牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒的製作方法
2023-06-29 17:18:16 1
牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供能對具有大範圍的免疫表型的患者以高精度檢查牙周病、並且能用自動化的機器進行高速處理的、血液試樣中的針對牙周病原菌的抗體效價或抗體的檢測試劑盒，適合用於該試劑盒的牙周病原菌抗原蛋白，以及使用該試劑盒的檢測血液試樣中的抗體效價或抗體的存在的方法，對牙齦卟啉單胞菌菌株進行分型的試劑盒。本發明公開了包含具有序列編號：1、3、9、15、19、31、41、43、63、65和67的胺基酸序列的一系列多肽的檢測試劑盒，具有序列編號：67的胺基酸序列的改性多肽，以及測定從人身體中分離的血液試樣中的針對牙周病原菌的抗體效價或抗體的存在的方法，該方法包括使該血液試樣與上述一系列多肽接觸的步驟。
【專利說明】牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，更詳細地說，涉及適合於用機器自動化檢測的包含特定的牙周病原菌抗原蛋白的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒、該試劑盒中使用的改性多肽、以及測定血液試樣的針對牙周病原菌的抗體效價的方法。
【背景技術】
[0002]牙周病是因口腔細菌感染牙周組織而引發的細菌感染症。
[0003]在牙科臨床的現場，將臨床症狀、口腔內照片、X光圖像或牙周組織檢查等臨床檢查的結果綜合起來進行牙周病的診斷。這些檢查中，口腔內照片和X光圖像診察是用視覺來評價牙周組織的形態變化，牙周組織檢查是測定牙菌斑附著狀況、牙周袋的深度、探診時的出血或牙齒的鬆動度等各種臨床項目來進行評價。因此，這些檢查需要繁瑣的操作，為了準確地診斷患者的牙周病病情，要求手術者有高超的技術。
[0004]S卩，根據情況的不同，會因手術者的熟練度而導致檢查結果不同，甚至有可能導致對患者的診斷不同。此外，上述牙科臨床檢查中，雖然牙周病是細菌感染症，但並不是在牙周病原菌的「感染」水平上進行評價，而是在牙周組織的「形態上的變化」的水平上進行評價，可以說是由手術者主觀地進行檢查，一直以來對於從細菌學、免疫學的觀點來看恰當、且不會因手術者的熟練度而導致檢查結果產生差異的客觀的牙周病檢查方法都存在需求。
[0005]在這種狀況下，建立了以針對牙周病原菌的血清抗體效價作為牙周病檢查的指標的牙周病檢查系統(非專利文獻I)。該牙周病檢查系統從由患者的指尖採集並分離的微量的血液來檢查、定量針對牙周病原菌的「特異性抗體」，由此評價牙周病原菌的感染狀態和牙周病的嚴重程度(炎症的狀態)，能通過採用免疫學方法來客觀且均一地評價牙周病的病情。
[0006]此外，該牙周病檢查系統中，從由指尖採集的血液中分離血漿，將血漿試樣郵遞至檢查機構，用檢查機構測定針對牙周病原菌的IgG抗體效價，評價牙周病的嚴重程度後，通知各患者牙周病檢查的結果(牙周病原菌血漿抗體效價檢查)。因此，能對全科醫師或家庭的牙周病檢查實施輔助，並且通過一攬子收集並分析檢查數據，也能利用龐大的數據來與病情進行關聯。
[0007]另一方面，這種牙周病檢查系統中，由於要處理大量的試樣，因此要求自動進行高速處理。
[0008]這種檢查系統中，試樣(血液)中的針對作為檢查對象的抗原的抗體的種類越多，則檢查結果與牙周病的相關性越高，越能以良好的精度檢查牙周病。此外，感染牙周病的人中，由於牙周病原菌和人的個體差異，導致識別的牙周病原菌抗原的種類不同，從這一點來看，也同樣是作為檢查對象的抗體的種類越多，越能以良好的精度檢查牙周病。
[0009]然而，如果欲測定多種抗體的抗體效價，則難以進行試樣的高速處理，不適合於用機器自動化檢測。[0010]現在的抗體效價測定中使用的抗原是將牙銀卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)等牙周病原菌粉碎而配製成的溶液,是包含種類繁多的細菌蛋白(也包括LPS、膜脂)的混合物。因此，難以用機器來自動地高速處理大量的試樣。
[0011]現有技術文獻非專利文獻
非專利文獻1:工藤值英子、R山牙學會雜誌、第28卷、第I號(2009) 1-14頁。
【發明內容】
[0012]發明要解決的技術問題
本發明的目的在於提供牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒、適合用於該試劑盒的牙周病原菌抗原蛋白、以及使用該試劑盒的檢測血液試樣的牙周病原菌血漿或血清抗體效價的方法，該試劑盒能涵蓋由於變化的牙周病原菌的抗原性和檢查對象的多樣的免疫反應性而產生的多樣的抗原抗體反應，能以高精度檢查具有多樣的免疫表型的廣大範圍內的患者的牙周病，並且能用自動化的機器進行高速處理。
[0013]用於解決技術問題的手段
基於該課題，本發明人對牙周病原菌蛋白的篩選進行了研究，該牙周病原菌蛋白即使種類少，也能涵蓋多樣的抗原抗體反應，能以良好的精度判定牙周病。其結果是，本發明人發現，特定的牙周病原菌蛋白的組合與從牙周病患者中分離的血液試樣中的血漿抗體特異性地反應，通過選擇性地使用這些細菌蛋白的組合，能涵蓋多樣的抗原抗體反應，能以良好的精度檢測血液試樣，並且能用自動化的機器進行高速處理，從而完成了本發明。
[0014]S卩，本發明提供:
[I]
牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其包含具有序列編號:1、3、9、15、19、31、41、43、63、65和67的胺基酸序列的一系列多肽。
[0015][2]
上述[I]所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其進一步包含具有序列編號:5和37的胺基酸序列的多肽。
[0016][3]
上述[I]或[2]所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其進一步包含具有序列編號:23、35和47的胺基酸序列的多肽。
[0017][4]
上述[I]?[3]中任一項所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其進一步包含具有序列編號:17的胺基酸序列的多肽。
[0018][5]
改性多肽，其具有序列編號:63的胺基酸序列。
[0019][6]
上述[5]所述的改性多肽，其包含由序列編號:64的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
[0020][7]
改性多肽，其具有序列編號:65的胺基酸序列。[0021][8]
上述[7]所述的改性多肽，其包含由序列編號:66的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
[0022][9]
改性多肽，其具有序列編號:67的胺基酸序列。
[0023][10]
上述[9]所述的改性多肽，其包含由序列編號:68的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
[0024][11]
改性多肽，其具有序列編號:141的胺基酸序列。
[0025][12]
上述[11]所述的改性多肽，其包含由序列編號:142的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
[0026][13]
改性多肽，其具有序列編號:145的胺基酸序列。
[0027][14]
上述[13]所述的改性多肽，其包含由序列編號:146的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
[0028][15]
牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其包含具有選自序列編號:1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、63、65、67、141、143、145、147、151、153 和 155 中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
[0029][16]
上述[15]所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其中，所述多肽是具有選自序列編號:3、5、15、19、31、41、141和145中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
[0030][17]
上述[15]所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其中，所述多肽是由選自序列編號:2、4、6、10、16、18、20、24、32、36、38、42、44、48、64、66、68、142、144、146、148、152、154和156中的一種或兩種以上的多核苷酸序列編碼的多肽。
[0031][18]
測定從人身體中分離的血液試樣中的針對牙周病原菌的抗體效價的方法，該方法包括使該血液試樣與牙周病原菌抗原多肽接觸的步驟，該方法的特徵在於，所述牙周病原菌抗原多肽是具有選自序列編號:1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、63、65、67、141、143、145、147、151、153和155中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
[0032][19]
測定從人身體中分離的血液試樣中的針對牙周病原菌的抗體的存在的方法，該方法包括使該血液試樣與牙周病原菌抗原多肽接觸的步驟，該方法的特徵在於，所述牙周病原菌抗原多肽是具有選自序列編號:3、5、15、19、31、41、141和145中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
[0033][20]
上述[19]所述的方法，其中，所述多肽是由選自序列編號:4、6、16、20、32、42、142和146中的一種或兩種以上的多核苷酸序列編碼的多肽。
[0034][21]牙齦卟啉單胞菌菌株的分型試劑盒，其包含具有選自序列編號:151、153和155中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
[0035][22]
上述[21]所述的分型試劑盒，其中，所述多肽是由選自序列編號:152、154和156中的一種或兩種以上的多核苷酸序列編碼的多肽。
[0036][23]
多肽，其具有序列編號:151的胺基酸序列。
[0037][24]
上述[23]所述的多肽，其包含由序列編號:152的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
[0038][25]
多肽，其具有序列編號:153的胺基酸序列。
[0039][26]
上述[25]所述的多肽，其包含由序列編號:154的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
[0040][27]
多肽，其具有序列編號:155的胺基酸序列。
[0041][28]
上述[27]所述的多肽，其包含由序列編號:156的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
[0042]本發明的第一形態中，提供包含特定的抗原蛋白的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒。
[0043]本發明的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒是與從人身體中分離的少量的血液反應來測定血液試樣(血漿或血清)的針對牙周病原菌的IgG抗體效價、從而檢查對象的牙周病原菌感染的試劑盒，一般有:包括
(1)刺血針，該刺血針用於在對象身體上造成小的傷口來引起少量的出血
(2)毛細管，該毛細管用於採集該血液
(3)瓶子，該瓶子加入有包含特定的牙周病原菌抗原蛋白的溶液
(4)針筒，該針筒用於壓縮該瓶子內部，從而從血液中分離血漿
(5)蓋子，該蓋子用於將該瓶子密閉
通過將用毛細管採集的血液與瓶子內的溶液混合，從而在血液試樣中存在針對牙周病原菌的IgG抗體的情況下與瓶子內的抗原蛋白發生抗原抗體反應，通過測定免疫沉澱來檢查牙周病原菌的感染的試劑盒；以及ELISA法中使用的試劑盒，該試劑盒是
(1)將抗原蛋白質固定化於進行固定化的96孔板中，
(2)將血液試樣(血漿或血清)加入96孔板，進行抗原抗體反應，
(3)清洗96孔板後，加入抗人IgG二抗，進行抗原抗體反應，
(4)清洗96孔板後，進行因特異性結合的抗人IgG二抗的存在而導致的顯色或發光反應，檢測該信號；以及抗原固定化濾器法中使用的試劑盒，該試劑盒是
(1)將抗原蛋白固定化於濾器(生物素化等)，
(2)將血液試樣(血漿或血清)加入濾器，在濾器中進行抗原抗體反應，
(3)清洗濾器後，加入抗人IgG二抗，進行抗原抗體反應，
(4)清洗濾器後，進行因特異性結合的抗人IgG二抗的存在而導致的顯色或發光反應，檢測該信號。
[0044]本發明的該形態的特徵在於檢測試劑盒中所包含的牙周病原菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原蛋白，其與牙周病患者所具有的針對牙周病原菌的抗體特異性地反應，並且與廣大範圍內的牙周病患者所具有的抗體反應。
[0045]即，本發明的牙周病原菌血漿或血清抗體血漿檢測試劑盒中所包含的牙周病原菌抗原蛋白是具有選自序列表的序列編號:1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、141、143、145、147、151、153和155中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽，通過將這些抗原蛋白的一種或兩種以上組合使用，能檢測牙周病患者所具有的抗體的抗體效價和種類，能檢查牙周病原菌的感染程度和感染類型。此外，雖然牙周病原菌的抗原蛋白和各牙周病患者的免疫表型(針對牙周病原菌的抗體的種類)存在個體差異，但通過將本發明的抗原蛋白組合使用，能涵蓋廣泛的免疫表型的牙周病患者。此外，能檢出心血管或腦血管疾病的風險因素即牙周病原菌SU63株。
[0046]此外，本發明中使用的牙周病原菌抗原蛋白優選為由選自序列表的序列編號:2、4、6、10、16、18、20、24、32、36、38、42、44、48、142、144、146、148、152、154 和 156 中的一種或兩種以上的核苷酸序列編碼的多肽。
[0047]本發明的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒中所包含的牙周病原菌抗原蛋白更優選為具有選自序列表的序列編號:3、5、15、19、31、41、63和67中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽，優選為由選自序列編號:4、6、16、20、32、42、64和68中的一種或兩種以上的多核苷酸序列編碼的多肽。
[0048]本發明的第二形態中，提供所述牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒中使用的改性多肽。
[0049]本發明人在尋找適合用於抗體效價檢測試劑盒的牙周病原菌抗原蛋白時發現，一部分抗原蛋白雖然與廣大範圍內的牙周病患者的抗體反應，但因為具有蛋白酶活性，所以會因其自體消化作用和其它抗原蛋白的分解作用而對檢查造成阻礙。於是，本發明人通過基因工程方法製備了一種改性多肽，該改性多肽在維持這些抗原蛋白的抗原性的同時喪失了蛋白酶活性。
[0050]S卩，本發明的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒中使用的改性多肽是具有序列編號:63、65或67的胺基酸序列的多肽，是序列編號:51的野生型多肽的477或488位的半胱氨酸殘基缺失、或置換成其它胺基酸殘基、優選置換成丙氨酸殘基的改性多肽(分別為序列編號:63和65)以及序列編號:57的野生型多肽的471位的半胱氨酸殘基缺失、或置換成其它胺基酸殘基、優選置換成丙氨酸殘基的改性多肽(序列編號:67)。通過將這些改性多肽的一種或兩種以上組合使用，特別能進行針對更廣泛種類的牙周病原菌的抗體的檢測。
[0051]本發明的第三形態中，提供測定從人身體中分離的血液試樣中的針對牙周病原菌的抗體效價的方法，該方法包括使該血液試樣與牙周病原菌抗原多肽接觸的步驟，方法中使用的血液試樣優選為從指尖毛細血管或靜脈採集的血液、血清或血漿，牙周病原菌抗原多肽是具有選自序列編號:1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、63、65、67、141、143、145、147、151、153和155中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。牙周病原菌抗原多肽優選為具有選自序列編號:3、5、15、19、31、41、63和67中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
[0052]本發明的該形態中的方法可適宜地用第一形態的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒來實施，優選可適宜地用牙周病原菌血漿抗體效價檢測來實施。
[0053]還可以根據抗體效價來檢測牙周病的發展程度(嚴重程度)。
[0054]本發明的第四形態中，提供牙齦卟啉單胞菌菌株的分型試劑盒，該試劑盒可對從人身體中分離的血液試樣中存在的牙齦卟啉單胞菌菌株、特別是FDC381株和SU63株進行分型，能檢查試樣中是否存在任一種菌株。該試劑盒包含具有選自序列編號:151、153和155中的一種或兩種胺基酸序列的多肽,多肽優選由選自序列編號:152、154和156中的一種或兩種多核苷酸編碼。
[0055]發明效果
通過本發明，可提供一種能高速且以高精度檢查牙周病的牙周病檢查試劑盒。此外，可提供一種能不依賴於手術者技術的熟練度來客觀地檢查牙周病的牙周病檢查試劑盒。
[0056]此外，通過本發明的牙周病檢查試劑盒的普及，全國的牙科醫院都能用統一的方法來檢查牙周病，此外，通過將所得的測定結果製成資料庫，能製作或修訂牙周病的判斷標準和治療方針。
[0057]本發明的牙周病檢查試劑盒還能檢出心血管或腦血管疾病的風險因素。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0058][圖1]是表示牙周病原菌抗原蛋白對人血清的抗原抗體反應的圖。A:對健康人血清的抗原抗體反應，B和C:對牙周病患者血清的抗原抗體反應。
[0059][圖2]是用抗體柱粗純化的牙齦卟啉單胞菌FDC381菌株抗原蛋白的SDS-PAGE電泳圖。泳道A:由健康人血清柱粗純化的抗原蛋白，泳道B:由患者血清I柱粗純化的抗原蛋白，泳道C:由患者血清2粗純化的抗原蛋白。
[0060][圖3]是表示粗純化的FDC381菌株抗原蛋白與血清的抗原抗體反應的圖。泳道A:由健康人血清柱粗純化的抗原蛋白，泳道B:由患者血清I柱粗純化的抗原蛋白，泳道C:由患者血清2柱粗純化的抗原蛋白。
[0061][圖4]是用抗體柱粗純化的牙齦卟啉單胞菌SU63菌株抗原蛋白的SDS-PAGE電泳圖。泳道A:由健康人血清柱粗純化的抗原蛋白，泳道B:由患者血清I柱粗純化的抗原蛋白，泳道C:由患者血清2柱粗純化的抗原蛋白。
[0062][圖5]是表示粗純化的SU63菌株抗原蛋白與血清的抗原抗體反應的圖。泳道A:由健康人血清柱粗純化的抗原蛋白，泳道B:由患者血清I柱粗純化的抗原蛋白，泳道C:由患者血清2柱粗純化的抗原蛋白。
[0063][圖6]是表示抗原蛋白的Mascot檢索結果的圖。
[0064][圖7]是表示鑑定出的抗原蛋白的基因信息和篩選結果的圖。
[0065][圖8]是表示血清與合成抗原蛋白的抗原抗體反應的圖。
[0066][圖9]是表示血清與合成抗原蛋白的抗原抗體反應信號值的圖。
[0067][圖10]是表示合成抗原蛋白的穩定性的SDS-PAGE電泳圖。
[0068][圖11]是表不健康人血清與合成抗原蛋白的抗原抗體反應信號值的圖。
[0069][圖12]是表示各種患者血清與抗原蛋白的抗原抗體反應信號值的圖。[0070][圖13]是概括各種患者血清與抗原蛋白的抗原抗體反應的圖。
[0071][圖14]是表示改性多肽的穩定性和抗原性的圖。
[0072][圖15]是表示血清與合成抗原蛋白的抗原抗體反應的圖。
[0073][圖16]是表示血清與合成抗原蛋白的抗原抗體反應信號值的圖。
[0074][圖17]是概括各種血清與抗原蛋白的抗原抗體反應的圖。
[0075][圖18]是表不健康人和患者血清與抗原蛋白的抗原抗體反應彳目號平均值和S/N 值的圖。
[0076][圖19]是表示關於針對各種抗原蛋白的各血清的信號值而求得的R0C曲線和 AUC值的圖。
[0077][圖20]是表示血清與各種抗原蛋白（SU63株)的抗原抗體反應的圖。
[0078][圖21]是概括血清與抗原蛋白（SU63株）的抗原抗體反應的圖。
【具體實施方式】
[0079]以下基於實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明不限定於這些實施例。
[0080]在所有本實施例中都使用牙銀卩卜啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis)FDC381 菌株和SU63菌株作為牙周病原菌。FDC381菌株由住商醫藥國際（住商— >夕一 t '> 3 t )株式會社售賣，SU63菌株可作為II型或IV型菌毛保有株獲得。
[0081]抗體柱的製備
在人感染牙周病原菌時，人身體內通過免疫反應而產生針對牙周病原菌的抗原的多種 抗體。這裡產生的抗體所識別的抗原因個體的免疫反應的差異而不同。
[0082]因此，考察了在牙周病原菌的抗原製備液的組成中是何種抗原成為抗體的靶點， 基於其結果來篩選用於純化更多的抗原的血清。
[0083]抗原蛋白的製備
將牙齦卟啉單胞菌（FDC381株和SU63株）超聲波粉碎，回收超離心後的上清組分，向 所得抗原製備液（株式會社特殊免疫研究所、200 ii g蛋白質當量）中加入磷酸緩衝生理鹽 水（PBS)，使其達到270iU。向其中加入三氯乙酸，在冰中靜置後，在低溫下進行離心，除去 上清。向該沉澱中加入冰冷乙醇進行清洗，再次在低溫下進行離心後，除去上清。然後進行 上述操作2次。風乾後，加入添加有0. 06%的十二烷基硫酸鈉（SDS)的PBS 120 u 1，將沉 澱溶解，針對各菌株分別配製抗原蛋白溶液。
[0084]抗原蛋白的定量
在96孔板的孔中分別加入配製的標準物（濃度：1000、500、250、125、62. 5或31. 25ng/ U l)25iU、用PBS稀釋的抗原蛋白溶液25 ill、作為對照的PBS 25 yl，接著在各孔中加入 蛋白質工作液（以Thermo scientific, Reagent A:B=50:1的用量混合）200 ii 1。接著，用 搖床攪 拌反應液，在恆溫恆溼機內於37°C孵育30分鐘後，用酶標儀（Intermed，NJ2000)測 定577nm的吸光度，對收集的抗原蛋白進行定量。
[0085]SDS-PAGE 電泳
對於經定量的牙齦卟啉單胞菌（FDC381菌株和SU63菌株）抗原蛋白，用各試樣緩衝液 (Invitrogen)配製成蛋白質濃度400ng/ u 1。將配製的試樣熱變性後，供於SDS-PAGE電泳 (蛋白質溶液5iU)。[0086]對於SDS-PAGE電泳後的凝膠,用iBlot乾式轉印系統(Invitrogen)在聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上進行轉印。
[0087]轉印至PVDF膜後，將電泳後的布局(layout)(分子量標準、FDC381株、SU63株)作為一組切出。對於切出的一組狹條(slit)進行麗春紅染色，確認蛋白質的轉印。對於其餘的狹條，加入Falcon管中，浸潰於封閉溶液(添加有3%的脫脂牛奶和0.1%的TWeen20的Tris緩衝生理鹽水(下稱「TBS」))中。
[0088]使用血清的抗原抗體反應
對於封閉後的狹條，除去封閉溶液後，加入血清反應液(在添加有3%的脫脂牛奶的TBS 20ml中加入從健康人或牙周病患者米集的血清8μ I而得的溶液)，在室溫下振湯。接著，用添加有0.05%的Tween20的TBS清洗狹條。清洗後，加入5000倍稀釋的結合有辣根過氧化物酶的山羊抗人IgG抗體反應液(在添加有3%的脫脂牛奶的TBS中加入抗人二抗(CHEMIC0N)而得的溶液)，在室溫下振蕩。接著，用添加有0.05%的Tween20的TBS清洗狹條。清洗後，將狹條浸潰於含有0.61mg/mL的4-甲氧基-1-萘酚和0.018%的過氧化氫水的TBS，確認顯色後，用純水清洗，進行乾燥。
[0089]抗原蛋白與人血清的反應結果示於圖1。
[0090]與健康人血清的抗原抗體反應中，幾乎未觀察到信號(圖1A:健康人對象血清)。
[0091]另一方面，與牙周病患者血清的抗原抗體反應中，觀察到明確的信號，其圖樣多種多樣(圖1B和圖1C)。此外，在與患者血清的抗原抗體反應中觀察到的多樣的信號大致可分為兩類。即，分為顯示出明確的條帶的信號(圖1B)和顯示出整體擴散的模糊的信號(圖1C)。多樣的抗原抗體反應圖樣是基於它們的大小的不同和對菌株的特異性的不同而形成的。
[0092]然後，如下所示大小的信號能在多數患者的血清中特異性地強烈觀察到。 46kDa(FDC381菌株和SU63菌株的抗原蛋白)
25-37kDa (FDC381菌株和SU63菌株的抗原蛋白)
100-1 IOkDa (FDC381菌株和SU63菌株的抗原蛋白)
57kDa(SU63菌株的抗原蛋白)
150-250kDa(SU63菌株的抗原蛋白)。
[0093]由使用牙周病患者血清的抗原抗體反應的結果可見，大致可以觀察到兩種信號圖樣(明確的條帶和整體擴散的模糊)，通過它們的組合(大小、菌株)而形成多樣的抗原抗體反應圖樣。即，這就表示,牙齦卟啉單胞菌感染症產生的抗體多種多樣,有時用某種血清能作為抗原蛋白識別、而用另一血清則完全無法識別。這與多樣的牙周病患者血清中所含的抗體以多樣的蛋白質作為抗原這一報導不矛盾。因此表明，為了通過抗體效價來測定牙齦卟啉單胞菌的感染，需要多樣的檢測抗原蛋白。
[0094]此外，將FDC381菌株和SU63菌株中共有的抗原蛋白用於檢查時，認為菌株的鑑定困難。另一方面，如果僅將對菌株有特異性的抗原蛋白用於檢查，則該檢查中顯示出陽性的情況下，懷疑是該菌株的感染。
[0095]患者血清中觀察到的抗原抗體反應圖樣多種多樣，但在初診患者(FV)和維護患者(SPT)的圖樣中未觀察到顯著的差別。因此，鑑定在患者血清中顯示出強信號的抗原蛋白，將其作為檢查中使用的抗原的候選。[0096]作為對於多數患者血清顯示出強信號的條帶，如結果所示，可例舉46kDa、25-37kDa、100-110kDa、57kDa和150_250kDa的抗原蛋白組。於是，考察了這些蛋白組對於
各種患者的血清有無抗原性。其結果示於表I。
[0097][表 I]
【權利要求】
1.牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其包含具有序列編號:.1、3、9、15、19、31、41、43、63、65和67的胺基酸序列的一系列多肽。
2.權利要求1所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其進一步包含具有序列編號:5和37的胺基酸序列的多肽。
3.權利要求1或2所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其進一步包含具有序列編號:23、35和47的胺基酸序列的多肽。
4.權利要求1-3中任一項所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其進一步包含具有序列編號:17的胺基酸序列的多肽。
5.改性多肽，其具有序列編號:63的胺基酸序列。
6.權利要求5所述的改性多肽,其包含由序列編號:64的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
7.改性多肽，其具有序列編號:65的胺基酸序列。
8.權利要求7所述的改性多肽，其包含由序列編號:66的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
9.改性多肽，其具有序列編號:67的胺基酸序列。
10.權利要求9所述的改性多肽，其包含由序列編號:68的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
11.改性多肽，其具有序列編號:141的胺基酸序列。
12.權利要求11所述的改性多肽，其包含由序列編號:142的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
13.改性多肽，其具有序列編號:145的胺基酸序列。
14.權利要求13所述的改性多肽，其包含由序列編號:146的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
15.牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其包含具有選自序列編號:.1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、63、65、67、141、143、145、147、151、153 和 155 中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
16.權利要求15所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其中，所述多肽是具有選自序列編號:3、5、15、19、31、41、141和145中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
17.權利要求15所述的牙周病原菌血漿或血清抗體效價檢測試劑盒，其中，所述多肽是由選自序列編號:.2、4、6、10、16、18、20、24、32、36、38、42、44、48、64、66、68、142、144、146、148、152、154和156中的一種或兩種以上的多核苷酸序列編碼的多肽。
18.測定從人身體中分離的血液試樣中的針對牙周病原菌的抗體效價的方法，該方法包括使該血液試樣與牙周病原菌抗原多肽接觸的步驟，該方法的特徵在於，所述牙周病原菌抗原多肽是具有選自序列編號:.1、3、5、9、15、17、19、23、31、35、37、41、43、47、63、65、67、141、143、145、147、151、153和155中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
19.測定從人身體中分離的血液試樣中的針對牙周病原菌的抗體的存在的方法，該方法包括使該血液試樣與牙周病原菌抗原多肽接觸的步驟，該方法的特徵在於，所述牙周病原菌抗原多肽是具有選自序列編號:3、5、15、19、31、41、141和145中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
20.權利要求19所述的方法，其中，所述多肽是由選自序列編號:.4、6、16、20、32、42、142和146中的一種或兩種以上的多核苷酸序列編碼的多肽。
21.牙齦卟啉單胞菌菌株的分型試劑盒，其包含具有選自序列編號:151、153和155中的一種或兩種以上的胺基酸序列的多肽。
22.權利要求21所述的分型試劑盒，其中，所述多肽是由選自序列編號:.152、154和156中的一種或兩種以上的多核苷酸序列編碼的多肽。
23.多肽，其具有序列編號:151的胺基酸序列。
24.權利要求23所述的多肽，其包含由序列編號其包含由序列編號:152的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
25.多肽，其具有序列編號:153的胺基酸序列。
26.權利要求25所述的多肽，其包含由序列編號154的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
27.多肽，其具有序列編號:155的胺基酸序列。
28.權利要求27所述的多肽，其包含由序列號156的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
【文檔編號】G01N33/569GK103443627SQ201180067623
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2011年10月18日 優先權日:2010年12月15日
【發明者】野添幹雄 申請人:新時代株式會社