新的具有止血活性的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的製作方法

2023-06-08 03:15:46 1

專利名稱：新的具有止血活性的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥和蛋白質酶學領域。具體的講，其涉及一種從尖吻蝮蛇(Agkisdroton acutus)蛇毒中提取的一種具有止血活性的類凝血酶(Agacutin)的結構特徵，純化方法和醫藥領域方面的用途。該止血效應的類凝血酶(Agacutin)通過激活纖維蛋白原而加強凝血，同時因不激活II和XIII因子，不會引起血栓形成。在臨床前研究中得出了高效極低毒性效果。
背景知識 尖吻蝮蛇又稱五步蛇或蘄蛇，分布在華南各省。其蛇毒中的精氨酸酯酶活性較低，無神經毒和激肽釋放酶活性。在其組份中，有幾種以纖維蛋白原為底物的酶在體外能使人血漿或牛纖原凝結，但在體內卻引起各種不同的生理效應如降纖抗凝、血小板聚集、血管出血和止血等。F.Kornalic將以纖維蛋白原為底物的蛇毒酶按其作用方式不同分成三類I類是類凝血酶(Thrombin-likeenzyme)或凝血蛋白酶(Thrombic protease)，它僅分解纖維蛋白原的α鏈和/或β鏈的N端肽鏈，釋放A肽(α鏈)和/或B肽(β鏈)，使血液凝固。II類是纖維蛋白原裂解酶(Fibrinogenolytic enzyme)，它直接從纖維蛋白原三條肽鏈(α，β和γ)的C端水解，將纖原分解成碎片，血液不被凝固。III類是纖溶酶原激活酶(Enzyme activating plasminogen)，它是纖維蛋白溶解的間接或直接激活劑，它通過激活纖溶酶原產生纖溶酶，來裂解纖維蛋白或纖維蛋白原。本發明屬第I類。
尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的研究，最早是1967年的Cheng HC和Ouyang C等，他們於1971年和1972年相繼分離出兩個類凝血酶組份，並經動物實驗驗證，它們均有不同程度抗凝作用。肖昌華等從1988年起和管錦華等從1992年起，多次償試從尖吻蝮蛇蛇毒中分離使動物凝血時間縮短的組份，但都因無法提純，對其結構無法準確定性和定量，未成功。國外相似的產品有Hemocoagulase、Bothropase和Reptilase，Hemocoagulase它是Klobusitzky和Konig等1936年從Bothrops jararaca蛇毒中部分純化的一個局部和非胃腸使用的安全止血劑，Bothropase由米蘭Ravizzo公司從Bothrops jararaca蛇毒中提取，Reptilase由Basle Pentapharm公司從Bothrops atrox蛇毒中提取。這些產品僅有立止血(Reptilase)的品種在國內由深圳建安醫藥公司代理銷售。立止血療效確切，付作用小，臨床適應症廣，優於其它止血藥等特點，於1996年進入中國國家基本藥物目錄。
自從Reptilase進入中國以來，國內許多研究者都嘗試尋找過類似的止血成分，如中科院上海生化所戚正武曾申請國家863計劃，未找到。自1993年起，我們開始研究尖吻蝮蛇蛇毒中的類凝血酶組分。經三年的努力，在提取類凝血酶溶栓藥-降纖酶的同時，我們獲得了三個新的類凝血酶。以後的研究證實，其中之一具有止血活性，並取名Agacutin。目前由山東北大高科華泰製藥有限公司生產和遼寧諾康醫藥有限公司總代理的注射用巴曲亭(立止血的國內產品)和邦停(仿立止血)，於2001年被SFDA批准上市。


發明內容
1 本發明的類凝血酶(Agacutin)作用方式與Reptilase相似，它通過切除纖原分子中的酸性A肽，能使人血漿和牛纖維蛋白原在體外凝固，因不激活XIII和II因子，產生可溶性非交聯纖維蛋白單體，在傷口處，該單體與其它凝血因子相互作用加速止血效應，在完整血管內，該單體有幾分鐘半衰期，可迅速被纖溶酶降解清除。該類凝血酶(Agacutin)在體外使檸檬酸化血漿凝固，在體內可使出凝血時間顯著縮短，同時又不造成血栓形成，達到傷口部位的止血或預防出血之目的。
2本發明的目的是提供具有預防臨床手術出血、治療外傷出血及全身和局部止血效應的尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)，確定其準確的物理化學性質、結構特徵和藥學效果。
3本發明的目的是提供該尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)的兩條肽鏈的N端15個胺基酸殘基序列，用於與其它類凝血酶的結構區別。
4本發明的目的是提供該尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)的止血活性不受肝素的影響，故可發展成診斷試劑，用於臨床測定某些使用肝素患者的出、凝血時間。
5本發明的目的還在於提供純化具有止血效應的尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)的方法，尤其是純化工藝的全面布局和層析條件。
6一種具有防治出血的蛇毒類凝血酶(Agacutin)，用SDS-PAGE(T∶C＝12∶3.9)法測得其全分子量為31KDa，有相近兩個亞基組成，亞基分子量16Da和15Da(見圖2B)，該酶最適溫度為35℃(見圖4A))，最適pH7.5(見圖4B)，等電點為5.39(見圖5A&B)，根據文獻和我們的試驗結果證實，該類凝血酶(Agacutin)結構與立止血完全不同。
7用反相液相色譜法(C-18柱)測該類凝血酶(Agacutin)胺基酸組成為(％)Asp6.2，Thr1.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93和NH32.68(NH3的含量代表Gln和/或Asn的量)。
8該止血效應的蛇毒類凝血酶(Agacutin)的純化方法，包括尖吻蝮蛇蛇毒的溶解，Sephedex G75凝膠過濾，兩次DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換和透析構成。其特徵在於該蛇毒類凝血酶(Agacutin)採用DEAE-Sepharose FastFlow色譜填料進行快速純化，流速40ml/min，流動相A10mM磷酸鹽緩衝液(pH6.9)，B液為含有0.065M氯化鈉的A液，線性洗脫梯度0-0.065M的氯化鈉。
9具體製備該酶的方法是取驗證了的尖吻蝮蛇蛇毒，加緩衝液溶解後離心，取上清液上Sephadaex G-75層析柱(見圖1A)，活性峰上DEAE-Sepharose FastFlow層析柱(見圖1B)，DEAE-Sepharose FF活性峰經透析後再上第二次DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱(見圖2A)，收集活性峰，即為純品。
10純化後的類凝血酶(Agacutin)，用SDS-PAGE(T∶C＝12∶3.9)法測定的全分子量為31KD，有16KD和15KD兩條多肽鏈組成(見圖2B)。反相HPLC(C-4柱)(見圖3B)和正相HPLC測定為單一峰(見圖3A)，PAGE為單一帶(見圖3C)，在體外能使新鮮人血漿和牛纖原凝固。N端15個胺基酸殘基的測序結果A亞基DCSSGWSSYEEHQYY；B亞基DSSGWSSYEGHEYYV。
11 體內藥效學驗證純化後的尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)經紐西蘭白兔耳靜脈和臀部肌注注射，實驗採用三個劑量組
，結果均使全血凝固時間(表1)明顯縮短，並使藥效維持24小時。各實驗劑量組靜脈注射使血纖維蛋白原含量(表2)和血液粘度(表10)有不同程度的減少。對家兔凝血活酶時間(表3)、血小板數量(表4)和質量(表5&6)無明顯影響。對優球蛋白凝固時間(表7)無影響，而對優球蛋白溶解時間(表8)，大劑量可時其縮短，中小劑量無明顯影響。本品耳靜脈注射10分鐘內起效，30分鐘達高峰，試驗設立立止血陽性對照組和生理鹽水陰性對照組，不論肌注還是靜注，相同劑量的本品與立止血對照組比較，兩者藥效相近，但優於生理鹽水組對照組。實驗小鼠尾靜脈剪斷出血實驗(表9)，該品(0.5、1.0、2.0U/Kg)腹腔注射，各劑量組小鼠尾靜脈出血時間與生理鹽水組和立止血組相比，均有不同程度的縮短，其中0.5u/kg劑量組與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。
12常用適用途徑有肌肉注射，靜脈注射，可局部或全身使用等。
13藥效學見表1～8。
表1尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)對紐西蘭兔全血凝固時問的影響(

n＝7) *P＜0.05給藥前後的t檢驗 表2尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)紐西蘭白兔纖維蛋白原含量的影響(

n＝7) *P＜0.05，**P＜0.01給藥前後的t檢驗 表3尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)對紐西蘭白兔APTT的影響(

n＝7) *P＜0.05，**P＜0.01給藥前後的t檢驗 表4尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)對血小板數量的影響(

n＝7) *P＜0.05與生理鹽水組相比 表5尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)對血小板釋放活性的影響(

n＝7) 表6尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)對血小板體外聚集率的影響(

n＝7) *P＜0 05，**P＜0.01，***P＜0.001與生理鹽水組相比 表7尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)對優球蛋白凝固時間(ECT)的影響(

n＝7) **P＜0.01與生理鹽水組相比 表8尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)對優球蛋白溶解時間(ELT)的影響(

n＝7) *P＜0.05，**P＜0.01與生理鹽水組相比 表9尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)對小鼠剪尾出血時間的影響 **P＜0.01，與生理鹽水組相比 表10尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutin)對紐西蘭兔全血粘度(mPaS)的影響(

n＝7) *P＜0.05給藥前後的t檢驗


圖1A粗毒的SephadexG-75凝膠色譜分離。實驗條件4.5×100cm色譜柱、0.01M濃度的磷酸鹽緩衝液(pH6.9)洗脫液和6ml/min流速。B對SephadexG-75洗脫2號活性峰的第一次DEAE-Sepharose FF離子交換分離。實驗條件梯度杯2000ml×2、平衡緩衝液0.01M磷酸液緩衝液(pH6.9)、0-0.065M NaCI線性梯度(pH6.9)、3×20cm色譜柱和15ml/min流速。
圖2A第二次DEAE-Sepharose FF柱色譜。實驗條件重複第一次DEAE-Sepharose FF線性洗脫條件。B類凝學酶Agacutin的SDS-PAGE分析(T∶C＝12∶5.84)。Lane1和2∶10和20μg樣品，Lane3分子量標準蛋白(14.4-97.4kDa)。
圖3A類凝血酶(Agacutin)凝膠HPLC分析。實驗條件色譜柱(BIOSEPSEC-S2000，Pharmacia-LKB Co.，2.6×150mm)、0.2 M磷酸鹽緩衝液(pH6.9)和1ml/min流速。B類凝血酶(Agacutin)的反相HPLC分析。實驗條件C4柱(Hypersil C4，2.6×40mm)、1ml/min流速、0.1％三氟乙酸水溶液和乙晴梯度。C類凝血酶(Agacutin)的聚丙烯醯胺凝膠電泳分析(T∶C＝7.5∶5.84)。Lane1和2∶10和20μg樣品。
圖4A溫度-活性曲線。BpH-活性曲線。凝結實驗條件0.2ml人拘櫞酸化血漿+0.2mlAgacutin酶溶液(0.2U)，37℃保溫測活。
圖5類凝血酶(Agacutin)的等電聚焦電泳。A聚丙烯醯胺等電聚焦圖。Lane1標準等電點蛋白和Lane2Agacutin酶。BpH值與凝膠長度關係曲線。

具體實施例方式 1類凝血酶Agacutin.的純化和活性10g尖吻蝮蛇蛇毒乾粉(購自廣西醫科大學蛇毒研究所和昆明龍津藥業有限公司)溶解在80ml 0.01M磷酸鹽緩衝液中(pH 6.9)，6000rpm離心20min。上清液上Sephadex G-75凝膠柱(7×100cm層析柱)。洗脫用0.01M磷酸鹽緩衝液(pH6.9)。收集的有效峰上DEAE-SepharoseFast Flow柱色譜(3×20cm層析柱)，洗脫條件用含有0-0.065M NaCI的磷酸鹽緩衝液(pH6.9)洗脫，梯度杯2000ml×2。在有效峰經0.01M磷酸鹽緩衝液(pH6.9)透析24h後，透析樣再上DEAE-Sepharose FF柱，重複第一次DEAE-Sepharose FF柱色譜洗脫條件。將純化的樣品經Sephadex G-25柱脫鹽和凍幹後，實驗完成。純化過程見圖1A&B和2B。純度結果(見圖3A、B&C)凝膠正相和C-4反相HPLC為單一峰，PAGE電泳位但一條帶。每支含1單位類凝血酶(1單位的類凝血酶Agacutin是指在37℃保溫條件下，使0.2ml人新鮮血漿在60±5秒凝結的酶量)。每支成品含1單位Agacutin和1％位分子右旋糖苷(購自中檢所)。純化過程總結如下表 *中間體由於受其它類凝血酶活性的幹擾，其活性和比活無法獲得。
2結構特徵用以上製備工藝和活性的類凝血酶Agacutin測其亞基分子量(SDS-PAGE法)為16224Da和14736Da，全分子量30960Da；等點電5.39；最使溫度35℃；最適pH7.5-8.0。N端15個胺基酸殘基的測序A亞基DCSSGWSSYEEHQYY，B亞基DSSGWSSYEGHEYYV。實驗結果見圖2-5。
3體內藥效學研究用以上工藝和結構特徵的Agacutin製劑成品[1單位/瓶，凍乾粉劑，內含1％微分子右旋糖酐敷料(敷料由中國藥品鑑定所提供)]進行了紐西蘭白兔和小鼠體內進行了完整的藥學評估。陽性對照品立止血(Reptilase)，批號770604，市售，1單位/瓶，瑞士巴塞爾素高大藥廠生產。兩種凍乾粉針臨用前用滅菌注射用水注入瓶，輕輕振搖，速溶。小白鼠，17-22g，雌雄兼有；紐西蘭白兔，2-3kg體重，雌雄兼有，由南方醫科大學動物中心提供，由耳靜脈給藥，直接心臟取全血。實驗結果見表1-8。
權利要求
1.一種防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutin)，其特徵在於其全分子量31KD，有16KD和15KD兩條多肽鏈組成，等電點5.39。
2.根據權利要求1所述的止血類凝血酶，其特徵在於N端15個胺基酸殘基的測序A亞基DCSSGWSSYEEHQYY；B亞基DSSGWSSYEGHEYYV。
3.根據權利要求1和2所述的止血類凝血酶，其特徵在於胺基酸組成為(％)Asp6.2，Thr1.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93，NH22.68。
4.根據權利要求1和2所述的止血類凝血酶，其特徵在於在體外，促進人枸櫞酸化血漿凝固和能使牛纖維蛋白原凝固，在體內使凝血時間縮短。
5.一種防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的純化方法包括取驗證了的尖吻蝮蛇蛇毒，加緩衝液溶解後離心，取上清液上Sephdaex G-75層析柱，活性峰上DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，活性峰經透析後再上DEAE-SepharoseFast Flow層析柱，收集活性峰，即為純品。
6.包括權利要求5所述的該類凝血酶的純化方法，其特徵在於該蛇毒類凝血酶採用FPLC DEAE-Sepharose Fast Flow色譜填料進行純化，流速40ml/min。流動相A10mmol/L磷酸鹽緩衝液PH6.9，B液為含有0.065mol/L氯化鈉的A液。洗脫梯度呈線性0-0.065mol/L的氯化鈉。
7.根據權利要求1和2所述的止血類凝血酶，其特徵在於可預防臨床手術出血，治療外傷出血及全身和局部止血。
8.根據權利要求7所述的止血類凝血酶，其特徵在於不僅可肌肉注射，還可靜脈注射和靜脈滴注，不僅全身，還可局部使用。
9.根據權利要求1和7所述的止血類凝血酶，其特徵在於該酶分子對血液的凝固不受肝素的影響，故可以製成診斷試劑用於臨床上測定某些使用肝素患者的出凝血時間。
10.據權利要求7和8所述的止血類凝血酶，其特徵在於該酶分子可通過血腦屏障，治療顱出血。
全文摘要
本發明的類凝血酶涉及生物醫藥和酶學領域。具體地講，涉及一種從尖吻蝮蛇蛇毒中提取的、具有止血活性酶的結構特徵，純化方法和醫藥領域用途。該酶全分子量為31KD(SDS－PAGE法)，有相近兩個亞基16KD和15KD組成，其N端15個胺基酸殘基的測序A亞基DCSSGWSSYEEHQYY，B亞基DSSGWSSYEGHEYYV。HPLC為單峰。該酶最適溫度為35℃，最適pH 7.5，等電點為5.39。用酸水解測得該酶有18或20種胺基酸組成。血漿凝結試驗在60±5秒，同時可使纖原凝結。該酶在體內使全血凝固時間顯著縮短，不造成血栓形成，用於預防臨床手術出血、治療外傷出血、全身和局部止血及診斷某些臨床凝血時間。
文檔編號A61K38/48GK101092612SQ20061003604
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月22日 優先權日2006年6月22日
發明者唐松山 申請人:唐松山