一種高效幾丁質降解菌豚鼠氣單胞菌及其產生的幾丁質酶系的製作方法

2023-06-30 00:03:46

專利名稱：一種高效幾丁質降解菌豚鼠氣單胞菌及其產生的幾丁質酶系的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選得到了一株高效幾丁質降解菌-豚鼠氣單胞菌，該菌株分泌一個至少由4種幾丁質酶組成的幾丁質酶系，降解幾丁質得到幾丁寡糖。
背景技術：
幾丁質為N-乙醯葡萄糖胺以β-1，4-糖苷鍵連接而成的直鏈聚合物，是自然界除纖維素外含量居第二位的多糖，主要存在於蝦、蟹外殼，真菌細胞壁以及昆蟲外殼。幾丁質酶(EC3.2.1.14)能夠降解幾丁質的β-1，4-糖苷鍵，可分為內切酶和外切酶。幾丁內切酶對糖鏈隨機切割，得到分子量不等的幾丁寡糖；幾丁外切酶從糖鏈非還原端以幾丁二糖為單位逐單位切割，產生幾丁二糖。許多微生物能夠分泌幾丁質酶，降解幾丁質為生長提供所需碳源和氮源，微生物對幾丁質的降解利用是幾丁質在自然界循環的重要環節。
幾丁寡糖主要指分子量在5000以下聚合度為2-20的多聚N-乙醯葡萄糖胺，尤指聚合度為2-6的的低分子量寡糖。低分子量寡糖具有多種生物活性，在口腔醫學、人體免疫、抗癌領域有著廣泛應用，它們是目前幾丁質工業中僅有的高附加值產品。造成幾丁寡糖高成本的原因是高分子幾丁質降解度不易控制，化學裂解的產物分子量偏大且不均一。

發明內容
本發明的目的是篩選得到了一株高效幾丁質降解菌-豚鼠氣單胞菌，該菌株分泌一幾丁質酶系，降解幾丁質得到幾丁寡糖。
我們從廈門海域採集的不同泥樣和水樣中，分離到幾十株具有較高几丁質酶活性的細菌和放線菌。將這些初篩得到的菌株接種到以膠體幾丁質為唯一碳源和氮源的基本培養基上，復篩得到一株酶活力大於0.68U/mg的細菌CB101(圖1)，經鑑定該菌株為豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)。CB101在無幾丁質的誘導的情況下能組成型分泌少量幾丁質酶，在培養基中添加膠體幾丁質誘導物後幾丁質酶表達量大幅增加(誘導後酶最高表達量約為組成型表達的十倍)，添加葡萄糖則抑制其表達。CB101接種於MM-Chitin培養基搖瓶培養三天後離心取發酵液，硫酸銨沉澱總蛋白後進行蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，蛋白凝膠復性後酶活性染色顯示在總蛋白中有四條幾丁質酶活性帶，分別約為85kDa，66kDa，60kDa和50kDa(圖2)。總蛋白降解膠體幾丁質為低分子量寡糖(主要為二糖、三糖以及少量四糖和五糖)和單糖(圖3)。該酶系最適反應溫度為50℃，pH從4-12相對平穩，在pH6時酶活力達最高峰(圖4)。
根據GENEBANK中已有幾丁質酶基因保守區，設計上下遊引物，以Aeromonas caviae CB101的總DNA為模板，PCR擴增出一條約2.6kb的片段，基因及蛋白序列如下附表1。
克隆的幾丁質酶基因命名為chil，全長2598個鹼基對，編碼865個胺基酸，分子量為91.514kDa。Chil的N末端23aa有明顯的革蘭氏陰性菌的信號肽特徵，包括一正電區(如Lys-5)，隨後依次為一段α螺旋、一段稍長的疏水區(如6個Leu、、2個Ala和1個Val)及一個短的不帶電荷的極性區(Thr、Ser)，另外-3與-1位置為Ala。此酶在野生菌株中屬分泌蛋白，在培養液中為優勢蛋白，從野生菌株培養液純化出此蛋白後經N末端序列分析後證實其N末端殘基為24-31。說明在該酶轉膜外泌過程中，相關蛋白酶在Ala-23與Ala-24間進行剪切，因而實際只有842aa(對應於從總蛋白中檢測出的約85kDa的幾丁質酶，實際分子量為89.3kDa)。幾丁質酶Chil降解幾丁3-6糖主要得到幾丁二糖，降解膠體幾丁質主要產物為幾丁二糖和幾丁三糖，延長降解時間後其產物中單糖產量大大增加，表明該酶同時具有幾丁外切和幾丁內切功能，且其最小底物為幾丁三糖。


圖1豚鼠氣單胞菌CB101(Aeromonas caviae)在以膠體幾丁質為唯一碳源和氮源的基本培養基上生長，降解膠體幾丁質出現透明圈。圖2豚鼠氣單胞菌CB101發酵培養液中幾丁質酶的檢測，1，蛋白質分子量標準2，發酵液總蛋白的蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)3，發酵液總蛋白電泳後復性，影印到糖幾丁質凝膠板上，幾丁質酶降解糖幾丁質後染色可顯示幾丁質酶帶所在位置。圖3、4豚鼠氣單胞菌CB101幾丁質酶系反應溫度和pH
附表1(chil序列)1 ATGTTAAGTCCAAAACTTTCCCTGCTGGCGCTTCTGGTCGGGGGGCTTTGCACTACCTCCGCCTTCGCCGCTGCCCCGGGCAAACCCACC1 M L S P K L S L L A L L V G G L C T T S A F A A A P G K P T91ATTGGCTCCGGCCCCACCAAGTTTGCCATCGTTGAAGTCAATCAGGCCGCTTCGGCCTACAACCAGCTGGTGACCGTCCACAAGGATGGC31 I G S G P T K F A I V E V N Q A A S A Y N Q L V T V H K D G181 GCTCCCGTCAGCGTGACCTGGAACCTTTGGTCCGGTGACGTCGGACAGACCGCCAAGGTACTGCTTGATGGCAAGGAGGTGTGGTCAGGC61 A P V S V T W N L W S G D V G Q T A K V L L D G K E V W S G271 CCGGCCTCCGCCGCGGGTACCGCCAACTTCAAGGTCACCAAGGGGGGGCGTTACCAGATGCAGGTGGCCCTGTGCAACGCCGACGGCTGC91 P A S A A G T A N F K V T K G G R Y Q M Q V A L C N A D G C361 ACCCTCTCCGACAAGAAGGAGCTGATGGTCGCCGATACCGACGGCAGCCACCTGGCGCCGCTCAATGCGCCCCTCAAGGAGAACAACAAG121T L S D K K E L M V A D T D G S H L A P L N A P L K E N N K451 CCCTACGCCAACAAGTCCGGCAAGGTGGTGGGGGCCTACTACGTGGAGTGGGGAGTCTATGGTCGCAAGTTCAGCGTGGACAAGATCCCG151P Y A N K S G K V V G A Y Y V E W G V Y G R K F T V D K I P541 GCCCAGAACCTGACCCATATCCTCTACGGCTTCACCCCCATCTGCGGTGGCAACGGCATCAACGACAGCCTCAAAGAGATCTCCGGCAGC181A Q N L T H I L Y G F T P I C G G N G I N D S L K E I S G S631 TTCGAGGCGTTGCAGCGCTCCTGTGCGGGTCGCGAAGACTTCAAGGTCTCCATCCATGATCCCTGGGCGGCGATCCAGATGTCCCAAGGC211F E A L Q R S C A G R E D F K V S I H D P W A A I Q M S Q G721 AACCTCAGCGCCTGGGATGAGCCCTACAAGGGCAACTTCGGCAACCTGATGGCCCTCAAACAGGCCCATCCGGACCTCAAGATCCTGCCG241N L S A W D E P Y K G N F G N L M A L K Q A H P D L K I L P811 TCTGTCGGCGGATGGACCCTCTCAGATCCCTTTTACTTCCTGGGTGACAAGACCAAGCGCGATACCTTCGTCGCCTCGGTCAAAGAGTTC271S V G G W T L S D P F Y F L G D K T K R D T F V A S V K E F901 CTGCAGACCTGGAAATTCTTCGACGGGGTGGACATCGACTGGGAGTTCCCGGGCGGACAGGGGGCCAACCCCAGCCTGGGCGGCCCGAAT301L Q T W K F F D G V D I D W E F P G G Q G A N P S L G G P N991 GACGGCGCCACCTATGTGGTGCTGATGAAGGAGTTGCGAGCCATGCTCGATGAACTGGAAGCCGAGACCGGCCGCCAGTATGAGCTGACC331D G A T Y V V L M K E L R A M L D E L E A E T G R Q Y E L T1081 TCGGCCATCAGCGCCGGCGGTGACAAGATTGCCAAGGTGGATTATCAGGCGGCCCAGCAGTACATGGACCACATCTTCCTGATGAGCTAC361S A I S A G G D K I A K V D Y Q A A Q Q Y M D H I F L M S Y1171 GACTTCAGCGGCGCCTTCGACCTGACGAATCTGGCCCACCAGACCAACCTCTTTGCCTCCAGCTGGGATCCGGCCACCAAGTACACCACC391D F S G A F D L T N L A H Q T N L F A S S W D P A T K Y T T1261 GACAAGGGCGTCAAGGCGCTGCTGGGTCAGGGGGTGACACCGGGCAAGATTGTGGTGGGGGCGGCCATGTATGGCCGTGGCTGGACCGGA421D K G V K A L L G Q G V T P G K I V V G A A M Y G R G W T G1351 GTGAAGAACTACCAGGCCGGCAACCCCTTCACCGGCACCGCCACCGGACCGGTGAGCGGTACCTGGGAAAATGGCGTGGTGGATTACCGC451V K N Y Q A G N P F T G T A T G P V S G T W E N G V V D Y R1441 GACATCGTCAACAACCGCATGGGCGCAGGCTGGGAGCAGGGCTATGACGAGTCGGCCGAGGCCCCCTATGTCTTCAAGGCCAGCAGTGGC481D I V N N R M G A G W E Q G Y D E S A E A P Y V F K A S S G1531 GACCTCATCACCTTCGACAACGACCGCTCGGTCAAGGCCAAGGGGCAGTACGTGCTGGCGAACCAGCTCGGCGGTCTGTTCGCCTGGGAA511D L I T F D N D R S V K A K G Q Y V L A N Q L G G L F A W E1621 ATTGATGCGGACAACGGCGACATCCTCAACGCCATGCACGAGGGGCTGGGCCACGGCGAGGGTACGCTGCCGCCGGTCAACAAGCCGCCG541I D A D N G D I L N A M H E G L G H G E G T L P P V N K P P1711 GTTGCCAATGCCGGCAGCGATCTGAGTGCCACCGGCCCGGCCGAGGTGACCCTCAACGGCAGCGCCTCCCACGATCCGGAAAACGGGGCG571V A N A G S D L S A T G P A E V T L N G S A S H D P E N G A1801 CTGACCTACAGCTGGAAACAGGTCTCCGGACCCCAGGCTAGCCTGCTGGATGCCACCCAGGCCAAGGCCCGTGTGGTACTGGATGCCGTC601L T Y S W K Q V S G P Q A S L L D A T Q A K A R V V L D A V1891 AGCAGCGACATCAATCTGGTGTTCGAGCTGACCGTGACCGACGATCAGGGGCTCTCGGCCAAGGATCAGGTGGTGGTCACCAACAAGGCG631S S D I N L V F E L T V T D D Q G L S A K D Q V V V T N K A1981 CCGCAGCCGAACCTGCCCCCCGTGGTCAGCGTACCGGCCAGTGCGACCGTCGAGGCCGGCAAGCAGGTGAGCATCAAGGCCACCGCTTCC661P Q P N L P P V V S V P A S A T V E A G K Q V S I K A T A S2071 GACCCCAATGGTGATGCCCTGAGCTATCAGTGGACAGTGCCGGCCGGGCTCAGCGCCACCGGTCTGGACAGCGCGACCCTGGTGGTAACG691D P N G D A L S Y Q W T V P A G L S A T G L D S A T L V V T2151 GGCTCGAACGTGACCAGTGATACGGCCTACGATCTGACCCTGGTGGTCACCGACGGGGCGCTGGATGCCACAGCCGTTACCCGCCTGACC721G S N V T S D T A Y D L T L V V T D G A L D A T A V T R L T2251 GTCAAGCCGGCCAGTACAGGTGGTGGCTGCGAGGCCAGCGATCCGGATGCGGCCAACCATCCGGCCTGGAGTGCTGGTACCGTCTACAAC751 V K P A S T G G G C E A S D P D A A N H P A W S A G T V Y N2341 ACCAATGACAAGGTGAGCCACAAGCAACTGGTGTGGCAGGCCAAGTATTGGACCCAGGGCAACGAGCCGAGCCGCACCGCCGATCAGTGG781 T N D K V S H K Q L V W Q A K Y W T Q G N E P S R T A D Q W2431 AAACTGGTGAGCCAGGTGCAACTGGGTTGGGATGCCGGAGTGGTCTACAACGGCGGTGATGTCACCAGCCACAACGGCCGCAAGTGGAAG811 K L V S Q V Q L G W D A G V V Y N G G D V T S H N G R K W K2521 GCCCAGTACTGGACCAAGGGCGATGAGCCCGGCAAGGCCGCCGTCTGGGTCGATCAGGGCGCGGCGAGCTGCAACTGA841 A Q Y W T K G D E P G K A A V W V D Q G A A S C N*
權利要求
1.一種豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，其具有降解膠體和晶體幾丁質的能力。
2.如權利要求1所述的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，其特徵在於其能夠分泌幾丁質酶，降解膠體幾丁質得到幾丁質寡聚糖和單糖。
3.如權利要求1所述的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，其特徵在於其能夠分泌幾丁質酶，降解晶體幾丁質得到幾丁二糖。
4.如權利要求所述1的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，其特徵在於所分泌的幾丁質酶系，該酶系包括四種幾丁質酶，反應溫度和pH分別為30-70℃和4-12。
5.如權利要求所述1的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，其特徵在於所分泌的幾丁質酶系，該酶系包括四種幾丁質酶，反應最適溫度和pH分別為50℃和6。
6.一種降解幾丁質生產幾丁寡聚糖的方法，其特徵在於利用生物幾丁質酶降解。
7.一個幾丁質酶基因，該基因長2598個鹼基對，序列為chil。
8.如權利要求5所克隆的幾丁質酶基因，其所編碼的蛋白質胺基酸序列，該蛋白質含865個胺基酸，分子量91.5kDa。
全文摘要
本發明公開得到了一株幾丁質降解菌－豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)，該菌株能夠分泌至少四種幾丁質酶，可以單獨或協同作用。該酶系反應最適溫度為50℃，最適pH6，能夠降解膠體幾丁質得到幾丁質寡聚糖(主要為二糖、三糖以及少量四糖和五糖)和單糖，降解晶體幾丁質主要得到幾丁二糖。克隆了該酶系中最大的一個幾丁質酶基因(全長2598個鹼基對)，此基因編碼一個865個胺基酸的蛋白質，分子量為91.5kDa，能夠降解膠體幾丁質主要得到幾丁二糖和三糖。
文檔編號C12N9/24GK1417324SQ01127590
公開日2003年5月14日 申請日期2001年11月1日 優先權日2001年11月1日
發明者肖湘, 王風平, 周櫻 申請人:國家海洋局第三海洋研究所