含有人生長激素或人粒細胞巨噬細胞刺激因子的用於治療損傷和潰瘍的外用製劑的製作方法
2023-06-07 21:45:46 1
專利名稱：含有人生長激素或人粒細胞巨噬細胞刺激因子的用於治療損傷和潰瘍的外用製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種外用製劑，特別涉及含有重組人生長激素(rhGH)或重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子(rhGM-CSF)的外用製劑。本發明還涉及重組人生長激素(rhGH)或重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子(rhGM-CSF)在用於治療各種損傷和潰瘍的藥物製備中的用途。本發明特別涉及用於治療角膜損傷及角膜潰瘍的眼部外用製劑。
背景技術：
人生長激素(hGH)是人的腦垂體腺前葉嗜酸細胞分泌的一種非糖基化多肽激素。hGH有多種生物功能，如能影響糖、蛋白和脂肪代謝，對一些細胞的增殖、分化和DNA合成有直接影響，但主要功能是刺激身體生長，包括骨骼、肌肉、結締組織、毛髮和皮膚。重組人生長激素是一種親水性蛋白，它有兩種大小不同的分子，主要組分的分子量為22KDa，有191個胺基酸殘基，等電點為4.9，分子中有4個Cys殘基，組成兩對二硫鍵，分別連成大小不同的兩個肽環。另有5％～10％的生長激素分子量為20KDa，有176個胺基酸殘基，缺失22KDa重組人生長激素的32～46位15個胺基酸殘基。
近年來，由於應用基因工程技術可以大量地生產重組人生長激素，從而促進了對生長激素的研究並擴大了其臨床應用，使用的範圍從原來的只限於治療嚴重生長受阻的垂體性侏儒症兒童，發展到治療其它疾病。用生長激素治療疾病主要有以下幾個方面1)治療GH缺陷的兒童或伴隨有生長受阻的疾病有些疾病在治療過程中引起GH缺陷而影響生長，如患有腦瘤、顱咽管瘤和白血病的病人，受到顱側放射治療或整個軀體放射治療，引起GH缺乏而影響生長。用rhGH治療可使病人繼續生長，而未接受治療的兒童不能自發地恢復由於放射治療誘導的GH缺乏。對患有成神經細胞瘤的兒童，GH也是有效的生長刺激劑。
有些疾病引起生長受阻及其它症狀，但患者的GH水平並沒有明顯的不正常，給予GH可使症狀減輕。如特納綜合症、唐氏綜合症等。
2)代謝更改GH對脂肪、葡萄糖和蛋白代謝有特異性效應，因此對GH相對缺乏的兒童、成年人和老年人來說，GH能有效影響他們的各種代謝參數。
3)骨質疏鬆症GH能增加軟骨細胞的增殖，也能增加成骨細胞的增殖和活性，GH也通過增加鈣的腸道吸收來增強骨功能。
4)腎功能不良GH能增強腎功能和回復由於慢性腎衰竭引起的生長抑制。
5)生殖功能障礙GH是許多促性腺激素的受納因子，說明GH能用於治療男性或女性不孕症。
6)治療燒傷病人近年來，由於GH具有間接地促進生長和直接地增強代謝、增加機體細胞和體液免疫以及降低應激反應的作用，而被廣泛地用於治療臨床燒傷病人和提高術後病人的免疫力以及加速傷口癒合。
粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是由骨髓分化而成、並可由骨髓前體細胞分離得到，其生物學功能為刺激巨噬細胞和粒細胞形成集落。GM-CSF也可刺激成熟巨噬細胞、嗜酸性白細胞和嗜中性白細胞而誘導各種功能活性。GM-CSF是酸性蛋白，與GM-CSF敏感細胞的受體有很高的親合性。
GM-CSF是活化的T細胞、B細胞、巨噬細胞、肥大細胞、內皮細胞及成纖維細胞等細胞產生並分泌的一種酸性蛋白。成熟的rhGM-CSF由127個胺基酸組成，是含144個胺基酸的蛋白前體切去17個胺基酸的信號肽後所得的蛋白質，相對分子量為147000Da，生物活性不受糖基化的影響。
近年來，由於應用基因工程技術可以大量地生產出rhGM-CSF從而促進了對rhGM-CSF的研究並擴大了其臨床應用，它是眾多細胞因子中最為臨床研究者所熟悉、且已正式投放市場的一種產品。GM-CSF最基本作用是刺激粒系造學祖細胞向粒細胞、巨噬細胞增殖分化，並逐漸成熟為具有吞噬功能的細胞。然而其臨床應用並非如此單一，而是非常廣泛，並涉及到很多領域。
目前，rhGM-CSF的臨床應用現狀主要包括以下幾個方面(1)rhGM-CSF在腫瘤性疾病治療中的應用1)實體腫瘤性疾病臨床上，多數腫瘤化療藥物隨劑量增加會增加對骨髓造血功能的毒性作用，導致中型粒細胞減少，增加感染機會。研究者證明在化療後加用GM-CSF，則可縮短中性粒細胞減少的時間，降低感染率；同時，GM-CSF在腫瘤治療方面可以誘導並增強外周血單核-巨噬細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。
2)白血病GM-CSF有促使白細胞祖細胞更多地進入細胞周期的作用，可縮短化療患者中性粒細胞減少期的持續時間，增加化療藥物對白血病細胞的殺滅作用，減少發熱和感染併發症。
3)再生障礙性貧血在再生障礙性貧血治療中使用GM-CSF，可是病人感染率降低50％左右。
(2)GM-CSF在骨髓移植中的應用GM-CSF能加速造血功能恢復，明顯加速WBC、PMN的恢復，降低感染率、減少抗生素輸注次數而縮短住院時間；同時，還可通過應用rhGM-CSF等細胞因子來調節和促進正常造血幹細胞的生長。
(3)GM-CSF在抗感染治療中的作用由於GM-CSF有刺激粒系造學祖細胞向粒細胞、巨噬細胞增殖分化，並逐漸成熟為具有吞噬功能細胞的功能，因此臨床上可以協同治療感染性疾病；另外，在愛滋病患者的菌血症及感染擴散過程中(分枝桿菌侵入到單核巨噬細胞內)，使用GM-CS能夠激活被感染了的巨噬細胞，進而抑制或殺滅細胞內的分枝桿菌，可協同抗生素治療效果。
基於GM-CSF大量的基礎及臨床研究結果，GM-CSF在下述幾方面將具有良好的臨床應用前景(1)GM-CSF有促進傷口癒合的作用動物實驗表明，GM-CSF能夠誘導纖維母細胞增殖以及典型肌原細胞的形成；活化中性粒細胞和單核/巨噬細胞、促進內皮細胞有絲分裂和遷移、促進角化細胞的增殖並調節纖維母細胞的表達。因此，在促進傷口癒合過程中起著非常重要的作用。
(2)根據GM-CSF對細胞周期與化療周期中的作用特點應用本細胞因子。
利用GM-CSF對造血系統各個生長發育水平細胞均有作用這一特點，在各個化療周期中選擇合適時間，聯合應用GM-CSF，則可大大減少化療毒性而增強化療療效。
(3)GM-CSF的免疫增效作用眾多實驗表明，GM-CSF是一種非常有效的免疫佐劑，它可通過全身作用、區域性應用、局部應用、融合蛋白及體外活化抗原表達細胞等五種方式來增強機體對疫苗(抗原)的免疫應答，增強機體對疾病的免疫抵抗能力。
由於GH和GM-CSF理化性質的特殊性，如易於在腸道中分解，目前在臨床治療中均以注射液的方式使用。到目前為止，還沒有將rhGH和rhGM製成外用製劑用於治療各種損傷和潰瘍，特別是在角膜損傷及角膜潰瘍中的應用未見報導。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種外用製劑，該製劑含有重組人生長激素或重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子，和外用製劑輔料。
本發明的另一個目的是提供所述外用製劑的製備方法。
本發明的再一個目的是提供重組人生長激素(rhGH)及重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子(rhGM-CSF)在用於治療各種損傷和/或潰瘍，特別是角膜損傷和/或潰瘍的藥物中的用途。
圖1為外用rhGH與陽性和陰性對照組在治療角膜潰瘍的不同時間的觀察結果。
圖2為外用rhGM-CSF與陽性和陰性對照組在治療角膜潰瘍的不同時間的觀察結果。
具體實施例方式
在本發明的外用製劑中，以外用製劑總重量的百分比計，所述外用製劑含有0.015-0.35％，優選0.035-0.25％，更優選0.07-0.14％的生長激素或0.0003-0.002％，優選0.0005-0.0015％，更優選0.0008-0.0012％的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子。
所述的外用製劑的單位製劑中，rhGH的濃度為150-3500μg/g基質，優選為350-3000μg/g基質，更優選為700-1400μg/g基質；或所述rhGM-CSF的濃度為3-20μg/g基質，優選為5-15μg/g基質，更優選為8-12μg/g基質。
本發明的外用製劑可以為眼用滴眼液、眼用凝膠劑或眼用膏劑。
對於所述眼用滴眼液來說，以製劑總重量的百分比計，其含有0.015-0.35％的生長激素或0.0003-0.002％的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子，0.1-約40％的製劑輔料，和餘量的無菌注射用水。
對於所述眼用凝膠劑或眼用膏劑來說，以製劑總重量的百分比計，其含有0.015-0.35％的生長激素或0.0003-0.002％的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子，30-90％的增稠劑，0.1-約40％的除增稠劑以外的製劑輔料，和餘量的無菌注射用水。
本發明的外用製劑中，作為基質成分的用於凝膠劑的所述增稠劑為選自聚乙烯醇、聚維酮、纖維素衍生物、甲基纖維素、羥丙甲纖維素、羥乙纖維素、羥丙纖維素、羧甲基纖維素、卡波姆、西黃蓍膠、透明質酸鈉、明膠、澱粉、丙二醇、甘油、黃原膠、殼聚糖類、海藻酸鈉、磷脂、泊洛沙姆、液體石蠟、凡士林、羧甲基纖維素鈉、羊毛脂、聚山梨脂、聚氧乙烯、脂肪油、膠體矽、鋁皂或鋅皂的物質。
作為基質成分用於膏劑的所述增稠劑為選自豚脂、植物油、氫化植物油、硫酸化氫化蓖麻油、凡士林、石蠟、地蠟、液體石蠟、羊毛脂、羊毛醇、蜂蠟、白蜂蠟、鯨蠟、膽固醇、一價皂、鯨蠟醇、硬脂醇、十二烷基硫酸鈉、十八烷基硫酸鈉、甘油單硬脂酸酯、聚甘油硬脂酸酯、吐溫-20、21、40、60、61、65、80、81、85、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯的物質、甘油明膠、澱粉甘油、海藻酸鈉、聚乙二醇、甲基纖維素、羥甲基纖維素鈉。
所述製劑輔料以製劑總重量的百分比計，包括0.1-10％的等滲調節劑，0-5％的蛋白穩定劑，0.5-5％的pH調節劑，0-30％的保溼劑，0-0.2％的防腐劑和0-2％的抗氧化劑。
所述製劑輔料為選自甘露醇、甘油、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、人血白蛋白、環糊精、丙二醇、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、甲醛合次硫酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、硼酸、硼酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、馬來酸、馬來酸鈉、組氨酸、三乙醇胺、氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨酸、山梨酸鉀、苯乙醇、苯氧乙醇、三氯叔丁醇、溴化苯甲烴銨(新潔爾滅)、杜滅芬、雙氯苯雙胍已烷、硝酸苯汞、硫柳汞、對羥基苯甲酸酯類的物質。其中的多種物質可同時作為所述製劑輔料中的等滲調節劑、蛋白穩定劑、pH調節劑、保溼劑、和抗氧化劑。例如，甘油可同時作為等滲調節劑、蛋白穩定劑和保溼劑使用，甘露醇可同時作為等滲調節劑和蛋白穩定劑使用等。
本發明的外用滴眼液的製備方法包括基於組合物總重量的百分比，在含有0.015-0.35％的生長激素或0.0003-0.002％的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的溶液中，加入根據需要的0.1-40％的製劑輔料，然後加入無菌注射用水至定量，混合均勻後進行除菌處理，例如用濾膜除菌。
本發明的外用凝膠劑或膏劑的製備方法包括基於組合物總重量的百分比，將30-90％的作為基質的增稠劑熔融或溶漲，根據需要將0.1-40％的製劑輔料加至熔融或溶漲的基質中，並加入無菌注射用水，混合均勻後進行除菌處理，例如經高壓溼滅或濾膜除菌，待冷卻至常溫後，加入經過濾膜除菌的含0-5％的蛋白穩定劑和0.015-0.35％的rhGH或0.0003-0.002％的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水補足餘量，混合均勻，冷卻，罐裝。
本發明的重組人生長激素(rhGH)及重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子(rhGM-CSF)可用於治療各種皮膚損傷和/或潰瘍，特別是角膜外傷或角膜潰瘍，如包括穿孔傷或擦傷的角膜外傷及角膜潰瘍等。
本發明的製劑可與其它具有協同治療作用的藥劑合用，如具有促進上皮與基質粘附作用的藥物、抗生素或人工淚液等。具體藥劑如地塞米松、氟米龍滴眼液、泰利必妥滴眼液、阿託品滴眼液、人工淚液等。
為了更好地理解本發明的實質，下面用重組人生長激素和重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子外用製劑在治療角膜外傷、角膜潰瘍以及皮膚潰瘍的藥效學試驗來說明其在製藥領域中的用途。由於眼用製劑是外用製劑中要求標準最高的製劑，因此，本發明以眼用製劑來舉例說明，但本發明的外用製劑絕不僅限於眼用製劑。對於其它的外用製劑，本領域的技術人員可以根據常規技術進行配製。
在本發明的外用製劑中，所述rhGH或rhGM-CSF是長春金賽藥業有限責任公司通過基因工程技術生產上市的安全的rhGH和rhGM-CSF，其商品名分別為賽增和金磊賽源。其各項物化指標完全符合《中華人民共和國藥典》(2005年版)中的各項規定。
下面用實施例的方式來具體地說明和解釋本發明。
滴眼液實施例1向含有200mg的rhGH或2.5mg的rhGM-CSF的20ml水溶液中加入1g白蛋白，再加入1g甘露醇及2g甘油，用5％的檸檬酸水溶液調pH至6.5，加入無菌注射用水至100ml定容，混勻後過0.2μm的濾膜除菌後，製成rhGH滴眼液或rhGM-CSF滴眼液。
實施例2向含有150mg的rhGH或1.2mg的rhGM-CSF的20ml水溶液中加入0.5g葡聚糖，再加入0.5g甘露醇及5g甘油，用10％的硼酸水溶液調pH至6.5，加入無菌注射用水至100ml定容，混勻後過0.2μm的濾膜除菌後，製成rhGH滴眼液或rhGM-CSF滴眼液。
眼用凝膠劑實施例3在稱量過的容器內高速攪拌下加入0.3g卡波姆934、0.05g山梨酸鉀、0.1g泊洛沙姆和70ml的水，用1N的氫氧化鈉水溶液調節pH值至5.5，在115℃滅菌20分鐘，待冷卻至室溫時加入除菌後的含0.5g白蛋白和75mg的rhGH溶液或含0.5g白蛋白和0.5mg的rhGM-CSF的溶液，加入無菌注射用水定容至100ml，攪拌均勻後分裝待用，製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例4在稱量過的容器內加入1g羧甲基纖維素鈉、0.15g山梨酸、0.2g吐溫-80和70ml的水，溶脹過夜後，在115℃滅菌20分鐘，待冷卻至室溫時加入已除菌的含1g葡聚糖和70mg的rhGH溶液或含1g葡聚糖和3mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水定容至100ml，攪拌均勻後分裝待用，製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例5在稱量過的容器內攪拌下加入1g甲基纖維素、0.1g泊洛沙姆和70ml的水，溶脹過夜，在115℃滅菌20分鐘，待冷卻至室溫時加入已除菌的含0.5g白蛋白和35mg的rhGH溶液或含0.5g白蛋白和0.75mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水定容至100ml，攪拌均勻後分裝待用，製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例6在稱量過的容器內攪拌下加入0.8g羥丙基甲基纖維素鈉、0.2g吐溫-80和70ml的水，加熱溶脹均勻，在115℃滅菌20分鐘，待冷卻至室溫時加入已除菌的含2g白蛋白和含350mg的rhGH溶液或含2g白蛋白和2.0mg的rhGM-CSF的蛋白溶液，加入無菌注射用水定容至100ml，攪拌均勻後分裝待用，製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例7在稱量過的容器內攪拌下加入0.1g透明質酸鈉、0.1g泊洛沙姆和70ml的水，溶脹過夜，用0.2μm濾膜過濾除菌後，加入已除菌的含0.5g白蛋白及125mg的rhGH溶液或含0.5g白蛋白和1mg的rhGM-CSF的蛋白溶液，加入無菌注射定容至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例8在稱量過的容器內攪拌下加入1g西黃蓍膠、0.10g山梨酸、0.1g泊洛沙姆、2g甘油和70ml的水，溶脹過夜，在115℃滅菌20分鐘，待冷卻至室溫時加入已除菌的含1.5g白蛋白和175mg的rhGH溶液或含1.5g白蛋白和1.25mg的rhGM-CSF的蛋白溶液，加入無菌注射定容至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例9在稱量過的容器內攪拌下加入1.5g海藻酸鈉、0.15g山梨酸、0.1g泊洛沙姆和70ml的水，溶脹過夜，在115℃滅菌20分鐘，待冷卻至室溫時加入已除菌的含2g葡聚糖及250mg的rhGH溶液或含2g葡聚糖和1.75mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例10在稱量過的容器內攪拌下加入0.2g透明質酸鈉、0.1g泊洛沙姆188、0.75g組氨酸和70ml的水，溶脹過夜，用0.2μm濾膜過濾除菌後，加入已除菌的含130mg的rhGH溶液或含1mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例11在稱量過的容器內攪拌下加入0.1g透明質酸鈉、0.1g泊洛沙姆188、0.03g尼泊金乙酯、0.6g組氨酸和70ml的水，溶脹過夜，用0.2μm濾膜過濾除菌後，加入已除菌的含65mg的rhGH溶液或含0.5mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例12在稱量過的容器內攪拌下加入0.4g透明質酸鈉、0.1g泊洛沙姆188、4.5g甘露醇、0.7g硼酸和70ml的水，溶脹過夜，在115℃滅菌20分鐘，待冷卻至室溫時加入已除菌的含15mg的rhGH溶液或含0.03mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例13在稱量過的容器內攪拌下加入0.25g透明質酸鈉、0.15g泊洛沙姆188、3.0g甘露醇、0.02g尼泊金乙酯、1.0g檸檬酸和70ml的水，溶脹過夜，在115℃滅菌20分鐘，待冷卻至室溫時加入已除菌的含350mg的rhGH溶液或含2mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
實施例14在稱量過的容器內攪拌下加入0.2g透明質酸鈉、0.1g泊洛沙姆188、0.70g組氨酸和70ml的水，溶脹過夜，用0.2μm濾膜過濾除菌後，加入已除菌的含150mg的rhGH溶液或含1.2mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用凝膠劑或rhGM-CSF眼用凝膠劑。
眼用軟膏實施例15在稱量過的容器內加入60g的液體石臘、20g的凡士林、0.1g泊洛沙姆、0.15g山梨酸，加熱至60℃，使其溶解，將混合後的基質在121℃滅菌30分鐘，溫度降至40℃時加入已除菌的含1g白蛋白及200mg的rhGH溶液或含1g白蛋白和1.5mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用膏劑或rhGM-CSF眼用膏劑。
實施例16在稱量過的容器內加入70g的黃凡士林、10g的液體石蠟、0.1g泊洛沙姆、0.15g山梨酸，加熱至60℃，使其溶解，將混合後的基質在121℃滅菌30分鐘，溫度降至40℃時加入已除菌的含0.5g白蛋白及30mg的rhGH溶液或含0.5g白蛋白和0.3mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用膏劑或rhGM-CSF眼用膏劑。
實施例17在稱量過的容器內加入60g的凡士林、10g的羊毛脂、10g液體石蠟、0.15g山梨酸，加熱至60℃，使其溶解，將混合後的基質在121℃滅菌30分鐘，溫度降至40℃時加入已除菌的含1.5g白蛋白及250mg的rhGH溶液或含1.5g白蛋白和1.25mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用膏劑或rhGM-CSF眼用膏劑。
實施例18在稱量過的容器內加入60g的聚乙二醇400、20g的硬脂醇、0.1g泊洛沙姆、0.15g山梨酸，加熱至60℃，使其溶解，將混合後的基質在121℃滅菌30分鐘，溫度降至40℃時加入已除菌的含1g白蛋白及150mg的rhGH溶液或含1g白蛋白和1mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用膏劑或rhGM-CSF眼用膏劑。
實施例19在稱量過的容器內加入60g的氫化植物油、15g的石蠟油、8g的蓖麻油、0.15g山梨酸，加熱至60℃，使其溶解，將混合後的基質在121℃滅菌30分鐘，溫度降至40℃時加入已除菌的含1g白蛋白及100mg的rhGH溶液或含1g白蛋白和0.75mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用膏劑或rhGM-CSF眼用膏劑。
實施例20在稱量過的容器內加入13.5g的鯨蠟醇、10g的羊毛脂、10g的凡士林、20g液體石蠟、0.15g山梨酸，加熱至60℃，使其溶解，將混合後的基質在121℃滅菌30分鐘，溫度降至40℃時加入已除菌的含0.75g白蛋白及75mg的rhGH溶液或含0.75g白蛋白和0.55mg的rhGM-CSF溶液，加入無菌注射用水至100ml，攪拌均勻後分裝待用，分別製成rhGH眼用膏劑或rhGM-CSF眼用膏劑。
外用rhGH及rhGM-CSF對角膜損傷及角膜潰瘍的治療作用1、實驗方法(1)兔無菌角膜潰瘍動物模型的製作採用氯胺酮0.5ml/Kg+安定0.5ml/Kg肌肉注射麻醉兔。在無菌條件下，使用顯微器械在顯微鏡下操作。將家兔的右眼角膜中央用5mm環鑽製作成大小為5mm、深度為0.1mm(約1/3角膜厚度)的無菌性穿孔傷及角膜潰瘍。術畢點用託百士。
(2)動物分組將64隻紐西蘭大白兔(體重2.0-2.5Kg)隨機分成8組，每組8隻。第一組為生理鹽水組，第二組為陽性對照藥(貝復舒)組，第三組為實施例1的rhGH滴眼液組，第四組為實施例2的rhGM-CSF滴眼液組，第五組為實施例14的rhGH凝膠劑組，第六組為實施例7的rhGM-CSF凝膠劑組，第七組為實施例18的rhGH軟膏劑組，第八組為實施例15的rhGM-CSF軟膏劑組。
(3)術後點藥術後當天8組48隻兔點用託百士3次。自術後第一天開始分別點用如上述製備的rhGH或rhGM-CSF滴眼液、凝膠劑及膏劑，並用0.9％的生理鹽水和貝復舒分別作為陰性和陽性對照，具體給藥方法如下第一組0.9％生理鹽水 每日3次+託百士每日3次第二組貝復舒 每日3次+託百士每日3次第三組rhGH滴眼液 每日3次+託百士每日3次第四組rhGM-CSF滴眼液 每日3次+託百士每日3次第五組rhGH凝膠劑 每日3次+託百士每日3次第六組rhGM-CSF凝膠劑 每日3次+託百士每日3次第七組rhGH膏劑 每日3次+託百士每日3次第八組rhGM-CSF膏劑 每日3次+託百士每日3次觀察記錄8組64隻兔角膜潰瘍在術後第3、7、10、14、18、21和28天的癒合情況，結果見附圖1。
(4)觀察及照相記錄術後第3天、第7天、第10天、第14天、第18天、第21天和第28天、觀察記錄8組64隻兔角膜潰瘍癒合情況，包括角膜潰瘍面大小變化、有無感染及穿孔。每組選取2隻兔使用TOPCON裂隙燈照相系統記錄在柯達膠片上，掃描入計算機，備圖像分析使用。
2、實驗結果3.1癒合標準(1)基本癒合無明顯潰瘍面、僅有上皮粗糙或點狀著染。(2)完全癒合無潰瘍面、無上皮粗糙無點狀著染。
3.2觀察結果8組64隻眼無1例感染。兔角膜潰瘍面寬和高的測量記錄見表1、圖1和2。
表1.外用rhGH及rhGM-CSF與陽性和陰性對照組治療角膜潰瘍的不同時間的觀察結果
續表1
第一組從第7天開始角膜潰瘍面積逐漸減小；第18天1隻眼基本癒合；第21天4隻眼基本癒合；至第28天實驗結束時4隻眼基本癒合，4隻眼完全癒合。
第二組從第3天開始角膜潰瘍面積逐漸減小；第14天1隻眼基本癒合；第18天3隻眼基本癒合；第21天3隻眼基本癒合，2隻眼完全癒合，至第28天實驗結束時2隻眼基本癒合，6隻眼完全癒合。
第三組從第3天開始角膜潰瘍面積明顯減小；第7天1隻眼基本癒合；第10天2隻眼基本癒合；第14天3隻眼基本癒合，5隻眼完全癒合；第18天1隻眼基本癒合，7隻眼完全癒合；第21天2隻眼基本癒合，6隻眼完全癒合；至第28天實驗結束時8隻眼完全癒合。
第四組從第3天開始角膜潰瘍面積逐漸減小；第7天1隻眼基本癒合；第10天1隻眼基本癒合；第14天3隻眼基本癒合，1隻眼完全癒合；第18天4隻眼基本癒合，2隻眼完全癒合；第21天6隻眼基本癒合，2隻眼完全癒合；至第28天實驗結束時5隻眼基本癒合，3隻眼完全癒合。
第五組從第3天開始角膜潰瘍面積明顯減小；第7天3隻眼基本癒合；第10天3隻眼基本癒合，2隻眼完全癒合；第14天2隻眼基本癒合，6隻眼完全癒合；第18天6隻眼完全癒合；第21天1隻眼基本癒合，7隻眼完全癒合；至第28天實驗結束時8隻眼完全癒合。
第六組從第3天開始角膜潰瘍面積逐漸減小；第7天2隻眼基本癒合；第10天4隻眼基本癒合；第14天3隻眼基本癒合，1隻眼完全癒合；第18天6隻眼基本癒合，2隻眼完全癒合；第21天4隻眼基本癒合，4隻眼完全癒合；至第28天實驗結束時1隻眼基本癒合，7隻眼完全癒合。
第七組從第3天開始角膜潰瘍面積明顯減小；第7天2隻眼基本癒合；第10天2隻眼基本癒合，2隻眼完全癒合；第14天2隻眼基本癒合，6隻眼完全癒合；第18天1隻眼基本癒合，7隻眼完全癒合；第21天8隻眼完全癒合；至第28天實驗結束時8隻眼完全癒合。
第八組從第3天開始角膜潰瘍面積逐漸減小；第10天3隻眼基本癒合；第14天2隻眼基本癒合，3隻眼完全癒合；第18天4隻眼基本癒合，4隻眼完全癒合；第21天3隻眼基本癒合，5隻眼完全癒合；至第28天實驗結束時2隻眼基本癒合，6隻眼完全癒合。
3、實驗結論本實驗將其應用於兔無菌性角膜潰瘍的動物模型中，採用局部點藥的方法，觀察其對兔淺層角膜潰瘍的治療效果。從實驗結果可以看出無論rhGH還是rhGM-CSF對角膜淺基質和上皮的修復都有明顯的促進作用，具體得出以下結論3.1 rhGH(滴眼液、凝膠劑、膏劑)、rhGM-CSF(滴眼液、凝膠劑、膏劑)及貝復舒(陽性對照藥)與陰性對照組相比，明顯縮短了潰瘍的癒合時間，潰瘍面積平均值與陰性對照組相比存在顯著性差異。由此可見，rhGH與rhGM在治療無菌性角膜潰瘍中有良好的應用前景。
3.2 rhGH(滴眼液、凝膠劑、膏劑)在促進潰瘍癒合和抑制潰瘍復發中作用優於有確定療效的貝復舒陽性對照組，潰瘍面積平均值存在顯著性差異。rhGM-CSF(滴眼液、凝膠劑、膏劑)組與貝復舒陽性對照組相比對無菌角膜潰瘍的癒合具有相似的療效，潰瘍面積平均值無顯著性差異。
3.3 rhGH與rhGM-CSF的外用製劑(滴眼液、凝膠劑、膏劑)在促進潰瘍癒合作用過程中，其凝膠劑與膏劑比液體製劑療效稍佳，但在統計學上無顯著性差異。
3.4在實驗觀察過程中，個別實驗組中的個別實驗兔在潰瘍癒合過程中出現了反覆，即潰瘍在癒合後或面積減小後又出現上皮缺損或潰瘍面積擴大的表現。這與兔角膜淺層潰瘍癒合的病理過程有關。研究發現正常角膜上皮與基質的粘附作用對維持角膜表面的完整性有十分重要的意義，其中基底膜複合結構對維持這種緊密粘附起主要作用。當角膜上皮連同基底膜和淺層基質被去除後，雖然上皮層可以在4天內很快覆蓋潰瘍表面，但在8周或更長的時間內都不能與下方基質形成緊密連接，因此當受到輕微的外傷或摩擦時就可以導致上皮再次剝脫。因此上皮與基質間粘附形成的延遲是造成角膜潰瘍復發的原因。提示在治療角膜淺層潰瘍時聯合使用促進上皮與基質粘附形成的藥物將會有效防止復發。
外用rhGH及rhGM-CSF對皮膚潰瘍的療效將男性22例，女性26例，年齡在10-42歲的口腔潰瘍患者48例隨機分成兩組，分別用含有800μg/ml rhGH的膏劑+含有3mg/ml的地塞米松的糊劑和單獨使用含有3mg/ml的地塞米松的糊劑作為對照，患者持續用藥3天每天3次。結果列於表2中。
表2
由表2的結果可以看出，通過結合使用生長激素和地塞米松，可以加快創面的癒合。
權利要求
1.一種外用製劑，該製劑含有重組人生長激素或重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子，和外用製劑輔料。
2.如權利要求1所述的外用製劑，其中以外用製劑總重量的百分比計，所述外用製劑含有0.015-0.35％的生長激素或0.0003-0.002％的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子。
3.如權利要求1或2所述的外用製劑，其中單位製劑中的rhGH的濃度為150-3500μg/g基質，優選為350-3000μg/g基質，更優選為700-1400μg/g基質；或所述rhGM-CSF的濃度為3-20μg/g基質，優選為5-15μg/g基質，更優選為8-12μg/g基質。
4.如權利要求1或2所述的外用製劑，該外用製劑為眼用滴眼液、眼用凝膠劑或眼用膏劑。
5.如權利要求4所述的外用製劑，其中以製劑總重量的百分比計，所述眼用滴眼液含有0.015-0.35％的生長激素或0.0003-0.002％的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子，0.1-40％的製劑輔料，和餘量的無菌注射用水。
6.如權利要求4所述的外用製劑，其中以製劑總重量的百分比計，所述眼用凝膠劑或眼用膏劑含有0.015-0.35％的生長激素或0.0003-0.002％的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子，30-90％的增稠劑，0.1-40％的除增稠劑以外的製劑輔料，和餘量的無菌注射用水。
7.如權利要求6所述的外用製劑，其中作為基質成分用於凝膠劑的所述增稠劑為選自聚乙烯醇、聚維酮、纖維素衍生物、甲基纖維素、羥丙甲纖維素、羥乙纖維素、羥丙纖維素、羧甲基纖維素、卡波姆、西黃蓍膠、透明質酸鈉、明膠、澱粉、丙二醇、甘油、黃原膠、殼聚糖類、海藻酸鈉、磷脂、泊洛沙姆、液體石蠟、凡士林、羧甲基纖維素鈉、羊毛脂、聚山梨脂、聚氧乙烯、脂肪油、膠體矽、鋁皂或鋅皂的物質。
8.如權利要求6所述的外用製劑，其中作為基質成分用於膏劑的所述增稠劑為選自豚脂、植物油、氫化植物油、硫酸化氫化蓖麻油、凡士林、石蠟、地蠟、液體石蠟、羊毛脂、羊毛醇、蜂蠟、白蜂蠟、鯨蠟、膽固醇、一價皂、鯨蠟醇、硬脂醇、十二烷基硫酸鈉、十八烷基硫酸鈉、甘油單硬脂酸酯、聚甘油硬脂酸酯、吐溫-20、21、40、60、61、65、80、81、85、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯的物質、甘油明膠、澱粉甘油、海藻酸鈉、聚乙二醇、甲基纖維素或羥甲基纖維素鈉的物質。
9.如權利要求5或6所述的外用製劑，其中所述製劑輔料包括以製劑總重量計，0.1-10％的等滲調節劑、0-5％的蛋白穩定劑、0.5-5％的pH調節劑、0-30％的保溼劑、0-0.2％的防腐劑和0-2％的抗氧劑。
10.如權利要求8所述的外用製劑，其中所述製劑輔料選自甘露醇、甘油、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、人血白蛋白、環糊精、丙二醇、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、甲醛合次硫酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、硼酸、硼酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、馬來酸、馬來酸鈉、組氨酸、三乙醇胺、氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨酸、山梨酸鉀、苯乙醇、苯氧乙醇、三氯叔丁醇、溴化苯甲烴銨、杜滅芬、雙氯苯雙胍己烷、硝酸苯汞、硫柳汞、對羥基苯甲酸酯類的物質。
11.重組人生長激素及重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子在用於製備治療皮膚損傷和/或潰瘍的藥物中的用途。
12.如權利要求11所述的用途，其中所述損傷或潰瘍為角膜外傷或角膜潰瘍。
13.如權利要求12所述的用途，其中所述角膜外傷為無菌性穿孔傷或潰瘍。
14.如權利要求11-13任意一項所述的用途，其中將含有重組人生長激素或重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的外用製劑與選自具有促進上皮與基質粘附作用的藥劑、抗生素或人工淚液合用。
15.如權利要求14所述的用途，其中將含有重組人生長激素或重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的外用製劑與選自地塞米松、氟米龍滴眼液、泰利必妥滴眼液、阿託品滴眼液或人工淚液合用。
16.權利要求5所述的外用滴眼液的製備方法，該方法包括基於組合物總重量的百分比，在含有0.015-0.35％的生長激素或0.0003-0.002％的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子的溶液中，加入根據需要的0.1-40％的製劑輔料，然後加入無菌注射用水至定量，混合均勻後進行除菌處理。
17.權利要求6所述的外用製劑的製備方法，該方法包括基於組合物總重量的百分比，將30-90％的作為基質成分的增稠劑熔融或溶漲，根據需要將0.1-40％的製劑輔料加至熔融或溶漲的基質中，並加入無菌注射用水，混合均勻後進行除菌處理，然後在常溫下，加入經過除菌的含0-5％的蛋白穩定劑和0.015-0.35％的生長激素或0.0003-0.002％的重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子溶液，再加入無菌注射用水補足餘量，混合均勻。
全文摘要
本發明提供一種外用製劑及其製備方法，所述外用製劑含有重組人生長激素(rhGH)或重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子(rhGM－CSF)和外用製劑的輔料。本發明的外用製劑可以是滴眼液、眼用凝膠劑或眼用藥膏等。本發明還涉及重組人生長激素(rhGH)或重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子(rhGM－CSF)在用於治療各種損傷和潰瘍，特別是角膜損傷及角膜潰瘍的藥物製備中的用途。
文檔編號A61P27/02GK1939534SQ20051010573
公開日2007年4月4日 申請日期2005年9月27日 優先權日2005年9月27日
發明者金磊, 裴瑾, 孟鋼, 胡君梅 申請人:長春金賽藥業有限責任公司