轉速離心20min，然後回收沉澱，得到芽孢和伴孢晶體混合物，芽孢和伴孢晶體的數量 比為0.8 1.2 1 ；四、按重量百分比加入50% 70%芽孢和伴孢晶體混合物、0.5% 5 %的載體和1 % 5 %的NaCl，攪拌均勻；五、混勻後按重量百分比加入5 % 20 %的潤溼 劑和5% 20%的分散劑，攪拌均勻，在50 70°C條件下烘乾至含水質量百分數3% 4% 時取出，然後研磨，再經過75 μ m篩，得到一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉 劑；其中，步驟五中的分散劑為普魯蘭多糖。
5.根據權利要求4所述的一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑的製備 方法，其特徵在於步驟四中的載體為人造沸石、高嶺土或硅藻土。
6.根據權利要求4或5所述的一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑的制 備方法，其特徵在於步驟五中的潤溼劑為十二烷基苯磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉。
7.根據權利要求6所述的一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑的製備 方法，其特徵在於步驟二中蘇雲金芽孢桿菌發酵培養基是將葡萄糖、黃豆餅粉、酵母粉、魚 粉、蛋白腖、K2HPO4和CaCl2溶解於水中配製培養基，其中葡萄糖20g/L，黃豆餅粉20g/L，酵 母粉 16g/L，魚粉 20g/L，蛋白腖 10g/L, K2HP0420g/L, CaCl230g/L，調 pH 值至 6. 8 7. 0，裝 入250mL三角瓶中，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min。
全文摘要
一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑及其製備方法，它涉及一種粉劑及其製備方法。它要解決現有技術製備的粉劑活性成分的保質期和持效期差，製備工藝單一、陳舊的問題。本發明含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑包括芽孢和伴孢晶體混合物、載體、潤溼劑和分散劑，其製備方法是一、製備種子菌液；二、發酵培養種子菌液，得到發酵液；三、濃縮發酵液，得到芽孢和伴孢晶體；四、向芽孢和伴孢晶體混合物中加入載體和NaCl，混勻；五、混勻後加入潤溼劑和分散劑，混勻，烘乾研磨，得到一種含有普魯蘭多糖的蘇雲金芽孢桿菌可溼性粉劑。本發明得到的粉劑中蘇雲金芽孢桿菌的活性高，保質期和持效期長，廣泛應用于田間防治農業害蟲領域。
文檔編號A01N25/10GK102027999SQ201010549039
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月18日 優先權日2010年11月18日
發明者劉春光, 朱勳, 李雲龍, 楊峰山, 韓德權 申請人:黑龍江大學