膜蛋白分子相互作用的光學探測方法

2023-06-08 12:10:26

專利名稱：膜蛋白分子相互作用的光學探測方法
技術領域：
本發明涉及生物學蛋白質，特別是一種膜蛋白分子之間相互作用的光學探測方法。
背景技術：
蛋白質是細胞功能的主要執行者，細胞功能的實現實質上是細胞內或細胞間各種蛋白質分子相互作用的結果，因此研究蛋白質之間的相互作用是理解細胞生命活動過程中化學機械運轉的關鍵，是生物學領域中的重大課題。尤其是在人類基因組測序工作完成之後，生命科學進入了後基因組學時代，在分子水平上研究蛋白質和蛋白質之間相互作用，揭示生物在體狀態下的生命活動過程成為生命科學、信息科學共同面臨的機遇和挑戰。
但是迄今為止，研究蛋白質分子之間相互作用的手段是很有限的。已知的生物化學技術，如免疫共沉澱(Robin.L，J.Virology，Vol.71，9803～9807，1997)、化學交聯(Jean.D.G，PNAS，Vol.86，4007～4011，1989)、片段層析(Pedro.C，PNAS，Vol.61，636～643，1968)等方法結合基因操作產生蛋白質突變以及蛋白質晶體結構的分析，篩選了許多重要蛋白質的相互作用並對其結構基礎有所了解，給我們帶來了豐富的信息。然而，這些生化信息都是離體(in vitro)研究的結果，並不能反應生理狀況下的情況，無法回答在活細胞內蛋白質分子之間相互作用的動力學問題。
酵母雙雜交技術是目前廣泛採用的在體(in vivo)條件下研究蛋白質相互作用的方法，它能快速檢測蛋白質相互作用，包括相應的結構域和基因編碼(Fields S，Nature，Vol.340，245～246，1989；Chien C.T，PNAS，Vol.88，9578～9582，1991；Bai C，Methods Enzymol，Vol.283，141～156，1996)。但是該方法也有固有的缺陷①它只是個篩選系統，並不能直接將蛋白質相互作用與特定的細胞功能聯繫起來；②而且它只能檢測細胞核內的蛋白質相互作用，對研究膜蛋白的相互作用則很困難；③在某些情況下會導致假陽性的錯誤信息(Rossi F，PNAS，Vol.94，8405～8410，1997)。
光學顯微成像方法可以實現蛋白質相互作用的在體探測，但是單一的成像的空間解析度受衍射極限的限制，無法突破200nm，無法在更深入的層次上詮釋生命活動的細節信息(Georgiou G.N，FEBS.Lett，Vol.250，487-492，1989)。近場光學成像方法雖然可以實現nm級的空間解析度，但是由於其固有探測原理的限制，很難實現在體探測(沈玉民、朱星，物理，Vol.29，13，2000)。
上世紀90年代發展起來的螢光共振能量轉移技術(以下簡稱FRET)，以不同於傳統手段的全新原理大大促進了生物分子之間相互作用的研究，它的出現使我們對1～10nm範圍內的相互作用探測成為可能，並且可以用於在體環境(Truong K，Curr.Opin.Struct.Biol，Vol.11，573～578，2001；Sorkin.A，Curr.Biol，Vol.10，1395～1398，2000)。但是FRET方法依然面臨著很多問題，例如它需要合適的供體-受體分子對(Pollok B A，Trends.Cell.Biol，Vol.9，57～60，1999；Sekar R B，J.Cell.Biol，Vol.160，629～633，2003)；而且要從FRET效率中得到分子的距離信息，還必須取得分子對之間的R0(Forster半徑，FRET的效率為50％時的供體、受體之間的距離)和分子偶極子取向因子κ2的可靠信息，否則就無法利用FRET效率進行精確的距離計算(Siegel R M，Sci STKE，Vol.38，PL1，2000；Dietrich A，Biotechnology，Vol.82，211～231，2002)。另一方面由於目前絕大多數的FRET技術依然是應用在整體細胞的水平，得到的是系綜平均的結果，這掩蓋了來自單個分子對的獨特信息。因此，生命科學的發展迫切需要提供新的方法和手段，來解決分子之間相互作用的檢測問題。

發明內容
本發明針對上述在先技術對分子之間相互作用探測方面的不足，尤其是在體條件下探測的不足，提出一種在活細胞內關於膜蛋白分子之間相互作用的光學探測方法，以獲得膜蛋白分子的相互作用的情況。
本發明的技術解決方案如下一種膜蛋白分子之間相互作用的光學探測方法，其特徵在於該方法包括下列步驟
第一步採用全內反射螢光成像系統探測細胞膜，對目標膜蛋白的不同區域獲取多組膜蛋白的圖像，每組圖像對應細胞膜的一個區域，每組圖像包含多幅分子序列圖片；第二步利用計算機進行數據處理，繪製螢光強度與時間的關係曲線圖，採用螢光強度與時間的關係曲線的淬滅次數判斷圖像中所含膜蛋白分子的數目；第三步採用中心定位法確定膜蛋白中每個分子的位置；第四步重複第二步和第三步對每組圖像逐一進行數據處理，繪製淬滅步驟統計圖和分子間距統計圖，以獲得膜蛋白的聚合程度和分子間距的統計結果。
所述的第一步的具體步驟如下①為了進行螢光探測，對待測的目標膜蛋白分子做螢光標記；②將具有螢光標記的目標膜蛋白分子的活細胞置於全內反射螢光成像系統中，用高靈敏度CCD對細胞的不同區域拍攝多組膜蛋白分子的圖像，每組圖像對應一個區域，每組圖像包含多幅分子序列圖片；所述的第二步的數據處理的過程如下①對一組圖像中的每一幅圖片進行測量，得到螢光強度最大值或螢光強度平均值，繪製螢光強度與時間的關係曲線圖，簡稱螢光強度圖；②分析螢光強度圖，該圖中的螢光強度隨時間的關係曲線呈現階梯狀的下降，螢光強度的第一次下降突變稱為第一步淬滅，第二次下降突變稱為第二步淬滅，第三次下降突變稱為第三步淬滅，如此類推；該螢光強度曲線中，第一步淬滅之前的的區域稱為a區間，第一步淬滅和第二步淬滅之間稱為b區間，第二步淬滅與第三步淬滅之間稱為c區間，……；根據螢光強度圖的淬滅次數判斷目標膜蛋白細胞的聚合程度一步淬滅說明沒有發生蛋白的聚合，二步淬滅代表圖片中含有兩個分子，稱為蛋白的二聚化，三步淬滅表明有三個分子，發生了蛋白的二聚化，以此類推。
所述的中心定位法是一種數據處理方法，對兩分子的膜蛋白的數據處理過程如下①將某一組目標膜蛋白圖像的處於b區間的某一單個圖片讀入計算機，即獲得一10×10的二維強度矩陣，稱為原矩陣I1，該矩陣I1包含有分子1的螢光強度分布；②對原矩陣I1做統計直方圖，該圖中螢光強度分界值設定為圖像的背景值B；③對原矩陣I1的螢光強度減去背景值B並進行插值處理，形成100×100的新矩陣I1』；④以下列公式(1)為曲線方程，I1』中的矩陣元為數據點，利用最小二乘法對圖像進行擬合，得到圖像的中心點即為分子1的位置坐標(x1，y1)，Nxy=N00exp[-(x-x1)2+(y-y1)22S2]---(1)]]>式中(x1，y1)即點物體的中心位置；Nxy，N00分別是像素(x，y)處和中心位置(x1，y1)處的成像強度值；S是點擴散函數的半高全寬；⑤將a區間的某一圖片讀入計算機，即獲得一10×10的二維強度矩陣，稱為原矩陣I2，該矩陣I2包含有分子1和分子2的螢光強度分布；⑥將矩陣I2減矩陣I1，得到分子2的螢光強度分布矩陣並進行插值處理，形成分子2的100×100螢光強度分布新矩陣I2』；⑦按上述步驟④進行數據處理，得到分子2的位置坐標(x2，y2)；⑧計算分子1和分子2之間的距離d(2，1)x＝|x2-x1|；d(2，1)y＝|y2-y1|。
所述的中心定位法是一種數據處理方法，對三分子膜蛋白的數據處理過程如下①將某一組目標膜蛋白圖像的處於c區間的某一單個圖片讀入計算機，即獲得一10×10的二維強度矩陣，稱為原矩陣I1，該矩陣I1包含有分子1的螢光強度分布；②對原矩陣I1做統計直方圖，該圖中螢光強度分界值設定為圖像的背景值B；③對原矩陣I1的螢光強度進行插值處理，形成100×100的新矩陣I1』；④以下列公式(1)為曲線方程，I1』中的矩陣元為數據點，利用最小二乘法對圖像進行擬合，得到圖像的中心點即為分子1的位置坐標(x1，y1)，Nxy=N00exp[-(x-x1)2+(y-y1)22S2]---(1)]]>式中(x1，y1)即點物體的中心位置；Nxy，N00分別是像素(x，y)處和中心位置(x1，y1)處的成像強度值；S是點擴散函數的半高全寬；⑤將b區間的某一圖片讀入計算機，即獲得一10×10的二維強度矩陣，稱為原矩陣I2，該矩陣I2包含有分子1和分子2的螢光強度分布；⑥將矩陣I2減矩陣I1，得到分子2的螢光強度分布矩陣並進行插值處理，形成分子2的100×100螢光強度分布新矩陣I2』；⑦按上述步驟④進行數據處理，得到分子2的位置坐標(x2，y2)；⑧將a區間的某一圖片讀入計算機，即獲得一10×10的二維強度矩陣，稱為原矩陣I3，該矩陣I3包含有分子1、分子2和分子3的螢光強度分布；從原矩陣I3減去矩陣I2，得到分子3的螢光強度分布矩陣並進行插值處理，形成分子3的100×100螢光強度分布新矩陣I3』按上述步驟④進行數據處理，得到分子3的位置坐標(x3，y3)；⑨計算分子1、分子2和分子3之間的距離分子1、分子2之間的距離d(2，1)x＝|x2-x1|d(2，1)y＝|y2-y1|；分子1、分子3之間的距離d(3，1)x＝|x3-x1|d(3，1)y＝|y3-y1|；分子2、分子3之間的距離
d(3，2)x＝|x3-x2|d(3，2)y＝|y3-y2|。
關於單分子的螢光強度隨時間的突然變化，可用統計理論來解釋。對於分子而言，光淬滅事件是一個泊松過程，它遵從指數分布P(t)=1e-t/]]>式中，P(t)是在時刻t螢光分子淬滅的機率；τ是光淬滅的時間常數，它依賴於分子的吸收截面、系間過渡時間等光物理參數以及外部環境。如果兩個或兩個以上分子聚集在一起，由於不同分子的光淬滅時間常數不同，就會表現出螢光強度突然多次改變的現象，即多步淬滅，淬滅的步數等於聚集分子的數目。
單分子的精確定位是基於這樣一個事實雖然由於衍射極限的限制，成像系統無法分辨物體的尺寸，但是根據物體所成的光斑，可以對物體的中心位置進行無限精確的恢復，這就是所謂的中心定位法。M.K Cheezum(Biophys.J.Vol.81，2378-2388，2001)及R.E Thompson(Biophys.J.Vol.82，2775-2783，2002)等人研究指出，對於低信噪比成像，中心定位法採用二維高斯函數對物體的衍射極限光斑圖像進行擬合，可得到最佳的定位結果。
二維高斯函數的表達式為Nxy=B+N00exp[-(x-x0)2+(y-y0)22S2]---(1)]]>式中，(x0，y0)即點物體的中心位置；Nxy，N00分別是像素(x，y)處和中心位置(x0，y0)處的成像強度值；S是點擴散函數的半高全寬；B是背景，它包括CCD的讀出噪音、暗電流以及光子散射噪音。
同時中心定位法所能達到的精確度與成像系統的參數有關，具體表達式為=S2N+a2/12N+8S4b2a2N2---(2)]]>N是圖像中信號強度值之和；a是探測器的像素尺寸；b是噪音的標準偏差。
顯然，本發明的特點在於可以定量獲取兩個或多個分子之間的相對距離，並可以獲取相對距離隨時間的變化。該方法彌補了FRET技術只能對1～10nm的分子間距離進行探測的缺點，同時也突破了光學顯微鏡(遠場)解析度大於200nm的限制，是一種對膜蛋白分子之間相互作用進行探測的光學新方法。
本發明的優點在於1、在體膜蛋白相互作用的無損探測。
2、大大突破遠場光學成像的衍射極限解析度。
3、發生相互作用的分子之間距離的精確確定。


圖1是分子螢光強度與時間的關係曲線圖的三步淬滅示意2是本發明實施例的一組膜蛋白分子序列圖片圖3是本發明實施例膜蛋白分子螢光強度與時間的關係曲線圖的二步淬滅示意4是圖2中第25幅分子圖片圖5是圖4分子圖像原矩陣I1統計直方6是圖像處理流程7是圖4分子圖片擬合的三維螢光強度顯示8是圖2中第10幅分子圖片圖9是第10幅分子圖片擬合的三維螢光強度顯示10為本發明實施例淬滅步驟的統計11為本發明實施例分子間距的統計圖具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發明作進一步說明，但不應以此限制本發明的保護範圍。
請參閱圖2、3、4、5、6、7、8、9和圖10，圖2至圖10是本發明膜蛋白相互作用的光學探測方法實施例的各階段的主要示意圖，本實施例的過程如下1對待測活細胞中的目標膜蛋白做螢光標記。本實施例中先構建膜蛋白與螢光蛋白的融合質粒，然後將其轉染到細胞中，完成待測樣品的螢光標記。由於是單分子探測，必須控制使轉染後蛋白表達的濃度很低。
2在全內反射螢光成像系統中，用高靈敏度CCD在細胞膜的不同區域拍攝多組目標膜蛋白單細胞圖像，共拍攝100組，每組對應一個區域，每組內含有60幅單細胞序列圖片，見圖2。本發明採用具體參數為物鏡NA＝1.45，放大倍率為100×；λ＝570nm，CCD尺寸為0.06μm/pixel(pixel即像素)，這樣CCD的每個像素對應成像空間的物理距離為60nm；每個區域的大小為10×10像素；一組內每幅圖片的曝光時間為200ms，圖片之間的拍攝延遲時間為0，每組拍攝的總時間為12s。
3對第一組圖像進行分析，其中含有60幅圖片。從每幅單細胞圖片中得到強度最大值或強度平均值，本實施例經測量取螢光強度最大值，共60個數據，數據如下表1所示表1


根據表1的數據繪製螢光強度最大值與時間的關係曲線圖，簡稱螢光強度圖，見圖3。從圖中可以看到，分子點的螢光強度呈現兩步淬滅，說明圖像中含有兩個分子。
5在圖3的區間b中任意選擇一幅分子圖片，本實施例選取第25幅圖片，見圖4。將圖片輸入計算機進行處理，流程圖見圖6，具體處理步驟如下①讀入圖像，在計算機中圖像顯示為一個二維螢光強度矩陣I1，見表2。此矩陣稱為原矩陣，大小為10×10，單位為任意單位②對原矩陣I1做統計直方圖，見圖5。直方圖中的強度分界值即為背景噪聲和信號光的分界值，將此分界值設定為圖像的背景值，即為式(1)中的B值，B＝20。
③對二維螢光強度矩陣I1的螢光強度減去背景值B值做插值處理，得到一新矩陣I1』，其大小為100×100；④以公式(1)為曲線方程，I1中的矩陣元為數據點，進行最小二乘法的曲線擬合。擬合結果見圖7。
⑤得到分子1的位置坐標(x1，y1)＝(5.4309，5.2499)pixel。
表2


在圖3的a區間中任意選擇一幅分子圖片，本實施例選取第10幅圖片，見圖8，輸入計算機進行處理，處理流程如下⑥讀入該圖片，得到另一二維強度矩陣，稱為原矩陣I2。此矩陣中包括分子1和分子2的螢光強度分布；⑦將矩陣I2與矩陣I1相減，即得到分子2的強度分布；⑧重複上述處理流程的第④步驟，擬合結果見圖9，得到分子2的位置坐標(x2，y2)＝(5.4287，5.4577)pixel。
⑨計算出分子1和分子2的之間的距離為dx＝0.2nm，dy＝12.5nm。
⑩對餘下的99組圖像重複以上分析並作統計，得到淬滅步驟的統計圖，見圖10。大多數分子(55/100)的螢光強度呈現二步淬滅，說明目標膜蛋白之間的相互作用表現為二聚化。從55組表現為二聚化的圖像中計算得到55組分子間距離，作分子間距離的統計圖，見圖11，分子之間的距離分布呈現中心值為12nm的正態分布，進一步說明蛋白分子不是隨機碰撞在一起，而是發生了相互作用。
權利要求
1.一種膜蛋白分子之間相互作用的光學探測方法，其特徵在於該方法包括下列步驟第一步採用全內反射螢光成像系統探測細胞膜，在細胞膜的不同區域獲取多組目標膜蛋白分子的圖像，每組圖像對應細胞膜的一個區域，每組圖像包含多幅膜蛋白分子的序列圖片；第二步利用計算機進行數據處理，繪製螢光強度與時間的關係曲線圖，採用螢光強度與時間的關係曲線的淬滅次數判斷圖像中所含膜蛋白分子的數目；第三步採用中心定位法確定聚合的膜蛋白中每個分子的位置，由此確定膜蛋白的之間的間距；第四步重複第二步和第三步對每組圖像逐一進行數據處理，繪製淬滅步驟統計圖和分子間距統計圖，以獲得膜蛋白的聚合程度和分子間距的統計結果。
2.根據權利要求1所述的膜蛋白分子之間相互作用的光學探測方法，其特徵在於所述的第一步的具體步驟如下①為了進行螢光探測，對待測的目標膜蛋白分子的活細胞做螢光標記；②將具有螢光標記的目標膜蛋白分子的活細胞置於全內反射螢光成像系統中，用高靈敏度CCD對細胞的不同區域拍攝多組膜蛋白分子的圖像，每組圖像對應一個區域，每組圖像包含多幅分子序列圖片。
3.根據權利要求1所述的膜蛋白分子之間相互作用的光學探測方法，其特徵在於所述的第二步的數據處理的過程如下①對一組圖像中的每一幅圖片進行測量，得到螢光強度最大值或螢光強度平均值，繪製螢光強度與時間的關係曲線圖，簡稱螢光強度圖；②分析螢光強度圖，該圖中的螢光強度隨時間的關係曲線呈現階梯下降，螢光強度的第一次下降突變稱為第一步淬滅，第二次下降突變稱為第二步淬滅，第三次下降突變稱為第三步淬滅，如此類推；該螢光強度曲線中，第一步淬滅之前的的區域稱為a區間，第一步淬滅和第二步淬滅之間稱為b區間，第三步淬滅與第二步淬滅之間稱為c區間，……；根據螢光強度圖的淬滅次數判斷目標膜蛋白的聚合程度一步淬滅說明沒有發生蛋白的聚合，二步淬滅代表圖片中含有兩個分子，稱為蛋白的二聚化，三步淬滅表明有三個分子，發生了蛋白的三聚化，以此類推。
4.根據權利要求1所述的膜蛋白分子之間相互作用的光學探測方法，其特徵在於所述的中心定位法是一種數據處理方法，對兩個分子膜蛋白的數據處理過程如下①將某一組目標膜蛋白圖像的處於b區間的某一單個圖片讀入計算機，即獲得一10x10的二維強度矩陣，稱為原矩陣I1，該矩陣I1包含有分子1的螢光強度分布；②對原矩陣I1做統計直方圖，該圖中螢光強度分界值設定為圖像的背景值B；③對原矩陣I1的螢光強度減去背景值B並進行插值處理，形成100x100的新矩陣I1』；④以下列公式(1)為曲線方程，I1』中的矩陣元為數據點，利用最小二乘法對圖像進行擬合，得到圖像的中心點，即為分子1的位置坐標(x1，y1)，Nxy=N00exp[-(x-x1)2+(y-y1)22S2]----(1)]]>式中(x1，y1)即點物體的中心位置；Nxy，N00分別是像素(x，y)處和中心位置(x1，y1)處的成像強度值；S是點擴散函數的半高全寬；⑤將a區間的某一圖片讀入計算機，即獲得一10x10的二維強度矩陣，稱為原矩陣I2，該矩陣I2包含有分子1和分子2的螢光強度分布；⑥將矩陣I2減矩陣I1，得到分子2的螢光強度分布矩陣並進行插值處理，形成分子2的100x100螢光強度分布新矩陣I2』；⑦按上述步驟④進行數據處理，得到分子2的位置坐標(x2，y2)；⑧計算分子1和分子2之間的距離d(2，1)x＝|x2-x1|； d(2，1)y＝|y2-y1|。
5.根據權利要求1所述的膜蛋白分子之間相互作用的光學探測方法，其特徵在於所述的中心定位法是一種數據處理方法，對三分子膜蛋白的數據處理過程如下①將某一組目標膜蛋白圖像的處於c區間的某一單個圖片讀入計算機，獲得一10x10的二維強度矩陣，稱為原矩陣I1，該矩陣I1包含有分子1的螢光強度分布；②對原矩陣I1做統計直方圖，該圖中螢光強度分界值設定為圖像的背景值B；③將原矩陣I1的螢光強度減去背景值B並進行插值處理，形成100x100的新矩陣I1』；④以下列公式(1)為曲線方程，I1』中的矩陣元為數據點，利用最小二乘法對圖像進行擬合，得到圖像的中心點即為分子1的位置坐標(x1，y1)，Nxy=N00exp[-(x-x1)2+(y-y1)22S2]----(1)]]>式中(x1，y1)即點物體的中心位置；Nxy，N00分別是像素(x，y)處和中心位置(x1，y1)處的成像強度值；S是點擴散函數的半高全寬；⑤將b區間的某一圖片讀入計算機，獲得一10x10的二維強度矩陣，稱為原矩陣I2，該矩陣I2包含有分子1和分子2的螢光強度分布；⑥將矩陣I2減矩陣I1，得到分子2的螢光強度分布矩陣並進行插值處理，形成分子2的100x100螢光強度分布新矩陣I2』；⑦按上述步驟④進行數據處理，得到分子2的位置坐標(x2，y2)；⑧將a區間的某一圖片讀入計算機，獲得一10x10的二維強度矩陣，稱為原矩陣I3，該矩陣I3包含有分子1、分子2和分子3的螢光強度分布；從原矩陣I3減去矩陣I2，得到分子3的螢光強度分布矩陣並進行插值處理，形成分子3的100x100螢光強度分布新矩陣I3』按上述步驟④進行數據處理，得到分子3的位置坐標(x3，y3)；⑨計算分子1、分子2和分子3之間的距離分子1、分子2之間的距離d(2，1)x＝|x2-x1|d(2，1)y＝|y2-y1|；分子1、分子3之間的距離d(3，1)x＝|x3-x1|d(3，1)y＝|y3-y1|；分子2、分子3之間的距離d(3，2)x＝|x3-x2|d(3，2)y＝|y3-y2|。
全文摘要
一種膜蛋白分子之間相互作用的光學探測方法，其特徵在於該方法包括下列步驟採用全內反射螢光成像系統探測細胞膜，在細胞膜的不同區域獲取多組目標膜蛋白分子的圖像，每組圖像對應細胞膜的一個區域，每組圖像包含多幅膜蛋白分子的序列圖片；利用計算機進行數據處理，繪製螢光強度與時間的關係曲線圖，採用螢光強度與時間的關係曲線的淬滅次數判斷圖像中所含聚合的膜蛋白的分子數目；採用中心定位法確定聚合的膜蛋白中每個分子的位置，由此確定膜蛋白的分子之間的間距；重複第二步和第三步對每組圖像逐一進行數據處理，繪製淬滅步驟統計圖和分子間距統計圖，以獲得膜蛋白的聚合程度和分子間距的統計結果。
文檔編號G06F19/00GK1793862SQ20051011159
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月16日 優先權日2005年12月16日
發明者王琛, 劉力, 餘琴, 王桂英, 徐至展 申請人:中國科學院上海光學精密機械研究所