一種SARS病毒DNA疫苗pVFS的製作方法

2023-06-29 19:22:21

專利名稱：一種SARS病毒DNA疫苗pVFS的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥生物工程技術領域，是一種用於預防嚴重急性呼吸道症候群的SARS病毒DNA疫苗pVFS。
背景技術：
世界衛生組織將嚴重急性呼吸道症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome；SARS)簡稱薩斯病，並確認是一種SARS病毒(SARS coronavirus)引起的傳染性疾病。目前尚無針對SARS病毒的特效藥，研製有效的預防性疫苗勢在必行。DNA疫苗，是近年興起的新型疫苗，具有抗體效價維持時間長和交叉保護效果好等優點。此外DNA疫苗還具有以下突出優點(1)能誘發體液及細胞全方位免疫應答，起到預防作用；(2)免疫保護時間長；(3)生產工藝簡單、成本低廉、穩定性好且貯運方便。

發明內容
本發明提供一種SARS病毒DNA疫苗pVFS，可用於預防人嚴重急性呼吸道症候群。其作用機理為將SARS病毒表面抗原S抗原編碼基因插入真核表達載體，將其注射於肌肉組織，使其在肌細胞中表達病毒表面抗原，經過抗原提呈過程，可激活體內的體液免疫系統和細胞免疫系統。激活的體液免疫系統可產生特異的抗體，消除游離在血液中的病毒，預防SARS病毒的入侵；而激活的細胞免疫系統可產生細胞毒淋巴細胞(CTL)，攻擊已被感染的細胞，消除隱藏的SARS病毒。
目前已知，S蛋白是存在於SARS病毒表面的糖蛋白，參與病毒入侵細胞時的受體結合、細胞融合，是病毒的主要抗原。已知的SARS病毒CUHK-W1(GENEBANKnumberAY278554)、HKU-39849(GENEBANK numberAY278491)、BJ01(GENEBANKnumberAY278488)、GZ01(GENEBANK numberAY278489)、Tor2(GENEBANK numberAY274119)、Urbani(GENEBANK numberAY278741)等株中的基因具有極高的同源性。它們的S基因基本結構為全長3768bp，編碼1255個胺基酸的成熟蛋白。
本發明將編碼S蛋白的全基因序列作為插入的外源DNA，為了提高該基因在真核細胞中的表達量，在不改變編碼胺基酸的前提下對該基因的5』末端的DNA序列進行改造，用使用頻率儘可能高的哺乳動物密碼子，將部分編碼苯丙氨酸的密碼子TTT改為TTC；編碼異亮氨酸的密碼子ATT改為ATC；編碼亮氨酸的密碼子TTA、CTC或CTT改為CTG；編碼蘇氨酸的密碼子ACT改為ACC；編碼絲氨酸的密碼子AGT或TCA改為AGC；編碼精氨酸的密碼子CGG、AGA或AGG改為CGC；編碼天東醯胺的密碼子AAT改為AAC；編碼甘氨酸的密碼子GGG改為GGC。經改變的鹼基以 表示。
改造後編碼S蛋白的核苷酸序列為 GGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAACCAGAATGCTCAAGCATTAAACACACTTGTTAAACAACTTAGCTCTAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCGACTTGATAAAGTCGAGGCGGAGGTACAAATTGACAGGTTAATTACAGGCAGACTTCAAAGCCTTCAAACCTATGTAACACAACAACTAATCAGGGCTGCTGAAATCAGGGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCTGAGTGTGTTCTTGGACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTGTGGAAAGGGCTACCACCTTATGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCATGGTGTTGTCTTCCTACATGTCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAGGAACTTCACCACAGCGCCAGCAATTTGTCATGAAGGCAAAGCATACTTCCCTCGTGAAGGTGTTTTTGTGTTTAATGGCACTTCTTGGTTTATTACACAGAGGAACTTCTTTTCTCCACAAATAATTACTACAGACAATACATTTGTCTCAGGAAATTGTGATGTCGTTATTGGCATCATTAACAACACAGTTTATGATCCTCTGCAACCTGAGCTTGACTCATTCAAAGAAGAGCTGGACAAGTACTTCAAAAATCATACATCACCAGATGTTGATCTTGGCGACATTTCAGGCATTAACGCTTCTGTCGTCAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTCGCTAAAAATTTAAATGAATCACTCATTGACCTTCAAGAATTGGGAAAATATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTGATGAGGATGACTCTGAGCCAGTTCTCAAGGGTGTCAAATTACATTACACATAA本發明SARS病毒DNA疫苗pVFS的製備方法如下1.人工合成SARS病毒S蛋白編碼基因(見核苷酸序列表1)a)序列特徵長度3780bp類型核酸鏈數雙鏈幾何結構線性b)分子類型DNAc)來源人工合成d)序列描述S蛋白編碼基因 TCTCCAATGTCTATGCAGATTCTTTTGTAGTCAAGGGAGATGATGTAAGACAAATAGCGCCAGGACAAACTGGTGTTATTGCTGATTATAATTATAAATTGCCAGATGATTTCATGGGTTGTGTCCTTGCTTGGAATACTAGGAACATTGATGCTACTTCAACTGGTAATTATAATTATAAATATAGGTATCTTAGACATGGCAAGCTTAGGCCCTTTGAGAGAGACATATCTAATGTGCCTTTCTCCCCTGATGGCAAACCTTGCACCCCACCTGCTCTTAATTGTTATTGGCCATTAAATGATTATGGTTTTTACACCACTACTGGCATTGGCTACCAACCTTACAGAGTTGTAGTACTTTCTTTTGAACTTTTAAATGCACCGGCCACGGTTTGTGGACCAAAATTATCCACTGACCTTATTAAGAACCAGTGTGTCAATTTTAATTTTAATGGACTCACTGGTACTGGTGTGTTAACTCCTTCTTCAAAGAGATTTCAACCATTTCAACAATTTGGCCGTGATGTTTCTGATTTCACTGATTCCGTTCGAGATCCTAAAACATCTGAAATATTAGACATTTCACCTTGCGCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGGAACAAATGCTTCATCTGAAGTTGCTGTTCTATATCAAGATGTTAACTGCACTGATGTTTCTACAGCAATTCATGCAGATCAACTCACACCAGCTTGGCGCATATATTCTACTGGAAACAATGTATTCCAGACTCAAGCAGGCTGTCTTATAGGAGCTGAGCATGTCGACACTTCTTATGAGTGCGACATTCCTATTGGAGCTGGCATTTGTGCTAGTTACCATACAGTTTCTTTATTACGTAGTACTAGCCAAAAATCTATTGTGGCTTATACTATGTCTTTAGGTGCTGATAGTTCAATTGCTTACTCTAATAACACCATTGCTATACCTACTAACTTTTCAATTAGCATTACTACAGAAGTAATGCCTGTTTCTATGGCTAAAACCTCCGTAGATTGTAATATGTACATCTGCGGAGATTCTACTGAATGTGCTAATTTGCTTCTCCAATATGGTAGCTTTTGCACACAACTAAATCGTGCACTCTCAGGTATTGCTGCTGAACAGGATCGCAACACACGTGAAGTGTTCGCTCAAGTCAAACAAATGTACAAAACCCCAACTTTGAAATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCTGACCCTCTAAAGCCAACTAAGAGGTCTTTTATTGAGGACTTGCTCTTTAATAAGGTGACACTCGCTGATGCTGGCTTCATGAAGCAATATGGCGAATGCCTAGGTGATATTAATGCTAGAGATCTCATTTGTGCGCAGAAGTTCAATGGACTTACAGTGTTGCCACCTCTGCTCACTGATGATATGATTGCTGCCTACACTGCTGCTCTAGTTAGTGGTACTGCCACTGCTGGATGGACATTTGGTGCTGGCGCTGCTCTTCAAATACCTTTTGCTATGCAAATGGCATATAGGTTCAATGGCATTGGAGTTACCCAAAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAACAAATCGCCAACCAATTTAACAAGGCGATTAGTCAAATTCAAGAATCACTTACAACAACATCAACTGCATTGGGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAACCAGAATGCTCAAGCATTAAACACACTTGTTAAACAACTTAGCTCTAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCGACTTGATAAAGTCGAGGCGGAGGTACAAATTGACAGGTTAATTACAGGCAGACTTCAAAGCCTTCAAACCTATGTAACACAACAACTAATCAGGGCTGCTGAAATCAGGGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCTGAGTGTGTTCTTGGACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTGTGGAAAGGGCTACCACCTTATGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCATGGTGTTGTCTTCCTACATGTCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAGGAACTTCACCACAGCGCCAGCAATTTGTCATGAAGGCAAAGCATACTTCCCTCGTGAAGGTGTTTTTGTGTTTAATGGCACTTCTTGGTTTATTACACAGAGGAACTTCTTTTCTCCACAAATAATTACTACAGACAATACATTTGTCTCAGGAAATTGTGATGTCGTTATTGGCATCATTAACAACACAGTTTATGATCCTCTGCAACCTGAGCTTGACTCATTCAAAGAAGAGCTGGACAAGTACTTCAAAAATCATACATCACCAGATGTTGATCTTGGCGACATTTCAGGCATTAACGCTTCTGTCGTCAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTCGCTAAAAATTTAAATGAATCACTCATTGACCTTCAAGAATTGGGAAAATATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTGATGAGGATGACTCTGAGCCAGTTCTCAAGGGTGTCAAATTACATTACACATAA 其中，5』末端的 為EcoR I酶切位點；3』末端的 是Xho I酶切位點。經改變的鹼基以 表示。
2.製備DNA疫苗pVFS用限制性內切酶EcoR I和Xho I分別對上述合成的S蛋白編碼基因和真核表達載體pVAX1(購自Invitrogen公司，序列和物理圖譜見該公司的產品目錄)進行雙酶切，酶切片段分別經瓊脂糖凝膠電泳純化回收。然後將上述pVAX1載體酶切片段與S基因酶切片段按一定比例混合，通過連接酶進行連接。然後以CaCl2法轉化至感受態大腸桿菌DH5α(購自GIBLCO公司)中，在卡那黴素平板上得到轉化子，進行篩選。篩選到的陽性轉化子為重組pVFS的工程菌，該工程菌可用於製備DNA疫苗pVFS。
本發明DNA疫苗是真核表達載體pVAX1與S蛋白編碼基因的重組質粒。該重組質粒含有pUC ori質粒複製起始位點、卡那黴素抗性基因Kanamycin、一個完整的真核轉錄翻譯單元的巨細胞病毒啟動子PCMV、SARS病毒S蛋白全基因及3』端的多聚腺苷酸BGH pA。本發明DNA疫苗製備工藝簡單，成本低廉，其可在真核細胞中表達S抗原並可激活淋巴細胞。


圖1為本發明SARS病毒DNA疫苗pVFS的結構示意2為本發明SARS病毒DNA疫苗pVFS的構建流程圖
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明的製備方法作詳細描述。
實施例1SARS病毒DNA疫苗pVFS的製備DNA疫苗pVFS結構見圖1，構建流程見圖2。
1.合成S基因DNA(結構如前所述)，其5』末端含EcoR I酶切位點 3』末端含Xho I酶切位點 2.構建pVFS的重組質粒用限制性內切酶EcoR I和Xho I對S基因DNA進行雙酶切。反應體系為S基因DNA 5μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mM Tris-Hcl pH7.5；100mM MgCl2；10mM Dithionthreitol；500mM NaCl)2μl；EcoR I酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；補H2O至總體積20μl。37℃溫浴消化2小時。之後將消化樣品進行1％低溶點瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收S酶切片段。同時，用EcoR I和Xho I雙酶切pVAX1載體。反應體系為pVAX1載體2μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mMTris-Hcl pH7.5；100mM MgCl2；10mM Dithionthreitol；500mM NaCl)2μl；EcoRI酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；補H2O至總體積20μl。37℃溫浴消化2小時。之後將消化樣品進行1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收pVAX1酶切片段。
將上述pVAX1酶切片段與S酶切片段混合，以連接酶進行連接。連接反應體系為pVAX1酶切片段0.5μl(200ng/μl)；S酶切片段1μl(50ng/μl)；連接Buffer(660mM Tris-Hcl pH7.6；66mM MgCl2；100mM DTT；1mM ATP)1μl；補H2O至總體積10μl。連接反應的條件定為12℃10小時。
3.構建pVFS工程菌將上述連接反應產物以CaCl2法轉化至感受態大腸桿菌DH5α中(詳見分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002)連接產物10μl與DH5α(1～2×109細菌/ml)感受態細胞200μl混合，冰浴放置30分鐘，42℃2分鐘，冰浴10分鐘，加入0.6ml 2YT液體培養基(16g蛋白腖/L；10g酵母抽提物/L；5g NaCl/L)，37℃培養45分鐘後鋪於含卡那黴素的瓊脂平板。37℃培養12小時後在瓊脂平板上出現轉化子。挑選轉化子接種在含100μg/ml卡那黴素的3ml 2YT培養基中37℃培養過夜，6,000rpm/分鐘離心收集菌體，以質粒小量抽提試劑盒(Qiagen)提取質粒DNA。然後用Hind III和Xho I雙酶切鑑定。反應體系為重組質粒1μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mM Tris-Hcl pH7.5；100mM MgCl2；10mMDithionthreitol；500mM NaCl)2μl；Hind III酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；補H2O至總體積20μl。37℃溫浴消化2小時。之後將消化樣品進行1％瓊脂糖凝膠電泳，結果可見3780bp的S片段和2.96kb的pVAX1載體片段。說明篩選到的該陽性轉化子為重組pVFS的工程菌。
4.SARS病毒DNA疫苗pVFS的製備本發明的DNA疫苗是用上述重組工程菌株製備的。培養方式為液體培養。採用細菌發酵罐行高密度懸浮通氣培養。選用2×YT(含1.6％胰蛋白腖、1％酵母提取物和0.5％氯化鈉，PH7.0)。發酵時添加礦物油等作為消泡劑。培養溫度為37℃，培養時間為14小時。
從擴增後的工程菌中分離純化質粒DNA，採用常規方法(分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002)。具體步驟如下100g溼菌中加入800mL溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-Cl pH8.0，10mMEDTA)強裂振蕩混勻。加入新鮮配製的1L溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)垂直輕柔混勻，室溫5分鐘。再加入冰預冷的0.75L溶液III(1M醋酸鉀，7M醋酸銨pH4.8)垂直輕柔混勻，冰浴5分鐘。連續流12000轉/分鐘4℃離心取上清。在上清中加入1.53L異丙醇室溫10分鐘，連續流12000轉/分鐘室溫離心留沉澱。加70％乙醇450ml漂洗過夜。10000轉/分鐘4℃離心10分鐘留沉澱。加1L PBS(pH7.4)溶解，加RNaseA(終濃度0.1％，華美生物工程有限公司)65℃消化30分鐘。再加入等體積的PEG溶液(PEG8000 13％，氯化鈉1.6M)沉澱，12000轉/分鐘4℃離心10分鐘，留沉澱。200ml PBS溶解沉澱，加1％體積Triton X114混勻，冰浴5-10分鐘，37℃30分鐘，37℃12000轉/分鐘離心10分鐘，取上層水相。最後用0.45μm和0.22μm雙層濾膜加壓過濾，用PBS緩衝液稀釋至1mg/ml，即SARS病毒DNA疫苗pVFS，可用於肌肉注射。
當然，構建pVFS也可採用其他真核表達載體，如pCDNA3。
表1 SARS病毒S蛋白改造後編碼基因的核苷酸序列表GAATTCATGTTCATCTTCCTGCTGTTCCTGACCCTGACCAGCGGTAGCGACCTGGACCGCTGCACCACTTTTGATGATGTTCAAGCTCCTAACTACACTCAACATACTAGCTCTATGCGCGGCGTTTACTATCCTGATGAAATTTTTCGCAGCGACACTCTTTATCTGACTCAGGATCTGTTTCTTCCATTTTATTCTAACGTTACAGGCTTTCATACTATCAATCATACGTTTGACAACCCTGTCATACCTTTTAAGGATGGTATTTATTTTGCTGCCACAGAGAAATCAAATGTTGTCCGTGGTTGGGTTTTTGGTTCTACCATGAACAACAAGTCACAGTCGGTGATTATTATTAACAATTCTACTAATGTTGTTATACGAGCATGTAACTTTGAATTGTGTGACAACCCTTTCTTTGCTGTTTCTAAACCCATGGGTACACAGACACATACTATGATATTCGATAATGCATTTAATTGCACTTTCGAGTACATATCTGATGCCTTTTCGCTTGATGTTTCAGAAAAGTCAGGTAATTTTAAACACTTACGAGAGTTTGTGTTTAAAAATAAAGATGGGTTTCTCTATGTTTATAAGGGCTATCAACCTATAGATGTAGTTCGTGATCTACCTTCTGGTTTTAACACTTTGAAACCTATTTTTAAGTTGCCTCTTGGTATTAACATTACAAATTTTAGAGCCATTCTTACAGCCTTTTCACCTGCTCAAGACACTTGGGGCACGTCAGCTGCAGCCTATTTTGTTGGCTATTTAAAGCCAACTACATTTATGCTCAAGTATGATGAAAATGGTACAATCACAGATGCTGTTGATTGTTCTCAAAATCCACTTGCTGAACTCAAATGCTCTGTTAAGAGCTTTGAGATTGACAAAGGAATTTACCAGACCTCTAATTTCAGGGTTGTTCCCTCAGGAGATGTTGTGAGATTCCCTAATATTACAAACTTGTGTCCTTTTGGAGAGGTTTTTAATGCTACTAAATTCCCTTCTGTCTATGCATGGGAGAGAAAAAAAATTTCTAATTGTGTTGCTGATTACTCTGTGCTCTACAACTCAACATTTTTTTCAACCTTTAAGTGCTATGGCGTTTCTGCCACTAAGTTGAATGATCTTTGCTTCTCCAATGTCTATGCAGATTCTTTTGTAGTCAAGGGAGATGATGTAAGACAAATAGCGCCAGGACAAACTGGTGTTATTGCTGATTATAATTATAAATTGCCAGATGATTTCATGGGTTGTGTCCTTGCTTGGAATACTAGGAACATTGATGCTACTTCAACTGGTAATTATAATTATAAATATAGGTATCTTAGACATGGCAAGCTTAGGCCCTTTGAGAGAGACATATCTAATGTGCCTTTCTCCCCTGATGGCAAACCTTGCACCCCACCTGCTCITAATTGTTATTGGCCATTAAATGATTATGGTTTTTACACCACTACTGGCATTGGCTACCAACCTTACAGAGTTGTAGTACTTTCTTTTGAACTTTTAAATGCACCGGCCACGGTTTGTGGACCAAAATTATCCACTGACCTTATTAAGAACCAGTGTGTCAATTTTAATTTTAATGGACTCACTGGTACTGGTGTGTTAACTCCTTCTTCAAAGAGATTTCAACCATTTCAACAATTTGGCCGTGATGTTTCTGATTTCACTGATTCCGTTCGAGATCCTAAAACATCTGAAATATTAGACATTTCACCTTGCGCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGGAACAAATGCTTCATCTGAAGTTGCTGTTCTATATCAAGATGTTAACTGCACTGATGTTTCTACAGCAATTCATGCAGATCAACTCACACCAGCTTGGCGCATATATTCTACTGGAAACAATGTATTCCAGACTCAAGCAGGCTGTCTTATAGGAGCTGAGCATGTCGACACTTCTTATGAGTGCGACATTCCTATTGGAGCTGGCATTTGTGCTAGTTACCATACAGTTTCTTTATTACGTAGTACTAGCCAAAAATCTATTGTGGCTTATACTATGTCTTTAGGTGCTGATAGTTCAATTGCTTACTCTAATAACACCATTGCTATACCTACTAACTTTTCAATTAGCATTACTACAGAAGTAATGCCTGTTTCTATGGCTAAAACCTCCGTAGATTGTAATATGTACATCTGCGGAGATTCTACTGAATGTGCTAATTTGCTTCTCCAATATGGTAGCTTTTGCACACAACTAAATCGTGCACTCTCAGGTATTGCTGCTGAACAGGATCGCAACACACGTGAAGTGTTCGCTCAAGTCAAACAAATGTACAAAACCCCAACTTTGAAATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCTGACCCTCTAAAGCCAACTAAGAGGTCTTTTATTGAGGACTTGCTCTTTAATAAGGTGACACTCGCTGATGCTGGCTTCATGAAGCAATATGGCGAATGCCTAGGTGATATTAATGCTAGAGATCTCATTTGTGCGCAGAAGTTCAATGGACTTACAGTGTTGCCACCTCTGCTCACTGATGATATGATTGCTGCCTACACTGCTGCTCTAGTTAGTGGTACTGCCACTGCTGGATGGACATTTGGTGCTGGCGCTGCTCTTCAAATACCTTTTGCTATGCAAATGGCATATAGGTTCAATGGCATTGGAGTTACCCAAAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAACAAATCGCCAACCAATTTAACAAGGCGATTAGTCAAATTCAAGAATCACTTACAACAACATCAACTGCATTGGGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAACCAGAATGCTCAAGCATTAAACACACTTGTTAAACAACTTAGCTCTAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCGACTTGATAAAGTCGAGGCGGAGGTACAAATTGACAGGTTAATTACAGGCAGACTTCAAAGCCTTCAAACCTATGTAACACAACAACTAATCAGGGCTGCTGAAATCAGGGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCTGAGTGTGTTCTTGGACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTGTGGAAAGGGCTACCACCTTATGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCATGGTGTTGTCTTCCTACATGTCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAGGAACTTCACCACAGCGCCAGCAATTTGTCATGAAGGCAAAGCATACTTCCCTCGTGAAGGTGTTTTTGTGTTTAATGGCACTTCTTGGTTTATTACACAGAGGAACTTCTTTTCTCCACAAATAATTACTACAGACAATACATTTGTCTCAGGAAATTGTGATGTCGTTATTGGCATCATTAACAACACAGTTTATGATCCTCTGCAACCTGAGCTTGACTCATTCAAAGAAGAGCTGGACAAGTACTTCAAAAATCATACATCACCAGATGTTGATCTTGGCGACATTTCAGGCATTAACGCTTCTGTCGTCAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTCGCTAAAAATTTAAATGAATCACTCATTGACCTTCAAGAATTGGGAAAATATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTGATGAGGATGACTCTGAGCCAGTTCTCAAGGGTGTCAAATTACATTACACATAACTCGAG
權利要求
1.一種SARS病毒DNA疫苗pVFS，其特徵在於由SARS病毒S蛋白改造後的編碼基因和真核表達載體構成，改造後的S蛋白編碼基因的核苷酸序列如下GAATTCATGTTCATCTTCCTGCTGTTCCTGACCCTGACCAGCGGTAGCGACCTGGACCGCTGCACCACTTTTGATGATGTTCAAGCTCCTAACTACACTCAACATACTAGCTCTATGCGCGGCGTTTACTATCCTGATGAAATTTTTCGCAGCGACACTCTTTATCTGACTCAGGATCTGTTTCTTCCATTTTATTCTAACGTTACAGGCTTTCATACTATCAATCATACGTTTGACAACCCTGTCATACCTTTTAAGGATGGTATTTATTTTGCTGCCACAGAGAAATCAAATGTTGTCCGTGGTTGGGTTTTTGGTTCTACCATGAACAACAAGTCACAGTCGGTGATTATTATTAACAATTCTACTAATGTTGTTATACGAGCATGTAACTTTGAATTGTGTGACAACCCTTTCTTTGCTGTTTCTAAACCCATGGGTACACAGACACATACTATGATATTCGATAATGCATTTAATTGCACTTTCGAGTACATATCTGATGCCTTTTCGCTTGATGTTTCAGAAAAGTCAGGTAATTTTAAACACTTACGAGAGTTTGTGTTTAAAAATAAAGATGGGTTTCTCTATGTTTATAAGGGCTATCAACCTATAGATGTAGTTCGTGATCTACCTTCTGGTTTTAACACTTTGAAACCTATTTTTAAGTTGCCTCTTGGTATTAACATTACAAATTTTAGAGCCATTCTTACAGCCTTTTCACCTGCTCAAGACACTTGGGGCACGTCAGCTGCAGCCTATTTTGTTGGCTATTTAAAGCCAACTACATTTATGCTCAAGTATGATGAAAATGGTACAATCACAGATGCTGTTGATTGTTCTCAAAATCCACTTGCTGAACTCAAATGCTCTGTTAAGAGCTTTGAGATTGACAAAGGAATTTACCAGACCTCTAATTTCAGGGTTGTTCCCTCAGGAGATGTTGTGAGATTCCCTAATATTACAAACTTGTGTCCTTTTGGAGAGGTTTTTAATGCTACTAAATTCCCTTCTGTCTATGCATGGGAGAGAAAAAAAATTTCTAATTGTGTTGCTGATTACTCTGTGCTCTACAACTCAACATTTTTTTCAACCTTTAAGTGCTATGGCGTTTCTGCCACTAAGTTGAATGATCTTTGCTTCTCCAATGTCTATGCAGATTCTTTTGTAGTCAAGGGAGATGATGTAAGACAAATAGCGCCAGGACAAACTGGTGTTATTGCTGATTATAATTATAAATTGCCAGATGATTTCATGGGTTGTGTCCTTGCTTGGAATACTAGGAACATTGATGCTACTTCAACTGGTAATTATAATTATAAATATAGGTATCTTAGACATGGCAAGCTTAGGCCCTTTGAGAGAGACATATCTAATGTGCCTTTCTCCCCTGATGGCAAACCTTGCACCCCACCTGCTCTTAATTGTTATTGGCCATTAAATGATTATGGTTTTTACACCACTACTGGCATTGGCTACCAACCTTACAGAGTTGTAGTACTTTCTTTTGAACTTTTAAATGCACCGGCCACGGTTTGTGGACCAAAATTATCCACTGACCTTATTAAGAACCAGTGTGTCAATTTTAATTTTAATGGACTCACTGGTACTGGTGTGTTAACTCCTTCTTCAAAGAGATTTCAACCATTTCAACAATTTGGCCGTGATGTTTCTGATTTCACTGATTCCGTTCGAGATCCTAAAACATCTGAAATATTAGACATTTCACCTTGCGCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGGAACAAATGCTTCATCTGAAGTTGCTGTTCTATATCAAGATGTTAACTGCACTGATGTTTCTACAGCAATTCATGCAGATCAACTCACACCAGCTTGGCGCATATATTCTACTGGAAACAATGTATTCCAGACTCAAGCAGGCTGTCTTATAGGAGCTGAGCATGTCGACACTTCTTATGAGTGCGACATTCCTATTGGAGCTGGCATTTGTGCTAGTTACCATACAGTTTCTTTATTACGTAGTACTAGCCAAAAATCTATTGTGGCTTATACTATGTCTTTAGGTGCTGATAGTTCAATTGCTTACTCTAATAACACCATTGCTATACCTACTAACTTTTCAATTAGCATTACTACAGAAGTAATGCCTGTTTCTATGGCTAAAACCTCCGTAGATTGTAATATGTACATCTGCGGAGATTCTACTGAATGTGCTAATTTGCTTCTCCAATATGGTAGCTTTTGCACACAACTAAATCGTGCACTCTCAGGTATTGCTGCTGAACAGGATCGCAACACACGTGAAGTGTTCGCTCAAGTCAAACAAATGTACAAAACCCCAACTTTGAAATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCTGACCCTCTAAAGCCAACTAAGAGGTCTTTTATTGAGGACTTGCTCTTTAATAAGGTGACACTCGCTGATGCTGGCTTCATGAAGCAATATGGCGAATGCCTAGGTGATATTAATGCTAGAGATCTCATTTGTGCGCAGAAGTTCAATGGACTTACAGTGTTGCCACCTCTGCTCACTGATGATATGATTGCTGCCTACACTGCTGCTCTAGTTAGTGGTACTGCCACTGCTGGATGGACATTTGGTGCTGGCGCTGCTCTTCAAATACCTTTTGCTATGCAAATGGCATATAGGTTCAATGGCATTGGAGTTACCCAAAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAACAAATCGCCAACCAATTTAACAAGGCGATTAGTCAAATTCAAGAATCACTTACAACAACATCAACTGCATTGGGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAACCAGAATGCTCAAGCATTAAACACACTTGTTAAACAACTTAGCTCTAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCGACTTGATAAAGTCGAGGCGGAGGTACAAATTGACAGGTTAATTACAGGCAGACTTCAAAGCCTTCAAACCTATGTAACACAACAACTAATCAGGGCTGCTGAAATCAGGGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCTGAGTGTGTTCTTGGACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTGTGGAAAGGGCTACCACCTTATGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCATGGTGTTGTCTTCCTACATGTCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAGGAACTTCACCACAGCGCCAGCAATTTGTCATGAAGGCAAAGCATACTTCCCTCGTGAAGGTGTTTTTGTGTTTAATGGCACTTCTTGGTTTATTACACAGAGGAACTTCTTTTCTCCACAAATAATTACTACAGACAATACATTTGTCTCAGGAAATTGTGATGTCGTTATTGGCATCATTAACAACACAGTTTATGATCCTCTGCAACCTGAGCTTGACTCATTCAAAGAAGAGCTGGACAAGTACTTCAAAAATCATACATCACCAGATGTTGATCTTGGCGACATTTCAGGCATTAACGCTTCTGTCGTCAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTCGCTAAAAATTTAAATGAATCACTCATTGACCTTCAAGAATTGGGAAAATATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTGATGAGGATGACTCTGAGCCAGTTCTCAAGGGTGTCAAATTACATTACACATAACTCGAG
2.按權利要求1所述的SARS病毒DNA疫苗pVFS，其特徵在於所說的真核表達載體為pVAX1。
3.權利要求1或2所述SARS病毒DNA疫苗pVFS用於預防嚴重急性呼吸道症候群的用途。
全文摘要
本發明涉及醫藥生物工程技術領域，是一種用於預防嚴重急性呼吸道症候群的SARS病毒DNA疫苗pVFS。它由pVFS病毒S蛋白的改造後編碼基因插入真核表達載體所構成。該重組質粒轉化感受態大腸桿菌DH5α就成pVFS工程菌，可用於製備疫苗pVFS。由於抗原基因S編碼序列5′端序列進行了改造，體內表達的抗原蛋白水平更高，從而增強了體液免疫，起到更好的預防SARS病毒感染的作用。本發明DNA疫苗製備工藝簡單，成本低廉，可在真核細胞中表達S抗原並可激活淋巴細胞。
文檔編號A61P11/00GK1449830SQ03129020
公開日2003年10月22日 申請日期2003年6月3日 優先權日2003年6月3日
發明者孫樹漢, 陳則, 郭瀛軍, 黃力, 王開宇, 張術 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學