一種土壤總dna小量快速提取方法
2023-06-30 01:49:16 2
專利名稱:一種土壤總dna小量快速提取方法
技術領域：
本發明屬於微生物學和分子生物學技術領域：
，具體涉及從土壤中小量快速提取總DNA的方法。
背景技術：
目前通常用於土壤總DNA提取的方法主要有間接法(Andrew E.Berry，Claudia Chiocchini，TinaSelby，Margherita Sosio，Elizabeth M.H.Wellington.(2003)Isolation of high molecular weight DNA from soil forcloning into BAC vectors.FEMS Microbiology Letters.22315-20)、直接法(Zhou，J.，Mary Ann Bruns，M.A.，andTiedje，M.J.(1996)DNA Recovery from Soils of Diverse Composition.Applied and Environmental Microbiology62(2)316-322)和試劑盒法(Q.BIOgene公司的FastDNA SPIN Kit for Soil)，中國發明專利申請公開說明書(公開號CN1456684A，專利申請號03120964.5)公開了「一種PCR-DGGE研究環境微生物群落的引物設計方案」，其提取土壤總DNA的方法也為直接法。從土壤中提取總DNA的間接法是先分離細胞再裂解，由於許多微生物與土壤顆粒緊密結合，細胞不易分離，導致最終的DNA產量低，還非常費時，此法一般少用；直接法是直接從土壤中裂解細胞，該法費時且效果一般；試劑盒法具有簡單、快速，但價格昂貴，對大批樣品的提取不經濟。
發明內容
本發明的目的在於克服現有方法存在的缺陷，建立一種操作簡單、快速、方便且價格經濟的新方法。目前國內還沒有土壤DNA提取試劑盒，該方法可用於製作試劑盒，在半小時左右提取比較純的土壤總DNA，直接作為PCR的模板和酶切的底物，用於土壤微生物學和分子生物學的操作。
本發明通過以下技術方案實現本申請人發明了一種土壤總DNA小量快速提取的新方法。以土壤為材料，採取物理和化學方法共同裂解細胞釋放DNA(即石英沙、二氧化矽粉末振蕩和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)聯用)，釋放的DNA在弱酸性或偏中性pH值和高濃度硫氰酸根離子(SCN-)下可被硅藻土(主要成分為二氧化矽)吸附，當條件改變後，在弱鹼性下DNA又被低鹽緩衝液或去離子水洗脫出來，這樣得到的DNA具有足夠的純度和量用於PCR和酶切反應。
本發明包括以下步驟本發明的主要步驟包括細胞裂解、DNA抽提和純化。其具體步驟如下(1)製作裂解管稱取石英沙和二氧化矽粉末各10克，先用稀硝酸洗滌，然後用去離子水洗滌並浸泡過夜，再在80℃下烘乾，精確稱取烘乾的石英沙和二氧化矽粉末各0.3克，裝入2ml的離心管，121℃滅菌30分鐘；(2)稱取土樣0.5克到步驟(1)的裂解管中，加裂解緩衝液(裂解緩衝液的製備0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.1MH3PO4Buffer，1.5M NaCl，pH8.0，121℃滅菌30分鐘後加CTAB，使其終濃度為1％(克/毫升))1毫升後混勻；(3)用膠帶將裂解管固定在旋渦混合儀(產自江蘇省海門市其林貝爾儀器製造有限公司，產品型號為QL-901型)上振蕩5分鐘；(4)在10,000×g下離心1分鐘後將儘可能多的上清液轉至一潔淨的1.5毫升離心管中；(5)在10,000×g下離心2分鐘後小心吸取上清液0.4毫升到一潔淨的2毫升離心管中，將吸附基質懸浮液(吸附基質懸浮液的製備0.3M HAc Buffer，7M KSCN，pH6左右，再加用稀硝酸洗滌和去離子水浸泡過夜並在80℃下烘乾的硅藻土，使其終濃度為5％(克/毫升))搖勻後加1毫升；(6)手動輕輕搖勻2分鐘，使DNA與吸附基質充分結合；(7)在10,000×g下離心10秒後小心棄去上清液0.8毫升，將吸附基質重新懸浮後全部吸取，移到含收集管的離心純化柱(離心純化柱購買自上海賽百盛基因技術有限公司)上；(8)在10,000×g下離心1分鐘收集沉澱，倒去收集管中的廢液；(9)在離心純化柱上加0.5毫升洗滌液(洗滌液的製備12ml 3M NaAc與100ml乙醇混合後調pH值至7.0)，在10,000×g下離心1分鐘洗滌基質，倒去收集管中的廢液，再在10,000×g下離心2分鐘以除去殘留的洗滌液；(10)將離心純化柱轉至一潔淨的1.5毫升離心管中，於室溫下乾燥2分鐘；(11)在離心純化柱中間加100微升TE緩衝液(TE緩衝液的製備10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，121℃滅菌30分鐘)或去離子水，用手指輕彈管壁1分鐘以保證DNA的充分洗脫，在10,000×g下離心1分鐘收集DNA；(12)以步驟(11)抽取的DNA為模板，以16S rDNA引物338F 5』CTCCTACGGGAGGCAGCAG3』，(Gentry，T.J.，Wang，G.，Rensing，C.and Pepper I.L.(2004).Chlorobenzoate-degrading bacteria in similar pristine soilsexhibit different community structures and population dynamics in response to anthropogenic 2-，3-，and4-chlorobenzoate levels.Microb.Ecology 48，90-102)和1492R 5』GGTTACCTTGTTACGACTT3』(Wilson，K.H.，Blitchington，R.B.and Green，R.C.(1990)Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chainreaction.Journal of.Clinical Microbiology 28，1942-1946)為引物擴增出土壤16S rDNA並進行電泳檢測；(13)用EcoR I和Pst I對步驟(11)提取的DNA作雙酶切並進行電泳檢測。
圖1是用3種不同方法提取同一樣品土壤總DNA的電泳檢測圖。圖中編號1-3依次為直接法、試劑盒法和本發明方法提取的DNA，點樣量均為10ul。DNA Marker I的分子量標準從上至下依次為15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bp(bp鹼基對，北京天為時代科技有限公司，目錄號MD115-01)。
圖2是用3種不同方法提取同一樣品土壤總DNA做PCR擴增的產物電泳檢測圖。1-3依次為直接法、試劑盒法和本發明方法提取的DNA不稀釋做模板，4-6依次為3種方法提取的DNA稀釋10倍做模板，點樣量均為10ul。DNA Marker II的分子量標準從上至下依次為1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp(bp鹼基對，北京天為時代科技有限公司，目錄號MD109-01)。
圖3是用本發明方法提取的DNA的酶切產物電泳檢測圖。1為未酶切的DNA，2為酶切的DNA，點樣量分別為5ul和20ul(DNA的量相同)。
圖4是用本發明方法提取自然林地、人工林地和水田土壤DNA的電泳檢測圖。1-3依次為3種土樣的DNA，點樣量均為10ul。
本發明的積極效果如表1表1本發明與直接法和試劑盒法與的實施效果比較
具體實施方式
實施例1從旱耕入為土(Orthic Anthrosols)中提取總DNA實驗土壤取自中國湖北省武漢市華中農業大學附屬中學運動場表層土樣(該土壤分類為旱耕入為土，pH＝5.87，分類命名為Orthic Anthrosols)，取樣後過2毫米×2毫米孔徑的篩，然後-20℃保存待用。具體操作步驟如下(1)製作裂解管稱取石英沙和二氧化矽粉末各10克，先用稀硝酸洗滌，然後用去離子水洗滌並浸泡過夜，再在80℃下烘乾，精確稱取烘乾的石英沙和二氧化矽粉末各0.3克，裝入2ml的離心管，121℃滅菌30分鐘；(2)稱取土樣0.5克到步驟(1)的裂解管中，加裂解緩衝液(裂解緩衝液的製備0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.1MH3PO4Buffer，1.5M NaCl，pH8.0，121℃滅菌30分鐘後加CTAB，使其終濃度為1％(克/毫升))1毫升後混勻；(3)用膠帶將裂解管固定在旋渦混合儀(產自江蘇省海門市其林貝爾儀器製造有限公司，產品型號為QL-901型)上振蕩5分鐘；(4)在10,000×g下離心1分鐘後將儘可能多的上清液轉至一潔淨的1.5毫升離心管中；(5)在10,000×g下離心2分鐘後小心吸取上清液0.4毫升到一潔淨的2毫升離心管中，將吸附基質懸浮液(吸附基質懸浮液的製備0.3M HAc Buffer，7M KSCN，pH6左右，再加用稀硝酸洗滌和去離子水浸泡過夜並在80℃下烘乾的硅藻土，使其終濃度為5％(克/毫升))搖勻後加1毫升；(6)手動輕輕搖勻2分鐘，使DNA與吸附基質充分結合；(7)在10,000×g下離心10秒後小心吸棄上清液0.8毫升，重懸基質後全部吸起(約0.6毫升)，移到含收集管的離心純化柱(離心純化柱購買自上海賽百盛基因技術有限公司)上；(8)在10,000×g下離心1分鐘收集沉澱，倒去收集管中的廢液；(9)在離心純化柱上加0.5毫升洗滌液(洗滌液的製備12ml 3M NaAc與100ml乙醇混合後調pH值至7.0)，在10,000×g下離心1分鐘洗滌基質，倒去收集管中的廢液，再在10,000×g下離心2分鐘以除去殘留的洗滌液；(10)將離心純化柱轉至一潔淨的1.5毫升離心管中，於室溫下乾燥2分鐘；(11)在離心純化柱中間加100微升TE緩衝液(TE緩衝液的製備10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，121℃滅菌30分鐘)或去離子水，用手指輕彈管壁1分鐘以保證DNA的充分洗脫，在10,000×g下離心1分鐘收集DNA；為了比較本發明與現有的直接法和試劑盒法的平行效果，申請人同時進行了利用直接法和試劑盒法的實驗，利用直接法從土壤中提取總DNA按照Zhou報導的方法進行(Zhou，J.，Mary Ann Bruns，M.A.，and Tiedje，M.J.(1996)DNA Recovery from Soils of Diverse Composition.Applied and Environmental Microbiology62(2)316-322)；利用試劑盒法從土壤中提取總DNA所用試劑盒購自Q.BIOgene公司，試劑盒的商品名稱為FastDNA SPIN Kit for Soil。上述兩種方法使用的土壤樣品同本發明，即樣品處理都用0.5g土樣提取其DNA，然後將提取的DNA溶於100微升的TE緩衝液中。
如圖1所示，採用直接法、試劑盒法和本發明的方法從土壤中提取的總DNA結果有較大差別，前兩種方法提取的總DNA產量相當，本發明的方法較高(採用常用分光光度計檢測的總DNA產量約為10ug)，比前兩種方法均高出1倍。
實施例2對實施例1提取的DNA做PCR檢測用本實施例1提取的DNA為模板，以設計的引物338F 5』CTCCTACGGGAGGCAGCAG3』和1492R5』GGTTACCTTGTTACGACTT3』，擴增土壤微生物16S rDNA(16S核糖核蛋白體RNA基因)。利用間接法、試劑盒法和本發明的方法製備的土壤總DNA不稀釋和稀釋10倍作PCR反應的模板分別來擴增土壤微生物的16S rDNA。PCR反應體系如下(50ul)ddH2O34.5ul；DNA2ul；10×PCR buffer(TaKaRa)5ul；10×MgCl2(TaKaRa)5ul；dNTP(Promega，每種10mM)1ul；16S rDNA引物338F(50ng/ul)1ul；16S rDNA引物1492R(50ng/ul)1ul；Taq Enzyme(TaKaRa，5U/ul)0.5ul。PCR程序如下預變性94℃ 5分鐘；變性94℃ 45秒；退火49℃ 45秒；延伸72℃ 1.5分鐘；最後延伸72℃ 10分鐘；循環數35個。
擴增的目的DNA片段大小為1151bp，如圖2所示，在1500bp和1000bp之間第3到第6泳道有強帶，第1和第2泳道無帶，這表明直接法和試劑盒法提取的DNA不可以直接作模板做PCR擴增；經過10倍稀釋後可以做PCR擴增，而本發明的方法提取的DNA不稀釋和稀釋10倍完全可以滿足做PCR的要求。
實施例3對使用本發明方法提取的DNA做酶切檢測對實施例1中用本發明方法提取的DNA做EcoR I(G↓AATTC)和Pst I(CTGCA↓G)雙酶切(參考文獻J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾.分子克隆實驗指南.第三版.科學出版社.2003)。酶切體系(20ul)ddH2O11ul；10×H buffer(TaKaRa)2ul；EcoR I(TaKaRa，15U/ul)1ul；Pst I(TaKaRa，15U/ul)1ul；DNA5ul。酶切條件37℃過夜。由圖3可以看出酶切後的DNA呈現一片連續的帶形，證明DNA被切成小片段，為smear狀，說明用本發明方法提取的DNA可以滿足酶切的要求。
實施例4應用本發明的方法從不同類型土壤樣品中提取土壤總DNA按照實施例1的方法分別提取3種土樣的DNA中國湖北省武漢市華中農業大學獅子山的自然林地土壤(pH＝6.65)和華中農業大學人工林地土壤(pH＝6.46)，兩種土壤均為溼潤雛形土，分類命名為Udic Cambisols；中國湖北省大冶市金礦附近的水田土壤(pH＝7.12)，該土壤為水耕入為土，分類命名為Stagnic Anthrosols。電泳檢測圖如圖4所示，由圖4看出，本實施例中的3種土樣都能製備出質量比較好的DNA，其發明效果如表2所示。
表2應用本發明對不同類型的土壤總DNA的製備效果
權利要求
1.一種土壤總DNA的小量快速提取方法，其主要步驟包括樣品製備、PCR和電泳，具體步驟如下(1)製作裂解管稱取石英沙和二氧化矽粉末各10克，先用稀硝酸洗滌，然後用去離子水洗滌並浸泡過夜，再在80℃下烘乾，精確稱取烘乾的石英沙和二氧化矽粉末各0.3克，裝入2ml的離心管，121℃滅菌30分鐘；(2)稱取土樣0.5克到步驟(1)的裂解管中，加裂解緩衝液1毫升後混勻；(3)用膠帶將裂解管固定在旋渦混合儀上振蕩5分鐘；(4)在10,000×g下離心1分鐘後將儘可能多的上清液轉至一潔淨的1.5毫升離心管中；(5)在10,000×g下離心2分鐘後小心吸取上清液0.4毫升到一潔淨的2毫升離心管中，將吸附基質懸浮液搖勻後加1毫升；(6)手動輕輕搖勻2分鐘，使DNA與吸附基質充分結合；(7)在10,000×g下離心10秒後小心棄去上清液0.8毫升，將吸附基質重新懸浮後全部吸取，移到含收集管的離心純化柱上；(8)在10,000×g下離心1分鐘收集沉澱，倒去收集管中的廢液；(9)在離心純化柱上加0.5毫升洗滌液，在10,000×g下離心1分鐘洗滌基質，倒去收集管中的廢液，再在10,000×g下離心2分鐘以除去殘留的洗滌液；(10)將離心純化柱轉至一潔淨的1.5毫升離心管中，於室溫下乾燥2分鐘；(11)在離心純化柱中間加100微升TE緩衝液或去離子水，用手指輕彈管壁1分鐘以保證DNA的充分洗脫，在10,000×g下離心1分鐘收集DNA；(12)以步驟(11)抽取的DNA為模板，以16S rDNA引物338F 5』CTCCTACGGGAGGCAGCAG3』和1492R5』GGTTACCTTGTTACGACTT3』為引物擴增出土壤16S rDNA並進行電泳檢測；(13)用EcoR I和Pst I對步驟(11)提取的DNA作雙酶切並進行電泳檢測。
2.權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述的裂解緩衝液按以下步驟製備0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.1M H3PO4Buffer，1.5M NaCl，pH8.0，121℃滅菌30分鐘後加十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，使其終濃度以克/毫升計為1％。
3.權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述的吸附基質懸浮液按以下步驟的製備0.3M HAc Buffer，7M KSCN，pH6.0，121℃滅菌30分鐘後加用稀硝酸洗滌和去離子水浸泡過夜並在80℃下烘乾的硅藻土，使其終濃度以克/毫升計為5％。
4.權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述的洗滌液按以下步驟製備將12ml 3M NaAc與100ml乙醇混合後調pH至7.0。
專利摘要
本發明公開了一種土壤總DNA的小量快速提取方法。以土壤為材料，採取石英沙、二氧化矽粉末振蕩和十六烷基三甲基溴化銨共同裂解細胞釋放DNA，釋放的DNA在弱酸性或偏中性pH值和高濃度硫氰酸根離子下可被硅藻土吸附，當條件改變後，在弱鹼性下DNA又被低鹽緩衝液或去離子水洗脫出來，這樣提取的DNA具有足夠的純度和量用於PCR和酶切反應。主要步驟包括裂解細胞、抽提DNA和純化DNA三步。本發明具有簡單、快速、方便、提取的DNA純度高和價格便宜等優點，而且可應用於試劑盒的製作，在半小時左右提取比較純的土壤總DNA，用於土壤微生物學和分子生物學研究。
文檔編號C12Q1/68GKCN1990863SQ200510120584
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月30日
發明者王革嬌, 蔡林 申請人:華中農業大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan