包含Tyrphostin化合物的藥物組合物的製作方法

2023-06-07 20:25:01 2

專利名稱：包含Tyrphostin化合物的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明是關於一類可用於對抗有害藥物試劑引起損害的組合物，這種有害藥物試劑特別包括用於癌症治療的抗腫瘤藥物如細胞毒性藥物。本發明中損害意指對細胞，組織或者是器官的有害作用。本發明還涉及對抗這種損害的治療方法。並且，本發明還提供了幾種用於這種組合物和治療方法的新型化合物。
背景技術：
絕大多數常用的抗腫瘤治療，包括化療和放療，都顯示對分裂的細胞和某些器官功能的有有害的毒性作用。特別易受這種治療影響的細胞是骨髓細胞，皮膚細胞和胃腸道上皮細胞。此外，這種治療還經常引起特定的器官損傷，如腎臟和肝臟。由於這種毒性作用，從而限制了這種治療的治療指數(therapeutic index)。
長時間以來醫學研究的一個願望是，試驗和開發既不影響藥物治療活性，又能降低有害毒副作用的治療方式和方法，從而提高這種藥物的治療指數。
程序性(apoptosis)或漸進性細胞死亡，是在胚胎發育和機體正常體內平衡過程中細胞死亡的基本生理學調節機制。最近的研究資料指出，許多化學治療劑的抗腫瘤作用，都與它們能夠誘發程序性細胞死亡有關。這些藥物試劑的毒性也可能與它們誘導正常細胞程序性細胞死亡有關。
已有初步報告論述，多種藥物試劑可用於防止使用抗癌藥引起的腎毒性(Skinner.R.,Current Opinion in Oncology,7:310-315,1995)。嘗試對抗因使用細胞毒性藥物順鉑引起的嚴重慢性近曲小管毒性。在對大鼠進行的體內試驗中，對-氨基苯甲酸(PABA)與順鉑一起共同給藥，導致順鉑的腎毒性降低，而不降低其抗腫瘤活性。其它一些藥物試劑如mitimazole，氯丙嗪和L-精氨酸，也用於在各種與順鉑毒性有關的體內試驗中對動物給藥，僅得到了一些初步的不明確的結果。
被脫磷酸產生硫羥部分的藥物氨磷汀也被用於降低抗腫瘤藥物的毒性作用(Cancer Res.55:4069,1995)。
本發明概述首先，本發明提供了一種藥物組合物，用於對抗，即降低或者防止對細胞或組織的損害，此組合物含有作為活性劑的有效量的通式Ⅰ的化合物以及可藥用載體
其中-Ar是下式基團，
或
-n是0，或者當Ar是上面結構式(ⅰ)時，則n也可以是1，R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHR3，或者當R1是4-NO2，以及R2是H或3-OH時，R也可以是下式基團，
或
在此R3是H，苯基，苯基(低級烷基)或吡啶甲基；-R1和R2各自獨立是H,OH,NO2，或者R是CN時，也可以是CH3,F，或CF3，條件是R1和R2不要同時是H。
該活性劑和藥物組合物，可以在各種疾病中給藥，或者使之與細胞或組織接觸，以便降低或防止對細胞，組織或器官的有害損傷。例如，這種疾病可能是導致細胞程序性死亡的疾病。防止這種有害的程序性死亡是本發明的特定實施方案。這種疾病還可能是使細胞，組織或器官暴露於有害因子，這類因子可能是外源性或內源性因子，以及其它一些可能導致損害的生理性疾病，例如溫度改變，血流減少，暴露於電離輻射等。有待預防的損害還可能是一種天然的生理學衰退過程的結果，例如那些在體外保存，生長或培養的細胞、組織或器官中發生的衰退過程。
本發明還提供了一種用於治療病人，對抗細胞，組織，器官損害的方法，包括對病人給予有效量的通式(Ⅰ)化合物。
名詞「有效量」應該被理解為意指對抗損害有效的活性化合物的量，而這種損害表現為對正常(無病的)細胞的破壞或者對組織或器官的損傷。
有害因子可能是外源性因素例如具有細胞毒性作用的治療藥物(如抗腫瘤藥)，放射作用，有毒的化學藥品等。此外，有害的因子也可能是內源性的，如在多種代謝過程中或其它紊亂中升高水平的自由基，自身抗體，細胞因子等。
本發明的藥物組合物還可用於如下範圍治療多種疾病，紊亂或病症，如AIDS，導致肝中毒的病症，輻射損傷，減少或抑制由於移植排斥作用對移植細胞或組織的損傷，用於治療中毒如撲熱息痛中毒，對抗治療藥物中有毒溶劑和載體的有害作用，對抗酒精引起的損害等。並且，該組合物還可以用於對抗不需要的免疫中介反應或炎症反應，如膿毒性休克，減少自身免疫反應引起的損傷，等等。最後，本發明的藥物組合物還可以用於在體外保存將用作移植的細胞或組織，減少或防止在移植之前的體外保存過程中將發生的細胞或組織的衰退或死亡等。
本發明的藥物組合物在對抗細胞毒性藥物或抗代謝藥物的，特別是例如用於癌症治療藥物的毒性作用中是非常有用的。有時，本發明的藥物組合物將和此細胞毒性藥物一起共同給藥。據此實施方案的藥物組合物可能含有這種藥物和上述結構式Ⅰ的化合物。
結構式Ⅰ的化合物屬於Tyrphostin化合物(Levitzki,A.，和Gazit,A.,Science,267:1782,1995)。在下面的敘述中，結構式Ⅰ的化合物將被稱為「Tyrphostin」，而含有這種化合物的組合物常常被稱為「Tyrphostin組合物」。
在來自結構式Ⅰ的Tyrphostin化合物中，有一些是已知的，但它們具有不同於本發明所提供的用途，而另一些是新穎的。這些新穎的Tyrphostin化合物構成了本發明的另一獨立方面，它們是如下的結構式Ⅰ化合物，其中Ar,R1,R2和R3定義同上，但條件是a)R不能是
b)當R是CN，並且n是0時，那末(ba)如果R1和R2中的一個是H或OH，則另一個不能是NO2，(bb)如果R1和R2中的一個是H或F，則另一個不能是H或F，以及c)當R1是4-NO2,R2是H，和n是0時，則R不能是-C(O)NH2，或-C(S)NH2。
用於該組合物的優選的式Ⅰ化合物，是那些其中R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHCH2C6H5或如下結構式的基團
並且n是0,R1是4-NO2,R2是H。
tyrphostin化合物實例被列舉在化合物表1中。列舉在化合物表1中的一些tyrphostin化合物是新穎的，這些新穎的tyrphostin化合物也被列舉在化合物表Ⅱ中。
化合物表Ⅰ
1該號碼指下文所附的參考文獻號化合物表Ⅰ(續)
化合物表Ⅱ(新化合物)
本發明所使用的某些已知化合物的參考文獻列表1．Mowry,D.T.,J.Am.Chem.Soc.,67:1050,1945.
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本發明特別優選的tyrphostin化合物，是在上面「化合物表Ⅰ」中被指定為AG1714,AG1744,AG1801和AG1843的化合物。這四個化合物中，後二個是新的。
式Ⅰ的tyrphostin化合物可以同另一種治療劑結合對病人給藥，例如同細胞毒性藥物或放療劑結合。在這種協同治療中，tyrphostin化合物可以同其它治療同時進行，或者不同時間進行，以便產生最大的效果。一個特別的例子是在給予其它治療之前給予tyrphostin化合物，例如在放療或給予細胞毒性藥物之前幾小時給藥。
本發明發現，當把結構式Ⅰ的tyrphostin化合物同另一種治療劑一起給藥時，它們不會降低另一種活性劑的治療活性，而是有助於降低對正常細胞或組織不希望有的毒副作用。這意味著，以相同劑量的治療劑，仍然可達到所希望的相同治療效果。例如，在使用化療藥物的情況下，以一定的給藥劑量給予tyrphostin化合物，對藥物降低腫瘤重量或者阻止腫瘤生長或復發的作用沒有影響，或者可能只有極小的影響。但是，在某些情況下，給予tyrphostin化合物甚至會增強這種治療作用。因此在這種組合治療中，tyrphostin化合物的總體作用是增加另一種治療的治療指數，也就是說，增加其治療作用與其有害毒副作用之間的比率。治療指數增加有時可能對增加治療劑的劑量是有利的，例如，增加細胞毒性劑或放療劑的劑量，而不會同時增加有害的毒副作用。
本發明的tyrphostin可以是一次給藥，或者在一段時間內，例如，在以細胞毒性劑治療或放療之前，之中和之後重複給藥。
tyrphostin對人的優選給藥方式是靜脈內給藥，儘管如此通過適當地配製，也可以按其它方式給藥，例如肌肉注射，腹膜內注射或口服給藥。
雖然tyrphostin組合物一般都包含一個tyrphostin化合物，但有時也可能以組合物和/或共同給藥的形式，包含2個或幾個tyrphostin化合物，它們以協同或補充的方式共同發揮作用來對抗由例如治療過程引起的損傷。
附圖簡述

圖1A圖解顯示用阿黴素處理的小鼠死亡率，與在用阿黴素處理之前二小時接受一次AG1714注射給藥的小鼠死亡率相比較。
圖1B圖解顯示用順鉑處理的小鼠死亡率，與在用順鉑處理之前二小時接受一次AG1714注射給藥的小鼠死亡率相比較；圖2圖解顯示21天內接受10次腹膜內注射阿黴素(5mg/kg，累積劑量50mg/kg)的小鼠死亡率，與同樣處理，並且在每次阿黴素注射之前二小時接受一次AG1714腹膜內注射(5mg/kg)的小鼠死亡率相比較；圖3圖解顯示僅用順鉑處理的，或者在順鉑給藥後的10天時間內以順鉑和AG1801處理的小鼠死亡率；圖4圖解顯示僅用阿黴素處理的，或者在阿黴素給藥後10天的時間內以tyrphostin化合物和阿黴素處理的小鼠死亡率；圖5圖解顯示多種tyrphostin化合物對順鉑處理小鼠腎毒作用的影響。這種毒性作用是通過檢測被處理小鼠血清中肌酸酐的水平來測定的，高水平肌酸酐表明腎臟受損傷(腎毒性)；圖6圖解顯示對小鼠僅給予順鉑或AG1714，或者合併給予順鉑和AG1714後，血清中的肌酸酐(圖6A)和血脲氮(BUN)(圖6B)水平(它們表明腎毒性)。此肌酸酐和BUN水平與只給予賦形劑的對照小鼠血清中相同物質的水平相比較；圖7的照片顯示對僅給予順鉑的小鼠，或在給予順鉑之前先給予tyrphostin AG1714的小鼠所進行的腎臟(圖7A-C)和小腸(圖7D-F)的組織病理學分析。最後的放大倍數為×400；圖7A-未處理的正常小鼠腎組織；圖7B-僅給予順鉑的小鼠腎組織，顯示近曲小管內有蛋白質大斑塊；圖7C-在給予順鉑之前先給予AG1714的小鼠腎組織，顯示正常的腎組織結構；圖7D-未處理的小鼠小腸組織；圖7E-僅給予順鉑的小鼠小腸組織，顯示嚴重的壞死和損傷；圖7F-在給予順鉑之前先給予AG1714的小鼠小腸組織，顯示正常的小腸組織結構；圖8圖解顯示僅給予抗-FAS抗體注射液的小鼠，或者合併給予tyrphostin AG1801的小鼠血清中二種轉氨酶，天冬氨酸轉氨酶(AST)和丙氨酸轉氨酶(ALT)的水平。轉氨酶的高水平表明抗-FAS抗體誘發了對肝臟的損傷(肝毒性)，圖9圖解顯示，僅給予抗-FAS抗體注射液的小鼠，或者合併給予tyrphostin AG1714的小鼠血清中二種轉氨酶AST和ALT的水平，轉氨酶的高水平表明抗-FAS抗體誘發了對肝臟的損傷(肝毒性)；圖10圖解顯示，僅用ConA處理的小鼠，或者合併給予AG1714的小鼠血清中AST和ALT水平；圖11圖解顯示用TNF/GalN處理的小鼠，或者合併給予tyrphostinAG1714的小鼠血清中AST和ALT水平；圖12圖解顯示，僅以阿黴素處理的，僅以AG1714處理的，或者以它們合併處理的小鼠股骨骨髓中，具核骨髓細胞的數量(圖12A)，或集落形成單位(CFU)(圖12B)的數量；圖13圖解顯示，僅以阿黴素處理的，或者以AG1714和阿黴素處理的小鼠骨髓中具核細胞的數量；圖13A顯示給予不同劑量阿黴素的小鼠骨髓中具核細胞的數量；圖13B顯示用阿黴素處理後，在不同時間被處理小鼠的骨髓中具核細胞的數量；圖14圖解顯示，僅以阿黴素處理的，或者在阿黴素給藥之前先以AG1714處理的小鼠脾重量(圖14A)和胸腺重量(圖14B)；圖15圖解顯示僅以5FU處理的，或者以5FU和AG1714處理的小鼠股骨中具核骨髓細胞的數量；圖16圖解顯示僅以絲裂黴素-C處理的，或者以絲裂黴素-C和AG1714處理的小鼠股骨中具核骨髓細胞的數量；圖17圖解顯示僅以阿黴素處理的，或者在阿黴素給藥之前不同時間以AG1801處理的小鼠骨髓中具核細胞的數量；圖18圖解顯示放射性照射的小鼠(300R)和照射之前先以tyrphostin AG1714處理的小鼠骨髓中具核細胞的數量；圖19圖解顯示放射性照射的小鼠(450R)和照射之前先以tyrphostin AG1714處理的小鼠骨髓中細胞的數量；圖20圖解顯示以致死劑量照射(800R)後小鼠的死亡率，同在照射之前用tyrphostin AG1714處理的小鼠死亡率相比較，顯示照射後23天內的死亡率；圖21圖解顯示以MCA-105肌纖維瘤細胞(圖21A)，路易士肺癌細胞(圖21B)，或B-16黑素瘤細胞(圖21C)接種的，並且用順鉑或AG1714單獨治療，或者用順鉑和AG1714合併治療的小鼠肺重量；圖22圖解顯示負有SK-28人黑素瘤細胞腫瘤的，並且用阿黴素，AG1714或用它們合併治療的裸鼠肺重量；圖23圖解顯示在用順鉑或AG1714單獨治療，或者用它們合併治療的小鼠中，人卵巢癌腫瘤(OVCAR-3)的體積；圖24圖解顯示，在上面圖23中所述的，反覆接受給藥治療的小鼠中，OVCAR-3腫瘤的體積；
圖25圖解顯示，在用順鉑或AG1801單獨治療，或用此二者合併治療的(圖25A)，或者用阿黴素，或AG1801單獨治療，或用它們合併治療的(圖25B)負有MCA-105肌纖維瘤的小鼠中肺的重量；圖26圖解顯示用順鉑或AG1801單獨治療的，或者用此二者合併治療的小鼠肺重量；圖27圖解顯示，在含有或不含有各種濃度AG1714下生長的骨髓細胞培養物中，集落形成單位(CFU)的數量；圖28圖解顯示，存在或不存在AG1714下生長的胸腺細胞，在對細胞加入AG1714後不同時間的生存能力；圖29圖解顯示，作為細胞生存能力指示的，存在或不存在AG1714下生長的培養心肌細胞每分鐘的搏動次數；圖30圖解顯示，存在或不存在AG1714時，以鼠腹膜滲出物胞毒淋巴細胞(PEL)胞溶EL-4靶細胞而導致其特異性51Cr釋放的百分數來測定的細胞溶解百分數。
製備實施例在下面的製備實施例中，示範性地製備了幾個上述的新穎化合物。在下面所有的實施例中，這種新穎化合物是通過醛與丙二腈或其取代的醯胺，進行knoevenagel縮合反應來合成的。實施例1-AG1801將0.45g,3mM對-硝基苯甲醛，0.61g,3.5mMN-(氰基乙醯)苄醯胺(參考文獻9)和50mgβ-丙氨酸在20ml乙醇中回流加熱5小時。冷卻，過濾後得到0.67g淡黃色固體物，產率73％,mp-164°。NMR(CDCl3)δ8.44(1H,S，乙烯基)，8.35,8.07(4H,AB,JAB=8.8Hz),7.35(5H,m),6.6(1H,br.t,NH),4.63(2H,d,J=5.8Hz)。
MS-m/e307(M+,50％),290(M-HCN,63),260(M-H-NO2,91),201(M-NHCH2C6H5,15),173(M-CONHCH2C6H5,13),155(22),127(21),105(100)。實施例2-AG1798將0.4g2.65mM對-硝基苯甲醛，0.57g,2.8mMN(氰基乙醯)3-丙苯醯胺(參考文獻9)和40mgβ-丙氨酸在30ml乙醇中回流加熱4小時。然後通過蒸發使此溶液濃縮，冷卻，過濾後得到0.38g淡黃色固體物，產率43％,mp-98°。
NMR(CDCl3)δ8.38(1H,S.乙烯基)，8.35,8.06(4H,ABq,JAB=8.6Hz),7.3(5H,m),3.50(2H,J=8.0Hz),2.74(2H,t,J=8.0Hz),2.0(2H，五重峰，J=8.0Hz)。實施例3-AG1719將146mg,0.87mM3-羥基4-硝基苯甲醛，48mg,0.89mM丙二腈二聚物和20mgβ丙氨酸，在10ml乙醇中回流加熱1小時。蒸發後以CH2Cl2-己烷研磨，過濾得到190mg黃色固體物，產率78％，mp-105°。NMR(丙酮d6)δ8.32(1H,d,J=8.6Hz),8.20(1H,S，乙烯基)，7.77(1H,d,J=2.2Hz),7.65(1H,dd,J=8.6,2.2Hz)。實施例4-AG1762將170mg,1mM 3-氟4-硝基苯甲醛，80mg,1.2mM丙二腈和15mgβ-丙氨酸回流加熱1小時，蒸發後以已烷研磨，過濾得到202mg，粉紅色固體，產率93％mp-120°。NMR(CDCl3)δ8.22(1H,m)，7.83(3H,m)。
MS-m/e217(M+,100),187(M-NO,78),171(M-NO2,19),159(M-NO-HCN-H,80),151(M-NO2-HF,33),144(M-NO2-HCN,71),132(75),124(M-NO2-HCN-HF,81)。實施例5-AG1799將0.4g2.65mM4-硝基苯甲醛，0.51g,2.8mM苯磺醯乙腈和40mgβ-丙氨酸，在30ml乙醇中回流加熱4小時。冷卻後過濾，並用乙醇洗，得到0.68g淡黃色固體，產率82％,mp-158°。NMR(CDCl3)δ8.36(2H,d,J=8.6Hz),8.31(1H,S，乙烯基)，8.07(4H,m),7.70(3H,m)。生物活性和治療活性實施例在下面的非限制性實施例中，將必要時參照附圖，對可用於本發明組合物的某些化合物的生物活性和治療作用，作例證性說明。Ⅰ．用tyrphostin化合物降低由阿黴素或順鉑引起的小鼠死亡率實施例6將6周齡的雌性CD1小鼠如下分組ⅰ．腹膜內注射(i.p)阿黴素(20mg/kg)的小鼠，ⅱ腹膜內注射順鉑(14mg/kg)的小鼠，ⅲ．在給予阿黴素之前2小時，一次腹膜注射AG1714(20mg/kg)的小鼠，ⅳ．在給予順鉑之前2小時，一次腹膜注射AG1714(20mg/kg)的小鼠。
如圖1中可見，與僅給予阿黴素的小鼠死亡率(P≤0.001)(圖1A)，或僅給予順鉑的小鼠死亡率(P≤0.005)(圖1B)相比較，以AG1714處理的小鼠，顯著地降低了小鼠的死亡率。實施例7將6周齡的雌性CD1小鼠分為如下二組ⅰ．在21天內，以每次注射5mg/kg的劑量，進行10次腹膜內阿黴素注射(累積劑量為50mg/kg)的小鼠，ⅱ．在21天內，以5mg/kg的劑量進行10次腹膜內阿黴素注射，並在每次阿黴素注射之前2小時，補充一次腹膜內注射AG1714(5mg/kg)的小鼠。
每組由10隻小鼠組成，並如上面所述，對每組小鼠的死亡百分率進行檢驗。
如圖2中可見，與僅用阿黴素處理的小鼠的高死亡率相比較，在每次阿黴素給藥之前給予AG1714注射液的小鼠的死亡率顯著降低了。實施例8對二組CD1小鼠如上所述注射順鉑14mg/kg。其中一組在給予順鉑注射液之前2小時，以1mg/kg的低劑量腹膜內給予一次AG1801注射液。如在圖2中可見，僅給予順鉑組中的所有小鼠，在注射後10天內全死亡。與此對比，在順鉑注射之前給予一次低劑量AG1801注射液的小鼠組中，死亡率僅為20％。實施例9將CD1小鼠分成如下5組ⅰ．腹膜內一次注射阿黴素20mg/kg的小鼠，ⅱ．腹膜內一次注射AG1714 20mg/kg的小鼠，並在2小時後腹膜內注射阿黴素20mg/kg，ⅲ．腹膜內一次注射AG1782 20mg/kg，並在2小時後腹膜內注射阿黴素20mg/kg的小鼠，ⅳ．腹膜內一次注射AG126 20mg/kg，並在2小時後腹膜內注射阿黴素20mg/kg的小鼠。
通過每天記錄死亡小鼠的數目，直到注射後10天，來確定上面各組小鼠的百分死亡率。
如圖10所示，在僅給予阿黴素的小鼠組(ⅰ)中，在注射後的1周內，90％的小鼠死亡了。在阿黴素給藥之前給予tyrphostin化合物的其它小鼠組中，死亡率降低到50％(ⅲ)-10％(ⅱ)。Ⅱ．用tyrphostin化合物降低多種有害藥物試劑對受處理小鼠器官(腎，肝，腸，心)的毒性作用實施例10對每組包括3隻小鼠的多組CD1小鼠，以14mg/kg的劑量腹膜內注射順鉑。在注射順鉑之前2小時，對除1組以外的各級小鼠以10mg/kg的劑量腹膜內注射了一次tyrphostin化合物。為了測定順鉑對受處理小鼠腎的毒性作用(腎毒性)，順鉑給藥後4天，用Sigma生產的商品試劑盒，檢測了每隻小鼠血清中肌酸酐的水平。
如在圖5中可見，在僅給予順鉑的小鼠血清中檢測的肌酸酐水平是大約2mg/dl，表明這些小鼠的腎功能降低了大約50％。與僅給予順鉑的小鼠血清中肌酸酐水平相比較，在順鉑注射給藥之前給予tyrphostin化合物注射液的許多小鼠血清中，測定到較低水平的肌酸酐。這表明，在順鉑注射給藥之前注射tyrphostin化合物，可降低順鉑對腎功能的毒性作用。不同的tyrphostin化合物對降低順鉑腎毒性的作用各不相同。例如，AG1824,AG1744,AG1751,AG1714,AG1823,AG1782,AG1801明顯地降低了順鉑的腎毒性，使血清中肌酸酐的水平接近對照小鼠的水平。實施例11對雌性CD1小鼠單獨注射順鉑，或者在注射順鉑之前2小時注射一次tyrphostin AG1843或AG1714，然後如上所述，測定它們血清中肌酸酐的水平。
如從下面表1中可見，與上面實施例10的結果一致，從它們的高血清肌酸酐水平(1.53)表明，單獨給予順鉑對小鼠具有腎毒性作用。通過在注射順鉑前2小時注射tyrphostin化合物，順鉑的這種毒性作用被顯著降低了(為0.45-0.70)。在此實施例中，tyrphostin AG1843的作用，以低劑量(5mg/kg)給藥比以高劑量(20mg/kg)更有效。
表1
實施例12如上面所述，給CD1小鼠(腹膜內)注射順鉑(14m/kg)，或者先注射AG1714(10mg/kg),2小時後注射順鉑，對照組小鼠僅注射賦形劑(以生理鹽水稀釋的乙醇chemaphore(50∶50)貯備液)。給予順鉑4天之後，測定了每隻小鼠順鉑給藥後4天的血清中幾個指示腎毒性和肝損傷的參數。指示順鉑腎毒性的參數是肌酸酐和血脲氮(BUN)，指示肝損傷的參數是以標準方法測定的肝臟轉氨酶，丙氨酸-轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST)。每組由3隻小鼠組成，結果以測定參數的平均值±SD表示。
如圖6所示，僅給予小鼠順鉑導致肌酸酐(圖6A)和BUN(圖6B)水平升高。下面表2顯示了這些小鼠的ALT和AST水平也升高了。這些結果表明，由於給予小鼠順鉑，既產生了腎毒性，又導致了肝損傷。如圖6和表2所示，在注射順鉑之前2小時給予AG1714，導致所有4個檢測參數降低至對照小鼠所測定的正常水平。
表2AG1714對順鉑誘發的腎和肝損傷的預防作用
實施例13對CD1小鼠以14mg/kg順鉑注射給藥，或者先腹膜內注射一次tyrphostin AG1714,2小時後注射14mg/kg順鉑。用甲醛固定的組織切片，以蘇木精伊紅染色，對未經處理和經處理小鼠的腎和小腸進行了組織病理學分析。
如圖7中所示，在僅給予順鉑的小鼠腎臟，近曲小管中顯示有大的蛋白質斑塊(7B)，以及在柱狀上皮中顯示有顆粒狀物質。與此相對照，在給予順鉑之前注射AG1714的小鼠腎臟(7C)沒有顯示出損傷，它們的結構與對照小鼠的(7A)相似。
也如圖7中所示，僅給予順鉑的小鼠小腸(7E)顯示有小腸柱狀上皮細胞嚴重壞死和瓦解，相比之下，在順鉑給藥之前給予AG1714的小鼠小腸(7F)，顯示出類似於在未受處理的小鼠小腸(7D)中所見到的正常結構。實施例14為了測定AG1714對阿黴素誘發的心臟毒性的預防作用，按照標準化程序(在如下文獻中所述毒物學體外試驗，模型系統和方法，McQueen.Telford Press New Jersey出版，1990,163頁，新生大鼠心肌細胞的初級培養物；和Kessler-Icekson,G.,J.Mol Cell Cardiol.20:649-755,1988)製備了7天的初級大鼠心肌細胞培養物。
將此心肌細胞培養物分成如下4組ⅰ．僅給予賦形劑的細胞(對照)，ⅱ．以20μM最後濃度給予AG1714的細胞，ⅲ．以10μM的濃度給予阿黴素的細胞，和ⅳ．以20μM最後濃度給予AG1714後1小時再加入阿黴素(10μM)的細胞。
開始溫育後24小時測定心肌細胞叢(「微小的心臟」)的搏動速度。
如表3中所示，在僅以阿黴素溫育的細胞培養物中，每分鐘搏動次數顯著地降低至僅以賦形劑溫育的對照培養物搏動次數的大約20％。相比之下，在以阿黴素和AG1714一起溫育的培養物中，每分鐘搏動的次數類似於在對照培養物中每分鐘搏動的次數。在溫育後16小時和40小時，在上面的心肌細胞培養物中也看到了類似的結果(未報告)。因此，在加入阿黴素之前1小時以AG1714溫育此培養物，可預防阿黴素對細胞培養物的心臟毒性作用。
表3AG1714對阿黴素誘導的心臟毒性的預防作用，體外試驗<
實施例15FAS抗原是一種細胞表面蛋白，屬於雙因子/神經生長因子受體家族，已顯示具有介導細胞程序性死亡的作用(Itoh,N，等人，Cell.66:233-243(1991))。對小鼠腹膜內給予抗-FAS抗體，導致嚴重的細胞程序性死亡的肝損傷。
為了測定tyrphostin AG1801和AG1714對於抗-FAS抗體誘發肝毒性的作用，給Balb/C小鼠腹膜內注射AG1801(5mg/kg)或AG1714(5mg/kg)。2小時後以5μg/只小鼠的劑量腹膜內注射抗-FAS抗體。另一組小鼠僅給予抗-FAS抗體注射液，預先未接受tyrphostin處理。注射抗-FAS抗體後5小時將動物處死，測定處死小鼠血清中二種轉氨酶AST和ALT的水平這一種轉氨酶的高水平可指示肝毒性(Ogasaware,J.等人，Nature,364:806-809,1993)。
如圖8和9中所示，僅以抗-FAS抗體處理的小鼠血清中AST和ALT的水平非常高，表明FSA抗體誘發了肝毒性。
對比之下，在注射抗-FAS之前以AG1801(圖8)或AG1714(圖9)處理的小鼠血清中，二種轉氨酶AST和ALT的水平顯著降低。因此，對小鼠給予tyrphostin化合物，可使之產生對抗由抗-FAS抗體誘發的肝毒性的作用。實施例16T-細胞介導的肝毒性是多種紊亂的疾病如B型肝炎病毒感染的併發症。這種肝毒性可通過注射伴刀豆球蛋白A(Con A)來誘發。按如下方法(見Tiegs.G.等人，J.Clin.Invest.90:196-203,1992)測定了AG1714對Con A誘發的小鼠肝毒性的作用。
將CD1小鼠分成如下各組ⅰ．小鼠僅給予賦形劑注射液(對照組)；ⅱ．小鼠腹膜內注射AG1714(10mg/kg)；ⅲ．小鼠靜脈內注射Con A(35mg/只)；和ⅳ．小鼠腹膜內注射AG1714(10mg/kg),2小時後靜脈內注射Con A(35mg/只)。
小鼠注射Con A之後6小時，如上所述測定經處理小鼠血清中肝臟酶AST和ALT的水平。這二種酶血清中含量增加反映出肝損傷。
如圖10中所示，單獨給予AG1714對小鼠沒有影響，而注射Con A對小鼠引起了顯著的肝毒性。Con A給藥之前給予AG1714，顯著地降低了Con A對這些小鼠誘發的肝毒性。實施例17現在已知道，多種免疫機制如細胞因子，以及多種已知引發細胞程序性死亡作用的其它藥物(如酒精或撲熱息痛)都可能誘發肝損傷。已建立了一種由細胞程序性死亡而誘發的這種肝損傷的模型，其中是通過體內注射半乳糖胺和TNF-α誘發肝損傷(見Leist,M.等人，J.Immunol.153:1778-1788,1994)。
按如下方法測定了AG1714對TNF誘發的小鼠肝損傷的作用將小鼠分成如下4組ⅰ．僅給予賦形劑注射液的小鼠；ⅱ．腹膜內注射1次AG1714(10mg/kg)的小鼠；ⅲ．靜脈內注射人TNF-α(0.25μg/只)並同時腹膜內注射半乳糖胺(Gal N)(18ml/只)的小鼠；和ⅳ．接受如上述第ⅲ組處理的小鼠，在注射TNF/Gal N之前2小時，腹膜內注射1次AG1714(10mg/kg)。
注射TNF/Gal N之後7小時，如上所述測定各處理組小鼠血清中肝臟酶AST和ALT的水平。
如圖11中可見，在對小鼠給予TNF/Gal N之前注射AG1714，顯著地降低了由於TNF/Gal N給藥誘發的肝毒性。因此，tyrphostin化合物可用於減少由變種免疫機制誘發的肝損傷。Ⅲ．用tyrphostin化合物可降低多種有害藥物活性劑對具核骨髓細胞和淋巴細胞的毒性作用(骨髓毒性和淋巴毒性)實施例18將CD1小鼠分成如下各組ⅰ．小鼠僅腹膜內注射阿黴素(10mg/kg)，ⅱ．小鼠先腹膜內注射AG1714(20mg/kg),2小時後腹膜內注射阿黴素(10mg/kg)，和ⅲ．小鼠先注射一次賦形劑，2小時後腹膜內注射阿黴素(10mg/kg)。
三天後測定受處理小鼠股骨中具核骨髓細胞和集落形成單位(CFU)的數量(Nikerich,D.A.等人J.Immunopharmacol.8:299-313,1986)。每組包括3隻小鼠，結果以平均值±SD表示。
如圖12中所示，對小鼠注射阿黴素，3天後引起了骨髓毒性，表現為具核細胞數量減少了47％(圖12A),CFU減少了55％(圖12B)。在注射阿黴素之前2小時以AG1714預處理的小鼠，完全防止了這種骨髓毒性作用。實施例19還研究了AG1714對由不同劑量阿黴素誘發的骨髓毒性的作用。按實施例18中所述方法處理小鼠。在阿黴素給藥後3天(圖13A)和不同的時間(圖13B)，測定受處理的小鼠中股骨具核骨髓細胞的數量。
如圖13A中所示，以10mg/kg和15mg/kg的劑量對小鼠給予阿黴素，在受處理小鼠中誘發了骨髓毒性。以AG1714預處理，顯著地降低了阿黴素誘發的骨髓毒性。
如圖13B中所示，以AG1714預處理的阿黴素給藥小鼠，也可導致阿黴素給藥後骨髓細胞迅速恢復正常。單獨用阿黴素(15mg/kg)處理時，5天後受處理小鼠股骨中骨髓細胞的數量仍然相當低。在阿黴素給藥之前以AG1714預處理小鼠，在此時，它們的骨髓細胞已完全再生了。實施例20CD1小鼠受腹膜內注射1次阿黴素(10mg/kg)，或者先腹膜內注射1次AG1714(20mg/kg),2小時後腹膜內注射阿黴素(10mg/kg)。阿黴素給藥後72小時處死小鼠，測量小鼠的脾重量和胸腺重量，作為淋巴毒性的參數。每個實驗組由3隻小鼠組成，結果以細胞平均數±SD表示。以僅接受賦形劑注射，而不接受阿黴素注射的小鼠作為對照。
如下面圖14中所示，單獨給予阿黴素，導致小鼠的脾重量(圖14A)和胸腺重量(圖14B)顯著減少。通過在給予阿黴素之前2小時給予小鼠AG1714，顯著地降低了阿黴素的這種骨髓毒性和淋巴毒性作用。實施例21對CD1小鼠以50mg/kg的劑量腹膜內注射1次環磷醯胺，並分成如下幾組ⅰ．小鼠在給予環磷醯胺之前2小時，僅接受1次賦形劑腹膜內注射，ⅱ．小鼠在給予環磷醯胺之前2小時，接受1次AG1714(20mg/kg)腹膜內注射，ⅲ．小鼠在給予環磷醯胺之前2小時，接受1次AG1801(2.5mg/kg)腹膜內注射。
環磷醯胺給藥後72小時處死小鼠，對小鼠骨髓中的具核細胞數量，脾和胸腺的重量進行測定。每個實驗組由3隻小鼠組成，結果以各組細胞平均數±SD表示。
如表4A和4B中可見，給予環磷醯胺導致骨髓、脾和胸腺中具核細胞數量顯著減少，指示環磷醯胺的骨髓毒性和淋巴毒性作用。在給予環磷醯胺之前給予tyrphostin AG1714或AG1801，導致環磷醯胺在上述3個器官中的骨髓毒性和淋巴毒性作用降低。雖然以tyrphostin化合物處理的小鼠骨髓，脾和胸腺中具核細胞的數量尚未達到對照鼠的水平，與僅接受環磷醯胺的小鼠相比較，這些小鼠器官中具核細胞的數量較高。
表4a和4bAG1714和AG1801防止環磷醯胺誘發的骨髓毒性和淋巴毒性
實施例22將CD1雌性小鼠分成如下各組ⅰ．對照組僅1次腹膜內注射賦形劑(助溶劑丙烯碳酸酯-Cremophor-生理鹽水)，ⅱ．小鼠以80mg/kg的劑量接受1次腹膜內注射5-氟尿嘧啶(5FU)。
ⅲ．小鼠以20mg/kg的劑量接受1次腹膜內注射AG1714，ⅳ．小鼠以2.5mg/kg的劑量接受1次腹膜內注射AG1801，ⅴ．小鼠以5mg/kg的劑量接受1次腹膜內注射AG1843，ⅵ．小鼠先接受1次腹膜內AG1714(20mg/kg)注射，2小時後腹膜內注射1次5FU(80mg/kg)，ⅶ．小鼠先接受1次腹膜內AG1801(2.5mg/kg)注射，2小時後腹膜內注射1次5FU(80mg/kg)，ⅷ．小鼠先接受1次腹膜內AG1843(5mg/kg)注射，2小時後腹膜內注射1次5FU(80mg/kg)。
對小鼠5FU給藥後5天，將小鼠處死，測定一根股骨的骨髓中具核細胞的數量。每組由2隻或3隻小鼠組成，結果以細胞平均數±SD表示。
如圖15中所示，給予5FU導致這些小鼠骨髓中具核細胞數量減少。在給予5FU之前先給予AG1714，導致顯著較低小鼠的骨髓中細胞數量減少。因此，AG17141降低了5FU對這些小鼠的骨髓毒性作用。實施例23將CD1雌性小鼠分成如下各組ⅰ．對照組僅接受1次腹膜內注射賦形劑(助溶劑丙烯碳酸酯-Cremophor-生理鹽水)，ⅱ．小鼠以2mg/kg的劑量接受1次腹膜內注射絲裂黴素-C，ⅲ．小鼠以20mg/kg的劑量接受1次腹膜內注射AG1714，ⅳ．小鼠先接受1次腹膜內AG1714注射(20mg/kg)，2小時後腹膜內注射1次絲裂黴素-C(2mg/kg)。
如上面實施例22中所述，給予小鼠絲裂黴素-C5天後將小鼠處死，測定1根股骨的骨髓中具核細胞的數量。每組由2隻或3隻小鼠組成，結果以所計數的細胞平均數±SD表示。
如圖16中所示，僅給予絲裂黴素-C的小鼠顯示出非常低的骨髓中具核細胞計數。雖然單獨給予AG1714對小鼠沒有作用，但是，在給予絲裂黴素-C之前先給予AG1714，導致降低了絲裂黴素-C對這些小鼠的骨髓毒性作用，幾乎提供了對絲裂黴素-C有害毒性的完全預防作用，使這些小鼠骨髓中具核細胞的計數達到僅給予助溶劑的對照小鼠的水平。實施例24測定了不同劑量的AG1801對抗阿黴素誘發小鼠骨髓毒性的作用。將CD1小鼠分成如下5組ⅰ．小鼠僅接受賦形劑，ⅱ．小鼠僅接受阿黴素(10mg/kg)，ⅲ．小鼠在給予阿黴素之前2小時，先接受腹膜內注射AG1801(0.5mg/kg)，ⅳ．小鼠在給予阿黴素之前2小時，先接受腹膜內注射AG1801(1mg/kg)，ⅴ．小鼠在給予阿黴素之前2小時，先接受腹膜內注射AG1801(2mg/kg)。
阿黴素給藥三天之後將小鼠處死，如上所述測定骨髓中具核細胞的數量。
如圖17中所示，給予小鼠AG1801，具有劑量相關的對抗阿黴素誘發骨髓毒性的預防作用。Ⅳ．用tyrphostin化合物可降低放射作用誘發的毒性實施例25為了測定tyrphostin AG1714對受放射處理小鼠的防禦活性，將用鈷源以300R放射性劑量照射的CD1小鼠分成如下二組ⅱ．小鼠未接受其它處理，和ⅱ小鼠在受照射之前2小時接受1次20mg/kg劑量的tyrphostinAG1714腹膜內注射。
第3組小鼠僅接受1次AG1714(20mg/kg)注射，第4組小鼠未作處理，作為正常對照小鼠。
在照射後不同的時間處死小鼠，測定1根股骨的骨髓中細胞的數量。
如圖18中所示，與未受處理的小鼠，或僅以AG1714處理的小鼠相比較，用300R照射小鼠，引起這些小鼠骨髓中細胞數量減少了。大約放射處理後5天，受照射小鼠骨髓中開始細胞再生。以AG1714預處理受照射的小鼠，可防止受照射小鼠骨髓中細胞數量減少，並引起了小鼠骨髓中細胞數量非常顯著地增加。因此，tyrphostin AG1714對放射處理引起的骨髓毒性具有預防作用。實施例26如上面實施例25中所述方法，測定了tyrphostin AG1714對大劑量照射(450R)引起的骨髓毒性的預防作用，不同的是照射劑量是450R而不是300R。
如圖19中所示，以450R照射的小鼠，照射後5天骨髓中的細胞數量顯著減少了，表明這種照射對小鼠具有嚴重的骨髓毒性作用。照射後5天骨髓中的細胞數量開始再生，但是，照射後18天受照射小鼠骨髓中的細胞數量仍然顯著低於未受處理的小鼠或僅給予AG1714的小鼠骨髓中的細胞數量。對於照射之前給予AG1714的小鼠骨髓，直到照射後5天骨髓毒性作用仍然可見。但是5天後，可見這些小鼠骨髓中的細胞數量顯著地恢復，到照射後18天，給予AG1714的受照射小鼠骨髓中的細胞數量已高於對照小鼠的細胞數量。因此，給予AG1714可促進受大劑量照射的小鼠骨髓中細胞數量的再生。實施例27用鈷源以致死劑量800R照射CD1小鼠，小鼠被分成2組ⅰ．小鼠僅接受照射處理；和ⅱ．小鼠在受照射之前1小時，接受1次20mg/kg劑量的AG1714腹膜內注射。
每組由10隻小鼠組成，通過記錄照射後每天死亡小鼠的數目，測定每組的死亡率。
如圖20所示，接受800R照射的小鼠組，照射後10天小鼠開始死亡，照射後23天這組小鼠的死亡率達到80％。相比之下，在照射之前接受AG1714的小鼠組，照射之後20天其死亡率顯著地降低為20％。
這二組的死亡率直到照射之後50天未進一步改變。V．tyrphostin化合物對化學治療劑抗腫瘤活性的影響實施例28應用多種小鼠腫瘤實驗模型測定了AG1714對化學治療劑抗腫瘤作用的影響。
分別在C57BL小鼠尾靜脈注射MCA-105肌纖維瘤細胞或Lewis肺瘤細胞2×105/只，以及B-16黑素瘤細胞5×104/只。
腫瘤細胞接種後4天腹膜內注射順鉑(4mg/kg)。給予順鉑之前2小時腹膜內注射AG1714(20mg/kg)或賦形劑。腫瘤細胞接種後24天處死小鼠，測定肺的重量和轉移病灶數量。每組包括5隻小鼠，結果以平均肺重量±SE表示。
從圖21A可見，順鉑明顯地抑制了MCA-105肌纖維瘤的生長。AG1714本身也具有輕微的抗腫瘤作用。以AG1714和順鉑合併治療，象單獨給予順鉑一樣，有效地抑制了已形成的MCA-105肺轉移病灶的生長。順鉑和AG1714本身都對Lewis肺癌具有部分抗腫瘤作用。以AG1714和順鉑合併治療也比順鉑能更有效地抑制已形成的這種腫瘤肺轉移病灶的生長(圖21B)。
順鉑(4mg/kg)或AG1714(20mg/kg)單獨對已形成的B-16黑素瘤肺轉移都沒有效果(圖21C)。以這二種藥物合併治療，比以每一種藥物單獨治療都更有效。實施例29按如下方法測定阿黴素和AG1714對裸鼠體內SK-28人黑素瘤細胞異種移植瘤的作用以SK-28人黑素瘤細胞4×105/只，靜脈注射接種無胸腺CD1 小鼠(nu/nu)。腫瘤接種後4天腹膜內注射阿黴素(4mg/kg)。在給予阿黴素之前2小時注射AG1714(20mg/kg)或賦形劑。腫瘤接種後24天，測定經治療小鼠的肺重量和肺內轉移病灶數量。每組包括5隻小鼠，結果以平均值±SE表示。
從圖22中可見，阿黴素明顯地抑制了SK-28腫瘤的生長，而AG1714本身也具有輕微的抗腫瘤作用。以AG1714預處理不會削弱阿黴素單獨抑制這種腫瘤生長的作用。實施例30以人卵巢癌(OVCAR-3)細胞皮下注射接種無胸腺小鼠(3×106個細胞/部位)。腫瘤接種後4天注射順鉑(4mg/kg)。在給予順鉑之前2小時腹膜內注射AG1714(20mg/kg)或賦形劑。在腫瘤接種後20天，測定腫瘤的短徑(S)和長徑(L)，並按公式V=[S2L]2]]>計算腫瘤的體積(V)。每組包括5隻小鼠，結果以平均值±SE表示。
如圖23中所示，順鉑對負有OVCAR-3腫瘤的小鼠其有明顯的抗腫瘤作用，而AG1714本身效果較小。給予AG1714不會削弱順鉑的化學治療作用。
從圖24中可見，與僅反覆注射順鉑或僅反覆注射AG1714的小鼠腫瘤體積相比較，反覆注射順鉑和AG1714的小鼠腫瘤體積較小。實施例31通過測定負有B-16黑素瘤小鼠的死亡率和它們肺中轉移病灶的數量或肺重量，檢測了AG1714對大劑量阿黴素效果的影響。
對小鼠靜脈內注射2×105B-16黑素瘤細胞，腫瘤接種後4天，對每隻小鼠腹膜內注射1次阿黴素(4mg/kg或8mg/kg)。在注射阿黴素之前2小時，對每隻小鼠以20mg/kg的劑量腹膜內注射AG1714。
如表5A和5B所示，二組如上所述完成的實驗中，給予小劑量阿黴素，引起較低的死亡率和顯著的治療作用。給予大劑量阿黴素產生了顯著高得多的治療效果，但對治療小鼠引起了高死亡率。AG1714單獨給藥也顯示它本身有一些治療作用。以大劑量阿黴素同AG1714一起合併給藥，產生了大劑量阿黴素的高治療效果，但是，小鼠的死亡率顯著降低了。
表5AG1714對大劑量阿黴素效力和對負有B-16黑素瘤小鼠死亡率的影響A
B
因此，AG1714與阿黴素一起合併給藥，可導致增強阿黴素的化學治療作用。與AG1714合併給藥，大劑量阿黴素的顯著治療作用可以達到，而大劑量阿黴素引起的高死亡率，通過合併給藥被中和了。
這種增強作用也可以在以如下方式治療的，負有MCA-105肌纖維瘤的小鼠中看見僅以阿黴素治療(表6A)或僅以順鉑治療(表6B)，或者以上而每種藥物與AG1714合併治療。
表6AG1714對大劑量阿黴素效力和對負有MCA-105肌纖維瘤小鼠死亡率的影響A
B．
實施例32按如下方法測定了AG1801對順鉑對於負有MCA-105肌纖維瘤的小鼠已形成的肺轉移病灶，抗轉移活性的作用將C57BL小鼠分成如下幾組ⅰ．小鼠在6周齡時靜脈內注射2×105肌纖維瘤MCA105細胞，4天後接受1次僅含有賦形劑的注射，ⅱ．小鼠在6周齡時靜脈內注射2×105肌纖維瘤MCA105細胞，4天後注射10mg/kg順鉑，ⅲ．小鼠在6周齡時靜脈內注射2×105肌纖維瘤MCA105細胞，4天後注射10mg/kg阿黴素，ⅳ．小鼠在6周齡時靜脈內注射2×105肌纖維瘤MCA105細胞，4天後注射5mg/kg AG1801，ⅴ．小鼠在6周齡時靜脈內注射2×105肌纖維瘤MCA105細胞，4天後先注射5mg/kg AG1801,2小時後注射10mg/kg順鉑，ⅵ．小鼠在6周齡時靜脈內注射2×105肌纖維瘤MCA105細胞，4天後先注射5mg/kgAG1801,2小時後注射10mg/kg阿黴素，ⅶ．未處理的C57BL小鼠。
如圖25A和25B中所示，負有腫瘤的小鼠肺的重量顯著地大於對照小鼠。雖然單獨注射AG1801對肺重量沒有影響，但注射順鉑(圖25A)或阿黴素(圖25B)，可使小鼠肺的重量減少至接近於未負有腫瘤的對照小鼠的肺重量。合併注射順鉑和AG1801(圖25A)和合併注射阿黴素和AG1801(圖25B)，導致小鼠肺中腫瘤負荷減少，類似於僅給予順鉑的小鼠腫瘤負荷減少。
上述4個實施例的結果清楚地表明，對負有腫瘤的小鼠，以tyrphostin化合物和順鉑一起給藥，不會影響順鉑的抗腫瘤作用，並且在某些情況下甚至可增加這種作用。實施例33如上面實施例29所述方法，測定了順鉑和AG1801對裸鼠體內SK-28人黑素瘤異種移植腫瘤的作用。
如圖26所示，單獨給予順鉑在一定程度上減少了負有腫瘤小鼠肺的重量，而給予AG1801，它本身沒有治療作用。AG1801同順鉑合併給藥則顯著地減少了受治療小鼠肺的重量，因此，在給予順鉑之前給予AG1801，可增強它的治療作用。
上述實施例清楚地表明，對負有腫瘤的小鼠，同順鉑或阿黴素一起給予tyrphostin化合物，不會削弱這些治療劑的抗腫瘤作用，並且有時甚至可增強這種作用。因此，tyrphostin化合物可用於提高和增強這些藥物的化學治療作用和效力。Ⅵ．按如下方法測定了AG1714對各種細胞在體外生存能力的作用實施例34通過在histopaque上作梯度離心，製備鼠骨髓具核細胞。然後將細胞分為二組ⅰ．細胞僅在生長培養基中溫育1小時(對照)，ⅱ細胞在加有不同濃度(5μM,10μM或20μM)tyrphostinAG1714的生長培養基中溫育1小時。
然後將細胞在半固體瓊脂板上作平板培養，溫育14天之後，測定集落形成單位(CFU)的數量(參見Nikerich等人，同上，1986)。
如圖27所示，與僅在生長培養基中培育的細胞相比較，加入AG1714的培養物平板培養效力(以每105具核細胞的CFU數量表示)顯著地提高了。因此，tyrphostin AG1714能較長時間保存骨髓細胞培養物。實施例35在含有5％FCS的RPNI 1640生長培養基中，從CD1幼小鼠的胸腺，製備濃度為3×106個細胞/ml的胸腺細胞。將此細胞如下分成二組ⅰ．細胞僅在生長培養基中生長；和ⅱ．細胞在加有AG1714的生長培養基中生長。
應用胰蛋白酶蘭色排除試驗，在對細胞加入AG1714之後不同時間，測定上面每組培養物中胸腺細胞的細胞生存能力。
如圖28所示，對培養的胸腺細胞加入AG1714，顯著地增強了它們的生存能力。實施例36如在Kessler-Iceksan G.,J.Mol,Cell.Cardiol.20:649-755,1988中所述，從大鼠製備了初級大鼠肌細胞培養物。將心肌細胞在培養基內培養7天，然後將此培養物分成二組ⅰ．培養物僅在生長培養基中培養，ⅱ．培養物在加有20μM tyrphostin AG1714的生長培養基中培養。
在對細胞加入tyrphostin化合物之後16小時和40小時，測定每組培養物中肌細胞叢每分鐘的搏動次數。
如圖29所示，與僅在生長培養基中培養的心肌細胞培養物中每分鐘的搏動次數相比較，加入tyrphostin AG1714的心肌細胞培養物中每分鐘的搏動次數顯著地較多。AG1714增強了培養的心肌細胞的生存活力。Ⅶ．對tyrphostin化合物的毒性研究實施例37為了研究tyrphostin AG1714和AG1801的毒性作用，將此tyrphostin化合物給ICR小鼠每周注射3次，持續5周。每次注射包含20mltyrphostin化合物，它們是在以生理鹽水/碳酸氫鹽1∶20稀釋的賦形劑丙烯碳酸酯cremophore(40/60)中製備的。
為了測定tyrphostin化合物累積性給藥的毒性作用，對被注射小鼠的多種參數進行測定，包括它們的體重，內部器官(胸腺，脾，腎)的重量，全血化學，骨髓細胞數量等。
如下面表7中所示，與僅注射生理鹽水或賦形劑的對照小鼠的相同參數相比較，注射tyrphostin AG1714和AG1801未引起對被注射小鼠所測定的這些參數發生顯著的改變。因此，在對小鼠累積性給藥之後，這些tyrphostin化合物未顯示出任何毒性作用。此外，注射tyrphostin化合物未引起小鼠死亡。
表7亞慢性腹膜內注射給予AG1714和AG1801(ICR雌性小鼠，每周注射3次共5周
表7(續)
賦形劑生理鹽水和碳酸氫鹽按1∶20稀釋的丙烯碳酸酯Cremophore(40/60)。Ⅷ．對特異性免疫活性的抑制作用實施例38如在Lavy,R，等人J.Immunol 154:5039-5048,1955，中所述方法製備能夠特異性溶解FL-4細胞的鼠腹膜滲出細胞毒性淋巴細胞(PEL)，並進行測定。將EL-4細胞分為如下各組僅同PEL共同溫育的細胞，先同AG1714(20μM)共同溫育，然後同PEL共同溫育的細胞，以及先同AG1714(50μM)共同溫育，然後同PEL共同溫育的細胞。應用特異性51Cr釋放檢測法，測定對靶細胞EL-4的細胞溶解作用。
如圖30所示，加入AG1714降低了PEL對靶細胞EL-4的特異性細胞毒活性。AG1714的這種抑制作用是劑量依賴性的。
上述結果表明，tyrphostin化合物對降低免疫介導的移植排異作用可能是有用的，還可能用於自身免疫性疾病以及同細胞特異性免疫活性有關的病症(例如在AIDS情況下的抗-CD4細胞)。Ⅸ．tyrphostin化合物的抗炎症作用個體炎症反應的主要併發症之一是導致敗血性休克，它起因於由細胞因子如TNF和IL-1介導的免疫反應的過度作用。如下測定了tyrphostin化合物對TNF和IL-1相關的免疫反應的影響。實施例39A．小鼠成纖維細胞與TNF-α共同溫育將導致這些細胞程序性死亡。為了測定tyrphostin化合物對TNF-α誘導的細胞程序性死亡的作用，將A9小鼠成纖維細胞與放線菌酮(50μg/ml)共溫育2小時，然後以20μM的最終濃度加入各種tyrphostin化合物，只有AG1801是以5μM的最終濃度加入。與tyrphostin化合物共溫育1小時之後，以0.2ng/ml的濃度對細胞加入TNF-α，並將此細胞再溫育10小時。在10小時之末，用propidium碘化物，通過FACS對培養細胞進行分析，並且測定每組培養細胞程序性死亡的程度(觀察DNA片段)(參見Novogrodsky A.等人Science,264:1319-1322,1994)。
如下表8中所示，對與TNF共溫育的小鼠成纖維細胞加入各種tyrphostin化合物，顯著地減弱了TNF使細胞程序性死亡的作用。不同的tyrphostin化合物減弱TNF使細胞程序性死亡的作用的程度稍微不同。
表8tyrphostin化合物對TNF-α誘導的小鼠成纖維細胞(A-9)程序性死亡的預防作用
B．如表9所示，對上述培養細胞的細胞周期分析表明，以TNF-α處理細胞，誘發了G1期停滯。tyrphostin化合物減弱由TNF引起的程序性死亡作用與它們能夠防止培養細胞發生G1期停滯有直接關係。
表9AG1714對TNF-α誘導的小鼠成纖維細胞(A-9)G0/G1期停滯和程序性死亡的預防作用
實施例40如上面實施例39所述，用A-9細胞以體外試驗測定了tyrphostin化合物對TNF誘導的細胞毒性的作用。此外，還以LPS(它誘導體內TNF毒性)注射小鼠，測定了tyrphostin化合物對TNF介導的體內細胞毒性的作用，對CD1小鼠以1.3mg/只的劑量腹膜內注射大腸桿菌LPS。除了對照小鼠僅以賦形劑注射之外，其餘的小鼠在注射LPS之前2小時，分別腹膜內注射各種tyrphostin化合物(20mg/kg)。如表10A所示，與上面實施例39中顯示的結果相一致，對同TNF共溫育的細胞加入tyrphostin化合物，顯著地減弱了TNF的毒性作用。如表10B所示，絕大多數tyrphostin化合物顯示出對LPS誘導的體內毒性有顯著的預防作用，同它們的體外活性相關聯。
表10tyrphostin化合物對TNF誘導的細胞毒性的作用(體外試驗)，以及對LPS誘導的致死性毒性的作用(體內試驗)A
B
實施例41IL-1是體內敗血性休克的主要介導劑之一。為了測定AG1714對於從與LPS共同溫育的細胞產生IL-1的抑制活性，將人外周血單核細胞(PBM)以2×106個細胞/ml的濃度分為如下幾組
ⅰ．細胞僅在生長培養基中培養，ⅱ．細胞在加入AG1714(20μM)的生長培養基中培養，ⅲ．細胞在加入LPS(10mg/ml)的生長培養基中培養，ⅳ．細胞在加有LPS(10mg/ml)和AG1714(20μM)的生長培養基中培養。將這些細胞溫育24小時，用Genzyme ELISA試劑盒測定IL-1β的量。
如表Ⅱ所示，它顯示了如上所述進行的2組實驗，對與LPS共同溫育的細胞加入AG1714，顯著地減少了細胞產生IL-1β的量。
表11AG1714抑制人外周血單核細胞中LPS誘導的IL-1β產生
上面的結果表明，tyrphostin化合物可用於減少在敗血性休克中IL-1介導的不希望有的作用。
上面3個實施例的結果表明，tyrphostin化合物可用於減少或防止在炎症反應的過程中形成敗血性休克。tyrphostin化合物還可以用作抗炎症藥物，以及用於對抗如在自身免疫反應中發生的，由各種細胞因子(例如TNF和IL-1)介導的致病作用。
權利要求
1．用於對抗對細胞或組織損害的藥物組合物，它含有效量的如下通式Ⅰ的化合物，以及可藥用載體，
其中-Ar是如下結構式的基團，
或
-n是0，或者當Ar是上面結構式(ⅰ)時，則n也可以是1，R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHR3，或者當R1是4-NO2，以及R2是H或3-OH時，則R也可以是如下結構式的基團，
或
在此R3是H，苯基，苯基(低級烷基)或吡啶甲基；-R1和R2各自獨立地是H,OH,NO2，或者R是CN時，也可以是CH3,F，或CF3，條件是R1和R2不同時為H。
2．權利要求1的藥物組合物，包含結構式Ⅰ的化合物，其中R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHCH2C6H5，或如下結構式的基團，
並且n是0,R1是4-NO2,R2是H。
3．權利要求1或2的藥物組合物，是用於對抗由細胞毒性藥物引起的損害。
4．權利要求3的藥物組合物，是用於對抗由抗腫瘤藥物引起的損害。
5．權利要求3或4的藥物組合物，包含與細胞毒性藥物組合的有效量的權利要求1中的結構式Ⅰ化合物。
6．權利要求3-5的任一藥物組合物，其中的藥物選自順鉑，阿黴素，環磷醯胺，絲裂黴素-C和5-氟尿嘧啶。
7．權利要求1-6的任一藥物組合物，是用於對抗骨髓毒性和淋巴毒性。
8．上述權利要求的任一藥物組合物，是適合於靜脈內給藥的劑型。
9．上述權利要求的任一藥物組合物，是適合於口服給藥的劑型。
10．權利要求1或2的藥物組合物，可用於體外保存細胞，組織或器官。
11．權利要求1或2的藥物組合物，可用於對抗由免疫介導或炎症反應引起的損傷。
12．權利要求1-10的任一藥物組合物，是用於對抗有害的程序性死亡。
13．一種用於治療個體，對抗對細胞，組織或器官損害的方法，該方法包括給予此個體有效量的如下通式1的化合物，以及可藥用載體，
其中-Ar是如下結構式的基團，
或
-n是0，或者當Ar是上面結構式(ⅰ)時，則n也可以是1，R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHR3，或者當R1是4-NO2，以及R2是H或3-OH時，則R也可以是如下結構式的基團，
或
在此R3是H，苯基，苯基(低級烷基)或吡啶甲基；-R1和R2各自獨立地是H,OH,NO2，或者R是CN時，也可以是CH3,F，或CF3，條件是R1和R2不同時是H。
14．權利要求13的方法，其中結構式Ⅰ的化合物中，R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHCH2C6H5，或如下結構式的基團，
並且n是0,R1是4-NO2,R2是H。
15．權利要求13或14的方法，其中有害的藥物是細胞毒性藥物。
16．權利要求15的方法，其中的細胞毒性藥物是抗腫瘤藥物。
17．權利要求16的方法，其中的細胞毒性藥物選自順鉑，阿黴素，環磷醯胺，絲裂黴素-C和5-氟尿嘧啶。
18．權利要求13-17的任一方法，是用於對抗骨髓毒性和淋巴毒性。
19．權利要求18的方法，可用於對抗放射治療中不希望的有害作用。
20．權利要求13-19的任一方法，其中結構式Ⅰ的化合物是與細胞毒性藥物或放射治療組合給藥。
21．權利要求1-20的任一方法，其中是在給予細胞毒性藥物或放射治療之前給予結構式Ⅰ的化合物。
22．權利要求13-21的任一方法，其中結構式Ⅰ的化合物是靜脈內給藥。
23．權利要求13-21的任一方法，其中結構式Ⅰ的化合物是口服給藥。
24．權利要求13或14的方法，可用於對抗由免疫介導或炎症反應引起的損傷。
25．一種用於在體外保存器官，組織或細胞的方法，包括使在體外的器官、組織或細胞，與通式Ⅰ的化合物以及可藥用載體接觸，
其中-Ar是如下結構式的基團，
或
-n是0，或者當Ar是上面結構式(ⅰ)時，則n也可以是1，R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHR3，或者當R1是4-NO2，以及R2是H或3-OH時，則R也可以是如下結構式的基團，
或
在此R3是H，苯基，苯基(低級烷基)或吡啶甲基；-R1和R2各自獨立地是H,OH,NO2，或者R是CN時，也可以是CH3,F，或CF3，只要R1和R2不同時是H。
26．通式Ⅰ′的化合物，
其中-Ar是如下結構式的基團，
或
-n是0，或者當Ar是上面結構式(ⅰ)時，則n也可以是1，-R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHR3，或者當R1是4-NO2,R2是H時，則R也可以是如下結構式的基團，
或
R1和R2各自獨立地是H,OH,NO2，或者當R是CN時，也可以是CH3,F或CF3，並且R3是H，苯基，苯基(低級烷基)或吡啶甲基；但條件是a)當R是CN和n是0時，則(aa)如果R1和R2之一是H或OH，則另一個不能是NO2，(ab)如果R1和R2之一是H或F，則另一個不能是H或F，並且b)當R1是4-NO2,R2是H，以及n是0時，則R不能是-C(O)NH2，或-C(S)NH2。
27．權利要求26的化合物，其中R是CN,-C(S)NH2,-C(O)NHCH2C6H5或如下結構式的基團，
並且n是0,R1是4-NO2,R2是H和n是0。
全文摘要
用於對抗不希望有的細胞,組織或器官毒性作用的化合物,具有式(Ⅰ)的結構,其中:Ar是結構式(i)或(ii)的基團,n是0,或者當Ar是上面結構式(i),則n也可以是1,R是CN,－C(S)NH
文檔編號C07D231/16GK1232392SQ97198596
公開日1999年10月20日 申請日期1997年8月14日 優先權日1996年8月14日
發明者A·諾沃格洛德斯凱, A·勒維茨基, A·加茲特 申請人:摩爾研究應用有限公司, 耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司