抗體人源化的方法以及由此獲得的人源化抗體的製作方法

2023-06-08 05:45:11

專利名稱：抗體人源化的方法以及由此獲得的人源化抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種通過確定和比較三維結構的方式進行抗體人源化的方法，由此獲得的人源化抗體及其在體內治療和診斷中的用途。
背景技術：
在人類中動物來源的單克隆抗體的治療性和診斷性應用具有基本禁忌徵候，特別是對於必需重複給藥的治療方案。具體地，鼠單克隆抗體具有相對短的半衰期，並且當用於人類時，缺乏一些免疫球蛋白的基本功能特性，如補體依賴性細胞毒性和細胞介導的細胞毒性。
另外，如果注射入患者體內的話，非人源的單克隆抗體包含免疫原性胺基酸序列。許多研究顯示在注射外源抗體後，受試者產生針對抗體本身的相當強烈的免疫反應(稱為HAMA-人抗鼠抗體-反應)，形成免疫複合物，藥物動力學改變，產生變應性反應等，完全消除了它的治療性用途。而且，考慮到在小鼠或在其它哺乳動物中為了不同病狀的治療而開發出來的不同單克隆抗體(因而對於人具有抗原性)的生長數目，由於交叉反應性，也是為了不相關療法而進行的治療可以是無效的或者甚至是危險的。儘管所謂嵌合性抗體(可變的鼠區域連接到人源的恆定區)的生產已經產生了一些陽性結果，但仍然餘留著顯著的免疫原性問題。
在人類治療性應用領域人源化抗體相對於動物源的抗體具有至少三種潛在的優點。第一，人源的效應區，能夠更好地與人免疫系統的其它部分相互作用，通過補體依賴性細胞毒性，或細胞介導的抗體依賴性細胞毒性更加有效地破壞靶細胞。而且，人免疫系統並不將人源化抗體的構架或恆定區(C)識別為外源性的，因此相對於針對鼠抗體(完全是外來的)的抗體反應和相對於由嵌合性抗體(部分外來的)誘導的反應，針對人源化抗體的抗體反應得以最小化。
已經報導了注射入人體內的鼠抗體比正常抗體具有短得多的半衰期(Shaw等，1987)。人源化的抗體與天然人抗體具有非常相似的半衰期，這樣就允許更少次數的給藥和更低的劑量。
人源化作用的基本原理為改變抗原識別，即CDR結構域，在人免疫球蛋白的環境中的特異性(「CDR移植」，Winter和Milstein)。已經報導了人源化抗體的幾個例子，其是為了試圖解決免疫原性的問題而生產的(Maeda等，1991；Singer等，1993；Tempest等，1994；Kettleborough等，1991；Hsiao等，1994；Baca等，1997；Leger等，1997；Ellis等，1995；Sato等，1994；Jones等，1986；Benhar等，1994；Sha and Xiang，1994；Shearman等，1991；Rosok等，1996；GussowSeemann，1991；Couto等，1994；Kashmiri等，1995；Baker等，1994；Riechmann等，1988；Gorman等，1991；Verhoeyen等，1988；FooteWinter，1992；LewisCrowe，1991；Co等，1991；Co等，1991；Verhoeyen等，1991；Eigenbrot等，1994；Hamilton等，1997；Tempest等，1995；Verhoeyen等，1993；Cook等，1996；Poul等，1995；Co等，1992；Graziano等，1995；Presta等，1993；Hakimi等，1993；Roguska等，1996；Adair等，1994；Sato等，1993；Tempest等，1991；Sato等，1996；Kolbinger等，1993；Zhu和Carter，1995；Sims等，1993；Routledge等，1991；Roguska等，1994；Queen等，1989；Carter等，1992)。
由動物(一般是鼠)到人源化的抗體的轉錄必需在相反的需求之間妥協，其解決方法根據情況而改變。為了使免疫原性最小化，免疫球蛋白將保持儘可能多的可接受的人序列。在任何情況下，為了保持最初的結合特性，免疫球蛋白構架在可接受的人序列中應當包含足夠數目的突變以保證CDR區的構象儘可能與供體鼠免疫球蛋白的CDR區的構象相似。作為這些對立考慮的結果，相對於相應的鼠抗體對於許多人源化抗體已經報導了結合親和性的顯著喪失(Jones等，1986；Shearman等，1991；Kettleborough，1991；German等，1991；Riechmann等，1988)。
當前，生產人源化免疫球蛋白的最普遍的方法是基於使用適合的基因組、合成序列，以及cDNA(Reichmann等，1988)。
專利申請EP 592106公開了由齧齒動物進行抗體人源化的方法。該方法是基於暴露於待人源化抗體的三維結構的表面上的胺基酸殘基的鑑定，基於對應人抗體相同位置上胺基酸殘基的鑑定，和基於用在人抗體中鑑定的殘基替代齧齒動物抗體序列中鑑定的殘基。

發明內容
本發明的作者建立了以一致性基於結構數據的途徑，獲得在人體中基本上無免疫原性的優化的人源化形式免疫球蛋白的方法，所述結構數據是通過實驗獲得的，其來自結晶學研究。本發明的方法允許以適合於治療性製劑並且適合於其它醫學和診斷應用的形式獲得抗體。
本發明涉及一種充分建立在結構數據上的進行人源化第一設計階段(通常更易出現誤差)的方法。人源化免疫球蛋白具有在輕鏈和重鏈之間的兩對異源二聚體，其中至少一條鏈具有一種或多種動物來源的CDRs，功能性結合到人來源的構架區片段上。例如，將動物來源的CDRs，與也是動物來源的天然相關聯的胺基酸殘基一起，導入人來源的構架區，以產生能夠結合各自抗原的人源化免疫球蛋白，其具有與動物來源的原始免疫球蛋白相當的親和力。
本發明的方法導致獲得適於治療性和診斷性應用的人源化抗體。具體地，獲得了人源化的免疫球蛋白，其源自能夠分別以高度特異性結合TrkA和NGF的抗TrkA抗體(專利EP 1181318)和抗NGF抗體，壓制配體和接納體之間的相互作用。這些分子可用於治療依賴於NGF/TrkA的腫瘤，慢性疼痛和炎性形式，並且可用於診斷目的，用於體內成像，例如，對TrkA陽性腫瘤進行成像，或對基底前腦進行成像作為阿爾茨海默氏病的早期標記。具體地，人源化的抗TrkA抗體在尿道和骨盆區的炎性形式中發現有特異性的治療性和診斷性應用。具體地，人源化的抗NGF抗體在由HIV病毒誘導的病狀中發現有特異性的治療性和診斷性應用，以誘導免疫細胞，如HIV感染的NGF依賴性巨噬細胞的凋亡。
所以，本發明的目的是提供已知序列的動物抗體的VH和VL可變區的人源化的方法，包括以下步驟a)如果不是現有的話，獲得動物抗體的VH和VL區的結晶學結構；
b)基於和所述動物抗體構架一級序列最高水平的同源性和同一性，預選一系列0-n個人來源或人源化抗體的可能的構架接納體，以不小於3的解析度對其結構進行實驗性測定；c)分別進行動物抗體的VH和VL可變區與b)中獲得的VH和VL區之間的結構比較，並且計算每次比較的RMS，以鑑定具有較小RMS的人來源的VH區和VL區；d)將所述動物抗體的CDR區的序列插入於c)中鑑定的人序列中的合適位置；e)如果必要的話，將c)中鑑定的人VH區和VL區的一個或多個胺基酸殘基逆向突變。
優選地，以重組DNA技術進行抗體的修飾。
在優選的實施方案中，所述動物抗體是抗NGF抗體，優選地它是αD11抗體，並且人源化序列基本上具有下列序列VHHumαD11 VH，EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTNNNVNWVRQAPGKGLEWVGGVWAGGATDYNSALKSRFTISRDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSSSTLYAMDAWGQGTLVTVSS，(SEQ ID No.17)和VLHumαD11 Vk，DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNALAWYQQKPGKAPKLLIYNTDTLHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQHYFHYPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID No.18).
在備選的實施方案中，所述動物抗體是抗TrkA抗體，優選地它是αMNAC13抗體，並且人源化序列基本上具有下列序列VHHumMNAC13VH，EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWARQAPGKGLEWVAYISKGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDSAVYYCARGAMFGNDFFFPMDRWGQGTLVTVSSA，(SEQ ID No.37)和VLHum MNAC13Vk，DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCHQWSSYPWTFGGGTKVEIK
(SEQ ID No.38)。
本發明的人源化免疫球蛋白(或保持結合活性的衍生片段和可以被衍生的其它化合物)能夠通過已知的重組DNA技術進行生產。作為所述人源化免疫球蛋白的隨後使用的功能，可以利用轉基因動物或轉染細胞進行它們的表達，優選無限增殖化的真核細胞(如骨髓瘤或雜交瘤細胞)，還優選原核宿主、昆蟲或植物細胞。還可以通過合成獲得得到的人源化免疫球蛋白序列的編碼多核苷酸。
本發明的人源化免疫球蛋白能夠單獨或與其它治療劑組合使用。在用作抗腫瘤劑的情況下，化療劑將是優選的，其可以根據藥理學應用(如蒽環黴素、紫杉醇、順鉑、吉西他濱、非甾類和皮質甾類抗炎物，或免疫抑制劑)而變化，以及組合所有目前應用於每種具體病狀的治療中的藥物。人源化免疫球蛋白或它們的複合物能夠以藥理學上可接受的劑量形式進行製備，其根據給藥類型而變化。
定義在兩種多核苷酸或多肽(分別是人源化免疫球蛋白的編碼DNA序列或人源化免疫球蛋白的胺基酸序列或其部分)的語境中術語「基本上相同的」指兩種或多種序列，當以最大一致性進行比較和比對時，其在核苷酸或胺基酸殘基上具有最小80％(優選90-95％或更多)的同一性。一般，「基本上的同一性」在至少50個殘基長的區域中變化，更加優選在至少100個殘基的區域上核實，或者，在最佳的條件中，在超過150個殘基或在完整序列上核實。如下所述，利用Kabat編號方案，任何兩種序列的抗體都只能以一種方式進行比對。因此，抗體的同一性百分比具有唯一的和明確的含意。成熟免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區的胺基酸被稱為Hx和Lx，x為根據Kabat編號方案指定胺基酸位置的號碼，Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda MD，1987，1991)。Kabat測定了每個亞組的抗體的胺基酸序列列表以及每個亞組的每個位置上最常見的胺基酸列表以便生成共有序列。Kabat利用一種方法將一個編號指定給列表中每個序列的每個胺基酸並且這種指定每個殘基的編號的方法已經成為本領域的標準方法。Kabat方案可以延伸到不存在於他的研究中的其它抗體，基於保守的胺基酸，將目標抗體與Kabat鑑定的共有序列之一進行比對。Kabat編號方案的使用允許輕易地鑑定不同抗體中等同位置上的胺基酸。例如，在人來源抗體的L10位置上的胺基酸佔有在鼠來源的抗體的L10位置上的胺基酸的等同位置。
眾所周知抗體的基本結構單元包含四聚體。每個四聚體都由兩對相同的多肽鏈構成，每對由一條輕鏈(25KDa)和由一條重鏈(50-75KDa)組成。每條鏈的氨基末端區包括大約100-110或更多胺基酸的可變區，其參與抗體識別。每條鏈的羧基末端區包含介導效應功能的恆定區。每對輕鏈和重鏈的可變區形成抗體的結合位點。所以，完整的抗體具有兩個結合位點。
輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、ε，並且它們將抗體的同種型分別定義為IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。在輕鏈和重鏈之內，可變區和恆定區通過大約12個或更多胺基酸的″J″區連接，而只有重鏈包括大約10個胺基酸的″D″區(Paul，1993)。
每對輕鏈和重鏈的可變區形成抗體的結合位點。它們的特徵是由稱作構架(FR)的相對保守區域構成的相同常規結構，所述構架是由三種稱作互補決定區(CDR)的高變區連接的(Kabat等，1987；Chothia和Lesk，1987)。通過構架區對每對的兩條鏈的CDRs進行比對，獲得結合特異性表位的功能。由氨基末端區起始朝向羧基末端區，輕鏈和重鏈的可變結構域都包含FR和CDR區的交替更迭FR，CDR，FR，CDR，FR，CDR，FR；因此，重鏈和輕鏈的特徵都是三個CDRs，分別為CDRH1，CDRH2，CDRH3和CDRL1，CDRL2，CDRL3。根據Kabat(1987和1991)和/或ChothiaLesk(1987)，Chothia等(1989)的定義將胺基酸指定到每一區域。
優選地，由於保守性胺基酸取代，例示的人源化免疫球蛋白的類似物與原始的免疫球蛋白不同。為了將胺基酸取代分為保守性的或非保守性的，可以將胺基酸進行如下分組I組(疏水性側鏈)M，A，V，L，I；
II組(中性親水性側鏈)C，S，T，N，Q；III組(酸性側鏈)D，E；IV組(鹼性側鏈)K，R；V組(影響主鏈定向的殘基)G，P；VI組(芳香族側鏈)F，Y，W。
保守性胺基酸取代涉及在相同類別的胺基酸之間的取代，而非保守性胺基酸取代則必需是在不同類別成員之間的交換。
術語「表位」包括能夠以特異性方式結合免疫球蛋白的每一種蛋白決定簇。一般，表位是由多組大分子的化學活性表面形成的，所述大分子如胺基酸或糖的側鏈，並且它們一般具有特異性的化學-物理和構象特性。
術語「免疫球蛋白」指這樣的蛋白質，其由一種或多種多肽組成，所述多肽由免疫球蛋白的基因編碼。除了四聚體抗體形式之外，免疫球蛋白能夠以多種形式存在例如，它們包括片段Fv，Fab和F(ab′)以及雙功能雜合抗體(Lanzavecchia等，1987)和單鏈Fv片段(Hood等，1984；Harlow和Lane，1988；Hunkapiller和Hood，1986)。
嵌合性抗體是這樣的抗體，其輕鏈和重鏈基因由屬於不同特種的免疫球蛋白基因區起始進行改造。例如，單克隆小鼠抗體基因的可變區段(V)可以連接到人來源抗體的恆定區段(C)上。所以，治療性的嵌合性抗體是一種雜合蛋白質，其由識別源自小鼠抗體的抗原的結構域V和源自人抗體的效應結構域C組成(儘管可以利用哺乳動物物種的其它組合)。
術語「構架」指根據Kabat的定義，在物種內不同免疫球蛋白之間相對保守的免疫球蛋白的輕鏈和重鏈的可變區的那些部分(不屬於CDRs)。因此，人構架是與天然發現於人抗體中的構架基本上相同(至少85％或更多相同)的構架區。
術語「人源化免疫球蛋白」指這樣的免疫球蛋白，其包含人構架和至少一個源自非人抗體的CDR，並且其中存在的每個恆定區都與人免疫球蛋白區域基本上相同(至少85％，優選至少90-95％相同)。因此，除了CDR之外人源化免疫球蛋白的所有部分都與天然人免疫球蛋白的一種或多種序列的對應區域基本上相同。例如，由小鼠的可變區和人來源的恆定區構成的嵌合性抗體並不包括在人源化免疫球蛋白之中。
發明詳述所述方法是基於對體內治療性和診斷性目標抗體的人源化的高解析度結構比較。另外，提供人源化的免疫球蛋白，其能夠特異性地針對各自的抗原(即NGF神經營養因子及其TrkA接納體)反應。人源化的免疫球蛋白具有人來源的構架並且它們具有一個或多個源自每種原始免疫球蛋白(即，αD11，一種大鼠免疫球蛋白，特異地針對NGF和MNAC13反應，所述MNAC13為特異性地識別TrkA的鼠免疫球蛋白)的互補決定區(CDRs)。所以，本發明的免疫球蛋白，其可以輕易地進行大規模生產，不僅在NGF/TrkA依賴性腫瘤形式的治療中，而且在慢性疼痛和炎性形式的治療中發現有治療性應用。而且，對於接納體的特異性人源化免疫球蛋白具有另外的診斷性應用，以便對於TrkA陽性腫瘤和對於基底前腦的細胞進行體內成像(作為阿爾茨海默氏病的早期標記)。
本發明利用編碼能夠結合在NGF上和在TrkA上的目標表位的輕鏈和/或重鏈CDR區的DNA重組片段，正如在單克隆抗體αD11和MNAC13(分別是大鼠和小鼠的)中的情形一樣。將這些區域的編碼DNA片段連接到編碼人來源的合適構架區的DNA片段上。編碼包含單克隆抗體MNAC13和αD11的輕鏈和重鏈CDRs的多肽鏈的DNA序列分別包括於圖7A，7B和8A，8B中。由於遺傳密碼的簡併和非關鍵胺基酸的取代，DNA序列可以輕易地進行修飾。而且，DNA片段一般包括額外的表達控制序列，其可操作性地結合到人源化免疫球蛋白的編碼序列上並且包含異源或天然關聯的啟動子的區域。優選地，所述表達控制序列是載體中具有真核啟動子的系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞，但也能夠使用原核控制序列。一旦將所述載體併入合適的宿主中，就將宿主維持在適合的條件下以確保高水平的表達。隨後分別以二聚體、完整抗體的形式或者以免疫球蛋白的其它形式對輕鏈和重鏈進行進一步純化。
可以通過公知的方法由多種人細胞分離人恆定區的編碼DNA序列，但是優選由無限增殖化的B細胞起始。本發明的免疫球蛋白中的CDRs類似地源自分別能夠結合NGF和TrkA的單克隆抗體αD11和MNAC13以及分別在大鼠和小鼠中的產物。適於表達和分泌免疫球蛋白的宿主細胞可以獲自許多來源，如美國典型培養物保藏中心(細胞系和雜交瘤的目錄，第五版(1985)Rockville，Maryland，USA)。優選地，併入人源化抗體中的CDRs具有對應於αD11和MNAC13的CDRs序列的序列並且能夠包括編碼抗體自身對應胺基酸序列的簡併核苷酸序列。
一般，人源化設計程序是循環的和反覆的，它包括鼠抗體胺基酸序列的分析；相應Fv區的模型構建；人抗體接納體構架胺基酸序列的分析和選擇；選定構架中推定的逆向突變的鑑定；人源化抗體的設計和實際構建；通過體外和/或體內測定的方式證實保持的親和性以及結合的特異性。
如果這些活性被人構架消極地影響，將必需改變接納體人抗體的構架的選擇，或引入補償性的突變。
即使人構架的選擇被視為該循環的最關鍵階段，至今尚未建立起通用的規則。這依賴於這樣的事實，即各種選擇的優點(相對於在患者中的免疫原性而言)尚未從臨床觀點進行精確研究。所以，為了進行正確的構架選擇，僅有一系列方法是可用的，其必須結合先前獲得的結果。
具體地，可能使用固定的構架(通常重鏈為NEW而輕鏈為REI，因為它們的結構是長期以來可用的)。另一種方法提供構架的用途，所述構架被發現在序列上與待人源化的抗體最具同源性。有許多資料庫來檢索同源性人抗體除了供體和接納體序列之間較高的同一性百分比之外，所述選擇一般考慮CDRs的長度，標準殘基水平上的同一性和界面水平上殘基的同一性。對於這兩種方法之間的比較，見Graziano等(1995)。
另外，根據第二種方法的變形，可以由兩種不同的人抗體選擇輕鏈和重鏈，所述兩種不同的人抗體特徵為較高的序列同源性。這一方法由Riechmann等(1988)和由Shearman等(1991)提出。在這點上，通常，相對於源自不同抗體的輕鏈和重鏈，源自相同抗體的輕鏈和重鏈具有較高的正確關聯，形成功能性結合位點的可能性，儘管這兩條鏈之間的界面非常保守的事實可以同樣確保正確的相互作用。對於這兩種方法之間的比較，見Roguska等(1996和1996)。
將所述方法限定於源自特定人抗體的構架必須承擔招致軀體突變的危險，其產生免疫原性的表位，即使所述構架是人來源的。一種備選的方法是使用基於人共有序列的構架，其中已經消除特應性軀體突變。所述兩種方法已經進行了比較在一個案例中，沒有注意到結合親和力的差異(Kolbinger等，1993)，相反在另一個案例中所述結合證明優於個別構架的情況(Sato等，1994)。
無論如何，共有序列自身是人造的，所以，即使它們沒有特應性殘基，它們也能產生免疫原性的非天然基元。備選的方法(Rosok等，1996)是使用在V-BASE資料庫中搜集的種系人序列。
具有人來源的構架的可變區的鼠CDR區的非天然毗連能夠帶來天然不表現的構象限制，其決定了結合親和性的喪失，除非它們被特定胺基酸殘基的取代所校正。通過計算機建模部分地確定待取代的胺基酸殘基的選擇。硬體和軟體可用於產生免疫球蛋白分子的三維圖像。通常，由已經解析了的免疫球蛋白結構域或鏈的結晶學結構起始來產生分子模型。基於胺基酸相似性將待建模的鏈與已解析的三維結構的鏈或結構域相比較，並且將顯示最高序列相似性的鏈或結構域選作分子模型構建中的起始點。不過，抗體結構的預測並不總是準確的。具體地，第三個CDR區難以建模並且它總是代表抗體結構預測中的不確定點(Chothia等，1987)。為此原因，通常人源化抗體，作為第一近似值，比起始的單克隆抗體具有小得多的對抗原的結合親和性和/或特異性。在以不能完全合理化的反覆試驗方法重建起始抗體特性的嘗試中，這需要許多連續循環的點突變。
考慮到可用人和人源化抗體的不斷增長的高解析度X射線結構數目，意圖是避免不確定性和不明確性，所述不確定性和不明確性源自計算機建模的使用，通過X射線結晶學的方式獲得本發明的兩種抗體的Fab片段的高解析度結構數據。為此目的，兩種抗體都由雜交瘤進行純化，以木瓜蛋白酶(一種在重鏈的CH1和CH2結構域之間連接的水平上剪切的蛋白酶)進行蛋白酶解處理，其生成Fab片段。作為另外純化的結果，兩種Fab片段都得以結晶並且來自兩個資料庫(低和高解析度)，有可能以分子置換法解析所述結構並且隨後精化它們。
由本發明提出的基於實驗獲得的結構數據的方法，在接納體人抗體的構架的選擇的關鍵階段，以及對於在兩種中和抗體人源化過程之中選定構架的推定逆向突變的鑑定，都提供了更加堅實和合理得多的起點。
在已報導的各種能夠指導人抗體構架選擇的標準中，所用的是鼠和人來源抗體在一級序列上同一性的程度，以基於結構比對的分析擴展和完善其結果。與原始標準相關聯的對應結構的比較分析保證了精確得多的比較並且因此保證了更大的可能性，即得到的人源化抗體能夠保持原始鼠抗體的親和性和特異性的特性。因此，在同一性程度和同源性水平方面，採用的策略都結合了源自胺基酸序列分析和比較的信息，比較各自的三維結構。
具體地，源自一級結構最佳比對的信息具有雙重作用。第一，這種分析允許減少待比較的可能的三級結構的數目，將其自身限制於特徵為高度同源性和同一性的那些。在這些通過一級結構水平上的最佳比對表徵的並且其結構數據已知的序列中，進行進一步的選擇，只集中在具有高解析度或者具有與我們所獲得的結構相當的解析度(即，不超過2.5)的經解析的結構上。這種方法保證了精確得多的三級結構的比對以及顯著得多的結構差異的評估，所述差異以RMS表示(均方根偏差均方偏差的平方根；Carugo和Pongor，2001和2003)。低解析度數據對於每個個別原子在空間上的實際相對位置提供了相當指示性的，並且是肯定不太精確的信息。
為了評定人來源或改造過的每種個別結構的重疊程度，計算構成各個胺基酸骨架的α碳原子之間的RMS，不考慮具有超過2的RMS的原子對。由這種分析，獲得一種信息，因此其必須不僅考慮結構之間的差異(由RMS的值表示)，還要考慮在計算每個RMS中實際採用的α碳原子的百分比。
將這些三級結構水平相似性數據與一級序列在同一性和同源性上的比較性分析相關聯。
因此推論人源化最佳構架的選擇為一個三變量的問題，因而當將同源性水平和同一性程度兩者與結構比對相關聯時，其能夠在空間上表現出來。隨後進行這種類型的分析，還將兩種類型的比對中的目標區域歸併為各自構架的區域。
通過將所考慮的抗體在三個分析的變量(分別是，RMS的值，據其計算RMS的原子的百分比和在一級結構之間的相似性指數，即，整體同一性，整體同源性，構架水平上的同一性，在構架水平上的同源性的百分比)的空間中的分布與如果是人來源的話每種抗體將會佔據的在三個變量的空間中的最佳位置相比較，有可能清楚地鑑定人來源抗體，所述抗體在一級和三級結構水平上最接近這個理想的位置。為了使這一結果合理化，在四種分析的每一種中都對與假定的最佳位置的偏差進行計算以獲得所考慮的人源化或人來源抗體的每一位置。
在這種選擇方法的基礎上，有可能在進行CDR移植以進行給定抗體的人源化的隨後過程中選擇接納體構架。通常，必需使以鼠來源的殘基進行人來源的胺基酸殘基的取代最小化，因為鼠殘基的引入增加抗體在人患者體內誘導HAMA反應的危險。另一方面，互補決定區(CDRs)包含具有與抗原相互作用的更大可能性的殘基並且為此原因它們必須保持在人源化抗體中。使用根據Kabat的序列或使用根據Chothia的結構對它們進行定義。利用第二種系統定義它們的優點是通常CDRs較短並且因此人源化抗體由異種片段的更小部分構成。在任何情況下都已證明一般按照Kabat的定義有可能顯著地減少人源化所需的循環數。一旦定義了CDRs，就必需鑑定它們所屬的標準類別(由Chothia和Lesk所定義的)並且隨後在人源化抗體中保持標準殘基。
還必需分析介導可變結構域的輕鏈和重鏈之間相互作用的殘基(表1)，在人源化抗體中保持任何獨特的殘基(Singer等，1993；Daugherty
等；1991；De Martino等，1991)。
另外，基於胺基酸對於CDRs的構象和/或對於與抗原的相互作用的可能影響來選擇要保持的其它胺基酸。當胺基酸在動物來源的構架和人來源的等同接納體構架之間有所不同時，所述接納體構架的胺基酸應當被等同的鼠殘基取代，如果有理由預期所述胺基酸與抗原具有直接非共價接觸，或者鄰近CDR區，或者在任何情況下都與CDR區相互作用(它位於距離CDR區4-6)的話。
表1介導可變結構域的輕鏈和重鏈之間相互作用的殘基輕可變鏈L重可變鏈H

具體地，進一步的分析涉及限定所謂Vernier區的其它殘基，所述Vernier區是穩定CDRs結構的區域；重要的是保持此區的特性。
候選進行突變的其它殘基是接納體構架的胺基酸，其對於人免疫球蛋白在該位置上是獨特的。這些殘基能夠用源自更典型的人免疫球蛋白的等同位置的胺基酸進行取代，或者當所述胺基酸對於人免疫球蛋白在那些特定位置上為典型的時候，能夠將源自供體構架等同位置的殘基導入接納體構架中。
另外，再次在人免疫球蛋白共有序列的基礎上，將突變導入人源化形式中，其插入在人體內保守的殘基而非獨特殘基，所述獨特殘基存在於供體和接納體構架中。
隨後對各對晶體學結構進行修飾，首先進行動物來源的CDRs在人構架中的移植。隨後，引入上述的所有突變和逆向突變。隨後在合成的免疫球蛋白中裝配修飾的結構。利用力場通過使機械能最小化(在扭角和結合角以及距離方面)精化得到的模型。
對於所有其它區域而言，與上面討論的特異性胺基酸取代不同，人源化免疫球蛋白的構架區通常是與其所源自的人抗體的構架區基本上相同的。在任何情況下在這些通過移植獲得的改造蛋白質中，由於許多胺基酸取代、缺失或插入，末端或中間，以及其它改變，構架區可以相對於天然序列在一級結構水平上變化。自然地，構架區中的大多數殘基給抗體的特異性或親和性帶來非常小的或者甚至是不存在的貢獻。所以，在構架殘基中的許多個別保守性取代能夠被容忍而在得到的人源化免疫球蛋白中沒有可感知的特異性或親和性的變化。然而，通常這些取代是不希望有的。有可能以多種廣泛採用的技術，如位點特異性誘變(GillmanSmith，1979；Roberts等，1987)來獲得核苷酸序列的修飾。
或者，可以生產只包含一部分抗體一級結構的多肽片段，所述片段保留免疫球蛋白的一種或多種特有活性(例如，結合活性)。這些多肽片段能夠通過起始自完整抗體的蛋白酶解消化或者通過位點特異性誘變將終止密碼子插入在具有重鏈和輕鏈可變區編碼DNA序列的載體中的所需位置(特別是在CH1區之後以產生Fab片段或在鉸鏈區之後以產生(Fab′)2片段)的方式進行生產。通過使用接頭連接重鏈和輕鏈的可變區可以獲得scFv形式的抗體(Huston等，1988；Bird等，1988)。Fv或Fab片段能夠在大腸桿菌(Buchner和Rudolph，1991；Skerra等，1991)中或者也能夠在真核細胞，優選來源的哺乳動物細胞中進行表達。考慮到像許多其它基因一樣，免疫球蛋白超家族的基因包含截然不同的功能區，每個功能區的特徵為一種或多種特異性生物學活性，所述基因可以融合到源自其它基因(例如酶)的功能區上以產生提供了新特性的融合蛋白(例如免疫毒素)。
人源化免疫球蛋白序列在細菌中的表達能夠被用來選擇特徵為較高親和性的人源化免疫球蛋白，誘變CDR區並且產生用於噬菌體展示的噬菌體文庫。利用這些文庫，有可能在人源化免疫球蛋白的CDRs水平上尋找變異體中進行篩選，所述人源化免疫球蛋白具有對於抗原較高的親和性和/或結合特異性。已經詳細報導了獲得具有免疫球蛋白可變區序列的噬菌體展示文庫的方法(Cesareni，1992；Swimmer等，1992；Gram等，1992；Clackson等，1991；ScottSmith，1990；Garrard等，1991)。隨後將由此其CDRs得以改建的得自人源化免疫球蛋白變異體的序列在宿主中進行表達，所述宿主適於確保其高水平表達。
如上所述，DNA序列在可操作性地結合(即以這種確保其功能性的方式定位)到表達控制序列上後在宿主細胞中進行表達。這些載體一般能夠在宿主生物中作為游離體或者作為染色體DNA的整合部分進行複製。一般，所述表達載體包含可選的標記以允許鑑定已經用目標DNA序列轉化的細胞。
為了以scFv重組形式或者以Fab形式生產本發明的人源化免疫球蛋白，優選原核系統。大腸桿菌是對於克隆本發明的DNA序列特別有用的原核宿主之一。而且，現有大量的經充分表徵的啟動子，例如lac或trp操縱子或β-內醯胺酶或λ噬菌體。一般，這些啟動子控制表達並且具有核糖體結合位點，以便正確啟動並完成轉錄和翻譯。通過與聚乙二醇(PEG)綴合有可能提高在原核系統中生產的本發明的人源化免疫球蛋白的半衰期。
其它單細胞生物，如酵母，可以用於表達。選擇的宿主是酵母屬(Saccharomyces)，利用提供了表達控制、複製終止和起點序列的合適載體。
昆蟲細胞培養物也可以用來生產本發明的人源化免疫球蛋白，一般使用以穩定方式轉染的S2果蠅細胞或具有基於杆狀病毒的表達系統的Spodoptera frugiperda的細胞(Putlitz等，1990)。
植物和植物細胞培養物可以用於本發明的人源化免疫球蛋白的表達(LarrickFry，1991；Benvenuto等，1991；Durin等，1990；Hiatt等，1989)。
不過，在所有這些情況下都不可能獲得確保在激活人免疫系統中的效應子功能所必需的糖基化的正確類型。為此目的，有可能利用哺乳動物細胞的組織培養物來以IgG1的完整形式表達本發明的多肽，IgG1已經證明在多種免疫球蛋白之中對於免疫反應的誘導是最有效的同種型(Winnacker，1987)。應當強調的是，考慮到所述同種型決定抗體的裂解潛能，一般IgG1同種型被用於治療目的(因為它誘導細胞介導的和由補體系統介導的免疫反應)，而IgG4被用於診斷應用(Riechmann等，1988)。具體地，考慮到為了分泌完整免疫球蛋白而開發的大量宿主細胞系，其中有CHO細胞系，幾種COS細胞系，HeLa細胞，骨髓瘤細胞系(NS0，SP/2，YB/0和P3X63.Ag8.653)，轉化的B細胞或雜交瘤，優選哺乳動物細胞。這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列，如複製起點，啟動子，增強子(Queen等，1986)，和核糖體結合、RNA剪切和多聚腺苷酸化所需的序列，以及轉錄終止序列。選擇的表達控制序列是源自免疫球蛋白基因和源自病毒，如SV40，腺病毒，牛乳頭狀瘤病毒，巨細胞病毒等等的序列。一般，表達載體包括可選擇的標記，如對新黴素的抗性。
對於人源化抗體的表達，優選用無血清的培養基培養哺乳動物細胞系。例如，HUDREG-55細胞系能夠易於生長在來自Sigma(St.Louis，Mo.)的無血清和無蛋白的雜交瘤培養基Cat.No.S-2897中。
編碼本發明的人源化免疫球蛋白的基因能夠用來生成非人轉基因動物，其一般在可獲取的體液如奶或血清中表達目標人源化免疫球蛋白。這些轉基因包含可操作性地結合到啟動子上的編碼人源化免疫球蛋白的多核苷酸序列，通常具有增強子序列，如嚙齒類免疫球蛋白的增強子序列或酪蛋白基因的啟動子/增強子(Buhler等，1990；Meade等，1990)。使用同源重組構建體可以將所述轉基因轉移到細胞或胚胎中。所用的非人動物中有小鼠，大鼠，綿羊，牛和山羊(WO91/08216)。
一旦它們作為完整的抗體，單個輕鏈和重鏈，或以其它方式進行表達就可以根據標準方法，如硫酸銨沉澱、親和柱、柱層析，它們的二聚體、對本發明的免疫球蛋白進行純化(Scopes，1982)。對於藥物學應用，基本上純的免疫球蛋白是必需的，最小同質性為90和95％之間，但是優選在98和99％之間或者甚至更高。一旦部分純化或純化至所需同質性，就可以將蛋白質用於治療性用途(也是以體外(extra-body)的方式)，診斷性用途(成像進行腫瘤或阿爾茨海默氏病的診斷)或開發和進行生物化學測定，免疫螢光染色等等(一般見，Lefkovits和Pernis，1979和1981)。
本發明的藥物應用涉及人源化免疫球蛋白MNAC13以免疫毒素形式消除表達TrkA的細胞的用途(在胰腺和前列腺腫瘤的情況下)。所述免疫毒素的特徵是兩種組分並且特別適於在體外和體內殺傷特定細胞。一般對於細胞致死的細胞毒性劑的一種組分被吸收或者如果它與細胞表面相互作用的話。第二種組分提供將毒性劑引導至特定靶細胞類型上的手段，所述特定靶細胞類型如表達TrkA接納體表位的細胞。通過任何一種現有的大量化學方法將這兩種組分相互進行化學結合。例如，當細胞毒性劑是蛋白質而第二種組分是完整的免疫球蛋白時，所述連接可以通過交叉結合和異雙功能劑(SPDP，碳化二亞胺，戊二醛)進行介導。或者，所述兩種組分可以進行遺傳結合(Chaudhary等，1989)。Thorpe等(1982)報導了各種免疫毒素的生產。
大量的細胞毒性劑適於作為免疫毒素應用。細胞毒性劑可以包括放射性核素如碘131或其它碘的同位素，釔90，錸188和鉍212或其它發射α粒子的同位素，大量化療藥物如長春地辛，氨甲蝶呤，阿黴素和順鉑；以及細胞毒性蛋白質，如抑制核糖體的蛋白質(如美洲商陸抗病毒蛋白，假單胞菌外毒素和白喉毒素，蓖麻毒素A和植物來源的棒麥角素(clavin))或在細胞表面水平上具有活性的物質(如諸如磷脂酶C的磷脂酶)-Baldwin和Byers編輯，1985；美國系列號07/290,968；Olsnes和Phil，1982。應當強調的是免疫毒素的細胞毒性區自身可以是免疫原性的並且因此限制了在慢性或長期治療中融合蛋白的臨床有效性。避免毒素的免疫原性問題的備選方案是將抗體的結合結構域與一種能夠與DNA相互作用的蛋白質融合表達並且將包含毒素表達盒的表達載體結合到這種融合蛋白上。結合DNA的人蛋白魚精蛋白的多個正電荷能夠以穩定的方式與DNA的負電荷相互作用，生成中性電荷抗體的融合夥伴，比所述毒素自身穩定得多並且免疫原性更低。在通過接納體介導的內吞作用進行抗體-質粒複合物的內在化後，所述毒素的表達引發細胞的死亡。
另外，可以通過將可誘導的或細胞特異性的啟動子插入毒素表達盒中來進一步增強針對要消除的靶細胞的選擇性。這種方法的目的是使腫瘤細胞的選擇性消除最大化同時使毒副作用最小化(Chen等，1995)。
將免疫毒素引導至正確靶標上的組分包括以完整免疫球蛋白形式或結合片段形式存在或作為Fab或Fv片段的本發明的MNAC13人源化免疫球蛋白。一般，免疫毒素中的抗體是人同種型IgM或IgG，但是也可以使用其它恆定區。
本發明的抗體和藥物組合物對於給藥特別有用，這種給藥是根據有效的方法在病理學中所涉及的組織水平上引導抗體。這包括(但不限於)腹膜內、肌內、靜脈內、皮下、氣管內、口服、腸、胃腸外、鼻內或皮膚給藥。本發明的抗體一般能夠通過液體製劑的注射(腹膜內或顱內-一般在腦室中-或心包內或囊內)進行局部應用或通過固體製劑(以丸劑、片劑、膠囊的形式)或液體製劑(以乳劑和溶液的形式)的攝取來給藥。用於胃腸外給藥的組合物一般包含溶於相容性溶液，優選水溶液中的免疫球蛋白的溶液。在這些製劑中抗體的濃度可以從小於0.005％到15-20％變化並且它主要根據液體的體積、其粘度等，以及根據選定的特定給藥方式進行選擇。
或者，能夠以固體形式製備抗體用於給藥。抗體可以與不同的惰性或賦形物質組合，後者可以包括配體如微晶纖維素、明膠或阿拉伯膠；受體如乳糖或澱粉；試劑如藻酸、Primogel或玉米澱粉；滑潤劑如硬脂酸鎂，膠體二氧化矽；甜料如蔗糖或糖精；或香料，如薄荷和水楊酸甲酯。其它藥物給藥系統包括水凝膠、羥甲基纖維素、脂質體、微膠囊、微型乳劑、微球等。在受疾病如腫瘤侵襲的組織中直接局部注射是一種優選的本發明的抗體給藥的方法。
本發明的抗體可以進行冷凍或凍幹並且在重構使用之前在合適的緩衝液中。考慮到凍幹和重構能夠決定抗體活性的可變喪失(對於常規的免疫球蛋白而言，IgM類的抗體趨於比IgG類抗體具有更大的活性喪失)，必須校準給藥水平以補償這一事實。
由於它們的高度阻斷能力，含有本發明抗體的組合物能夠給藥進行預防和/或治療以阻止或減少與病理狀況或慢性疼痛相關聯的炎性成分，所說的慢性疼痛尤其是慢性內臟疼痛(與生理病症，如痛經、消化不良、胃腸道逆流、胰腺炎、內臟痛或過敏性腸症候群相關聯的)。
在預防性應用中，將包含本發明抗體的組合物向尚未患有特定疾病的患者給藥以提高他們的抵抗力。
本發明的抗體還提供一種減小前列腺或胰腺腫瘤體積和預防進一步腫瘤生長或者降低腫瘤生長速率的方法。這種效應可以由本發明的人源化抗體所介導，因為它們對於抑制NGF和TrkA之間相互作用極為有效，所述相互作用是以自分泌或旁分泌的方式維持腫瘤生長和發展所必需的。另外MNAC13的人源化形式與膜接納體相互作用並且因此也能夠用於瘤細胞的直接消除，因為它們能夠激活宿主的免疫反應(如果以IgG1的形式給藥的話)或輸送細胞毒性劑將它在癌實體的水平上進行定位(如果以免疫毒素的形式給藥的話)。
它們在腫瘤部位的給藥優選通過直接和定位注射入組織內或腫瘤部位附近來進行。對於全身性給藥，劑量從0.05mg/kg每天到500mg/kg每天變化，儘管優選所述範圍的下部區中的劑量，因為它們更易於給藥。可以對用量進行校準以便例如保證抗體在血漿中的特定水平(在大約5-30mg/ml的範圍內，優選在10-15mg/ml之間)並且維持這一水平持續一段給定的時間直到達到臨床效果。人源化抗體應當被消除得慢得多並且需要較低的劑量來維持血漿中的有效水平；而且，考慮到高親和性，與具有較低親和性的抗體相比給藥次數更少並且用量更小。基於腫瘤體積的減小或基於腫瘤生長速率或者理想地基於癌的病理狀態的完全消失，在治療過程中可以確定每種抗體的治療有效劑量。測定或評估胰腺或前列腺腫瘤階段的有效方法是基於血液中前列腺特異性抗原(PSA)的測定，基於胰腺腫瘤存活時間的測定，基於兩種腫瘤情況下轉移擴散的延緩或抑制的測定。
對於在腫瘤部位水平上的直接注射，劑量依賴於不同的因素，包括腫瘤的類型、階段和體積，以及許多其它變量。根據腫瘤體積，一般的治療劑量可以從注射0.01mg/mm變化到10mg/mm，所述劑量能夠以必要的次數進行給藥。另一種評估特定治療的有效性的方法是評估TrkA接納體的抑制，例如通過ELISA測定的方式測定其活性(Angeles等，1996)。
重要的是要強調TrkA不僅被視為治療性靶標還被視為診斷性靶標以進行體內成像，例如，進行TrkA陽性腫瘤的成像(作為陽性或陰性標記，根據腫瘤類型和起源)和對於基底前腦細胞的成像(作為阿爾茨海默氏病發生的早期標記)。本發明的MNAC13人源化抗體還能夠發現有廣泛的體外應用(ELISA，IRMA，RIA，免疫組織化學)。
對於診斷目的，所述抗體可以是標記的和未標記的。未標記的抗體可以與其它標記的抗體(二抗)組合使用，所述其它標記的抗體對於人源化的，或人抗體具有反應性(例如針對人免疫球蛋白恆定區的特異性抗體)。或者，抗體能夠直接進行標記。可以使用多種標記，例如放射性核素、螢光團、著色劑、酶、酶底物、酶因子、酶抑制劑、配體(特別是aptenic)等。許多類型的免疫學測定在該領域是可用的。
具體地，對於成像診斷應用，如Goding(1986)和Paik等(1982)所述，抗體上綴合了可以檢測的試劑或以同位素的方式(利用碘、銦、鎝的放射性同位素)或者以順磁性方式(順磁性原子或離子，如過渡元素，錒系元素和稀土元素；特別是，錳II，銅II和鈷II)進行標記。成像方法必需靜脈內、腹膜內或皮下注射(在淋巴引流區以鑑定淋巴結轉移)並且它們在免疫閃爍法中利用放射性核素髮射的檢測器(如閃爍β計數器)；如果代之以利用順磁性標記，則使用NMR(核磁共振)光譜計。


現在將參照下列附圖，在其非限制性實施方案中描述本發明。
圖1A)通過變性條件下的聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE 12％)和用考馬斯藍染色的方式進行MNAC13抗體Fab片段的純化結果的分析(孔1用木瓜蛋白酶蛋白酶解消化的MNAC13抗體樣品；孔2結合到DEAE Sephacell離子交換樹脂上並用NaCl 250mM洗脫的級分；孔3分子量；孔4純化和濃縮的MNAC13抗體的Fab片段)；B)MNAC13抗體的Fab片段的典型晶體；C)用MNAC13抗體的Fab片段的晶體獲得的高解析度衍射光譜；D)MNAC13抗體的Fab片段的重鏈和輕鏈的主鏈的扭角的Ramachandran圖。
圖2A)通過變性條件下的聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE 12％)和用考馬斯藍染色的方式進行αD11抗體Fab片段的純化結果的分析(孔1用木瓜蛋白酶蛋白酶解消化的αD11抗體樣品；孔2純化和濃縮的αD11抗體的Fab片段；孔3分子量)；B)αD11抗體的Fab片段的典型晶體；C)用αD11抗體的Fab片段的晶體獲得的高解析度衍射光譜；D)αD11抗體的Fab片段的重鏈和輕鏈的主鏈的扭角的Ramachandran圖。
圖3A)B)C)D)人源化的或人來源的抗體(利用它們的晶體學結構的PDB代碼命名的)根據三個分析的變量的分布；E)F)人源化的或人來源的抗體與MNAC13假定最佳值的偏差(考慮總體同一性和同源性的程度-用藍色-和構架水平-用洋紅色-而進行計算)；G)人源化的或人來源的抗體各個區域與MNAC13的Fv片段的結構比對，根據與鼠抗體的同一性和同源性程度以及現有結構數據的解析程度選擇所述抗體；H)I)在H)中選定的人源化抗體1AD0(以紅色顯示)各個區域與MNAC13的Fv片段(以青色顯示)的結構比對；在I)中CDR移植後得到的抗體模型(在構架水平上以黃色顯示，在CDR水平上以白色顯示)與MNAC13的Fv片段的結構比對；L)作為在選定構架中推定的逆向突變的鑑定結果獲得的MNAC13人源化抗體的Fv片段的模型(人來源殘基以綠色顯示而鼠來源殘基以洋紅色顯示)。
圖4A)B)C)D)人源化的或人來源的抗體(利用它們的晶體學結構的PDB代碼命名的)根據三個分析的變量的分布；E)F)人源化的或人來源的抗體與αD11假定最佳值的偏差(考慮總體同一性和同源性的程度-用藍色-和構架水平-用洋紅色-而進行計算)；G)人源化的或人來源的抗體各個區域與αD11的Fv片段的結構比對，根據與鼠抗體的同一性和同源性程度以及現有結構數據的解析程度選擇所述抗體；H)I)在H)中選定的人源化抗體1JPS(以紅色顯示)各個區域與αD11的Fv片段(以青色顯示)的結構比對；在I)中CDR移植後得到的抗體模型(在構架水平上以黃色顯示，在CDR水平上以白色顯示)與αD11的Fv片段的結構比對；L)作為在選定構架中推定的逆向突變的鑑定結果獲得的αD11人源化抗體的Fv片段的模型(人來源殘基以青色顯示而鼠來源殘基以紫色顯示)。
圖5分別為MNAC13(SEQ ID No.22，SEQ ID No.24)的，選擇進行人源化的人源化抗體(1AD0；SEQ ID No.39，SEQ ID No.40)的，在1AD0構架上CDR移植後MNAC13的人源化形式的以及所述逆向突變和突變(Hum MNAC13SEQ ID No.37，SEQ ID No.38)的重鏈(A)和輕鏈(B)的可變區的一級結構的比對。通過下劃線特徵在MNAC13兩條鏈的人源化形式的序列中對CDRs突出顯示。
圖6分別為αD11(SEQ ID No.2，SEQ ID No.4)的，選擇進行人源化的人源化抗體(1JPS；SEQ ID No.19，SEQ ID No.20)的，在1AD0構架上CDR移植後αD11的人源化形式的以及所述逆向突變和突變(Hum αD11SEQ ID No.17，SEQ ID No.18)的重鏈(A)和輕鏈(B)的可變區的一級結構的比對。通過下劃線特徵在αD11兩條鏈的人源化形式的序列中對CDRs突出顯示。
圖7A)MNAC13的鼠形式的輕鏈可變區的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.23)；B)MNAC13的鼠形式的重鏈可變區的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.21)；C)和E)繪製來通過重疊裝配PCR技術獲得MNAC13輕鏈可變區人源化形式的寡核苷酸序列(SEQ ID No.38)L1SSEQ ID No.31；L2ASSEQ ID No.32；L3SSEQ ID No.33；L4ASSEQID No.34；L5SSEQ ID No.35；L6ASSEQ ID No.36，與相應的翻譯的胺基酸序列在一起顯示；D和F)繪製來通過重疊裝配PCR技術獲得MNAC13重鏈可變區人源化形式的寡核苷酸序列(SEQ ID No.37)H1SSEQ ID No.25；H2ASSEQ ID No.26；H3SSEQ ID No.27；H4ASSEQ ID No.28；H5SSEQ ID No.29；H6ASSEQ ID No.30，與相應的翻譯的胺基酸序列在一起顯示。
圖8A)αD11的大鼠形式的輕鏈可變區的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.3)；B)αD11的大鼠形式的重鏈可變區的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.1)；C)和E)繪製來通過重疊裝配PCR技術獲得αD11輕鏈可變區人源化形式的寡核苷酸序列(SEQ ID No.18)L1SSEQID No.11；L2ASSEQ ID No.12；L3SSEQ ID No.13；L4ASSEQID No.14；L5SSEQ ID No.15；L6ASSEQ ID No.16，與相應的翻譯的胺基酸序列在一起顯示；D和F)繪製來通過重疊裝配PCR技術獲得αD11重鏈可變區人源化形式的寡核苷酸序列(SEQ ID No.17)HISSEQ ID No.5；H2ASSEQ ID No.6；H3SSEQ ID No.7；H4ASSEQ ID No.8；H5SSEQ ID No.9；H6ASSEQ ID No.10，與相應的翻譯的胺基酸序列在一起顯示。
圖9質粒圖譜，所述質粒用來克隆通過重疊裝配PCR獲得的兩種抗體的人源化可變區的序列。A)pVLexpress針對輕鏈的可變結構域，B)pVHexpress針對重鏈的可變結構域，C)由在pVLexpress中克隆每種人源化抗體輕鏈的可變區而得到的質粒，D)作為在pVHexpress中克隆每種人源化抗體重鏈的可變區的結果而獲得的備選構建體1)為了以完整免疫球蛋白形式IgG1進行表達，2)為了以Fab片段形式進行表達，3)為了以免疫毒素形式進行表達。
圖10通過ELISA測定法比較以嵌合形式和以人源化形式存在的MNAC13抗體的結合活性，其固定在以免疫粘附素形式存在的可塑性TrkA上進行A)在隨後進行濃縮的，被轉染的COS細胞的上清液的系列稀釋液之間進行比較；B)在通過G sepharose蛋白質純化的轉染的COS細胞的上清液的系列稀釋液之間進行比較。
圖11通過ELISA測定法對以人源化形式存在的αD11抗體的結合活性的測定，其固定在可塑性NGF上進行。
具體實施例方式
MNAC13和αD11單克隆抗體的Fab片段的X-射線結構按照標準方法來獲得並純化兩種單克隆抗體。通過培養雜交瘤細胞，用29％硫酸銨沉澱來濃縮，隨後在PBS中進行透析使MNAC13 IgG1和αD11 IgG2a免疫球蛋白在上清液中表達。使用Protein G Sepharose(Pharmacia)柱通過親和色譜法來純化兩種免疫球蛋白。
在使用Spectra-Por 12/14K膜(Spectrum)在4℃於磷酸鹽緩衝液10mM pH 7，EDTA 20mM中進行透析後，每種樣品通過Centricon 50KDa超濾裝置(Amicon)來進行濃縮，以13mM Cys進行溫育，並用固定的木瓜蛋白酶(Pierce)(以1∶15的酶∶底物比例)在37℃處理5小時。純化各個Fab片段的方法是多樣化的，儘管其總是基於離子交換層析進行的。
在MNAC13的情形中，在相對於Tris HCl 100mM pH 8.0進行透析後，通過用相同緩衝液平衡的DEAE-Sephacel柱(Pharmacia)來去除Fc片段是可能的。在排除體積中收集FabMNAC13，同時用250mM NaCl洗脫Fc片段和未消化的IgG1的級分。通過在用Tris HCl 100mM pH 8.0，NaCl150mM平衡的Superdex G75(Pharmacia)柱上進行凝膠過濾使Fab片段與未消化的IgG1分離。通過在12％的聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離隨後用考馬斯染色來控制級分的同質性和純度(圖1A)。通過Lowry測定法(Bio-Rad)來測定純化的蛋白質的濃度。從11個雜交瘤surnatant中，獲得多達3mg的MNAC13 Fab(其純度超過99％)是可能的。
關於αD11抗體Fab片段的純化，將用木瓜蛋白酶處理的樣品相對於10mM pH 7.8的磷酸鹽緩衝液進行透析通過用這種相同的緩衝液平衡的DEAE-Sephacel柱(Pharmacia)來去除Fc片段。在排除體積中收集αD11的Fab片段，同時用250mM pH 6.8的磷酸鹽緩衝液來洗脫Fc片段和未消化的IgG2a的級分。通過在用10mM pH 7.8的磷酸鹽緩衝液，NaCl 150mM平衡的Superdex G75柱(Pharmacia)上進行凝膠過濾使Fab片段與未消化的IgG2a分離。通過在12％的聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離隨後用考馬斯染色來控制所述級分的同質性和純度(圖2A)。通過Lowry測定法(Bio-Rad)來測定純化的蛋白質的濃度。從11個雜交瘤surnatant中，獲得多達6mg的αD11 Fab(其純度超過99％)是可能的。
將在10mM Tris pH 8.0，50mM NaCl中純化的MNAC13抗體的Fab片段，和在10mM磷酸鈉pH 7.8和50mM NaCl中純化的αD11抗體的Fab片段通過Centricon 30KDa超濾裝置(Amicon)濃縮到5-10mg/ml。使用Crystal Screen I和II(Hampton Research-Laguna Niguel，CA，USA-)和篩選試劑盒(Jena BioSciences)，在因子組合方法(JancarikKim，1991)後，於16℃按照懸滴方法進行結晶實驗。
將2μl的濃縮蛋白質樣品的數滴加入等體積的包含沉澱劑的溶液中，並通過擴散與在24孔Linbro平板的儲器(0.7ml)中的溶液進行平衡。
對於MNAC13抗體的Fab片段，將以等體積的蛋白質和包含2M的硫酸銨的沉澱劑，5％v/v的異丙醇(Crystal Screen II，Reactant#5)，獲得的最有前景的初始結果進行優化直到獲得在約1周內生長的晶體，其類似於在圖1B中所顯示的。
對於αD11抗體的Fab片段，使用等體積的蛋白質和包含20％PEG4000，0.6M NaCl，100mM MES pH 6.5(試劑盒號4，溶液C2)獲得的最有前景的初始結果需要更長的優化過程，將沉澱劑的組成修改為PEG4000，0.6M NaCl，100mM BTP pH 5.5和在蛋白質和沉澱劑溶液之間的比例(1.5∶1)直到獲得在約1周內生長的晶體，其與在圖2B中顯示的類似。
在兩種情形中，在ELETTRA同步加速器(Trieste，義大利)的XRD1衍射線上採集初始的一組低解析度數據，接著，在ESRF同步加速器(Grenoble，法國)的ID14-EH1衍射線上採集第二組更完全的較高解析度的數據。在MNAC13抗體的Fab片段情形中，使用包含2.2M的硫酸銨，6％v/v的異丙醇和20％v/v的甘油作為低溫防護劑的溶液，用Oxford Cryosystems(Oxford，UK)的冷卻系統在液氮流下冷凍晶體。將每種蛋白的代表性高解析度衍射光譜顯示於圖1B和圖2B中。
分別使用DENZO和SCALEPACK程序(OtwinowskiMinor，1997)對所有的4組X-射線衍射數據進行處理，編入索引中，綜合併隨後進行定標，同時將CCP4(Collaborative Computational Project，第4期，1994)包用於數據處理。在下面的表中陳列了對MNAC13抗體的Fab片段的晶體的高和低解析度數據的採集和處理的統計數值X-射線源ELETTRAESRF波長()1.000 0.934檢測器 mar345 marCCD空間基團P212121P212121晶胞的參數a() 52.78 52.73b() 67.53 67.55c() 111.51 111.43鑲嵌度(Mosaicity)(°) 0.40 0.47解析度間隔() 12.0-2.50 17.0-1.80(2.59-2.50)(1.83-1.80)測量數 98688 414115以I≥0觀察的反射數 56918 227914以I≥0觀察的單一反射數 14203(1371)38392(1893)完全度(％) 99.5(99.3) 99.5(99.6)豐度4.0(4.0) 5.9(4.9)測量數據的I/σ(I) 9.4(4.7) 8.2(1.1)Rsym(％) 5.7(15.2) 6.3(39.8)類似地，下面的表總結了對於αD11抗體的Fab片段的晶體的高和低解析度數據的採集和處理的統計數值
X-射線源ELETTRAESRF波長()1.000 0.934檢測器 marCCD marCCD空間基團P1 C2晶胞的參數a() 42.685 114.801b() 50.626 69.354c() 102.69764.104α(°) 81.977 90.β(°) 89.116 117.02.γ(°) 85.957 90鑲嵌度(Mosaicity)(°) 0.44 0.40解析度間隔() 47.6-2.57 17.0-1.70(2.8-2.7) (1.75-1.70)測量數 124456 492594觀察的反射數I≥074241 399184觀察的單一反射數I≥023413(2162)47951(3198)完全度(％) 98.2(92.4) 97.2(78.4)豐度5.7 (5.2) 6.7(7.5)測量數據的I/σ(I) 29.6(6.7) 9.5(2.1)Rsym(％) 11.0(33.5) 5.8(27.8)其中在括號中的值指具有最高解析度的殼層。
考慮到可獲得的Fab片段的結構的高數目，確定兩種蛋白質的結構的最方便的方法是分子置換。在對於同源結構的在蛋白質資料庫(Berman等，2000)中的研究中，選擇標準優先考慮在可比較的解析度和最高水平的序列同一性之間的組合。在這些基礎上，分別地，選擇對於MNAC13∶1BM3以解析度2.0分辨的並具有重鏈和輕鏈分別為70和88％的序列同一性的在Opg2 Fab免疫球蛋白的Fab片段和由其識別的肽之間的複合物的結構(Kodandapani等1999)。
對於αD11∶1CIC以解析度2.5分辨的並具有重鏈和輕鏈分別為82和82.65％的序列同一性的獨特型-抗獨特型Fab片段FabD1.3-FabE225的複合物的結構(Bentley等1990)。
考慮到在可變區和恆定區之間由二元假對稱的軸形成的角的極端可變性分別使用恆定結構域和可變結構域，以各自的模型，通過使用AmoRe程序(Navaza，1994)的分子置換方法來獲得兩種結構的確定。在下面的表中顯示，在用剛性體精化後在確定MNAC13的Fab片段的結構中獲得的溶液

類似地，在下面的表中顯示在用空間基團C2的剛性體精化後，在確定αD11的Fab片段的結構中獲得的溶液

其中V＝可變結構域C＝恆定結構域αβγ＝Eurelian角(°)。
x，y，z＝平移(分數的)。
Cf＝振幅的相關性(x100)。
Rf＝結晶學R因子(x100)。
Ci＝強度的相關性(x100)。
Cp切餘Patterson函數的相關性(x100)。
通過循環方法來獲得兩種結構的隨後的精化，所述循環方法包括兩個交替的階段使用計算機圖解「O」的人機對話軟體(Kleywegt和Jones，1994)來手工構建該模型；使用CNS程序組，晶體學和NMR系統的自動方法(Brunger等1998)來進行位置精化和B各向同性熱因子的精化。在用剛性體精化的一些階段後的程序，預期不同的精化循環。一旦完成插入所有的突變和缺失來完善該模型，就進行水分子和任何離子和配體的定位。最後，在立體化學方面，在儘可能使模型維持接近理想值的同時，對位置權wa和熱因子B的權r-權進行優化。將描述獲得的MNAC13抗體的Fab片段的模型質量的統計數值和最終參數總結於下面的表中蛋白質原子的數目 3244溶劑原子的數目 351硫酸根離子的數目 4Tris分子的數目 1異丙醇分子的數目 1解析度間隔() 39-1.778最終R因子19.35％最終Rfree因子(根據10％的數據計算)23.22％Rms偏差結合距離() 0.008結合角(°) 1.456二面角(°) 27.29假角(°) 0.928平均各向同性熱因子(A2)完全蛋白質 23.55輕鏈 24.14重鏈 22.99水分子 31.95離子(硫酸根) 55.94Tris 46.06異丙醇 32.60類似地，將描述獲得的αD11抗體的Fab片段的模型質量的統計數值和最終參數總結於下面的表中蛋白質原子的數目3229溶劑原子的數目 403氯化物離子的數目1解析度間隔() 39-1.70最終R因子 19.54％最終Rfree因子(在10％的數據上計算) 24.22％Rms偏差結合距離()0.0096結合角(°) 1.6571二面角(°) 27.40假角(°)1.048平均各向同性熱因子(A2)完全蛋白質 25.58輕鏈24.14重鏈22.99水分子 38.80離子(氯化物)20.58而且，用PROCHECK程序組(Laskowski等，1993)通過最終的幾何分析來檢查兩種模型，如在各個表和在各個Ramachandran圖(圖1D和2D)中所顯示的。
MNAC13和αD11單克隆抗體的Fab片段的X射線結構在人來源的構架的選擇中的應用在人抗體構架的選擇中，按照上述方法，其將在一級序列水平上的鼠和人來源的抗體之間的同一性的程度與多肽骨架的結構相似性的程度相結合。
特別地，在通過在BLAST資料庫中檢索的一級結構的同源性和同一性兩者的最高水平的基礎上選擇人來源或人源化抗體的一系列可能的接納體構架。在考慮抗體的完整可變區並縮小對構架區的檢索的情況下，對於兩種封閉抗體進行這種選擇。
在選定的抗體的每個組中，僅考慮可獲得具有高解析度或具有與我們所獲得的結構的解析度相當的解析度(即，不大於2.5)的結構數據的抗體，在PDB(蛋白質資料庫)中進行檢索。接著，使用「疊加」軟體(Diederichs，1995)來對各個胺基酸骨架進行疊加。
圖3G和4G顯示在待人源化的抗體的一級結構的最佳比對和可獲得的結構數據的高解析度的基礎上選擇的，在Fv區域(分別為MNAC13和αD11的)和人源化或人來源的抗體的α碳原子骨架的三級結構之間比對的結果。
為了評價人來源或改造的每個個體結構的疊加的程度，關於MNAC13和αD11計算了構成各自的胺基酸骨架的α碳原子之間的RMS，不考慮具有超過2的RMS的原子對。
用於人源化的最佳構架的選擇為一個三變量的問題，因而當將同源性水平和同一性程度兩者與結構比對相關聯時，其能夠在空間上表現出來。然後進行這種類型的分析，還將在兩種類型的比對中的目標區域歸併為各個構架的區域。
如在圖3和4中所顯示，所考慮的抗體在三個分析的變量(分別為，RMS的值，據其計算RMS的原子的百分比和在一級結構之間的相似性指數，即整體的相似性-A-的百分比，整體同源性-C-的百分比，在構架水平上的同一性-B-的百分比，在構架水平上的同源性-D-的百分比)的空間中的分布對於考慮的兩種情形而言都是相互關聯和一致的。
另外，如果抗體是人來源的話，通過將這些分布與每種抗體將會佔據的在三個變量的空間中的最佳位置相比，有可能清楚地鑑定人來源抗體，所述抗體在一級和三級結構水平上最接近這個理想的位置。在兩種抗體的情況中，為了使這一結果合理化，在四種分析的每一種中都計算與假定的最佳位置的偏差以獲得所考慮的人源化或人來源抗體的每一位置(圖3E和3F針對MNAC13而圖4E和4F針對αD11)。在這種情況下，結果也是一致的並且證實了先前的跡象。
在這種選擇方法的基礎上，在隨後的CDR移植過程中選擇兩種不同的人源化抗體作為接納體構架以進行兩種抑制NGF/TrkA相互作用的抗體的人源化。具體地，圖3H和4H顯示兩種封閉抗體與各自選定的人源化抗體在Fv區水平上的結構比對，即利用PDB，對於αD11利用1JPS密碼而對於MNAC13利用1AD0密碼。圖3I和4I比較了鼠抗體與CDR移植後相同抗體模型的相同區域。
一旦限定了CDRs，就對它們所屬的標準類別(由Chothia和Lesk所定義的)進行鑑定並且隨後維持人源化抗體中的標準殘基對於每種抗體，在圖5和圖6中以下劃線的特徵對它們進行突出顯示。
關於隨後對要引入的逆向突變的分析，插入下列逆向突變以維持兩種結構域之間的界面，所述逆向突變的引入是為了維持介導可變結構域的輕鏈和重鏈之間相互作用的殘基對於MNAC13為L46和H35，H37對於αD11為L34，L46，L92和H35。
另外，為了維持Vernier區的特性，進行下列逆向突變對於MNAC13為L98對於αD11為H71(其在任何情況下都與人共有序列中表現的胺基酸殘基的取代相關)。
隨後，根據與人免疫球蛋白主要共有序列的比較，進行下列逆向突變對於MNAC13為L1，L2，L13，L50，L73，L104和H24，H48，H49，H73，H76，H82B，H87，H90，H93對於αD11為L56。
另外，再次在人免疫球蛋白共有序列的基礎上，將下列突變導入MNAC13的人源化形式中，所述突變插入在人體內保守的殘基而非存在於供體和接納體構架中的獨特殘基。
L42(L→Q)，L83(I→V)和H83(Q→R)，H89(I→V)。
為了同樣的理由，將下列突變引入αD11的人源化形式中。
H67(V→F)。
對各對晶體學結構進行修飾，首先進行動物來源的CDRs在人源化構架中的移植。隨後，引入上述的所有突變和逆向突變。隨後在合成的免疫球蛋白中裝配修飾的結構。利用力場通過使機械能最小化(在扭角和結合角以及距離方面)精化得到的模型。
MNAC13和αD11單克隆抗體的人源化在選擇構架的供體人源化抗體以實現MNAC13的CDR移植後，設計各自的可變區，其將MNAC13的鼠CDRs與根據上面所述突變修飾的人源化抗體的構架相組合。隨後對αD11進行類似的操作。基本上，通過基於重疊裝配PCR方法的操作，利用大約80個鹼基的寡核苷酸，可以獲得兩種人源化可變區，其更迭具有20個鹼基長的連續重疊的有義和反義鏈，這種更迭是以這樣的方式進行的，即允許部分雙鏈分子作為雜交的結果而形成(圖7B和8B)。在通過Vent聚合酶填補中斷後，利用兩種短寡核苷酸作為引物對所述雙鏈進行PCR擴增，所述短寡核苷酸具有雙鏈自身5』端的序列以及適於隨後定向克隆的限制性酶切位點(分別是，對於輕鏈可變結構域的克隆為ApaLI/BgIII而對於重鏈可變結構域的克隆為BssHII/BstEII)，這種克隆是在用各自的限制性酶進行消化後，對於輕鏈可變結構域在pVLexpress質粒中進行的(圖9A)而對於重鏈可變結構域是在pVHexpress質粒中進行的(圖9B)。這些載體允許以與克隆序列融合的方式分別表達人來源的恆定結構域Cκ和CH1，CH2和CH3。所以利用這些載體，有可能在像上面所列的那些人細胞系中以IgG1分子的形式表達兩種抗體(圖9C和9D1)。
為了獲得Fab片段形式的兩種人源化抗體，單獨作用於克隆了重鏈的載體是足夠的。具體地，有可能用單獨的CH1結構域取代完整的恆定部分，所述CH1結構域是利用在末端具有限制性酶切位點以進行SacII-XbaI定向克隆的特異性引物進行PCR擴增的(如圖9D2中所示)。
最後，為了獲得免疫毒素形式的MNAC13人源化抗體，有可能在恆定結構域CH1的羧基末端表達鹼性魚精蛋白，所述鹼性魚精蛋白是利用在末端具有限制性酶切位點以進行非定向Xba1克隆的特異性引物進行PCR擴增的(如圖9D3中所示)。
MNAC和αD11人源化抗體的表達和結合測定根據推薦的方案(Roche)通過FuGENE以1μg編碼每種人源化抗體的VH和VK的質粒DNA(共2μg)共轉染250,000個COS細胞。利用所述構建體獲得IgG1形式的人源化抗體。
與上述構建體的共轉染同時，對每種抗體共轉染相應的嵌合形式，即在CMV pVH express中克隆的鼠MNAC13的VH以及在CMV pVKexpress中克隆的鼠MNAC13的VK；關於αD11，將大鼠VH與人來源的Cγ在pcDNA1中進行融合克隆並且將大鼠VK與人來源的Cγ在pcDNA1中進行融合克隆。
轉染後72小時，收集含有由宿主細胞表達的免疫球蛋白的上清液，並利用Centriprep 50(Amicon)進行濃縮。
通過ELISA測定法確證兩種人源化抗體識別各自配體的能力並且與各自的嵌合形式進行比較。結果顯示於圖10和11中。
為了進行可塑性的固定，以含有這兩種抗體各自配體(純化的重組免疫粘附素TrkA Camel和由下頜下腺純化的鼠NGF)的溶液將96孔Maxi吸附平板於4℃溫育過夜，所述溶液是在0.1M pH 9.6碳酸鈉緩衝液中濃度為10μg/ml。
在用含有3％奶的PBS(MPBS)於環境溫度下封閉一小時後，以連續稀釋(1∶2，1∶20；1∶200)將濃縮的上清液進行溫育並且同時還與未轉染的COS細胞的上清液(陰性對照)一起溫育。
在用一抗(其識別人來源的恆定Cγ區)和用二抗(綴合了過氧化物酶的抗兔抗體)溫育後，有可能通過與TMB底物(TECNA)一起溫育的方式來檢測作為在450nm下的光密度(OD450)的結合活性。包括濃度為500ng/ml的各種單克隆抗體作為陽性對照。
圖10B顯示了類似ELISA測定的結果，所述ELISA測定是在通過親和色譜法純化表達的免疫球蛋白之後進行的。
詳細地說，收集轉染細胞的上清液，並且在通過離心去除細胞碎片後，將它們與100μl的Protein G Sepharose一起溫育並且在用PBS充分洗滌後，用1mM HCl洗脫每種蛋白質，並且在洗脫後立即用1M TrispH 8.8中和pH。以Lowry測定法評估各自的濃度。
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權利要求
1.進行已知序列的動物抗體的VH和VL可變區的人源化的方法，包括以下步驟a)如果不是現有的話，獲得動物抗體的VH和VL區的結晶學結構；b)基於和所述動物抗體構架一級序列最高水平的同源性和同一性，預選一系列0-n個人來源或人源化抗體的可能的構架接納體，以不小於3的解析度對其結構進行實驗性測定；c)分別進行動物抗體的VH和VL可變區與b)中獲得的VH和VL區之間的結構比較，並且計算每次比較的RMS，以鑑定具有較小RMS的人來源的VH區和VL區；d)將所述動物抗體的CDR區的序列插入於c)中鑑定的人序列中的合適位置；e)如果必要的話，將c)中鑑定的人VH區和VL區的一個或多個胺基酸殘基逆向突變。
2.如權利要求1中所要求的方法，其中以重組DNA技術進行抗體的修飾。
3.如權利要求1中所要求的方法，其中所述動物抗體是抗NGF抗體。
4.如權利要求2中所要求的方法，其中所述抗NGF抗體，優選地它是αD11抗體，並且人源化序列基本上具有下列序列VHHumαD11VH(SEQ ID No.17)和VLHumαD11Vk(SEQ ID No.18)。
5.如權利要求1中所要求的方法，其中所述動物抗體是抗TrkA抗體。
6.如權利要求4中所要求的方法，其中所述抗TrkA抗體是MNAC13抗體，並且人源化序列基本上具有下列序列VHHum MNAC13VH(SEQ IDNo.37)和VLHum MNAC13Vk(SEQ ID No.38)。
7.根據如在前任一個權利要求所要求的方法可以獲得的人源化動物抗體。
8.根據如在前任一個權利要求所要求的方法可以獲得的抗NGF人源化動物抗體。
9.根據如在權利要求5或6中所要求的方法可以獲得的抗TrkA人源化動物抗體。
全文摘要
進行已知序列的動物抗體的VH和VL可變區的人源化的方法，根據該方法可以獲得的人源化動物抗體，特別是抗NGF和抗TrkA人源化動物抗體。
文檔編號G06F19/16GK1906212SQ200480040565
公開日2007年1月31日 申請日期2004年12月23日 優先權日2003年12月24日
發明者A·卡特尼奧, S·科瓦瑟斯扎克, D·拉姆巴 申請人:雷萊恩基因組股份公司, 阿萬紮蒂－西薩國際高級學院