治療癌症的己糖化合物的製作方法

2023-06-08 01:22:16

專利名稱：：治療癌症的己糖化合物的製作方法
技術領域：
：本發明指向可用於治療癌症的己糖化合物，以及通過施用這種化合物來治療需要這種治療的受試者中的癌症介導的疾病的方法。
背景技術：
：癌症的治療往往與對肺瘤抗性發展的挑戰相聯繫。凋亡是一種編程性細胞死亡，包括一系列會導致細胞形態學改變和死亡的生化事件。凋亡程序以安全地處理細胞碎片的方式-皮執行。然而，通過闡明癌症治療過程中的細胞內信號傳導路徑，有可能改變誘導細胞死亡的關鍵結構和程序。確實，有缺陷的凋亡程序已經與許多疾病相關。過度凋亡導致細胞遺失性疾病，如缺血性疾病。另一方面，凋亡的數量不足會導致不受控制的細^^包增生，例如癌症。惡性神經膠質瘤進程中發生的變化可能與PI-3K/AKT路徑的激活相關(通常通過PTEN缺失或者通過生長因子活性如EGFR的活性)。這種存活路徑激活許多適應性變化，優選地，其中包括血管發生的刺激物、凋亡抑制劑和促進糖酵解激活的代謝轉變。類似地，胰腺癌的新治療靶標包括信號傳導路徑的粑點和與血管發生，特別地，ras致癌基因信號路徑相關的分子和基質金屬蛋白酶(MMP)的抑制劑。許多癌症對傳統治療具有固有的抗性，在治療上具有極大的挑戰性，如惡性神經膠質瘤和胰腺癌。每年惡性神經膠質瘤的發生率為每萬人中有6.4個病例(CentralBrainTumorRegistryoftheUnitedStates,2002-2003),是最常見的原發性腦瘤和致命性人類癌症的亞類。當其表現為最具侵略性的惡性膠質瘤多態形(GBM)時，即使盡最大努力進行治療，患者的平均存活時期為9~12個月。實際上，儘管進行放射治療和化學治療，在約1/3患有GBM的患者中，肺瘤仍然繼續生長。類似地，一般認為胰腺癌的預後是非常差的，這取決於診斷時胂瘤擴散的程度，很少患者能夠在診斷5年後仍然存活，而完全免除的患者更為罕見。進一步地，除了腫瘤對治療產生抗性之外，惡性胂瘤治療中的另一個問題在於治療對未受該疾病影響的正常組織具有毒性作用。化學治療通常粑向殺死快速分化的細胞，而不管這些細胞是正常的還是惡性的。然而，如果能夠破壞腫瘤的生長控制路徑，則對於抑制腫瘤而言，大範圍的細J包死亡和癌症治療的相關副作用就不是必需的。例如，一種方法利用治療的敏感化，使用低劑量的標準治療結合特異性粑向胂瘤細胞中的關鍵過程的藥物，從而增強其他藥物的作用。此外，聯合治療包括基於疫苗的方法，與具有免疫治療的肺瘤細胞毒性特異性的減滅細胞的和免疫調節的化療元件相結合。然而，對於患者和醫生來說，聯合治療一般比僅需要單一藥劑的治療方法更加困難。此外，某些腫瘤對放療具備固有的抗性，許多化療形式可能由於差別生長模式和不同種類的生長模式而在各個腫瘤中表現出不同低氧程度的區域。例如，神經月交質瘤主要以滲透的方式生長，相對於更為快速的明顯增加的實質損害，在MRI掃描中極少或未見到明顯的增大胂瘤。類似地，早期的胰腺癌可能不被檢出。同樣，含氧量相對低的區域可見於迅速生長的腫瘤實體的中心，該中心往往具有與該腫瘤相關的壞死區域，含氧量相對低的區域還可見於腫瘤滲入部分中的某些含氧量相對低的區域。因此，一些這種含氧量相對低的區域可能含有細胞，這些細胞以較為緩慢的速度循環，因此對化療劑可能具有抗性。最近，某些癌症治療建議把目標投向利用糖酵解抑制劑。這類抑制劑被設計成能夠從細胞由有氧代謝轉變為無氧代謝選擇性結果中獲益。因為肺瘤的生長，癌細胞從血液中4皮除去(氧氣供應)。在低氧的條件下，腫瘤細胞上調轉運蛋白和糖酵解酶的表達，接著，有利於相對有氧環境下的正常細胞增加葡萄糖類似物的攝取。阻斷血液中的細胞內的糖酵解不會殺死該細胞，這是因為該細胞通過利用氧氣燃燒其線粒體中的脂肪和蛋白質生成能量而存活(通過儲存能量的分子例如ATP)。相反，當低氧環境中的細胞內的糖酵解^皮阻斷時，該細胞死亡,因為沒有氧氣，該細胞不能通過線粒體氧化脂肪和蛋白質來產生能量。因此，雖然糖酵解抑制劑具有治療某些癌症的前景，但是對於含氧量低的環境中的癌細胞沒有治療作用。實際上，OttO瓦爾堡的經典觀察已經證明許多腫瘤偏愛優先利用糖酵解來產生細胞能量，即使在存在足量的氧氣的情況下(這被稱作為氧化糖酵解或"瓦爾堡效應，，)。對於惡性神經膠質瘤來說，這種腫瘤的適應反應看來似乎也是適用的。因此，存在對一種治療方法的需求，該方法用於治療對化療抗性的，顯示出差別生長模式或者在腫瘤中具有不同程度低氧區域的生長模式，和/或具有刺激血管生成或抑制凋亡的存活路徑的癌症。發明概述已經發現了預防、抑制和調節癌症的己糖化合物及其藥物組合物，以及使用該化合物來治療癌症，特別是惡性月交質瘤和胰腺癌。本發明公開了己糖化合物用於治療癌症和癌症介導的疾病和狀況的用途。治療惡性膠質瘤和胰腺癌的方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的己糖化合物。特別有興趣的是治療腫瘤增生的方法，包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的2-FM。本發明包括通過給需要這種治療的受試者施用甘露糖化合物來治療癌症的方法。附圖簡介圖1A描述用2-DG、2-FDG、2-FDM和草氨酸鹽處理SKBR3細胞24小時後的腫瘤生長抑制分析的結果。各個數值是三份樣品的平均值±SD。圖1B描述用2-DG、2-FDG、2-FDM和草氨酸鹽處理SKBR3細胞24小時後的細胞毒性分析的結果。各個數值是三份樣品的平均值±SD。圖2A描述當培養液中不存在或存在2mM的2-DG或2-FDG和乳酸鹽濃度時，SKBR3細胞生長24小時時的結果。圖2B描述SKBR3細胞在存在與圖2A中所用濃度相同的2-DG或2-FDG下生長6小時後，量化全細胞溶解產物中的ATP的結果。圖3A描述在存在各種糖的情形下用2-DG處理SKBR3細l包後的生長抑制分析結果。各個數值是三份樣品的平均值±SD。圖3B描述在存在各種糖的情形下用2-DG處理SKBR3細l包後的細胞毒性分析結果。各個數值是三份樣品的平均值±SD。圖3C描述在存在或缺少2mM甘露糖下，在用2-DG處理後，三個不同低氧模型中的生長抑制分析結果。圖3C描述在存在或缺少2mM甘露糖下，在用2-DG處理後，三個不同的低氧模型中的細胞毒性分析結果。圖4A描述用如各個泳道所標明的不同藥物處理48小時的SKBR3細胞的結果，獲得總的細胞抽提物，並用結合了HRP的ConA進行印跡分析。將等量的蛋白質加載到各個泳道中，並且用P-肌動蛋白驗證。糖蛋白(用箭頭區分)表明8mM2-DG和2-FDM而不是2-FDG降低與ConA的結合，並且這種降低能被甘露糖逆轉。圖4B描述了圖4A的細胞的結果，對於該細胞進行高度表達的糖蛋白erbB2的印跡分析。類似劑量的2-DG和2-FDM造成此蛋白質的分子量發生改變。圖5A顯示了用8mM2-DG、2-FDM或2-FDM處理24小時的SKBR3細胞的結果，對總細胞提取物中的兩種分子伴4呂Grp78和Grp94進行印跡分析。1mg/ml的衣黴素(TUN)被用作陽性對照。將蛋白質加載用卩-肌動蛋白驗證。圖5B顯示當在低氧模型A、B和C中的細胞用類似劑量的糖類似物處理時對所分析的蛋白質進行的蛋白質印跡。圖6描述用8mM的2-DG、2-FDG或2-FDM處理24小時的SKBR3細胞的結果，並且對全細胞溶解產物中的CHOP/GADD154進行探測。通過添加外源的甘露糖能夠逆轉由2-DG和2-FDM引起的對CHOP/GADD154的誘導。衣黴素被用作陽性對照。將蛋白質加載用卩-肌動蛋白驗證。圖7顯示糖酵解和N-聯糖基化路徑舉例說明2-DG、2-FDM和2-FDG能夠抑制葡糖磷酸異構酶，導致阻斷糖酵解，隨即含氧量低的腫瘤細胞死亡。然而，在有氧條件下，在某些肺瘤細l包類型中，2-DG和2FDM會干擾寡糖的脂聯聚集，導致引發未摺疊蛋白應激和毒性，這是由於它們的結構類似於甘露糖以及葡萄糖(三角形=葡萄糖，六邊形=甘露糖和正方形二N-乙醯-葡糖胺)。圖8A顯示證明選擇的神經膠質瘤細胞系和某些本發明的己糖化合物的敏感性的MTT分析結果。圖8B顯示證明選擇的神經膠質瘤細胞系和某些本發明的己糖化合物的敏感性的MTT分析結果。圖8C顯示證明選擇的神經膠質瘤細胞系和某些本發明的己糖化合物的敏感性的MTT分析結果。圖9A描述用不同己糖化合物處理後的神經膠質瘤細胞生長狀況。圖9B描述用2-DG處理後抑制D54細胞的生長。圖9C描述用2-FG處理後抑制D54細l包的生長。圖IO說明低氧對用2-DG處理的細胞的不同影響。圖11顯示在含氧量低和含氧量正常的條件下，人惡性膠質瘤細胞系中的乳酸產量。圖12顯示在含氧量低和含氧量正常的條件下，神經膠質瘤細胞系的生長結果。圖13證明在神經膠質瘤細胞中2-FG的攝取。圖14顯示在小鼠中用2-DG治療神經膠質瘤的結果。圖15顯示2-FM抗Colo357-FG胰腺癌細胞的活性。圖16顯示2-面代-D-甘露糖抗U251神經膠質瘤細胞的活性。圖17顯示2-FM對U87細月包生長的抑制作用。圖18提供一張圖表，描述了用2-氟-甘露糖處理後在U87神經膠質瘤細胞中誘導的自我吞噬的百分比。發明詳述惡性神經膠質瘤的可選擇治療手段仍然相當有限。這部分是由於神經膠質瘤細胞對許多可用的化療選擇具有固有的抗性。這還可能部分地是由於惡性神經月交質瘤具有的差示生長才莫式(differentialgrowthpattern)。也就是il,神經月交質瘤主要以滲透的方式生長，相對於更為快速的明顯增加的實質損害，在MRI掃描中極少或未見到明顯的增大肺瘤。許多研究已經表明這些不同類型的生長模式也代表了單個腫瘤中的不同低氧程度的區域。含氧量相對低的區域可見於快速生長的肺瘤實質的中心，該中心常常具有與之相關的壞死區域，而一些含氧量相對低的區域位於胂瘤滲入部分之中。因此，一些這種含氧量相對低的區域具有以較慢速度循環並且因此對許多化療劑的抗性更強的細胞。另外，瓦爾堡的觀察報告對惡性神經膠質瘤似乎也是適用的，瓦爾堡描述了即使存在足量氧氣時許多腫瘤也優先進行糖酵解(被稱作為氧化糖酵解或"瓦爾堡效應")。本發明人假定由於這些特性，神經膠質瘤和其他高度發生糖分解的肺瘤如胰腺癌對糖酵解抑制劑敏感，並且對胂瘤生長具有顯著影響。因此，通常獨特於大腦並特異於神經膠質瘤的其他特性在於葡萄糖轉運蛋白的表達增加，這導致過度地將糖攝入CNS中。本發明人假定由於這些特徵，神經膠質瘤代表了一種獨特的疾病狀態，其對糖酵解抑制劑特別敏感。為了檢驗這種假設，本發明人在含氧量低和含氧量正常的條件下，使用已知的糖酵解抑制劑體外抵抗大量神經膠質瘤細胞系小組。採用大量不同的給藥方案，在具有神經膠質瘤同位異種移植物的動物中檢測該試劑的作用。高級神經膠質瘤引起的代謝改變在於即便存在氧氣時也優先利用糖酵解作為主要的能量生成來源。"瓦爾堡效應"部分地是由HIF-la和PI-3激酶路徑的活化來啟動。2-脫氧葡萄糖是一種有效的糖酵解抑制劑，其阻斷通過烯醇酶反應進行的2-脫氧葡萄糖-6-磷酸的轉化，導致該化合物由於帶電磷酸基團而在細胞中發生積聚。在高級贅生物中發生已知的代謝改變，包括優先利用糖酵解來滿足細胞對能量需求的神經膠質瘤。這些改變通過存活路徑來啟動，包括誘導糖酵解所需的關鍵酶的生成以及上調葡萄糖轉運蛋白的HIF-la和PI-3激酶活化。這種糖酵解表型是一種主要特徵，即便是在含氧量正常的條件下也是主要的形式。這種表型已經被證實，先前被描述為"瓦爾堡效應，，。由於該表型變化，這些胂瘤對糖酵解抑制劑的敏感性應當比正常細胞高。一組基於糖的糖酵解抑制劑和其他甘露糖化合物可以作為治療劑。2-脫氧葡萄糖是一種基於糖的原型抑制劑，在本研究中已經#皮證明具有可耐受的並且有效的抗神經月交質瘤的作用。在治療癌症特別是神經膠質瘤和胰腺癌中，己糖化合物單獨或者與細胞毒性化療組合是有效的。此外，由於在腫瘤環境中，這種糖酵解表型最初是被低氧條件啟動的，這種類型的治療應當與抗血管發生治療一同考慮。實際上，能夠"逃脫，，抗血管生成治療的肺瘤一般優先對糖酵解抑制劑和/或己糖化合物更為每文感。本發明人已經證明基於糖的己糖化合物在高級神經膠質瘤和胰腺癌的治療中是有效的。此外，其他抑制劑類的化合物被設計成有利於被攝取到CNS中，並且保持2-DG目前所具有的有利的口服生物利用度。目前正對己糖化合物與細胞毒性劑和抗血管生成劑的組合進行研究，樂觀地將為將來的臨床組合試驗提供智力引導。己糖化合物是指並且包括含有六個碳原子的任何單糖。一類己糖是己醛糖家族，例如，其包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖。己醛糖還包括各種脫氧糖，例如2-脫氧葡萄糖、巖藻糖、,茲麻糖和鼠李糖。另一類己糖是己酮糖家族，示例為果糖和山梨糖。雖然本發明的己糖通常具有天然存在的D-構象，己糖也可以是L-對映體。本發明的己糖可以包括oc異構體、p異構體及其混合物。本發明己糖的任何一種被任選地取代。這種取代包括用卣素，例如氟、氯或者溴置換羥基。在本發明中，取代通常位於己糖的C-2碳原子上，可以佔據六元環椅式構象的己糖的直立位置或平伏位置。C-2上的取代是直立位置上的，則該糖被確定為甘露糖衍生物或者具有甘露構象的糖。C-2上取代是平伏位置上的，則該糖被確定為葡萄糖衍生物或者具有葡糖構象的糖。可用於實施本發明的己糖化合物包括在美國專利US6,670,330和美國專利申請US20030181393、US20050043250和US20060025351中公開的化合物，在此引入作為參考。在本發明的某些具體實施方案中，優選化合物是基於糖的腫瘤增生抑制劑，例如2-脫氧-葡萄糖(2-DG)、2-脫氧-甘露糖(2-DM)、2-氟-葡萄糖(2-FG)和2-氟-甘露糖(2-FM)等。"中樞神經系統的肺瘤"是指在大腦、脊髓或者其他中樞神經系統組織中的任何異常生長，包括良性的或惡性的。特別包括神經膠質瘤，例如毛細胞型星細胞瘤、低級星細胞瘤、退行發育星細胞瘤和惡性膠質瘤多態形(GBM或惡性膠質瘤)。"中樞神經系統的肺瘤"還包括其他類型的良性或惡性的神經膠質瘤，例如腦幹神經膠質瘤、室鼓膜瘤、神經節細胞瘤、青少年毛細胞型神經膠質瘤、混合神經膠質瘤、少突膠質瘤和視神經膠質瘤。"中樞神經系統的腫瘤"還包括非-神經膠質瘤、例如脊索瘤、顱咽管瘤、成神經管細胞瘤、腦(脊)膜瘤、松果體瘤、垂體腺瘤、原神經外胚層瘤、施旺細胞瘤、血管瘤和纖維神經瘤。最後，中樞神經系統的肺瘤還包括轉移性肺瘤，其中惡性細胞從機體的其他部分蔓延到中樞神經系統。按照本發明，"治療"、"處療"或"緩和"是指治療性的處理和預防性或阻止性的措施，其中目的在於阻止或減緩中樞神經系統的肺瘤的生長，縮小腫瘤的尺寸或者完全消除腫瘤。需要治療的那些個體包括具有被確定的中樞神經系統腫瘤的受試者、被懷疑患有中樞神經系統腫瘤的受試者以及#皮確定為存在產生中樞神經系統腫瘤的風險的受試者。在按照本發明的方法接受了治療量的己糖化合物後能觀察到一種或多種如下狀況，則受試者中樞神經系統肺瘤^L成功地"治療"肺瘤尺寸縮小或腫瘤消失；腫瘤的生長被抑制或停止；腫瘤轉移被抑制或停止；和/或與腫瘤相關的一種或多種症狀減輕到一定程度，例如發生率和死亡率降低或者生活質量提高。在某種程度上，己糖化合物阻礙生長和/或殺死現存的大腦胂瘤細胞，則被認為能抑制細胞生長和/或具有細胞毒性。術語"進行共同施用"或"共同施用"用於包括同時或者順序地施用治療劑。例如，共同施用包括以單一組合物的方式施用糖酵解抑制劑和化療劑。也包4舌同時施用許多這種組合物。可替代地，共同施用包括在相同時期的不同時間施用許多這種組合物。按照本發明的己糖化合物包括，但是不限於糖酵解抑制劑，它是一種能夠抑制神經膠質瘤或其他大腦胂瘤中的氧化糖酵解的化合物，還可以包括己糖化合物，例如2-脫氧-葡萄糖、2-氟-葡萄糖、2-氟-甘露糖等。上文定義的抗增生處理可被用作為單一的治療方式，或者可能除了至少一種本發明的化合物外，還包括一種或多種其他物質和/或處理。這種處理通過同時、順序或者分開地施用各個治療成分來實現。本發明的化合物還可以與已知的抗癌的和細胞毒性的試劑和處理如放療組合使用。如果被配製成固定的劑量，這種組合產品採用在本文描述的劑量範圍內的本發明的化合物和在被批准的劑量範圍內的其他藥物活性試劑。糖酵解抑制劑可作為還包括其他抗癌的或細胞毒性的試劑的化療方案的一部分被順序使用，和/或與非化療處理例如手術或放療結合使用。化療劑包括但是不限於三種主要的化療劑類別(i)抗血管生成劑，例如三羧氨基喹啉(Linomide)、整聯蛋白-oc-P3的功能抑制劑、血管抑制素、雷佐生)；(ii)細胞生長抑制劑例如抗雌激素(例如，它莫西芬、託瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxifene)、孕激素(例如曱地孕酮乙酸鹽)、芳香化酶抑制劑(例如阿那曲唑、來曲唑、硼。秦、依西美坦)、抗激素、抗孕激素、抗雄激素(例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、環丙氯地孕酮)、LHRH激動劑和拮抗劑(例如醋酸戈舍瑞林、10亮丙立得)，睪丸激素5-CC-二氬還原酶的抑制劑(例如非那雄胺)，法尼基轉移酶抑制劑、抗侵入劑(例如，金屬蛋白酶抑制劑如馬立馬司他以及尿激酶血漿酶原活體受體功能的抑制劑)和生長因子功能的抑制劑(這種生長因子包括例如，EGF、FGF、血小板來源的生長因子和肝細胞生長因子，這種抑制劑包括生長因子抗體、生長因子受體抗體，例如Avastin.(貝伐單抗)和Erbitux.(西妥昔單抗)；酪氨酸激酶抑制劑和絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑)；和(iii)抗增生/抗血管生成的藥物及其組合，如藥物胂瘤學上所用的，例如抗代:射物(例如抗葉酸藥物如氨曱蝶呤、氟嘧啶如5-氟尿嘧啶、噤呤和腺苷類似物，胞嘧啶阿拉伯糖苦)；嵌合性抗胂瘤抗生素(例如蒽環類抗生素如阿黴素、道諾黴素、表柔比星和去甲氧基柔紅黴素(伊達比星)、絲裂菌素-C、放線菌素D、光神黴素)；鉑衍生物(例如順鉑、卡鉑)；烷化劑(例如氮芥、美法侖、瘤可寧、白消安、環磷醯胺、異環磷醯胺亞硝基脲、噻替派；抗有絲分裂劑(例如長春花鹼如長春新鹼，和類紫杉醇如泰素(紫杉醇)、泰素帝(多西他賽)以及新的microbtubule劑例如埃坡黴素類似物、discode畫lide類似物和艾榴塞洛素類似物);拓樸異構酶抑制劑(例如表鬼臼毒素如依託泊甙和替尼泊苷、安吖啶、拓樸替康)；細胞周期抑制劑；生物反應調節物和蛋白酶體抑制劑例如Velcade(bortezomib)。本領域的普通技術人員將容易地認識到，本發明公開的治療方法可以通過多種給藥途徑和使用不同數量/濃度的己糖化合物來實施。優選的給藥途徑可以根據所使用的己糖化合物來變化，這種途徑包括但是不限於口服、口腔的、肌肉內(i.m.)、靜脈內(i.v.)、胃腸道內(i.p.)、體表或者FDA批准的任何其他給藥途徑。給藥濃度或治療濃度將根據正,皮治療的患者和正一皮施用的己糖化合物而變化。在某些具體實施方案中，己糖化合物的濃度範圍為1mg~50gm/kg體重。首先，製備一系列2-氟、2-澳和2-氯-取代葡萄糖類似物，並將其作為糖酵解路徑中的葡萄糖的陽性竟爭底物來進行分析，這種類似物可能作為糖酵解抑制劑起作用，其作用方式與2-脫氧-葡萄糖(2-DG)類似。本發明人已經發現2-氟-D-甘露糖是一種有效的抗腫瘤劑，這是由於其具有由如下事實帶來的特性，鑑於氟原子和氳原子在大小上相似，2-氟-D-甘露糖(在本文中也被稱作為"2-FM")類似於2-脫氧-D-葡萄糖(與2-脫氧-D-甘露糖相同)，而在誘導效應和形成氫鍵的可能性方面，2-氟-D-甘露糖類似於甘露糖的羥基而不是氫原子，因而類似於D-甘露糖。在後一種情形下，2-氟-D-甘露糖會影響與D-甘露糖相關的生物學功能、代謝和生物學程序。以及這些效果的組合會影響與D-葡萄糖和D-甘露糖相關的細胞程序。事實上，圖15~18中提供的數據表明，2-氟-D-甘露糖比2-DG更為有效，並且在胰腺Colo357-FG細胞中的活性高於或類似於2-氟-D-葡萄糖的活性。此外，將2-氟-D-甘露糖(2-FM)與其他2-脫氧-D-甘露糖類似物比較，即與2-氯-D-甘露糖(2-CM)和2-溴-D-甘露糖(2-BM)比較。令人驚奇地並且不可預期的是，在這一系列物質中，2-氟-甘露糖比其他物質更為有效。特別地，該數據表明在抑制U251惡性月交質瘤和大腦腫瘤細胞的生長方面，2-氟-D-甘露糖(2-FM)明顯優於溴(2-BM)和氯(2-CM)的類似物。在正常含氧量條件下，2-FM還表現出令人驚奇的優於低氧條件下的抗U87惡性膠質瘤細胞的活性(圖17)。此外，至少一種2-FM的作用模式是不可能被預期的，即2-FM具有在大腦肺瘤細胞中有效誘導細胞自我吞噬的作用，從而為其抗肺瘤細胞系的作用機制提供至少一種解釋。如下面立即給出的，2-脫氧葡萄糖(2-DG)在C-2位置上具有兩個氫原子。在該糖的六元環椅式構象中，這兩個氫原子佔據直立位置和平伏位置。2-DG2-FM甘露淨5|本質上，2-氟甘露糖(2-FM)用氟原子置換2-脫氧葡萄糖中的直立的氫原子(與2脫氧甘露糖中的情況一樣)。氟原子通常被認為與氫原子是等排的。因此，在某些方面，2-FM的化學性質可能類似於2-DG。實際上，2-FM可能基於這種異構辯解而具有糖酵解抑制活性。然而，氟原子的電負性實質上高於氳原子，結果其能夠參與氬鍵的基序。在該方面，2-FM表現得更為接近於甘露糖，因此，在高級的甘露糖寡聚糖合成中，2-FM可能破壞N-聯糖脂/蛋白質路徑。簡而言之，2-FM顯示出令人驚奇地好的抗腫瘤細l包增生的作用，表現出比2-脫氧-D-葡萄糖(在此也被稱作為"2-DG，，)和2-脫氧-2-氟-D-葡萄糖(在此也被稱作為"2-FG，，)更為有效。如下文所討論，在231-GFP乳腺癌、U251惡性膠質瘤多態型大腦腫瘤(圖16)和Colo357-FG人胰腺癌細胞系(圖15)中對化合物2-FM進4亍了測試。在U251和Colo357-FG細胞中，2-FM直接與2-DG、2-FG、2-脫氧-2氯-D-甘露糖(在此有時也il稱作為"2-CM")、2-脫氧-2-溴-甘露糖(在此也淨皮稱作為"2-BM")、2-脫氧-氯-D-葡萄糖(在此也一皮稱作為"2-CG")和2-脫氧-2-溴-D-葡萄糖(在此也被稱作為"2-BG，，)比較。在惡性膠質瘤(圖16、17和18)和胰腺癌(圖15)中，2-FM是這些淨皮比較的試劑中最有效的，在2-FM與它的氯和溴的衍生物之間觀察到的差別尤其大。當與2-DG比較時，該差別也是顯著的。因此，該數據表明在抑制腫瘤細胞增生方面，2-FM所起的作用不同於2-DG和2-FG。該數據進一步表明，對於癌症，特別是大腦和胰腺的腫瘤來說，2-FM是一種非常有效的抗胂瘤治療措施。更特別地，圖15示範了用MTT分析Colo357細胞系對用2-脫氧-葡萄糖(2-DG)、2-氟-葡萄糖(2-FG)或2-氟-甘露糖(2-FM)處理的反應的細胞存活率的劑量反應曲線。可以看出，劑量反應曲線偏移到左側，表明2-FM比2-DG或2-FG更加有效。圖16證明甘露糖的第二位置上的滷素性質是影響活性的重要因素。將神經膠質瘤細胞系U251MG用2_氯-甘露糖(2-CM)、2-溴-甘露糖(2-BM)或2-氟-甘露糖(2-FM)處理。再通過MTT分析測量細胞活性，結果清楚地表明當與其他卣素類似物相比時，2-FM具有較好的活性。圖17示例說明了在低氧(<1%氧氣)或者含氧量正常(20%氧氣)條件下用2-氟-甘露糖(2-FM)處理的細胞系進行的MTT分析。可以看出，數據體現出一種不尋常的情形，即在低氧的情況下，該試劑在U87細胞系中並不更為敏感。這隱含地表明，2-FM的另一種作用^/L制在於產生細i包殺死作用。圖18證明了2-氟-甘露糖(2-FM)的一種獨特的和先前未被確定的作用機制。在U87MG神經膠質瘤細胞系中，2-FM誘導通過細胞自我吞噬作用而引起的細胞死亡。圖表展示的是通過用吖。定橙染色而獲得的酸性嚢狀細胞器(AVO)的流式細胞分析結果(參見操作程序部分)，這是自我吞噬過程的特性和特點。該結果顯示了隨著2-FM暴露劑量的增加，發生自我吞噬的細胞的比例也升高。由於僅暴露了很短的40小時就觀察到該結果，因此這種自我吞噬作用的誘導程度給人的印象深刻。目前，在臨床試驗中施用2-DG來評估添加糖酵解抑制劑的程度，糖酵解抑制劑殺死緩慢生長的低氧胂瘤細胞，存在於實體肺瘤中的抗性最強的細胞群體會提高標準化學治療的治療功效，該化學治療耙向快速分化的含氧量正常的細胞。本發明部分地來自於發現當施用2-DG或2-FM而不是2-脫氧-2-氟-D-葡萄糖(2-FG)時，即便存在氧氣，某些肺瘤細胞系也被殺死。由於2-FG和2-DG都抑制糖酵解，推定有一種除了阻斷糖酵解之外的作用機制產生了這種效果。在20世紀70年代進行的研究導致了這樣的報導2-DG和2-FM幹擾病毒衣殼糖蛋白的N-聯糖基化，這種幹擾可以通過添加甘露糖來逆轉。由於甘露糖和葡萄糖之間的差別在於C-2位置上的氫原子的方向，並且由於2-DG在C-2位置上有兩個氫原子(而不是一個氫原子和一個羥基)，而甘露糖和葡萄糖都是一個氫原子和一個羥基，2-DG可被視為甘露糖類似物或者葡萄糖類似物。因此，2-DG對糖酵解和糖基化都起作用。本發明提供用於抑制腫瘤細胞增生的方法，無論該細胞處於低氧或含氧量正常的環境下，單獨使用己糖衍生物，或者聯合其他的抗腫瘤處理，其他抗肺瘤處理包括但是不限於耙向含氧量正常的細胞的細胞毒性劑、抗血管發生劑、放療和手術。本發明還為臨床使用如2-DG、2-CM和2-FM等類似物作為耙向某些胂瘤類型中的含氧量正常的(通過幹擾糖基化)和所有低氧的(通過阻斷糖酵解)的癌症細胞群體的細胞毒性劑提供依據。下面的實施例提供數據證實了本發明的效用，並證明了2-DG、2-CM和2-FM而不是2-FG對在含氧量正常條件下生長的選擇的腫瘤細胞具有毒性。在實施例中描述的一些試驗被設計來確定，與抑制糖酵解相反，對糖基化的幹擾是否是負責含氧量正常條件下的效果的作用機制。儘管不期望受理論的約束，所獲得的結果支持了這些化合物能夠抑制糖基化並從而殺死某些癌症細胞類型，無論那些細胞是否處在低氧環境下。這些結果還支持2-FM、2-DG和2-CM而不是2-FG破壞脂聯寡糖鏈的組裝並引發未摺疊蛋白應答(UPR),UPR是幹擾糖蛋白酶合成的指示。接著，UPR導致在敏感細胞而不是抗性細胞中激活UPR特異性凋亡信號。在含氧量正常的條件下對2DG、2-FM和2-CM敏感的腫瘤細胞類型已經被確定。從腫瘤中分離，並離體測試來確定在含氧量正常的條件下該細胞是否對2-DG、2-CM或2-FM敏感。下面的實施例闡明了用於確定一種細胞是否敏感的方法。在其他具體實施方案中，將密切相關的2-DG敏感和抗性的細胞對的分子信號與測試細胞系進行比較。還描述了磷酸甘露糖異構酶和參與糖差化的其他酶以及參與2-DG積聚的酶在含量和/或活性方面的差異。在存在氧氣時(含氧量正常的條件下)，2-DG對肺瘤細胞系亞組具有毒性。該結果是令人驚奇的，由於先前的研究證明，在含氧量正常的情況下用2-DG處理，會抑制肺瘤細胞和正常細胞的生長而不是殺死它們。這些已有的生長抑制觀察結果被認為是由於在含氧量正常的條件下，2-DG在細胞中積聚到足以阻斷糖酵解的水平，使得糖酵解路徑中的中間體的含量下降而降低生長速度，這些中間體可用於與細胞增生相關的各種合成代謝過程。然而，如果線粒體的功能是正常的，細胞就不會死亡，在有氧條件下處理的細胞能夠在用2-DG阻斷糖酵解的處理中存活。因此，為什麼細l包在含氧量正常的條件下對2-DG專丈感，一種可能的解釋是該細胞的線粒體存在缺陷。在這一點上，已知由於線粒體呼吸存在缺陷，腫瘤細胞能夠利用葡萄糖通過無氧糖酵解而不是氧化磷酸化來產生能量(ATP)。然而，進一步的試馬全已經證明，其他的糖酵解抑制劑對這些細力包沒有毒性，如草氨酸鹽和2-FG,所以線粒體呼吸存在缺陷不可能是導致它們對2-DG敏感的原因。因此，猜想存在一種除了阻斷碳酵解之外的作用機制，導致在含氧量正常的條件下2-DG會對這些選擇的細胞系具有毒性作用。因此，其他猜想可能解釋這種含氧量正常的細胞毒性的作用機制。一種可能的作用機制是對糖基化的千擾。對這種可能作用機制的支持可見於20世紀70年代後期以來的一系列文章，這些文章報導，在某些病毒中，N-聯糖蛋白的合成被大量的包括2-DG在內的糖類似物抑制。葡萄糖通過三種主要路徑代謝糖酵解、戊糖磷酸化支路和糖基化。圖7是糖酵解和糖基化代謝路徑的圖解。在葡萄糖進入細胞質中後，己糖激酶將葡萄糖的C6磷酸化，合成葡萄糖-6-磷酸(G6P)。如果G6P通過葡萄糖磷酸異構酶(PGI)轉化為果糖-6-磷酸，會繼續進行糖酵解路徑，生成ATP和丙酮酸鹽。可替代地，G6P也可以用於合成各種糖，包括甘露糖，滿足脂聯寡糖組裝的需要，該合成是在ER中進行的。已經證明2-DG會干擾三種代謝途徑中的兩種通過抑制PGI來阻斷糖酵解或者通過幹擾二磷酸鳥苷(GDP)長醇磷酸聯甘露糖轉移到N-乙醯氨基葡萄糖殘基上來破壞被再連接的寡糖前體的組裝並且能夠耗盡長醇-P,長醇-P是將甘露糖從細胞質轉運到ER內腔所需要的。如上文指出，由於2-DG在碳2的兩個位置上均有氫原子，類似於一種甘露糖類似物。相反，在氟類似物的該位置上存在氟而產生新的對映體中心，因此氟衍生物僅被認為是葡萄糖類似物或甘露糖類似物；在描述這些類似物時，對於甘露糖類似物來說，氟化物部分被畫在碳水化合物環平面的上方，而對於葡萄糖類似物來說，畫在下方。當甘露糖被添加到脂聯寡糖鏈上時，其首先必須通過轉移到二磷酸鳥苷(GDP)或長醇磷酸上，以被活化。2-DG轉化成2-DG-GDP,在脂聯寡糖的組裝過程中，在將甘露糖添加到N-乙醯氨基葡萄糖殘基上方面，2-DG-GDP會與甘露糖-GDP發生竟爭。因此，在科技文獻報導的試驗中，由於用2-DG處理生成異常的寡糖，導致病毒糖蛋白的合成下降。在這些試^驗中，2-DG的抑制作用可以通過添加外源性甘露糖來逆轉，但是添加葡萄糖不能產生逆轉作用，這進一步證明了2-DG的作用有點類似於甘露糖類似物。這些研究人員還證明了另一種甘露糖類似物，2-氟-甘露糖(2-FM)具有與2-DG類似的作用，也能夠;故甘露糖逆轉，表明這些類似物的甘露糖構象對於它們幹擾糖基化作用可能是重要的。此外，遺傳試驗已經表明，破壞糖基化具有重要的生物學作用。在患有lb型碳水化合物缺陷糖蛋白綜合症的患者中不存在甘露糖磷酸異構酶(PMI)。缺乏這種酶會導致血清糖蛋白的低糖基化，從而引起血栓症和表現為蛋白質丟失性腸下垂的胃腸道紊亂。當在這些患者的飲食中添加外源性甘露糖時，它們的症狀消失，它們的血清糖蛋白恢復正常，並且它們從該疾病中恢復。該觀察結果與用於本發明中的化合物的作用機制是一致的，試驗數據表明外源性甘露糖能夠拯救選擇的胂瘤細胞，將這些腫瘤細胞在正常氧氣水平下用2-DG處理，它們會一皮殺死。這可能是這些特定的腫瘤細胞下調PMI或者在該酶方面存在缺陷。另一方面，在這些細胞中，生成N-聯糖基化所需的甘露糖中間體的酶被上調，產生較高的2-DG-GDP與甘露糖-GDP相比的比例，從而導致這種在正常氧氣條件下對2-DG的異常敏感性。無論是何種作用機制，本發明提供即使在含氧量正常的條件下施用2-DG和其他葡萄糖類似物和甘露糖類似物作為處理腫瘤的單一試劑來治療癌症的方法。已經證明該化合物能夠有效抵抗大量肺瘤細胞系，包括人乳腺癌細胞系(SKBR3)、非小細胞肺癌細胞系(NSCLC)、神經膠質瘤細胞系、胰腺癌細胞系和骨肉瘤細胞系，當用劑量相對低的2-DG處理時，所有這些細胞系發生細胞死亡。圖3B顯示了在正常氧氣條件下，SKBR3細胞對用指定劑量的2-DG、2-FM和其^^試劑處理72小時的反應。通過臺盼藍4非除，測定細胞毒性。結果表明2-DG和甘露糖類似物2-FM具有毒性，而葡萄糖類似物2-FG沒有毒性。此外，草氨酸鹽作為一種在乳酸脫氫酶水平上阻斷糖酵解的丙酮酸鹽類似物，其對在含氧量正常的條件下生長的細胞沒有毒性作用。相反，甘露糖類似物2-FM也,皮證明對這些細胞具有毒性，再次表明甘露糖骨架對具有這種活性的化合物是重要的。添加外源性甘露糖能夠逆轉2-DG的抑制作用，但是當添加葡萄糖不能逆轉2-DG的抑制作用，進一步證明2-DG是作為一種甘露糖類似物起作用的。其他測試表明，2-DG對在含氧量正常的條件下生長的NSCLC也具有毒性，而添加lmM甘露糖能夠逆轉這種毒性作用。該數據進一步支持由於幹擾糖基化，2-DG和2-FM對在含氧量正常條件下生長的選擇的腫瘤細胞具有毒性。指示錯誤摺疊或者錯誤糖基化蛋白質的未摺疊蛋白應答蛋白GRP78和94以劑量依賴的方式被2-DG和2-FM上調，但是不^皮2-FG上調；這些作用同樣可以通過添加甘露糖來逆轉，證明了這些甘露糖類似物是通過這種機制而不是通過阻斷糖酵解的方式起作用。因此，甘露糖類似物2-DG和2-FM而不是葡萄糖類似物2-FG對在含氧量正常的條件下生長的選擇的肺瘤細胞類型具有毒性，而添加甘露糖能逆轉這種毒性。由於2-FG抑制糖酵解的效果好於2-DG,幹擾糖基化而不是抑制糖酵解被認為是產生這種效果的作用機制。如上文指出，已經報導2-DG幹擾病毒衣殼蛋白的N-聯糖基化，而添加外源性甘露糖能逆轉這種結果。因此，2-DG對含氧量正常條件下的SKBR3、NSCLC和兩種其他人胂瘤細胞系的毒性作用可能是由於幹擾糖基化而產生的。如果這種作用機制理論正確，那麼添加甘露糖應當逆轉2-DG在這些細胞系中產生的毒性作用。實際上，lmM甘露糖逆轉6mM2-DG在任何一種所測試的細胞系(NSCLC)中產生的毒性作用。已知血液中甘露糖的含量範圍在50~60mg/ml,可以進4亍劑量反應試^r來確定逆轉2-DG的毒性作用所需的最小甘露糖劑量。例如，由於胎牛血清(FBS)通常含有殘留量的甘露糖，因此可以用添加了經過透析的FBS的生長培養液進行試-驗來實施測定。此外，為了證實添加甘露糖而不是其他糖是逆轉2-DG的毒性作用所需的，可以;險測已知參與糖蛋白合成的糖，即葡萄糖、果糖、半乳糖等是否能夠逆轉2-DG的毒性作用。如果這些糖中的任何一種能夠類似地逆轉毒性作用，然後在誘導UPR及其後續結果即幹擾寡糖鏈延長而逆轉2-DG的作用，以及結合伴刀豆球蛋白A方面，將它們的活性與下述試驗中的甘露糖的活性比較。總之，這些試驗使得能夠在體外評估用於在體內存在生理性甘露糖含量的情況下產生抗腫瘤活性的2-DG或2-FM的劑量。然而，用於本發明的方法中的口月l施用2-DG、2-FM和2-CM的治療有效量通常在5-500mg/kg,例如50-250mg/kg患者體重的範圍內。在一個具體實施方案中，該劑量為約100mg/kg患者體重。本發明還提供大量診斷方法，臨床醫生可用來確定腫瘤或者其他癌症中是否含有對目前的處理方法易感的細^9包。在一個具體實施方案中，在含氧量正常的條件下對來自腫瘤的細胞進行測試，確定它們是否被2-DG、2-FM或2-CM殺死。在另一個具體實施方案中，進4亍該測試；然後，添加甘露糖來確定其是否逆轉該細胞的毒性作用。在另一個具體實施方案中，易感性的測試是用N-聯糖基化作為指示來實施的。如上文指出，2-DG和2-FM而不是2-FG(1)破壞脂聯寡糖鏈的組裝，(2)引發未摺疊蛋白應答(UPR)，這指示幹擾了正常的糖蛋白合成，以及(3)在2-DG敏感的細胞中而不是抗性細胞中活化UPR特異性凋亡信號。此外，甘露糖逆轉這些作用。因此，可以在感興趣的腫瘤或癌症細胞中進行這些相同的測試，確定該細胞是否對用本發明的方法處理易感。如上文指出，在病毒感染的細胞中，在ER的細胞質表面上發生甘露糖摻入到脂聯寡糖鏈上，而這種摻入能夠被2-DG或2-FM的GDP衍生物，即GDP-2DG和GDP-2-FM抑制。通常，在第五個甘露糖被添加之後，脂聯寡糖鏈轉動面向ER的內腔。為了繼續將甘露糖添加到逐漸延長的鏈上，長醇-磷酸酯(Dol-P)被用作將甘露糖從細胞質轉運到ER的基質上的載體。2-DG-GDP與甘露糖-GDP竟爭結合到長醇上，從而進一步幹擾N-聯糖基化。此外，在ER中，長醇聯的2-DG也與甘露糖竟爭被轉運到寡糖鏈上。因此，在2-DG敏感和抗性的細胞系中進行試驗，證明2-DG和2-FM對脂聯寡糖前體和甘露糖衍生物形成的作用，該甘露糖衍生物即甘露糖-6-磷酸、甘露糖-l-磷酸、GDP-甘露糖和Dol-P-甘露糖。這轉而證明在寡糖組裝中能夠^皮2-DG和2-FM抑制的階段或步驟。這轉而允許根據當暴露於2-DG、2-FM和/或2-CM時所生成(和未生成)的寡糖，來將其他細胞類型表徵為敏感或抗性的。先前建立的層析法可用於收集和測定SKBR3和NSCLC細胞中的甘露糖衍生物和脂聯寡糖前體的含量。簡而言之，將細胞用[2-H3]甘露糖標記，將細胞溶解產物分別用氯仿/曱醇(3:2)和氯仿/甲醇/水(10:10:3)提取，來收集Dol-P-Man和脂聯寡糖。對含有Dol-P-Man的等分試樣進行薄層層析分析，同時可以通過HPLC分離脂聯寡糖。可以通過液相閃爍計數來分析洗出液餾分。通過遞減紙層析分離甘露糖磷酸和GDP-甘露糖，並且通過溫和的酸解從各個餾分中釋放的[2」H]甘露糖並對其進行測量。可以將來自用2-DG或2-FM處理的細胞的數值與未處理的對照進行比較，來證明這些藥物對N-聯寡糖前體和甘露糖衍生物的作用。由於外源性甘露糖逆轉2-DG的毒性作用，還可以測試甘露糖是否也能夠逆轉所觀察到的2-DG糖基化紊亂。除了2-DG和2-FM之外能夠抑制N-聯糖基化的特定步驟的衣黴素和脫氧mannojirimydn(DMJ)是兩種其他的糖基化抑制劑，可以用作陽性對照。衣黴素幹擾第一個N-乙醯氨基葡萄糖殘基添加到長醇焦磷酸上，而DMJ是甘露糖苷酶I的一種特異性抑制劑，其能夠修剪N-聯寡糖鏈末端上的三個甘露糖殘基。因此，外源性甘露糖應當不能逆轉這些試劑的毒性或者對糖基化的作用。而且，由於葡萄糖類似物2-FG不殺死含氧量正常的條件下的SKBR3和NSCLC細胞，但是在阻斷糖酵解和殺死〗氐氧細胞方面比2-DG更為有效，它幹擾糖酵解而不作用於糖基化，同樣也可以在這種測試中用作工具。幹擾內質網(ER)中的N-聯糖基化過程會導致糖蛋白的錯誤摺疊，引發被稱作為未摺疊蛋白應答(UPR)的ER應激反應。聯想到P53對DNA損傷的反應，ER對應激的反應極其相似(l)通過誘導留守分子伴侶(residentchaperone)(GRP78和GRP94)而提高摺疊能力，(2)通過關閉蛋白質合成而降低本身的生物合成負載，和(3)增加對未摺疊蛋白質的降解。如果應激不能被減輕，則啟動凋亡路徑，細胞隨後死亡。因此，幹擾糖基化的一種測量結果是UPR上調。當用2-DG處理SKBR3細胞時，這兩種ER應激反應蛋白GRP78和94隨著劑量提高而增加；甘露糖逆轉這種誘導作用。2-FG不會誘導這些蛋白質。因此，在本發明的另一個具體實施方案中，這種反應用於確定一種腫瘤或癌症細胞是否對按照本發明方法的處理易感。在含氧量正常的條件下對2-DG不敏感的細胞系可類似地被用作陰性對照，其中不出現這些蛋白質的上調是與它們對2-DG的抗性相關。當ER應激不能夠一皮克月良時，啟動凋亡信號。ER應激通過一種細胞核轉錄因子CHOP/GADD153誘導一種線粒體依賴的凋亡路徑，CHOP/GADD153下調BCL-2,並且在人細l包系中通過胱天蛋白酶4和5以及在小鼠細胞系中通過胱天蛋白酶12誘導一種不依賴於線粒體的路徑。因此，進行試驗來確定特異於ER應激的凋亡信號是否在2-DG敏感的而非2-DG抗性的細胞中被活化。CHOP/GADD153的上調和胱天蛋白酶4和5的活化通過蛋白質印跡來分析。如同先前的測試，如果這種上調特異於2-DG敏感細胞系，那麼在測試癌症細胞中觀察到的上調指示該細胞所來源的癌症對按照本發明的處理易感。由於SKBR3大量表達糖蛋白ErbB2，因而期望2-DG將會作用於該蛋白質的N-聯糖基化，導致錯誤摺疊和降解。對來自用2-DG處理的SKBR3細胞的ErbB2進行蛋白質印跡，與來自未處理細胞的那些ErbB2進行比較，來確定該蛋白質的總體水平。此外，通過免疫沉澱並用伴刀豆球蛋白A印跡來分析用2-DG處理後的ErbB2中的甘露糖含量，伴刀豆球蛋白A是一種識別高級甘露糖型N-聯寡糖的凝集素。由於有可能甘露糖類似物不僅能夠抑制ErbB2而且能夠抑制所有N-聯糖蛋白的甘露糖含量，也可以採用該凝集素來探查從這些細胞中獲得的全細胞溶解產物。將結合所有蛋白質的麗春紅染料用作陰性對照，來證明2-DG和2-FM特異性地影響糖蛋白，而且，該方法或者類似的方法可以;故用於確定一種癌症或腫瘤細胞是否對按照本發明的處理易感。即使通過2-DG和2-FM證實了指示幹擾N-聯糖基化的ER應激確實發生，在細胞質而不是在ER中發生的幹擾O-糖基化也可以被評估。科技文獻報導2-DG對從O-糖基化轉錄因子Spl上切除N-乙醯氨基葡萄糖殘基具有抑制作用，導致對Spl結合到其相應的啟動子上的抑制。Spl是用於活化大量癌基因的一種重要轉錄因子，如果其至少部分地可能受2-DG的作用，就解釋了在含氧量正常的條件下生長的SKBR3細胞為什麼會對2-DG敏感。因此，在用2-DG和2-FM處理後，Spl的糖基化才莫式可以通過免疫沉澱和用WGA進4亍:探查來研究，WGA是一種特異性地結合O-糖基化蛋白質的凝集素。就2-DG對Spl和O-聯糖基化的作用程度而言，糖基化的這種改變可被測定並用作胂瘤細胞系或其他癌症細胞系對2-DG介導的細胞殺死作用易感的指示劑。當細胞對錯誤摺疊的蛋白質反應時，在該細胞的內質網中發生由未摺疊蛋白應答引發的細胞死亡，可以通過施用一種額外試劑versipelostatin而增加這種細月包死亡。因此，在一個具體的實施方案中，2-DG、2-FM和/或2-CM被施用給需要進行癌症治療的患者，並且將versipelostatin共同施用給該患者。類似地，通過用蛋白體抑制劑對錯誤摺疊糖蛋白的水解進行阻斷，可以增強對蛋白質錯誤摺疊反應而發生的細胞死亡。因此，在另一個具體的實施方案中，本發明提供通過施用與2-DG、2-FM和/或2-CM組合的一種蛋白體抑制劑來治療癌症的方法。在一個具體實施方案中，該蛋白體抑制劑是Velcade。某些類型的癌症可能對本發明的處理比其他肺瘤更為易感。為了確定這種類型的肺瘤，可以按照本發明的方法對多種細胞類型進行;險測。例如，從ATCC獲得多種癌症細胞系，如上所述對它們進行篩選，確定在存在氧氣的情況下對甘露糖類似物例如2DG和2FM極其每丈感的其他細胞類型。在5mM2-DG或2-FM或更低濃度下被殺死的細胞被確定為易感的。還測試這些易感的肺瘤細胞系對劑量分別至多20mM和30mM的2-FG和草氨酸鹽的敏感性。如果對糖基化的幹擾是2-DG和2-FM的毒性模式，那麼這些細胞系應當對其他糖酵解抑制劑2-FG和草氨酸鹽具有抗性，除非它們的線粒體氧化磷酸化存在缺陷。為了^S正這些細胞的線粒體的功能，使用例如Clark電極設備來測量呼吸作用。為了證實2-DG和2-FM的毒性是由於幹護u了這些細胞系中的糖基化，可以如上所述分析由甘露糖產生的細胞死亡恢復作用。細胞對目前的方法具有抗性而對另一種方法沒有抗性的分子基礎可能是由於與由葡萄糖合成GDP-甘露糖相關的基因的表達，即葡萄糖磷酸異構酶(PMI)存在差異，該酶能夠將葡萄糖-6-磷酸轉化為甘露糖一6-磷酸(參見圖7)。如上提及，PMI中的缺失被證實會導致糖基化綜合症lb,引起血清糖蛋白的低糖基化，導致在被確定具有該缺陷的患者中發生血栓症和胃腸道紊亂。已經證實往飲食中添加甘露糖會減輕患者的症狀以及使其糖蛋白正常化。因此，該酶的缺陷或者下調能夠解釋2-DG和2-FM在如此測試的敏感細胞系中產生的毒性以及被外源性甘露糖逆轉的現象。當缺乏PMI時，細胞依賴於外源性甘露糖(存在於血清中)來合成N-聯寡糖前體，這是PMI的下調或者缺失會在敏感細胞系中產生2-DG毒性的原因。已經知曉，在哺乳動物血清中的甘露糖濃度(50-60mg/ml)或者用於體外研究的培養液中的甘露糖濃度顯著地低於葡萄糖的濃度。因此，在PMI缺失或者一皮下調的細月包中，^氐劑量的2-DG和2-FM能夠順利地與血清中存在的低含量的甘露糖竟爭，完全阻斷該糖被添加到寡糖鏈上。另一個方面，具有正常的PMI細胞能夠從葡萄糖生產GDP-甘露糖；因此，較高劑量的2-DG或2-FM是導致完全破壞寡糖組件所必需的。這可以解釋為什麼大部分所測試的細胞在含氧量正常條件下對2DG具有抗性。對這種酶的活性的直接測量可用於本發明中，以確定PMI的缺乏或者含量低是否是導致在含氧量正常的條件下生長的選擇的細胞對2-DG和2-FM敏感的原因，並且如果情況如此，則可用於確定對按照本發明方法處理易感的腫瘤和癌症細胞。解釋這種異常敏感性的另一種可能是，與在正常氧氣壓力下生長時不受2-DG和2-FM影響的大多數正常細胞系和腫瘤細胞系相比，這些選擇的細胞中的PMI被2-DG和2-FM的抑制程度較大。為了直接對此進行測試，可以從SKBR抗性和敏感的細胞對中分離細胞提取物，並且在存在或缺乏2-DG和2-FM的情況下，確定其將葡萄糖-6-P轉化為甘露糖-6-P的能力。如果PMI活性下降不是負責2-DG在SKBR3敏感細胞中產生毒性的原因，那麼解釋該情形的一種可替代的作用機制是編碼與用於寡糖組裝的甘露糖衍生物生成相關的酶的基因，即磷酸甘露糖變位酶(PMM)和GDP-Man合成酶被上調(圖7)。存在一種可能性，即對2-DG敏感的細胞中的糖基化增加，從而上調這些酶的一種或者兩者。從而與糖基化發生速度較慢或者數量較少的抗性細胞相比，這種細胞將積聚更多的2-DG-GDP，更大程度地幹擾糖基化和隨後更多的細胞死亡。無論上調糖基化是否最終作為一種作用機制，細胞由此變得對2-DG敏感，所積聚的或者摻入到細胞中的2-DG總量也對其敏感性升高有貢獻。因此，用fH]標記的2-DG進行4聶取和積聚研究，以確定4交高水平的葡萄糖轉運蛋白是否使得細胞對按照本發明方法的處理更為敏感。用劑量遞增的2-DG處理2-DG敏感細月包並對存活率進4亍篩選，可以獲得2-DG抗性突變體。抗性突變體與其親本的敏感配對物可以被用於所述的方法中。該研究還提供了理解細胞變得對2-DG具有抗性的作用機制的手段，從而可以適於更好地在臨床上使用這種藥物。之前的討論表明，分子信號可被用於預測哪種腫瘤細胞類型在存在氧氣的情況下會對2-DG和2-FM敏感。細胞死亡的執行具有引人注目的塑性，其範圍橫跨凋亡和壞死。使用已經建立的方法，通過研究DNA斷裂的類型、膜組成、完整性和色調的改變來比較細胞死亡的模式，能夠確定由於幹擾糖基化和抑制糖酵解而引起的細胞死亡的作用機制。抑制糖酵解和氧化磷酸化、導致嚴重的ATP消耗，從而導致從凋亡轉變為壞死。由於ATP是活化胱天蛋白酶所需的，當ATP被嚴重消耗時，凋亡被阻斷，最後，沒有能量，細胞死於壞死。一種用糖酵解抑制劑處理的需氧細胞能夠通過氧化磷酸化來生產ATP,該氧化磷酸化由作為能量來源的胺基酸和/或脂肪提供燃料。因此，在含氧量正常的情況下由2-DGi秀導導致細月包死亡的UPR時，一般認為該細胞會發生凋亡。相反，在低氧的細胞才莫式中，預期當2-DG的劑量高至足以阻斷糖酵解時，這些細胞將發生ATP耗盡，並由於壞死而死亡。因此，可以用已經建立的分衝斤凋亡和壞死的方法，確定2-DG是否通過凋亡、壞死或者兩者的混合方式來殺死細l包。通過流式細l包分對斤方法檢測數個凋亡參數，來區分壞死和凋亡。在用2-DG處理後，用膜連蛋白-V和碘化丙錠對細胞進行雙重染色，分別檢測phosphoatidyl絲氨酸是否暴露到細胞表面上以及細胞膜是否丟失其完整性。單獨染色膜連蛋白-V或者同時染色膜連蛋白-V和碘化丙錠指示發生凋亡，而單獨染色典4b丙4走指示壞死。此外，還可以衝全測凋亡的兩種最終結果核DNA分級以及形成單鏈DNA。已經報導，這兩種參數是細胞凋亡死亡專一性的，並且已經;波不同的研究人員用來區分凋亡與壞死。還可以分析ATP含量，來確定它們是否與所檢測的死亡模式相關。此外，如果2-DG在低氧細胞中誘導凋亡和壞死兩者，那麼可以確定2-FG在低氧條件下誘導細胞死亡的模式。如上提及，2-FG不幹擾糖基化，並且是比2-DG更有效的糖酵解抑制劑。因此，預期由2-FG誘導的細胞死亡將僅通過壞死發生。已經證明在體外的含氧量正常的條件下對2-DG和/或2-FM和/或2-CM敏感並容易在棵鼠中生長的細胞系可用於證明2-DG(和2-FM和2-CM)作為抵抗它們的單一試劑在體內給予時也是有效的。在腫瘤達到某一尺寸時，採用2-DG的處理將通過腹膜內注射而被應用。按照先前在這些動物中確定的最小致死劑量的2-DG的劑量和處理方案可用於證明腫瘤衰退和細胞毒性。實施例1:材料與方法分離抗性突變體。將2-DG敏感的SKBR3和NSCLC細胞暴露於劑量遞增的2-DG中，並且分離抗性克隆，並在適當劑量的2-DG中繁殖。然後對所繁殖的2-DG抗性細胞進行分析，並與用於表達負責該獨特的敏感性的特定基因的野生型的敏感配對物比較。藥物和抗體。Rho123、寡黴素、星形孢菌素和2-DG、2-FG、2-FM、衣黴素、脫氧mannojirinomycin購自SigmaChemicalCo.。如下的初級抗體可,皮使用HIF-Ia和LDH-a的單克隆抗體(BDBiosciences);erbB2(Calbiochem,USA);Grps78&94(StressGen,USA);胱天蛋白酶4和5(StressGen,USA);以及月幾動蛋白(SigmaChemicalCo.);GLUT畫I(USABiological)和GADD153/CHOP(SantaCruz,USA)的多克隆抗體。二級抗體是與辣根過氧化物酶綴合的兔抗鼠和羊抗兔(Promega,Co.)。細胞毒性分析和快速DNA含量分析。細月包培養在37°C、5%C〇2下24小時，此時開始藥物處理並持續72小時。這時，用胰蛋白酶消化附著的細胞，並與它們各自的培養液混合，接著以400g離心5分鐘。將含有該細胞的沉澱懸浮在1.5ml培養液/臺盼藍混合物中，用於細胞毒性分析，或者懸浮在碘化丙錠/低滲檸檬酸鹽染色溶液中，用於通過CoulterXL流式細胞計數器確定核DNA含量和細胞周期。分析至少10,000個細月包，產生DNA分布柱狀圖。乳酸分析。將0.025ml來自經過處理或者未被處理的培養物的脫蛋白培養液添加到含有0.1ml乳酸脫氫酶(1000umts/ml)、2ml氨基乙酸緩衝液(氨基乙酸，0.6mol/L,和肼，pH9.2)以及1.66mg/mlNAD的反應混合物中，來測定乳酸。用lml8。/。w/v高氯酸處理0.5ml來自測試培養物的培養液，攪動30秒，然後在4。C下溫育該混合物5分鐘，並以1500g離心10分鐘，進行脫蛋白質處理。將上清液離心3次以上，將0.025ml最終澄清的上清液用於測定乳酸。使用BeckmanDUr520紫外/可見分光光度計，在340nm下檢測NADH的形成，其直接對應於通過乳酸鹽標準曲線所確定的乳酸水平。2-DG的攝取。將細胞接種到陪氏培養皿中，在37。C和5Q/。C02下培養24小時。然後除去培養液，用不含葡萄糖和血清的培養液洗滌培養亞。將2ml含有3H標記的2-DG的無血清培養液添加到該培養亞中(lyCi/亞)，溫育該培養皿適當時間。然後除去培養液，在4。C下洗滌培養皿3次，加入含有100|uM未一皮標記的2-DG和0.5mlINNaOH的無血清培養液。在37。C下培養3小時(或過夜)後，刮下細胞並通過超聲波降解獲得勻漿(10秒鐘)。將溶液收集到試管中，用於3H量化(保留一部分用於蛋白質分析)。將100iuL蚊酸、250jaL樣本和7ml閃爍計數混合物添加到3H計數瓶中，並用閃爍計數器讀取。通過總CPM/比放射性/總蛋白質來計算轉運速度(nmol/mg蛋白質/時間)。ATP定量分析。用ATP小試劑盒(PerkinElmer)來量化ATP的水平。將約50mL細月包溶解液添加到底部透明的96孔平糹反內的100mL細胞上清液中。將該平板放置在搖床(700rpm)上，在室溫下培養5分鐘。將50mL底物溶液添加到孔中，並在室溫下再搖晃(700rpm)5分鐘。然後將該平板在黑暗中放置10分鐘，測量其發光度。Dol-PMan和脂聯寡糖(LLO)的代謝標記和提取.按照Lehle描述的程序，用[2」H]甘露糖標記細胞30分鐘，刮取到2ml水冷的曱醇中，通過超聲波溶解。在加入4ml氯仿後，進行超聲波降解，-接著在4。C下以5000rpm離心10分鐘。收集上清液，用氯仿/曱醇(3:2)(C/M)萃取沉澱兩次。將含有Dol-P-Man和小分子量的脂聯寡糖的組合上清液在N2中乾燥，溶解在3mlC/M中，洗滌，並用含有C/M/H20(65:25:4)的流動緩衝液在矽膠60鋁薄片上進行薄層層析分析。對含有大尺寸的LLO的剩餘丸片進行洗滌，並用C/M/H20(10:10:3)進行萃取。將相應的C/M和C/M/H20萃取物的等份物混合，並在N2下乾燥，並重新懸浮在35yll-丙醇中。為了通過溫和的加酸水解來釋放寡糖，加入500丫10.02NHCI，接著在IO(TC下溫育30分鐘。將水解的物質在N2下乾燥，然後通過超聲波處理而重新懸浮在200yl水中，並通過離心使之澄清。含有被釋放的寡糖的上清液被用於HPLC分析。通過HPLC進行寡糖的大小分級.可以在包括LC-NH2(2cmx4.6mm)預柱的SupelcosilLC隱麗2柱(25cmx4.6mm;5ym;Supelco)上進行LLO的分離。以1ml/min的流速應用線性濃度梯度為70%到50%的乙腈水溶液。通過液相閃爍計數對洗出液部分進4亍分一斤。甘露糖6-磷酸、甘露糖l-磷酸、GDP-甘露糖的製備。在用[2^H]甘露糖標記後，收集細l包，並通過Korner等人描述的紙層析將游離的甘露糖與核苦酸連接的和磷酸化的甘露糖衍生物分離開來。部分通過液相閃爍計數對洗出液進行分析。蛋白質印跡分析。以104個細胞/(^12將細胞鋪板，並使其在藥物處理的條件下生長指定時間。在處理的後期，收集細胞，並用添加了蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩衝液(150mMNaCl、1%Np-40、0.5%DOC、0.1%SDS、50mMTris-HCI，ph8.0)溶解。4吏溶液通過21G針頭10次，將DNA片段化。用超級蛋白質分析試劑盒(Cytoskeleton,USA)測定蛋白質濃度。將樣本與2xLaemmli樣品緩衝液(Bio-Rad,USA)混合，並在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上電泳。將凝膠轉移到硝基纖維素膜(Amersham,USA)上，用特定的抗體探查。探查後，洗滌膜並且使其與HRP綴合的二級抗體一起溫育。通過對膠片進行曝光來檢測化學發光。顯示時，用剝離緩衝液(Pierce,USA)來剝離膜，並且用抗肌動蛋白的初級抗體再次:探查。ErbB2的免疫沉澱反應。在處理細胞24小時後，用RIPA(15mMNaCl、l%Np-40、0.1%SDS)溶解和超聲波處理細胞。將細胞溶解產物與連接到單克隆ErbB2抗體(Calbiochem,USA)上的CnBr活化的瓊脂糖珠(Amersham，USA)—起溫育，並以400g旋轉5分鐘。將免疫沉澱的ErbB2加載到SDS-PAGE凝膠上，並用伴刀豆球蛋白A印跡，伴刀豆球蛋白A特異性地結合糖蛋白的甘露糖殘基。凋亡分析。如所述進行凋亡ELISA分析，其基於由曱醯胺引起的凋亡細胞的濃縮染色體中的選擇性DNA變性以及凋亡細胞中單鏈DNA(ssDNA)與高度特異性地結合ssDNA的單克隆抗體的反應。這些抗體特異性地;險測凋亡細胞而不與壞死細月包發生反應。通過流式細胞計數研究細胞死亡機制。用膜連蛋白-V-螢光染色試劑盒(Roche,USA)將凋亡與壞死區分開。在進行特定處理後，將106個細胞重新懸浮在含有偶聯了膜連蛋白-V的FITC和碘化丙錠的培養緩衝液中，分別4企測phosphotdyl絲氨酸和質膜的完整性。在培養後，通過流式細胞計數器對細胞進行分析，使用488nm激發光，將515nm帶通濾光器用於檢測螢光，並且將>600nm的濾光器用於檢測PI。基因表達模式。基因陣列試劑盒購自SuperArrayInc。通過反轉錄反應，用dCTP[oc-32P](3000Ci/mmol)對來自選擇的細胞系的總RNA進行探查。將探查到的被標記的cDNA加入到預雜交的陣列膜上，在雜交條件下溫育過夜。在多次洗滌除去游離探針後，將膜曝光到X-射線膠片上來記錄圖象。體內肺瘤試-驗。重複在CancerRes.2004(Lampidis等人)中淨艮道的用於2-DG+Dox的所述方案，用2-FG替換2-DG。將5-6周齡、重30g的CDl品種的棵鼠以10個細胞/ml植入(S.C.)100y1人骨肉瘤細胞系143b。當胂瘤大小達到50mm3(9-10天後)時，將小鼠按照如下配對分成四組(8隻/組)生理鹽水處理對照組；單獨2-EG;單獨Dox;和Dox+2-FG。在第0天，單獨2-FG組和Dox+2-FG組以75mg/ml(500mg/kg)劑量接受0.2ml2-FGi.p.,這在試-驗期間每周重複3次。第1天，讓Dox組和Dox+2-DG組以0.6mg/ml(6mg/kg)的劑量接受0.3mlDoxi.v.,該處理每周l次，總共處理3次(18mg/kg)。對小鼠進行稱重，每周用卡尺測量肺瘤三次。在上述才莫型中，植入SKBR3細胞並進行測試，使用2-DG或2-FM,但是不用阿黴素(Dox)。實施例2某些胂瘤細胞對甘露糖衍生物的含氧量正常的敏感性在低氧條件下生長的細胞僅依賴於通過糖酵解的葡萄糖代謝來產生能量。結果，當用2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)阻斷該路徑時，含氧量低的細胞死亡。相比之下，當在含氧量正常的條件下阻斷糖酵解時，大部分細胞能夠存活，這是因為脂肪和蛋白質可以替代作為能量來源，為線粒體氧化磷酸化提供燃料。本發明部分地基於這樣的發現在正常的氧氣壓力下，大量被選擇的腫瘤細胞系在相對低劑量的2-DG(4mM)下被殺死。先前已經證明，2-DG幹擾病毒衣殼糖蛋白合成中的N-聯糖基化過程，這可以通過添加外源性甘露糖來逆轉。由於在此描述的含氧量正常條件下的2-DG毒性能夠被低劑量的甘露糖(2mM)完全逆轉，糖基化而不是糖酵解被認為是產生這些結果的作用機制。另外，在阻斷糖酵解和殺死含氧量低的細胞方面，2-氟-脫氧-D-葡萄糖(2-FDG)比2-DG更有效，但是在含氧量正常的條件下，2-氟-脫氧-D-葡萄糖(2-FDG)對任何對2-DG敏感的細胞類型沒有毒性。為了研究2-DG對糖蛋白合成的作用，將伴刀豆球蛋白A(其特異性結合糖蛋白的甘露糖部分)用於研究，該研究表明2-DG而不是2-FDG使結合減小，這可以通過添加外源性甘露糖來逆轉。類似地，已知當N-聯糖基化發生改變時，會誘導未摺疊的蛋白應答(UPR)蛋白質grp98和78,這兩種蛋白質被2-DG而不是2-FDG上調，同樣地，這種作用能夠被甘露糖逆轉。此外，2-DG通過上調介導凋亡的UPR特異性轉錄因子(GADD154/CHOP)而誘導細胞死亡。因此，在某些肺瘤細胞類型中，2-DG可在臨床上被用作單一試劑來選擇性地殺死實體腫瘤中的有氧細胞(通過幹擾糖基化)以及低氧細胞(通過抑制糖酵解)。儘管血管發生，但是腫瘤的快速生長的代謝需求常常超過氧的供應，這有助於在大部分實體腫瘤中形成低氧區域。當肺瘤生長時，發生氧含量降低，導致低氧部分中的細胞複製速度下降，產生對大部分通常靶向快速增生細胞的化療劑的抗性。Brown,J.M,等人，ExploitingTumorHypoxiaInCancerTreatment,NatRevCancer2004;4:437-47。由於生長緩慢並且缺乏產生活性氧組分所需的氧氣，低氧細胞還會對放療產生抗'l"生。Semenza,G丄.，IntratumoralHypoxia,RadiationResistance,AndHIF-I,CancerCell2004;5:405-406。除了這些癌症治療的不利之處外，低氧致使腫瘤細胞依賴於糖酵解來生產能量並存活。在低氧情況下，生產ATP的最有效手段的氧化磷酸化被抑制，留下糖酵解作為生成ATP的唯一手段。因此，阻斷低氧腫瘤細胞的糖酵解會導致細胞死亡。實際上，在體外模擬低氧的三種不同條件下，已經證明腫瘤細胞可以被糖酵解抑制劑殺死。Maher,J.C,等人,GreaterCellCycleInhibitionAndCytotoxicityInducedBy2-deoxy-D-glucoseInTumorCellTreatedUnderHypoxicvsAerobicConditions,CancerChemotherPharmacol2004;53:116-122。jt匕外，抑制含氧正常的細胞內的糖酵解並不顯著地影響其能量生產，這是因為可替代的碳源，即胺基酸和脂肪，可被用於啟動線粒體氧化磷酸化。因此，糖酵解抑制劑可用於選擇性地耙向低氧肺瘤細胞，對正常的或者依靠氧氣生長的腫瘤細胞不具有大的毒性。Boros,L.G.,等人，InhibitionOfOxidativeAndNonoxidativePentosePhosphatePathwaysBySomatostatin:APossibleMechanismOfAntitumorAction,MedHypotheses1998;50:501;LaManna,丄C,NutrientConsumptionAndMetabolicPerturbation,NeurosurgClinNAm1997;8:145-163。事實上，體內試驗已經證明在不同人腫瘤異種移植物中，2-DG(粑向緩慢生長的低氧腫瘤細胞)提高了標準化療劑(對準快速增生的需氧糹田月包)的功歲支。Maschek,G.,等人,2-dexyo-D-glucoseIncreasesTheEfficacyOfAdriamycinAndPaclitaxelInHumanOsteosarcomaAndNon-SmallCellLungCancersInVivo,CancerRes2004;64:31-4。這些試驗的結果以及來自體外低氧模型的數據已經引導測試該策略用於改善在人中進行的化療方案，以題為"2-脫氧-D-葡萄糖單獨和結合多西他賽(docetaxel)在患有高級實體惡性肺瘤的患者中的I期劑量調整試-瞼"的I期臨床試驗的形式進行，該試驗目前正在進行中。Maher,J.C.,等人，GreaterCellCycleInhibitionAndCytotoxicityInducedBy2-deoxy-D-glucoseInTumorCellTreatedUnderHypoxicvsAerobicConditions,CancerChemotherPharmacol2004;53:116-122。來自動物試驗的數據以及來自I期臨床試驗的初步數據表明，對於正常細胞而言，對2-DG的耐受性糹艮高並且相對沒有毒性。儘管理論上，含有能夠進行氧化磷酸化的線粒體的胂瘤細胞不會被糖酵解抑制劑2-DG殺死，但是在存在氧氣的情況下，選擇量的癌症細胞系死於低劑量的這種糖類似物。該毒性作用機制不是通過阻斷糖酵解，這是因為這些細胞系進行正常的線粒體呼吸，並且對其他糖酵解抑制劑具有抗性。類似的作用機制在病毒的糖蛋白合成中也已經被顯示，其中2-DG通過幹擾脂聯寡糖組裝來阻斷N-聯糖基化。Datema,R.等人，InterferenceWithGlycosylationOfGlycoproteins,BiochemJ1979;184:113-123;Datema,R.等人，FormationOf2-Deoxyglucose-ContainingLipid-LinkedOligosaccharides,EurJBiochem1978;卯505-516。在含氧量正常條件下生長的^皮選擇的肺瘤細l包系中2-DG的毒性作用似乎是由於類似的機制而引起的。按照本發明，在某些具有含有在含氧量正常的條件下對2-DG敏感的細^^的實體胂瘤的患者中，2-DG可以淨皮用作單一試劑。因此，在這些患者中，2-DG應當具有雙重作用(1)通過幹擾糖基化而靶向需氧的胂瘤細胞群體；和(2)抑制肺瘤中的低氧部分的糖酵解；這兩種機制都導致細力包死亡。材料與方法細胞類型^口King,MP.等人,HumanCellLackingMtdna:RepopulationWithExogenousMitochondriaByComplementation,Science1989;246:500-503中所述，通過用溴化乙4t處理骨肉瘤細胞系143B(wt)延長的時間來分離pG細胞。由於pG細胞是尿苷和丙酮酸鹽營養缺陷型的，將它們培養在添加了10%胎牛血清、50mg/ml尿苦和100mM丙酮酸鈉的DMEM(GIBCO,USA)中。SKBR3細胞系是從邁阿密大學的JosephRosenblatt教授的實驗室獲得。胰腺癌細胞系1420和1469、卵巢癌細胞系SKOV3、宮頸癌細胞系HELA和骨肉瘤細胞系143B購自ATCC。非小細胞肺癌細胞系和小細胞肺癌細胞系由邁阿密大學的NiramolSavaraj教授從患者中獲得。將SKBR3和SKOV3細胞在McCoy的5A培養液中培養；將1420、1469和143B在DMEM(GIBCO,USA)中培養；而將HELA在MEM(GIBCO,USA)中培養。在培養液中添加了10%胎牛血清。使所有細胞在5。/。C02和37。C下生長。藥物和化學藥品2-DG、寡黴素和衣黴素購自Sigma。2-FDG和2-FDM是由Priebe教授(MDAndersonCancerCenter,TX)惠贈。低氧對於在低氧條件下進行的試驗(模式C)，接種細胞，並如下用於直接細胞毒性分片斤那樣在37。C和5%C02下培養24小時。在培養24小時後，細胞接受藥物處理，並將其放置在與IIO型氧氣控制器(RemingBioinstrumentsCo.Redfield,NY)相連的Pro-Ox體外腔室中，其中用95%氮氣和5。/nC02混合氣體灌注該腔室，以獲得期望的氧氣水平(0.1%)。細胞毒性分析在37。C和5%C02下培養細胞24小時，此時開始藥物處理，並繼續培養72小時。這時，用胰蛋白酶消化附著的細胞，並與各自的培養液混合，接著以400g離心5分鐘。將沉澱重新懸浮在lml漢克斯溶液中，用Vi-Cell(BeckmanCoulter,USA)細胞存活率分析儀進行分析。乳酸分析將0.025ml來自經處理或未禾皮處理的培養物的脫蛋白培養液添加到反應混合物，測量乳酸，該反應混合物中含有0.1ml乳酸脫氬酶(1000單位/ml)、2ml氨基乙酸緩衝液(氨基乙酸，0.6mol/L和肼，pH9.2)以及1.66mg/mlNAD。用lml8%w/v高氯酸處理0.5ml來自測試培養物的培養液，攪動30秒，然後在4。C下溫育該混合物5分鐘，並以1500g離心10分鐘，進4亍脫蛋白質處理。將上清液離心3次以上，如上所述將0.025ml最終澄清的上清液用於測定乳酸。用BeckmanDUr520紫外/可見分光光度計在340nm下檢測NADH的形成，其直接對應於通過乳酸鹽標準曲線所確定的乳酸水平。ATP定量分析用ATP小試劑盒(PerkinElmer)量化ATP的水平。將約50mL細胞溶解液添加到底部透明的96孔平板內的100mL細胞上清液中。將該平板放置在搖床(700rpm)上，在室溫下培養5分鐘。然後將50mL底物溶液添加到孔中，並在室溫下再搖晃(700rpm)5分鐘。然後在黑暗中放置該平板10分鐘，測量其發光度。蛋白質印跡分析以104個細胞/^112的密度將細胞鋪板，並在藥物處理的條件下生長指定的時間。在處理的後期，收集細胞，並用含有1。/。SDS並添加了蛋白酶抑制劑混合物的80mMTris-HCL(ph7.4)緩衝液溶解。通過超聲波處理使DNA片段化，並用微BCA蛋白質分析試劑盒(Pierce,USA)測定蛋白質濃度。將樣本與2xLaemmli樣品緩衝液(Bio-Rad,USA)混合，並在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上電泳。將凝膠轉移到硝基纖維素膜(Amersham,USA)上，用抗-KDEL(Stressgen,Canada)(用於4企測Grp78和Grp94);抗畫CHOP/GADD154多克隆抗體(SantaCmz，USA)、抗-erbB2多克隆抗體(DAKO,USA)進行探查。探查後，洗滌膜，與HRP綴合的二級抗體一起溫育。通過對膠片曝光來檢測化學發光。顯示時，用剝離緩衝液(Pierce,USA)剝離膜，並用抗肌動蛋白的初級抗體再次探查。為了分析伴刀豆球蛋白A(ConA)的結合情況，將膜與0.2mg/mlHRP綴合的ConA—起溫育，並如所述檢測化學發光。結果2-DC和2-氟-D-甘露糖，而不是2-FDG殺死在含氧量正常的條件下生長的SKBR3細胞。在測量大量腫瘤細胞系在含氧量正常和低氧條件下對糖酵解抑制劑的不同敏感性時，發現人乳腺癌細胞系SKBR3在含氧量正常的條件下生長時對2-DG每丈感。圖1A和B證明，當用3mM2-DG處理SKBR372小時時，其生長^皮抑制了50%(ID50),而當用12mM處理時，60%細胞被殺死。先前的研究表明，當線粒體呼吸存在缺陷或者^皮化學阻斷時，用類似劑量2-DG進4亍處理，腫瘤細l包會死亡。因此，為了確定這些細胞是否存在線粒體呼吸缺陷，測定它們的氧消耗量。如下面表l所證明，在平均氧消耗量方面，SKBR3細胞和其他兩種在含氧量正常條件下生長對2-DG具有抗性的細胞系沒有顯著差異。另一方面，線粒體缺陷的細胞系pG表現出急驟下降的氧消耗量，證明SKBR3的呼吸正常。此外，兩種其他細胞系，1420和HELA,在含氧量正常的條件下對2-DG敏感，其呼吸與抗性細胞系一樣甚至更好(參見表1)。因此，在含氧量正常的條件下2-DG在這些細胞中產生的毒性是由於阻斷糖酵解之外的其他作用才幾制而引起的。為了證實這一點，將SKBR3細月包用兩種其他糖酵解抑制劑，即2-脫氧-2-氟-葡萄糖(2-FDG)和草氨酸鹽處理。在圖1A和B中，可以看出這兩種試劑對在含氧量正常的條件下生長的SKBR3細胞都沒有毒性。表1.在2-DG敏感的與抗性的細胞系中的氧消耗量的比較tableseeoriginaldocumentpage33此外，在對SKBR3細胞產生毒性方面，儘管2-氟-D-甘露糖(2-FDM)的效率較低，但是與2-DG類似(參見圖1)。在結構上，2-DG和2-FDM而不是2-FDG類似於甘露糖，從而能夠幹擾甘露糖的代謝。這些數據表明，2-DG和2-FDM幹擾甘露糖的代謝，主要是眾多蛋白質的N-聯糖基化，引起SKBR3細胞死亡以及抑制細胞生長。2-FDG是比2-DG更好的糖酵解抑制劑，導致在SKBR3細胞中更多地消耗了ATP在先前的報導中，一般認為2-DG在含氧量正常條件下生長的SKBR3細胞中產生的毒性作用是通過抑制糖酵解的ATP生成來調節的。Aft,R丄.等人,EvaluationOf2-dexyo-D-glucoseAsAChemotherapeuticAgent:MechanismOfCellDeath,BrJCancer2002;87:805-812。然而，如上指出，另一種糖酵解抑制劑2-FDG在這些細i包中沒有毒性。而且在抑制糖酵解和殺死〗氐氧細胞方面，2-FDG類似物優於2-DG。Lampidis,TJ.等人，Efficacyof2-HalogenSubstitutedD-GlucoseAnalogsinBlockingGlycolysisandKilling"HypoxicTumorCells,"CancerChemotherPharmacol(inpress)。實際上，當用2-FDG或2-DG處理SKBR3細J包時，2-FDG抑制乳酸水平(糖酵解的測量值)的效果優於2-DG(參見圖2A)。而且，用2-FDG處理時，ATP的損肆毛更為突出，進一步證實了在這些細胞中，這種糖類似物是糖酵解和ATP生成的一種較好的抑制劑(參見圖2B),此外，發現當SKBR3細胞在低氧條件下生長時，2-FDG的毒性大於2-DG,進一步證實了在SKBR3細胞中，2-FDG是一種較好的糖酵解抑制劑(數據未顯示出來)。因此，與先前的報導相反，2-DG在含氧量正常的條件下產生的毒性似乎與其抑制糖酵解和減少ATP庫的能力無關。2-DG在含氧量正常的條件下的SKBR3細胞中產生的毒性作用可以通過外源性甘露糖逆轉。在病毒蛋白方面，2-DG已經被證明能夠抑制N-聯寡糖的組裝，這種抑制作用可以;波外源性甘露糖逆轉。Datema,R.等人，InterferenceWithGlycosylationOfGlycoproteins,BiochemJ1979;184:113-123。圖3A和3B說明添加甘露糖而不是其他糖，即葡萄糖、果糖和海藻糖，在含氧量正常的條件下暴露於2-DG引起的細胞死亡能被逆轉，這表明細胞死亡是由通過類似的作用機制幹擾糖基化來介導的。Datema,R.等人，InterferenceWithGlycosylationOfGlycoproteins,BiochemJ1979;184:113-123。作為陰性對照，已經發現甘露糖不能夠逆轉在相同條件下由衣黴素在SKBR3細胞引起的毒性作用。這可通過如下事實來解釋，即衣黴素幹擾在甘露糖被添加到寡糖上之前的步驟的糖基化，從而使之不受甘露糖代謝的影響(數據未顯示出)。在三種低氧模型中的2-DG毒性作用不被外源性甘露糖所逆轉如上指出，在低氧條件下生長的細胞僅依賴於糖酵解來生產能量。因此，用糖酵解抑制劑抑制該代謝路徑會導致細胞死亡，這先前已經祐二i正明了。Maher,J.C等人，GreaterCellCycleInhibitionAndCytotoxicityInducedBy2-Deoxy-D-GlucoseInTumorCellsTreatedUnderHypoxicvsAerobicConditions,CancerChemotherPharmacol2004;53:116-122。為了辨別2-DG對在含氧量正常的條件下生長的SKBR3細胞產生毒性的作用機制，將甘露糖添加給在三種不同的低氧條件下生長的細胞。如圖3C和D中所示，在正常生長培養液或在添加了2mM甘露糖的相同培養液中，生長抑制和細胞死亡均不存在顯著性差異。這些結果提供證據表明外源性甘露糖逆轉2-DG在含氧量正常的條件下生長的SKBR3細胞中產生的毒性作用與糖酵解無關，進一步暗示幹擾糖基化是這些在含氧量正常條件下生長的細胞死亡的才莫式。2-DG和2-FDM僅對在含氧量正常條件下生長的大量被選擇的胂瘤細胞系具有毒性為了研究2-DG在含氧量正常的條件下的毒性作用是否僅限於某些類型的癌症組織，對大量細胞系進行了測試。這些測試的結果示於表2中，表明僅選定數量的在正常氧氣壓力下的腫瘤細胞系(15個中的6個)在用6mM2-DG或2-FDM而不是2-FDG處理時發生大量細胞死亡。對2-DG敏感的細胞系是乳腺癌細胞系SKBR3;胰腺癌細胞系1420;2種直接來自患者的非小細胞肺癌細胞系；多發性骨髓瘤細胞系RT8226;宮頸癌細胞系HELA和惡性膠質瘤細胞系TG98。然而，在正常氧氣壓力下，來自類似組織的癌症細胞系對2-DG和2-FDM都具有抗性，表明這些糖類似物的毒性作用並不必然地是組織特異性的。表2.抗性的與敏感的細胞系(在含氧量正常下的2-DG)2-DG敏感細胞系2-DG抗性細胞系SKBR3,乳腺癌SKOV3,卵巢癌1420,胰腺癌1469,胰腺癌HELA,宮頸癌143B,骨肉瘤S-l和S隱2，非小細胞肺癌Ra-l、2和3,小細月包肺癌TG98,大腦癌症(神經"交質瘤)MCF-7,乳&泉癌RT8228，多發性骨髓瘤U266,多發性骨髓瘤HEPA-l,大鼠肝細i包瘤MDA-MB-231,乳腺癌MDA-MB-468,乳腺癌2-DG和2-FDM降低SKBR3細胞中的伴刀豆球蛋白A(ConA)的結合以及糖蛋白的分子量。ConA是一種特異性地結合糖蛋白上的甘露糖的凝集素，並被用於檢測高級甘露糖型的糖蛋白。ProteinPurificationMethods:APracticalApproach,In:HarrisELV,AngalS,editors.NewYork:IRLPressatOxfordUniversityPress;1994.p.270。該技術一皮用於證明2-DG和2-FDM以及衣黴素降低了ConA與大量糖蛋白的結合(參見圖4A)。此外，在用2-DG和2-FDM而不是衣黴素處理的細月包中，外源性甘露^f唐恢復對照的ConA結合水平，而用2-FDG處理的細胞在ConA結合方面沒有下降。此外，erbB2是一種已知的糖蛋白，是在用2-DG處理後在SKBR3細胞中表達的酪氨酸激酶受體，該糖蛋白的分子量改變可通過蛋白質印跡來分析。圖4B說明了2-DG和2-FDM都能降低erbB2的分子量，而2-FDG不產生該作用。與ConA的數據相一致，外源性甘露糖能將該蛋白質的分子量恢復到其原始大小。這些數據進一步支持了2-DG和2-FDM而不是2-FDG通過幹擾N-聯糖基化，對被選擇的胂瘤細胞具有毒性，並且這種幹擾作用能夠被甘露糖逆轉。用2-DG或2-FDM處理會在含氧量正常的條件下在SKBR3細胞中產生未摺疊蛋白的應答當蛋白質的正常糖基化過程受到影響時，錯誤摺疊的蛋白質會在內質網(ER)中積聚，導致發出被稱作為未摺疊蛋白應答(UPR)的級聯信號。已經證明幹擾糖基化的藥物能夠引發UPR,導致通過上調分子伴侶Grp78/Bip或Grp94,提高ER的蛋白質摺疊能力。如圖5中所示，在含氧量正常的條件下，用2-DG、2-FDM或者眾所周知的糖基化抑制劑衣黴素處理SKBR3細胞，Grp78和Grp94都被上調。此外，添加2mM甘露糖逆轉2-DG和2-FDM對分子伴侶的上調作用，但是不逆轉衣黴素的上調作用。甘露糖逆轉由2-DG引發的UPR與圖3D中的數據相關，圖3D中的數據證明通過添加外源性甘露糖能逆轉2-DG的毒性作用；類似結果可見於2-FDM處理的細胞中(數據未給出)。如所期望的，2-FDG不能與2-DG或2-FDM—樣提高這些分子伴侶的水平，這與證明在含氧量正常的條件下被處理的SKBR3細胞未發生死亡的毒性數據是相關的(圖IB)。相比之下，當2-DG或2-FDM被應用於在三種不同的低氧試驗條件下生長的細胞時，與模型C相比，在模型A和B中未見UPR一皮顯著上調，但是兩種分子伴侶都^L上調。此外，在所有三種模型中，作為陽性對照的衣黴素被證明會誘導這些分子伴倡的合成(圖5B)。這些結果表明，當用2-DG或2-FDM處理細胞時，在"低氧，，(阻斷糖酵解)與含氧量正常(幹擾糖基化)的條件下，細胞死亡的作用機制是不同的。2-DG和2-FDM的毒性與SKBR3細胞中的UPR特異性凋亡路徑的誘發相關。據報導，當細胞不能克服ER應激時，UPR通過誘導GADD154/CHOP來引發特異性的凋亡路徑。Xu,C等人，EndoplasmicReticulumStress:CellLifeAndDeathDecisions,JClinInvest2005;115:2656-2664;Obeng,E.A.等人，Caspase-12AndCaspase曙4AreNotRequiredForCaspase-DependentEndoplasmicReticulumStress-InducedApoptosis,JBiolChem2005;280:29578-29587。因此，為了確定在含氧量正常的條件下，2-DG和2-FDM殺死SKBR3細胞是否是由於ER應激而致，將這種UPR特異性的凋亡蛋白質用蛋白質印跡進行分析。這可參見圖6，在用2-DG、2-FDM和衣黴素處理後，誘導了GADD154/CHOP，但是2-FDG處理不誘導GADD154/CHOP。當這種凋亡路徑被2-DG或2-FDM引發時，可以用甘露糖共同處理來逆轉；然而，衣黴素誘導的GADD154/CHOP不能通過添加這種糖來逆轉。這些數據與如圖2B中所示的通過甘露糖來逆轉細胞毒性作用是相關的。實施例1和2的討i侖由於血管生成不足、腫瘤生長迅速以及腫瘤血管攜帶氧的能力下降，實體腫瘤含有低氧區域和含氧量正常的區域。Gillies,RJ.等人，MRIOfTheTumorMicroenviroment,JMagnResonImaging2002;16:430-450;Maxwell,P.H.等人,Hypoxia-InducibleFacoro-1ModulatesGeneExpressionInSolidTumorsAndInfluencesBothAngiogenesisAndTumorGrowth,PNAS1997;94:8104-8109;Semenza,G丄.，TargetingHIF-IForCancerTherapy,NatureRev2003;3:721-732。由於在4氐氧細胞中，唯一的能量生產路徑是糖酵解，已經證明糖酵解抑制劑2-DG選擇性地對這些細胞具有毒性，但是對需氧細胞沒有毒性並且僅抑制其生長。Maher,丄C等人,GreaterCellCycleInhibitionAndCytotoxicityInducedBy2-dexyo-D-glucpseInTumorcellTreatedUnderhypoxicvsAerobicConditions,CancerChemotherPharmacol2004;53:116-122;Maschek,G.等人,2-deoxy-D-glucpseIncreasesTheEfficacyOfAdriamycinAndPaclitaxelInHumanOsteosarcomaAndNon-SmallCellLungCancersInVivo,CancerRes2004;64:31-4;Liu,H.等人,HypersensitizationOfTumorcellToGlycolyticInhibitors,Biochemistry2001;40:5542-5547;Liu,H.等人,HypoxiaIncreasesTumorCellSensitivityToGlycolyticInhibitors:AStrategyForSolidTumorTherapy(ModelC,.BiochemPharmacol2002;64:1745-1751。然而，在存在氧氣時，選定數量的肺瘤細胞系被2-DG殺死。這些敏感的細胞類型中有人乳腺癌細胞系SKBR3。線粒體呼吸的缺陷能夠解釋這些細胞對2-DG敏感的原因，這是因為線粒體受到危害的細胞的糖酵解被阻斷將降低ATP水平，導致細胞壞死性死亡。Gramaglia,D.等人,ApoptosisToNecrosisSwitchingDownstreamOfApoptosomeFormationRequiresInhibitionOfBothGlycolysisAndOxidativePhosphorylationInABCL-XlAndPKB/AKT-IndependentFashion,CellDeathDifferentiation2004;11:342-353。然而，這種可能性通過氧消耗試驗而被排除了，氧消耗試驗證明SKBR3細胞的呼吸與兩種被發現在含氧量正常條件下對2-DG具有抗性的其他細胞系是類似的(表1)。而且，在含氧量正常的條件下對2-DG也敏感的細胞系1420的呼吸速率高於2-DG抗性細胞系。因此，在含氧量正常的條件下，2-DG在SKBR3中的毒性不能通過線粒體功能缺陷來解釋，表明該細胞死亡機制與該糖阻斷糖酵解的作用無關。先前已經報導，由於抑制了糖酵解，SKBR3細胞在含氧量正常的條件下對2-DG敏感，導致ATP庫的耗盡，這會引起葡萄糖轉運蛋白-I的表達增加，並且更多地攝取2-DG。Aft,R丄.等人，EvaluationOf2-Deoxy-D-GlucoseAsAChemotherapeuticAgent:MechanismOfCellDeath,BrJCancer2002;87:805-812。然而，2-FDG是比2-DG更為有效的糖酵解抑制劑(ll,圖2),但是對在含氧量正常的條件下生長的SKBR3細胞沒有毒性，進一步支持了2-DG通過阻斷糖酵解和抑制ATP生成的之外的其他機制殺死這些細胞的結論。證明SKBR3細胞對甘露糖類似物2-FDM也敏感的數據表明，糖類似物的甘露糖構象對於它們在含氧量正常的條件下生長的被選擇的腫瘤細胞中產生的毒性活性來說是重要的。在2-DG的第二個碳原子上缺乏氧原子，使得該化合物成為葡萄糖和甘露糖的類似物，其中2-FDG中的氟基團使其僅是葡萄糖類似物。有Schwartz領導的研究小組在20世紀70年代末期發表的試驗結果支持了甘露糖構象與這些糖類似物的毒性相關的結論。該研究小組證明2-DG、2-FDG和2-FDM會干擾雞胎成纖維細胞中的N-聯糖基化，該細胞感染了家禽痘疫病毒，結果導致糖蛋白合成減少和病毒繁殖速度下降。Datema,R.等人，InterferenceWithGlycosylationOfGlycoproteins,BiochemJ1979;184:113-123;Datema,R.等人,FormationOf2-Deoxyglucose-ContainingLipid-LinkedOligosaccharides,EurJBiochem1978;90:505-516;Datema,R.等人，Fluoro-GlucoseInhibitionOfProteinGlycosylationInVivo,EurJBiochem1980;109:331-341;Schmidt,M.F.G.等人,Nucleoside-diphosphateDerivativesOf2-Deoxy-D-GlucoseInAnimalCells,EurJBiochem1974;49:237-247;Schmidt,M.F.G.等人，MetabolismOf2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H]GlucoseAnd2-Deoxy-2-Fluoro-D隱fH]MannoseInYeastAndChick-EmbryoCells,EurJBiochem1978;87:55-68;McDowell,W.等人,MechanismOfInhibitionOfProteinGlycosylationByTheAntiviralSugarAnalogue2國Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose:InhibitionOfSynthesisOfMan(Gicnac)2PP-DolByTheGuanosineDiphosphateEster,Biochemistry1985;24:8145-8152。這些報導得出的結論是2-DG能夠抑制脂聯寡糖的組裝，這些脂聯寡糖將被運送到細胞內質網中的蛋白質上。已經證明2-DG、GDP-2DG的代謝產物會引起寡糖組裝的過早終止，產生不適合運送到蛋白質上的被削短的脂聯寡糖。Datema,R.等人，FormationOf2-Deoxyglucose-ContainingLipid-LinkedOligosaccharides,EurJBiochem1978;90:505-516。總之，這些結果表明這些類似物抑制病毒糖蛋白合成的效率的順序為2-DG>2-FDM>2-FDG,這與這些類似物在含氧量正常的條件下生長的SKBR3細胞中的毒性是類似的。Datema,R.等人，Fluoro-GlucoseInhibitionOfProteinGlycosylationInVivo,EurJBiochem1980;109:331-341。該研究小組還報導這些類似物的抑制作用能夠通過添加低劑量的外源性甘露糖來逆轉。Datema,R.等人，InterferenceWithGlycosylationOfGlycoproteins,BiochemJ1979;184:113-123。類似地，2mM甘露糖完全逆轉2-DG和2-FDM在SKBR3細胞中產生的毒性作用，表明這兩種甘露糖類似物通過幹擾N-聯糖基化來殺死這些細胞。Datema,R.等人，InterferenceWithGlycosylationOfGlycoproteins,BiochemJ1979;184:113-123.;Datema,R.等人，FormationOf2-Deoxyglucose-ContainingLipid-LinkedOligosaccharides,EurJBiochem1978;90:505-516;Datema,R.等人,Fluoro-GlucoseInhibitionOfProteinGlycosylationInVivo,EurJBiochem1980;109:331-341;Schmidt,M.F.G.等人,Nucleoside-diphosphateDerivativesOf2-Deoxy-D-GlucoseInAnimalCells,EurJBiochem1974;49:237-247;Schmidt，M.F.G.等人,MetabolismOf2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H]GlucoseAnd2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H]MannoseInYeastAndChick-EmbryoCells,EurJBiochem1978;87:55-68;McDowell,W.等人，MechanismOfInhibitionOfProteinGlycosylationByTheAntiviralSugarAnalogue2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose:InhibitionOfSynthesisOfMan(Gicnac)2PP-DoIByTheGuanosineDiphosphateEster,Biochemistry1985;24:8145-8152.雖然甘露糖是N-聯糖基化蛋白中的核心糖，但是它也能參與糖酵解路徑，這是因為其能夠被磷酸甘露糖異構酶轉化為果糖-6-磷酸。因此，甘露糖通過規避2-DG抑制的糖酵解步驟來逆轉2-DG在SKBR3細胞中產生的毒性作用仍然是可能的(圖7)。然而，這種可能性似乎很小，這是由於在低氧模型A和B中，2mM甘露糖不能逆轉由2-DG引起的生長抑制和細胞死亡(參見圖3C和3D)，儘管在模型C中，實際上細胞在低氧條件下生長，存在微小的恢復作用。這種微小的恢復作用可被解釋為(1)即使在低氧條件下，2-DG和2-FDM能干擾糖基化，和/或(2)甘露糖在模型C中逆轉對糖酵解的抑制，這是因為這些在0.5%低氧條件下的細胞仍然發生氧化磷酸化，儘管該磷酸化下降了。總之，在含氧量正常的條件下對2-DG和2-FDM敏感的細胞中，甘露糖逆轉這些糖類似物的毒性作用，但是在線粒體被關閉的細胞(模型A和B)中不產生逆轉作用，支持了幹擾糖基化而不是抑制糖酵解負責含氧量正常的低氧。當N-聯糖基化被抑制，蛋白質不能夠正確摺疊，並一皮保留在ER中。Ellgaard,L.等人,QualityControlInTheEndoplasmicReticulum,NatRevMolCellBiol2003;4:181-191;Parodi,AJ.,ProteinGlycosylationAndItsRoleInProteinFolding,A腿RevBiochem2000;69:69-93。未摺疊蛋白質的積聚導致細胞器膨脹以及蛋白質翻譯紊亂。在這種事件中，細胞啟動一種複雜但是保守的信號發送級聯，被稱作為未摺疊蛋白應答(UPR),在ER中重新建立動態平衡。三種ER跨膜蛋白將未摺疊蛋白質的信號轉換成核需要肌醇的酶1(IRE1);雙鏈RNA活化蛋白激酶(PERK),和活化轉錄因子6(ATF6)。Schroder,M.等人，ERStressAndUnfoldedProteinResponse,MutatRes2005;569:29-63。當未摺疊的蛋白質在ER中積聚時，分子伴侶葡萄糖調控蛋白78(Grp78/Bip)從這三種ER跨膜蛋白質中分離，從而激活它們。Pahl,H丄.，SignalTransductionFromTheEndoplasmicReticulumToTheCellNucleus,PhysiolRev1999;79:683-701。這引起大量的^i射變4b和分子改變，包括上調糖轉運蛋白，增加磷脂合成、胺基酸運輸和分子伴侶Grp78/Bip和Grp94的表達。Ma,Y.等人，TheUnfoldingTaleOfTheUnfoldedProteinResponse,Cell2001;107:827-830;Doerrler.W.T.,等人，RegulationOfDolicholPathwayInHumanFibroblastsByTheEndoplasmicReticulumUnfoldedProteinResponse,PNAS1999;96:13050-13055;Breckenridge,D.G.,等人,RegulationOfApoptosisByEndoplasmicReticulumPathways,Oncogene2003;22:8608-8618。2-DG和2-FDM上調在含氧量正常條件下生長的SKBR3細胞中的Grp78和Grp94的表達，這可以通過添加外源性甘露糖來逆轉，有力地支持了這些糖類似物幹擾N-聯糖基化，產生未摺疊的蛋白質，從而啟動UPR,此外，2-FDG是一種優於2-DG或2-FDM的糖酵解抑制劑，在引發UPR反應的效率方面也不同。對這些類似物的UPR反應大小似乎方文映了對糖基化的幹擾程度，這與證明在阻斷病毒衣殼蛋白的脂聯寡糖組裝的作用方面2-DG>2-FDM〉2-FDG的報導是相一致的。Datema,R.等人，Fluoro-GlucoseInhibitionOfProteinGlycosylationInVivo,EurJBiochem1980;109:331-341;Schmidt,M.F.G.等人，Nucleoside-diphosphateDerivativesOf2-Deoxy-D-GlucoseInAnimalCells,EurJBiochem1974;49:237-247;Schmidt,M.F.G.等人，MetabolismOf2-Deoxy-2-Fluoro-D-[3H]GlucoseAnd2誦Deoxy-2曙Fluoro-D-[3H]MannoseInYeastAndChick-EmbryoCells,EurJBiochem1978;87:55-68;McDowell,W.等人,MechanismOfInhibitionOfProteinGlycosylationByTheAntiviralSugarAnalogue2-Deoxy-2-Fluoro-D-Mannose:InhibitionOfSynthesisOfMan(Gicnac)2PP-DolByTheGuanosineDiphosphateEster,Biochemistry1985;24:8145-8152。此外，該UPR數據與細胞毒性結果是相一致的，細胞毒性結果類似地證明了在含氧量正常的條件下在抑制生長和殺死SKBR3細i包方面，2-DG〉2-FDM〉2-FDG。另一方面，在低氧模型A和B中，Grp78和Grp94不被2-DG上調，表明這些細胞死亡是通過抑制糖酵解而不是通過幹擾糖基化而實現的。解釋在這些^t型中不引發UPR的原因的一種可能作用機制與Grp78/Bip結合未摺疊的蛋白質從而活化UPR所需的ATP水平相關。與模型A和B形成對照，在模型C中引發了UPR(圖5B),其中ATP水平被2-DG降低得較少。此外，已知衣黴素並不顯著地影響ATP水平，在"低氧，，模型中，衣黴素並不上調分子伴侶，證明了這些細胞中的一種功能性UPR路徑。UPR非常類似於p53,當DNA損傷發出細胞周期停滯、活化DNA修復酶，並且取決於這些過程的結果，發出凋亡的信號。因此，如果UPR不能在內質網中重新建立動態平衡。ER應激特異性的凋亡路徑4皮激活。Breckenridge,D.G.等人,RegulationOfApoptosisByEndoplasmicReticulumPathways,Oncogene2003;22:8608-8618。在凋亡路徑的調節物中包括胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶12和CHOP/GADD154,增加的後者的活化被證明是優於其他的對ER誘導的哺乳動物凋亡路徑的指示。Obeng,E.A.等人,Caspase-12AndCaspase-4AreNotRequiredForCaspase-DependentEndoplasmicReticulumStress-InducedApoptosis,JBiolChem2005;280:29578-29587。因此，圖6證明了CHOP/GADD154的表達與2-DG和2-FDM在含氧量正常的條件下生長的SKBR3細胞中產生的毒性作用相關，支持了這些糖類似物是通過幹擾糖基化引起的ER應激而具有毒性作用。此外，通過添加甘露糖而不是葡萄糖逆轉CHOP/GADD154的誘導，進一步支持了2-DG和2-FDM是通過這種才幾制而產生毒性作用的。最基本的問題是為什麼當存在氧氣時，某些肺瘤細胞類型在用2-DG處理時死亡，而大部分腫瘤以及正常細胞未死亡。對該問題的一種回答來自遺傳試驗，其中在患有被描述為lb型碳水化合物缺陷糖蛋白綜合症患者中，磷酸甘露糖異構酶被缺失。Niehues,R.等人，Carbohydrate-DeficientGlycoproteinSyndromeTypeIb.,JClinInvest1998;101:1414-1420;Freeze,H.H.,HumanDisordersinN-glycosylationandAnimalModels,BiochimBiophysActa2002;1573:388-93。這種酶的缺失引起血清糖蛋白的次級糖基化，導致血栓症和特徵為蛋白質丟失性腸下垂的胃腸道紊亂。當將外源性甘露糖添加到這些患者的飲食中時，他們的血清糖蛋白恢復正常，症狀消失。Freeze,H.H.,SweetSolution:SugarstotheRescue,JCellBiol2002;158:615-616;Paneerselvam,K.等人,MannoseCorrectsAlteredN-glycosylationinCarbohydrate-DeficientGlycoproteinSyndromeFibroblasts,JClinInvest1996;97:1478-1487。這與本發明中的證明外源性甘露糖能夠拯救在含氧量正常的條件下用2-DG處理殺死的被選擇的肺瘤細胞的數據是相關的。可能這些類型的腫瘤細胞下調或者缺乏磷酸甘露糖異構酶，或者2-DG在這些肺瘤細胞中對該酶的作用大於大部分在含氧量正常條件下對2-DG處理具有抗性的其他細l包。然而，如圖7中所示，存在許多其他步驟，其中2-DG和2-FDM可能抑制與N-聯糖基化相關的甘露糖代謝。2-DG、2-CM和2-FDM(2-FM)通過幹擾會導致ER應激和凋亡的糖基化而殺死某些腫瘤類型。2-FDG不殺死這些細胞的發現排除了2-DG和2-FDM的毒性是由於抑制糖酵解和ATP耗盡引起的可能性。在處理被選實體腫瘤時，這些試劑可用作單一試劑治療(參見圖7)。實施例3如圖8和9中所示，多重MTT分析證明了高級神經膠質瘤細胞系和各種基於糖的糖酵解抑制劑的敏感性，並用圖表顯示。多種條件被採用，包括暴露於含氧量正常或低氧條件下及其對這些化合物的敏感性的影響。該結果顯示了對各種基於糖的糖酵解抑制劑的相對一致的敏感性(具有一些細微的差別)。對於低氧條件對敏感性的影響，一些細胞系.存在巧顯的差別。通常，大部分細胞系在低氧條件下生長對糖酵解抑制劑更為敏感，這將是可預期的。然而，一些細胞系完全忠於需氧的糖酵解表型(完全的"瓦爾堡效應，，)，、例如U87MG,其中乳酸含量(作為糖酵解的標記)在含氧量正常的條件下是最大的，並且在低氧條件下不會升高(參見下面的乳酸鹽數據)。由於經驗觀察表明在低氧條件下生長的細胞的生長速度較慢，細胞由此對能量的需求可能更低，在這種情況下，通過該經驗觀察來解釋敏感性的差異。圖8A顯示對在低氧(<1%氧氣)或含氧量正常的(20%氧氣)條件下用2-FG處理的U87人大腦腫瘤細胞系進行的MTT分析。圖8B和8C描述類似的試驗，但是基於糖的糖酵解抑制劑是不同的。在B組中使用2-DG,而在C組中使用2-FM。可以看出，U87表現出一種不平常的表型，其持久地利用糖酵解來滿足其代謝需要，因此，該細胞系在低氧條件下並不表現出對這些試劑的敏感性升高了。圖9給出存在2-FG或2-FM時的6天以上的生長曲線。該組圖證實了對U87細胞系生長的顯著抑制作用，其中2-FG似乎比2-FM略微有效些。B組和C組證明細l包系D-54在低氧和含氧量正常的條件下具有類似的生長抑制曲線。在該情形下，當細胞在低氧條件下生長時的效果明顯被提高，這與該特定細胞系在低氧條件下能夠刺激進一步的糖酵解代謝是相關的。實施例4圖10和11顯示了人U87MG惡性膠質瘤-星細胞瘤細胞系(U87)與D-54人神經膠質瘤細胞系在含氧量正常和低氧條件下暴露於2-DG時，在敏感性上的差異。在低氧條件下或在有氧條件下，U87MG細胞具有高的糖酵解速度(氧化糖酵解或者"瓦爾堡效應")，因此，當U87MG細胞在4氐氧條件下生長時，其對2-DG的每丈感性不會改變。另一方面，在有氧生長條件下，D54細胞部分地轉向糖酵解代謝，因此當在低氧條件下生長時，該細胞系對2-DG的敏感性較高。圖IO顯示了這兩種細胞系之間的顯著差異，並且U87相對不敏感，其更為突出。圖ll說明了U87和D54的這種表型差異背後的基本原理。該組圖證明D54誘導較多的糖酵解，而U87已經在最大限度地生產乳酸鹽水平。圖lO和ll中顯示的結果證明當用糖酵解抑制劑處理細胞系時，低氧的差別作用。高度依賴於糖酵解的細胞系(例如U87MG)對糖酵解抑制劑的敏感性最大，並且不需要在缺氧條件下來表現其敏感性。細胞系例如U87MG生產的乳酸的水平高且未變化證明了這一點，而D54在低氧條件下提高了其敏感性和乳酸水平。引人注目地，神經膠質瘤細胞系對含氧量低的條件的抗性十分高。從圖12中可以看出，在含氧量正常的條件下或完全低氧條件下(<1%)生長的細胞系能夠依賴糖酵解提供細胞所需的能量，並且繼續相當良好地生長。實施例5腫瘤攝取2-DG類似物2-氟18-葡萄糖(2-F18G)的證明。圖13證明了在常規的PET掃描研究中，在神經膠質瘤中過度地攝取2-F18G。對患有惡性膠質瘤多態型的患者進行PET掃描，結果證明在該肺瘤中顯著地攝取了2-FG。該組圖顯示了在給予了患者17mCi2-F"G後的CT無對照(A)、CT有對照(B)和CT登記的PET的掃描。該藥學現象提供了這些胂瘤獨特地適合基於糖的糖酵解抑制劑的戲劇性的證明。實施例6在小鼠中的人神經膠質瘤的處理。將小鼠的人神經膠質瘤細胞的同位異種移植物用單一的2-DG處理或者結合泰莫佐羅(temozolomide)(替莫唑胺)一起處理。這些動物提供了一種高級神經膠質瘤的同位異種移植模型。重複這些試驗三次，類似結果示於圖14中。在動物的顱骨內植入U87MG細胞，5天後用陰性對照(PBS)、陽性對照(替莫唑胺)、試-驗性單一試劑(2-DG)或者試^r性組合(2-DG+替莫唑胺)處理。圖12中所示的結果首次證明了2-DG對抗同位腫瘤模型的單一試劑功效。在三個連續的動物試驗中，各個組共有18隻小鼠，這些結果是重複的並且是相一致的(數據未顯示出)。這種特定的動物模型是非常嚴謹的，並且在存活率方面僅僅最中等的提高也曾經#:所研究的新藥物揭示。可以看出，2-DG與目前可用於大腦腫瘤的最好藥物替莫唑胺是等效的(參見參見陽性對照)。令人驚奇地，2-DG與替莫唑胺是等效的，並且其組合甚至優於單一劑量治療。2-DG被口服給予並且其耐受性非常好。2-DG和替莫唑胺的功能相當是重要的，這是因為替莫唑胺是目前用於治療大腦肺瘤的"金標準"。最後，這類試劑的單一試劑的功效也已經;故證明，它們獨特於這種疾病。這些結果證明抑制糖酵解提高動物的存活率，類似於所用的陽性對照替莫唑胺的作用。動物對這種治療劑的耐受性很高，並且沒有表現出毒性的跡象。最後，現在從一組相關的基於糖的糖酵解抑制中選擇化合物，用於先導候選選擇，所述選擇基於體外和體內的功效、藥物特性、化學穩定性和化學合成的成本。進行首位篩選時，進行更高級的試驗以及正式的動物毒物學測試。儘管已經詳細地提供和描述了本發明的特定具體實施方案，用於闡明本發明原則的應用，但是應當理解，在不偏離該原則時本發明可以被另外地具體化。權利要求1.一種治療惡性膠質瘤的方法，包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的己糖化合物。2.—種治療胰腺癌的方法，包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的己糖化合物。3.—種治療腫瘤增生的方法，包括給需要這種治療的受試者施用治療有凌丈量的2-FM。4.一種治療胰腺癌的方法，包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的甘露糖化合物。5.—種治療大腦癌症的方法，包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的甘露糖化合物。6.—種用於在患者中達到一種效果的方法，包括施用治療有效量的己糖化合物，其中所述效果選自由胰l^癌和神經月交質瘤組成的組。全文摘要通過給需要這種治療的受試者施用治療有效量的己糖化合物而提供了治療惡性膠質瘤和胰腺癌的方法。本發明包括治療大腦癌症和胰腺癌的方法，包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的甘露糖化合物。本發明還包括治療腫瘤增生的方法，包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的2-FM。文檔編號A61K31/70GK101426508SQ200780014205公開日2009年5月6日申請日期2007年2月26日優先權日2006年2月24日發明者C·康拉德,I·富克特,S·什曼斯基,S·蘇,T·J·蘭皮迪斯,W·普裡貝申請人:德克薩斯系統大學評議會