毒素基因及其使用方法

2023-06-07 21:15:11 1

專利名稱：:毒素基因及其使用方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學領域。所提供的是編碼殺蟲蛋白的新基因。這些蛋白質和編碼它們的核酸序列用於製備殺蟲製劑和用於產生轉基因抗害蟲植物。
背景技術：
：蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)是革蘭氏陽性的產芽孢土壤細菌，其特徵在於其產生晶狀包含體的能力，該晶狀包含體特異性地對某些目和種的昆蟲有毒，但對植物和其他非靶標生物體無害。由於此原因，包含蘇雲金芽孢桿菌菌株或它們的殺蟲蛋白的組合物可以用作環境可接受的殺蟲劑來控制農業昆蟲害蟲或各種人或動物疾病的昆蟲媒介。源自蘇雲金芽孢桿菌的晶體(Cry)蛋白質(δ-內毒素)具有主要針對鱗翅目(L印idopteran)、雙翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)幼蟲的有效殺蟲活性。這些蛋白質還已顯示針對膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、蝨目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱蟎亞綱(Acari)害蟲目，以及其他無脊椎動物目如線形動物門(Nemathelminthes)、扁形雲力物(Platyhelminthes)禾口肉鞭蟲門(Sarcomastigorphora)的活性(AdvancedEngineeredPesticides,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.中的Feitelson(1993)TheBacillusThuringiensisfamilytree)。最初主要根據這些蛋白質的殺蟲活性將它們分類為CryI至CryV。主要的種類是鱗翅目(L印idoptera)特異的(I)、鱗翅目和雙翅目(Diptera)特異的(II)、鞘翅目(Coleoptera)特異的(III)、雙翅目特異的(IV)和線蟲類特異的(V)和(VI)。進一步將這些蛋白質分類進入亞家族；為各家族內更高度相關的蛋白質指定各字母如CrylA、CrylB、CrylC等。各分部內還更接近地相關的蛋白質命名為如CrylCl、CrylC2等。最近描述了基於胺基酸序列同源性而非昆蟲靶特異性的Cry基因的新命名法(Crickmore等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。在此新分類中，為各毒素指定合併了初級等級(阿拉伯數字)、二級等級(大寫字母)、三級等級(小寫字母)和四級等級(另一個阿拉伯數字)的唯一的名稱。在此新分類中，在初級等級中已將羅馬數字調換為阿拉伯數字。序列同一性低於45%的蛋白質具有不同的初級等級，二級等級和三級等級的標準分別是78%和95%。晶體蛋白質直到被攝入並在昆蟲中腸中溶解時才顯示殺蟲活性。昆蟲消化道中的蛋白酶將攝入的前毒素水解為活性毒性分子。(H6fte和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53:242-255)0該毒素與靶標幼蟲中腸中的頂刷狀緣受體結合併插入頂膜(apicalmembrane)產生離子通道或管孔，導致幼蟲死亡。δ-內毒素一般具有5個保守序列域(sequencedomain)和3個保守結構域(見例如deMaagd等Q001)TrendsGenetics17:193-199)。第一個保守結構域由7個α螺旋組成並涉及膜插入和管孔形成。結構域II由以希臘鑰匙構型排列的3個β片層組成，而結構域III由」薄卷餅」型的2個反平行β片層組成(deMaagd等，2001，上文)。結構域II和III涉及受體識別和結合，因此認為它們是毒素特異性決定子。基於蘇雲金芽孢桿菌的殺蟲劑的密集使用已經在菜蛾(Plutellaxylostella)田間群體中引起了抗性(Ferr6和VanRie(2002)Annu.Rev.Entomol.47:501-533)最常見的抗性機制是毒素與其一種或多種特異性中腸受體結合的減弱。這還可以賦予對共用同一受體的其他毒素的交叉抗性(Ferr6和VanRie(2002))0發明概述本發明提供用於賦予細菌、植物、植物細胞、組織和種子害蟲抗性的組合物和方法。組合物包含編碼S-內毒素多肽序列的核酸分子、包含那些核酸分子的載體和包含載體的宿主細胞。組合物還包含該內毒素的多肽序列和那些多肽的抗體。該核苷酸序列可以用於用來在生物體(包含微生物和植物)中轉化和表達的DNA構建體或表達盒中。核苷酸或胺基酸序列可以是設計用於在包含但不限於微生物或植物的生物體中表達的合成序列。組合物還包含轉化的細菌、植物、植物細胞、組織和種子。具體而言，提供對應於δ-內毒素核酸序列的分離的核酸分子。此外，涵蓋對應於該多核苷酸的胺基酸序列。具體而言，本發明提供編碼包含編碼SEQIDNO:61-121和133-141中任一項所示的胺基酸序列的核苷酸序列的分離的核酸分子，或SEQIDNO1-60和1M-132中任一所示的核苷酸序列，以及其變體和片段。還涵蓋與本發明的核苷酸序列互補的核苷酸序列，或與本發明的序列雜交的核苷酸序列。本發明的組合物和方法用於產生具有殺蟲劑抗性的生物體，尤其是細菌和植物。這些生物體和從它們衍生的組合物是為了農業目的而希望得到的。本發明的組合物還用於產生改變的或改進的具有殺蟲活性的S-內毒素蛋白質，或用於檢測δ-內毒素蛋白質或核酸在產物或生物體中的存在。發明詳述本發明涉及用於在生物體，尤其是植物或植物細胞中調節害蟲抗性的組合物和方法。該方法涉及用編碼本發明的S-內毒素蛋白質的核苷酸序列轉化生物體。具體而言，本發明的核苷酸序列可用於製備具有殺蟲活性的植物和微生物。因此，提供轉化的細菌、植物、植物細胞、植物組織和種子。組合物是蘇雲金芽孢桿菌S-內毒素的核酸和蛋白質。這些序列用於構建表達載體用於隨後轉化進入目的生物體，作為用於分離其他S-內毒素基因的探針，和用於通過本領域已知的方法，如結構域交換或DNA改組產生改變的殺蟲蛋白。這些蛋白質用於控制或殺死鱗翅目、鞘翅目和線蟲類害蟲群體，並用於產生具有殺蟲活性的組合物。「δ-內毒素」指具有針對一種或多種害蟲的毒性活性的源自蘇雲金芽孢桿菌的毒素，或與這種蛋白質具有同源性的蛋白質，所述一種或多種害蟲包含但不限於鱗翅目、雙翅目和鞘翅目的成員或線蟲動物門(Nematodaphylum)的成員。在一些情況下，已從包含雙酶梭菌(Clostridiumbifermentans)和日本甲蟲類芽孢桿菌(Paenibacilluspopilliae)的其他生物體分離了S-內毒素蛋白質。S-內毒素蛋白質包含從本文公開的全長核苷酸序列推斷的胺基酸序列，和由於使用其他下遊起始位點或由於產生具有殺蟲活性的較短蛋白質的加工而比全長序列短的胺基酸序列。加工可以發生在表達該蛋白質的生物體中，或該蛋白質被攝入後發生在害蟲體內。δ-內毒素包含鑑定為cryl至cry43、cytl和cyt2和Cyt-樣毒素的蛋白質。目前已知超過250種具有大範圍的特異性和毒性的δ-內毒素。全面的列表見Crickmore等(1998)，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813,定期更新見www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index上的Crickmore等(2003)"Bacillusthuringiensistoxinnomenclature，，。本文所提供的是賦予殺蟲活性的新的分離的核苷酸序列。還提供δ-內毒素蛋白質的胺基酸序列。從該基因翻譯產生的蛋白質允許細胞控制或殺死將其攝入的害蟲。分離的核酸分子及其變體和片段本發明的一個方面涉及包含編碼δ-內毒素蛋白質和多肽或其生物學活性部分的核苷酸序列的分離的或重組的核酸分子，以及能夠用作雜交探針來鑑定S-內毒素編碼核酸的核酸分子。本文所用的術語「核酸分子」旨在包含DNA分子(例如重組DNA、cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸類似物產生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優選是雙鏈DNA。「分離的，，或「純化的，，核酸分子或蛋白質或其生物學活性部分基本上游離於其他細胞物質或培養基(通過重組技術產生時)，或基本上游離於化學品前體或其他化學品(化學合成時)。優選地，「分離的」核酸游離於衍生該核酸的生物體的基因組DNA中天然位於該核酸側翼(即位於該核酸的5'和3'端的序列)的序列(優選蛋白質編碼序列)。為了本發明的目的，當用來指核酸分子時，「分離的」排除了分離的染色體。例如，在各種實施方案中，分離的3-內毒素編碼核酸分子可以包含少於約5吐、41^、31^、21^、11^、0.51^或0.Ikb在衍生該核酸的細胞基因組DNA中天然位於該核酸分子側翼的核苷酸序列。基本上游離於細胞物質的S-內毒素蛋白質包含具有少於約30^^20^^10%或5%(按乾重計)的非S-內毒素蛋白質(本文還稱之為「汙染蛋白質」)的蛋白質製劑。編碼本發明的蛋白質的核苷酸序列包含SEQIDNO:1_60和1M-132中所示的序列及其變體、片段和互補序列。「互補序列」是指與給定的核苷酸序列充分互補，使得其可以與該給定的核苷酸序列雜交從而形成穩定的雙鏈體的核苷酸序列。由該核苷酸序列編碼的δ-內毒素蛋白質的對應的胺基酸序列示於SEQIDNO:61-121和133-141。本發明還涵蓋是這些δ-內毒素編碼核苷酸序列的片段的核酸分子。「片段」是指編碼S-內毒素蛋白質的核苷酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以編碼δ-內毒素蛋白質的生物學活性部分，或者它可以是用下文所公開的方法可以用作雜交探針或PCR引物的片段。取決於預期的用途，是S-內毒素核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、四50、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350個毗連核苷酸，或高達存在於本文所公開的全長S-內毒素編碼核苷酸序列中的核苷酸的數目。「毗連」核苷酸是指彼此相鄰的核苷酸殘基。本發明的核苷酸序列的片段可編碼保留S-內毒素蛋白質的生物學活性並因此保留殺蟲活性的蛋白質片段。「保留活性」是指該片段可具有至少約30%、至少約50%、至少約70%、80(%、90(%、95(%或更高的δ-內毒素蛋白質的殺蟲活性。測量殺蟲活性的方法為本領域熟知。見例如Czapla禾口Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252:199-206;Marrone等(1985)J.ofEconomicEntomology78:290-293；和美國專利號5，743，477，所有文獻在此完整引入作為參考。編碼本發明的蛋白質的生物學活性部分的δ-內毒素編碼核苷酸序列的片段可編碼至少約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100個毗連胺基酸，或高達存在於本發明的全長S-內毒素蛋白質中的胺基酸的總數。本發明優選的δ-內毒素蛋白質由與SEQIDNO:1_60和1Μ-132的核苷酸序列幾乎相同的核苷酸序列編碼。「幾乎相同的」是指使用標準參數用本文所述的比對程序之一與參考序列相比，具有至少約60%或65%序列同一性、約70%或75%序列同一性、約80%或85%序列同一性、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的胺基酸或核苷酸序列。本領域技術人員可知，通過考慮密碼子簡併性、胺基酸相似性、閱讀框定位等，可以適當調節這些值來測定由兩條核苷酸序列編碼的蛋白質的對應的同一性。為了測定兩條胺基酸序列或兩個核酸的百分比同一性，比對序列用於最佳比較的目的。兩條序列間的百分比同一性是序列所共有的相同位置數的函數(即百分比同一性=相同位置數/位置(例如重疊位置)總數xlOO)。在一個實施方案中，兩條序列具有相同的長度。在另一個實施方案中，比較跨越參考序列的整體(例如跨越SEQIDNO:1-60和1M-132之一的整體，或跨越SEQIDNO:61-121和133-141之一的整體)。可以用與下文所述技術類似的允許或不允許缺口的技術來測定兩條序列間的百分比同一性。在計算百分比同一性中，通常計數精確匹配。可以用數學算法完成兩條序列間百分比同一性的測定。用來進行兩條序列的比較的數學算法的非限制性實例是按Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877中修改的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.ki.USA87:2264的算法。這種算法已被併入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLASTN和BLASTX程序。可以用BLASTN程序，得分=100，字長=12進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發明的S-內毒素樣核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，得分=50，字長=3進行BLAST蛋白質搜索，以獲得與本發明的δ-內毒素蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目的的缺口比對，可以按Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25:3389中所述使用缺口BLAST(在BLAST2.0中)。備選地，可以用PSI-Blast進行檢測分子間距離關係的迭代搜索。見Altschul等(1997)上文。當利用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序時，可以使用各程序(例如BLASTX和BLASTN)的默認參數。還可以通過目檢進行手工比對。用於進行序列比較的數學算法的另一個非限制性實例是ClustalW算法(Higgins^(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680)。ClustalW比較序列並比對胺基酸或DNA序列的整體，從而可以提供關於整個胺基酸序列的序列保守性的數據。ClustalW算法用於幾種市售DNA/胺基酸分析軟體包中，如VectorNTIProgramSuite(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)的ALIGNX模塊。用ClustalW比對胺基酸序列後，可以評估百分比胺基酸同一性。用於ClustalW比對分析的軟體程序的非限制性實例是GENED0C。GENED0C(KarlNicholas)允許評估多個蛋白質間的胺基酸(或DNA)相似性和同一性。用於進行序列比較的數學算法的另一個非限制性實例是Myers和Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法。這種算法已併入ALIGN程序(2.0版)，其是GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage,版本10(可從Accelrys,Inc.,9685ScrantonRd.,SanDiego,CA,USA獲得)的部分。當用ALIGN程序進行胺基酸序列比較時，可以使用PAM120權重餘數表(weightresiduetable)，缺口長度罰分12和缺口罰分4。除非另作說明，將使用以下參數，用GAP版本10(其使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453的算法)來測定序列同一性或相似性核苷酸序列的％同一性和％相似性使用缺口權重(GAPWeight)50和長度權重3和nwsgapdna.cmp評分矩陣；胺基酸序列的％同一性或％相似性使用缺口權重8和長度權重3和BL0SUM62評分程序。還可以使用等同的程序。「等同的程序」指任意序列比較程序，其為所討論的任意兩條序列產生這樣的比對，當與由GAPVersion10產生的對應的比對相比時，該比對具有相同的核苷酸殘基匹配和相同的百分比序列同一性。本發明還包含變體核酸分子。S-內毒素編碼核苷酸序列的「變體」包含編碼本文所公開的S-內毒素蛋白質，但由於遺傳密碼的簡併性而保守地不同的那些序列，以及如上文所討論的幾乎相同的那些序列。可以用熟知的分子生物學技術，如下文概述的聚合酶鏈反應(PCR)和雜交技術來鑑定天然存在的等位變體。變體核苷酸序列還包含合成衍生的核苷酸序列，其通過例如使用位點定向誘變產生，但其仍按下文所討論編碼本發明中公開的S-內毒素蛋白質。本發明所包含的變體蛋白質是有生物學活性的，即它們繼續保持所希望的天然蛋白質的生物學活性，即保留殺蟲活性。「保留活性」是指變體可具有至少約30%、至少約50%、至少約70%或至少約80%天然蛋白質的殺蟲活性。測量殺蟲活性的方法為本領域熟知。見例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252:199-206；Marrone等(1985)J.ofEconomicEntomology78:290-293；和美國專利號5，743，477，所有文獻在此完整引入作為參考。熟練的技術人員可進一步理解，可以通過本發明的核苷酸序列的突變來引入改變，從而在不改變蛋白質生物學活性的情況下導致所編碼的S-內毒素蛋白質胺基酸序列中的改變。因此，可以通過將一個或多個核苷酸取代、添加或缺失引入本文所公開的對應核苷酸序列來產生分離變體的核酸分子，以便將一個或多個胺基酸取代、添加或缺失引入所編碼的蛋白質。可以通過標準技術，如位點定向誘變和PCR介導的誘變引入突變。這類變體核苷酸序列也包含於本發明。例如，可以在一個或多個預測的非必需胺基酸殘基處產生保守胺基酸取代。「非必需」胺基酸殘基是可以在不改變生物學活性的情況下從S-內毒素蛋白質的野生型序列改變的殘基，而「必需」胺基酸殘基為生物學活性所需。「保守胺基酸取代」是用具有相似側鏈的胺基酸殘基取代該胺基酸殘基的取代。已在本領域內定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族。這些家族包含具有鹼性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支(β-branched)側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的胺基酸。δ-內毒素一般具有5個保守序列域和3個保守結構域(見例如deMaagd等(2001)TrendsGenetics17:193-199)。第一個保守結構域由7個α螺旋組成並涉及膜插8入和管孔形成。結構域II由以希臘鑰匙構型排列的3個片層組成，而結構域III由」薄卷餅」型的兩個反平行β-片層組成(deMaagd等，2001，上文)。結構域II和III涉及受體識別和結合，並因此認為它們是毒素特異性決定子。可以在保留功能的非保守區域中進行胺基酸取代。一般，不對保守胺基酸殘基或處於保守基序內的胺基酸殘基進行這類取代，其中這類殘基是蛋白質活性必需的。保守且可以為蛋白質活性必需的殘基實例包含，例如，包含於本發明的胺基酸序列比對中的所有蛋白質和已知的S-內毒素序列間相同的殘基。保守但可以允許保守胺基酸取代且仍保留活性的殘基的實例包含，例如，在包含於本發明的胺基酸序列比對中的所有蛋白質和已知的S-內毒素序列間僅具有保守取代的殘基。但是，本領域技術人員應理解，功能性變體可以在保守殘基中具有較少的保守或非保守改變。備選地，可以通過沿全部或部分編碼序列隨機引入突變，如通過飽和誘變來產生變體核苷酸序列，並可以針對賦予S-內毒素活性的能力篩選產生的突變體來鑑定保留活性的突變體。誘變後，可以重組表達所編碼的蛋白質，並可以用標準測定技術測定蛋白質的活性。可以用如PCR、雜交等的方法鑑定對應的δ-內毒素序列，這類序列與本發明的序列具有基本的同一性。見例如Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)禾口Innis等(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NY)。在雜交法中，可以用全部或部分δ-內毒素核苷酸序列來篩選cDNA或基因組文庫。構建這類cDNA和基因組文庫的方法一般為本領域已知並公開於Sambrook和Russell，2001，上文中。所謂的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，並可以用可檢測基團如32P或任意其他可檢測標記，如其他放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子標記。可以根據本文所公開的已知的S-內毒素編碼核苷酸序列，通過標記合成的寡核苷酸來產生用於雜交的探針。此外，可以使用根據核苷酸序列或所編碼的胺基酸序列中的保守核苷酸或胺基酸殘基設計的簡併引物。探針通常包含在嚴格條件下與本發明的δ-內毒素編碼核苷酸序列或其片段或變體的至少約12、至少約25、至少約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400個相鄰核苷酸雜交的核苷酸序列區域。用於製備雜交探針的方法一般為本領域已知並公開於Sambrook和Russell，2001，上文中，其在此引用作為參考。例如，可以將本文所公開的整個δ-內毒素序列或其一個或多個部分用作能夠特異性地與對應的S-內毒素樣序列和信使RNA雜交的探針。為了在各種條件下達到特異性雜交，這類探針包含獨特且優選長度為至少約10個核苷酸或長度為至少約20個核苷酸的序列。可以用這類探針通過PCR從所選擇的生物體擴增對應的δ-內毒素序列。該技術可以用來從所希望的生物體分離其他編碼序列或作為診斷測定來測定編碼序列在生物體中的存在。雜交技術包含塗布DNA文庫的雜交篩選(噬斑或菌落；見例如Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。這類序列的雜交可以在嚴格條件下進行。「嚴格條件」或「嚴格雜交條件」是指這樣9的條件，在該條件下，探針可與其靶序列雜交至高於與其他序列的雜交的可檢測程度(例如超過背景至少2倍)。嚴格條件是序列依賴性的且在不同環境中可不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可以鑑定與探針100%互補的靶序列(同源探測)。備選地，可以將嚴格性條件調整為允許序列中的一些錯配，以便於檢測較低程度的相似性(異源探測)。一般，探針長度小於約1000個核苷酸，優選長度小於500個核苷酸。通常，嚴格條件可以是這樣的條件在pH7.0至8.3，鹽濃度低於約1.5M鈉離子，通常為約0.01至1.OM鈉離子濃度(或其他鹽類)，溫度對短探針(例如10至50個核苷酸)為至少約30°C，對長探針(例如大於50個核苷酸)為至少約60°C。還可以用去穩定劑如甲醯胺的加入達到嚴格條件。示例性低嚴格性條件包含在37°C下用30-35%甲醯胺、IMNaCl、l%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩衝液雜交，並在50_55°C下在IX至2XSSC(20XSSC=3.OMNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性中等嚴格性條件包含在37°C下在40-45%甲醯胺、1.0MNaCl、l%SDS中雜交，並在55-60°C下在0.5X至IXSSC中洗滌。示例性高嚴格性條件包含在37°C下在50%甲醯胺、IMNaCl、l%SDS中雜交，並在60-65°C下在0.IXSSC中洗滌。可選地，洗滌緩衝液可以包含約0.至約SDS0雜交時間一般少於約M小時，通常為約4至約12小時。特異性通常是雜交後洗滌的函數，臨界因子是最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對於DNA-DNA雜種，可以從Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的方程得出近似Tm值=Tm=81.5°C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)-0.61(%甲醯胺)-500/L；其中M是單價鹽離子的體積摩爾濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲醯胺是雜交溶液中甲醯胺的百分比，L是以鹼基對計的雜化物的長度。Tm是在該溫度下50%互補靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。對每的錯配，Tffl降低約1°C；因此，可以調節Tm、雜交和/或洗滌條件來與具有所希望的同一性的序列雜交。例如，如果尋找具有>90%同一性的序列，可以將Tm降低10°C。一般，在給定的離子強度和pH下，選擇嚴格條件為比特定序列和它的互補序列的熱熔點(thermalmeltingpoint,Tm)低約5°C。但是，極嚴格條件可以利用比熱熔點(Tm)低1、2、3或4°C下的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可以利用比熱熔點(Tm)低6、7、8、9或10°C下的雜交和/或洗滌；低嚴格性條件可以利用比熱熔點(Tm)低11、12、13、14、15或20°C下的雜交和/或洗滌。普通技術人員可理解，利用該方程、雜交和洗滌組合物和所希望的Tm，隱喻了雜交和/洗滌溶液的嚴格性中的變化。如果所希望的錯配程度導致低於45°C(水性溶液)或32°C(甲醯胺溶液)的Tm，則優選提高SSC濃度，使得可以使用較高的溫度。核酸雜交的大量指導見於Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分，第2章(Elsevier，紐約)；和Ausubel等，編輯(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章(GreenePublishingandffiley-Interscience,M^tl)中。見Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork))。分離的蛋白質及其變體和片段δ-內毒素蛋白質也包含於本發明內。「δ-內毒素蛋白質」是指具有SEQIDNO61-121和133-141中所示的胺基酸序列的蛋白質。還提供其片段、生物學活性部分和變體，且其可以用來實施本發明的方法。「片段」或「生物學活性部分」包含含有與SEQIDNO:61-121和133-141的任一項中所示的胺基酸序列幾乎相同的胺基酸序列並顯示殺蟲活性的多肽片段。S-內毒素蛋白質的生物學活性部分可以是長度為例如10、25、50、100或更多個胺基酸的多肽。可以通過重組技術製備這類生物學活性部分並評估其殺蟲活性。測量殺蟲活性的方法為本領域熟知。見例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252:199-206；Marrone等(1985)J.ofEconomicEntomology78:290-293；禾口美國專利號5，743，477，所有文獻在此完整引入作為參考。如此處所用，片段包含SEQIDNO:61-121和133-141的至少8個毗連胺基酸。但是，本發明包含其他片段，如大於約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300個胺基酸的蛋白質中的任意片段。「變體」是指與SEQIDNO:61-121和133-141中任一項的胺基酸序列具有至少約60%、65%、約70%、75%、約80%、85%、約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的蛋白質或多肽。變體還包含由在嚴格條件下與SEQIDNO1-60和1M-132的核酸分子雜交的核酸分子或其互補分子編碼的多肽。變體包含由於誘變而在胺基酸序列中不同的多肽。本發明所包含的變體蛋白質是有生物學活性的，即它們繼續保持所希望的天然蛋白質的生物學活性，即保留殺蟲活性。測量殺蟲活性的方法為本領域熟知。見例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252:199-206；Marrone等(1985)J.ofEconomicEntomology78:290-293；禾口美國專利號5，743，477，所有文獻在此完整引入作為參考。細菌基因，如本發明的axmi基因常在靠近可讀框起點處具有多個甲硫氨酸起始密碼子。通常，在一個或多個這些起始密碼子處的翻譯起始可導致功能性蛋白質的產生。這些起始密碼子可以包含ATG密碼子。但是，細菌如芽孢桿菌屬物種(Bacillussp.)還將密碼子GTG識別為起始密碼子，在GTG密碼子處起始翻譯的蛋白質在第一個胺基酸處包含甲硫氨酸。此外，通常不確定這些密碼子中的哪一個是細菌中天然優先使用的。因此，據理解，備選甲硫氨酸密碼子之一的使用也可以導致編碼殺蟲活性的S-內毒素蛋白質的產生。這些S-內毒素蛋白質包含於本發明中並可以用於本發明的方法。針對本發明的多肽或針對其變體或片段的抗體也涵蓋於本發明。產生抗體的方法為本領域熟知(見例如Harlow禾口Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；美國專利號4，196，265)。改變的或改良的變體據認可，可以通過各種方法改變δ-內毒素的DNA序列，這些改變可以產生這樣的DNA序列，其編碼具有不同於本發明的δ-內毒素所編碼的胺基酸序列的胺基酸序列的蛋白質。可以用多種方式改變該蛋白質，該各種方式包括SEQIDNO:61-121和133-141的一個或多個胺基酸的胺基酸取代、缺失、平截和插入，包含至多約2個、約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約15個、約20個、約25個、約30個、約35個、約40個、約45個、約50個、約55個、約60個、約65個、約70個、約75個、約80個、約85個、約90個、約100個、約105個、約110個、約115個、約120個、約125個、約130個或更多個胺基酸取代、缺失或插入。[0047]進行這類操作的方法一般為本領域已知。例如，可以通過DNA中的突變製備δ-內毒素蛋白質的胺基酸序列變體。這還可以通過幾種誘變形式之一和/或在定向進化中達到。在一些方面中，編碼於胺基酸序列中的改變可以基本上不影響蛋白質的功能。這類變體可以具有所希望的殺蟲活性。但是，據理解，可以通過在本發明的組合物上使用這類技術來改進δ-內毒素賦予殺蟲活性的能力。例如，可以在DNA複製過程中顯示高鹼基錯參率的宿主細胞，如XL-IRed(Stratagene)中表達δ-內毒素。在這類菌株中繁殖後，可以分離δ-內毒素DNA(例如通過製備質粒DNA，或通過用PCR擴增並將產生的PCR片段克隆入載體)，在非誘變菌株中培養S-內毒素突變，並例如通過進行測試殺蟲活性的測定來鑑定具有殺蟲活性的突變的S-內毒素基因。一般而言，將蛋白質混合併用於攝食測定。見例如Marrone等(198J.ofEconomicEntomology78:290-293。這類測定可以包括將植物與一種或多種害蟲接觸，並測定植物存活和/或引起害蟲死亡的能力。產生提高的毒性的突變的實例見於^An印f等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:775-806中。備選地，可以在基本不影響活性的情況下，在氨基或羧基端對許多蛋白質的蛋白質序列進行改變。這可以包含通過現代分子方法如PCR(包括由於在用於PCR擴增的寡核苷酸中包含胺基酸編碼序列而改變或衍生蛋白質編碼序列的PCR擴增)引入的插入、缺失或改變。備選地，所添加的蛋白質序列可以包含整個蛋白質編碼序列，如本領域中通常用來產生蛋白質融合的序列。這類融合蛋白質通常用來(1)提高目的蛋白質的表達；(引入結合結構域、酶活性或表位以便於蛋白質純化、蛋白質檢測或本領域已知的其他實驗用途;(3)將蛋白質的分泌或翻譯靶向至亞細胞器，如革蘭氏陰性菌的壁膜間隙，或真核細胞的內質網，其中後者常導致蛋白質的糖基化。本發明的變體核苷酸和胺基酸序列還包含衍生自誘變法和重組法(如DNA改組)的序列。使用這種方法，可以用一個或多個不同的S-內毒素蛋白質編碼區來產生具有所希望的特性的新的S-內毒素蛋白質。在這種方式中，從相關序列多核苷酸的群體產生重組多核苷酸文庫，該群體包含具有基本的序列同一性且可以在體外或體內同源重組的序列區域。例如，使用此方法，可以在本發明的S-內毒素基因和其他已知的S-內毒素基因間改組編碼目的結構域的序列基序，以獲得編碼具有改進的目的特性(例如增加的殺蟲活性)的蛋白質的新基因。用於這種DNA改組的策略為本領域已知。見例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature370:389-391；Crameri等(1997)NatureBiotech.15:436-438；Moore等(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509；Crameri等(1998)Nature391:288-291；和美國專利號5，605，793和5，837，458。結構域交換或改組是產生改變的δ-內毒素蛋白質的另一種機制。可以在δ-內毒素蛋白質間交換結構域II和III，得到具有改良的殺蟲活性或目標特徵的雜化物或嵌合毒素。用於產生重組蛋白質和測試它們的殺蟲活性的方法為本領域熟知(見例如Naimov等(2001)Appl.Environ.Microbiol.67:5328-5330;deMaagd等(1996)Appl.Environ.Microbiol.62:1537-1543；Ge等(1991)J.Biol.Chem.26617954-17958;Schnepf等(1990)J.Biol.Chem.265:20923-20930；Rang等91999)Appl.Environ.Microbiol.652918-2925)。載體[0052]可以在用於在目的植物中表達的表達盒中提供本發明的δ-內毒素序列。「植物表達盒」是指能夠在植物細胞中引起從可讀框表達蛋白質的DNA構建體。這些通常包含啟動子和編碼序列。通常，這類構建體還可包含3'非翻譯區。這類構建體可以包含「信號序列」或「前導序列」以便於該肽共翻譯或翻譯後轉運至某些胞內結構如葉綠體(或其他質體)、內質網或高爾基體。「信號序列」是指已知或懷疑其導致肽共翻譯或翻譯後轉運跨過細胞膜的序列。在真核細胞中，這通常涉及分泌進入高爾基體，其中一些產生糖基化。「前導序列」是指，在翻譯胺基酸序列時，能夠引起肽鏈共翻譯轉運至亞細胞器的任意序列。因此，這包含通過進入內質網，經過液泡、質體(包含葉綠體、線粒體等)靶向轉運和/或糖基化的前導序列。「植物轉化載體」是指有效的植物細胞轉化所必需的DNA分子。這種分子可以由一個或多個植物表達盒組成，且可以組織入一個以上的「載體"DNA分子。例如，二元載體是利用兩個非毗連DNA載體來編碼植物細胞轉化必需的所有順式和反式作用功能的植物轉化載體(Hellens和MullineauxUOOO)iTrendsinPlantScience5:446-451)。「載體」指設計用於在不同宿主細胞間轉移的核酸構建體。「表達載體」指具有在外源細胞中摻入、整合和表達異源DNA序列的能力的載體。盒可以包含與本發明的序列有效連接的5'和3'調節序列。「有效連接」是指啟動子和第二序列的功能性連接，其中啟動子序列起始和介導對應於第二序列的DNA序列的轉錄。一般而言，有效連接指所連接的核酸序列是毗連的，且在必須連接兩個蛋白質編碼區的地方是毗連並處於同一閱讀框中的。盒可以額外包含至少一個待轉化進入生物體的其他基因。備選地，一個或多個其他基因可以提供在多個表達盒上。「啟動子」指發揮作用來指導下遊編碼序列的轉錄的核酸序列。啟動子與其他轉錄和翻譯調節核酸序列(也稱為「控制序列」)共同為目的DNA序列的表達所需。提供具有多個限制位點的這種表達盒用於將δ-內毒素序列插至調節區的轉錄調節下。表達盒可以在5'至3'的轉錄方向上包含轉錄和翻譯起始區(即啟動子)、本發明的DNA序列和在植物中有功能的翻譯和轉錄終止區(即終止區)。對植物宿主和/或對本發明的DNA序列而言，啟動子可以是天然的或類似的，或外源的或異源的。備選地，啟動子可以是天然序列或備選地是合成序列。啟動子是植物宿主的「天然」或「同源」啟動子時，其是指該啟動子見於該啟動子所引入的天然植物中。啟動子是本發明的DNA序列的「外源」或「異源」啟動子時，其是指該啟動子不是本發明DNA序列的有效連接的天然的或天然存在的啟動子。終止區可以是轉錄起始區的天然終止區，可以是有效連接的目的DNA序列的天然終止區，可以是植物宿主的天然終止區，或可以衍生自其他來源(即對啟動子、目的DNA序列、植物宿主或其任意組合而言是外源的或異源的)。可從根瘤農桿菌(A.tumefaciens)的Ti質粒獲得方便的終止區，如章魚鹼合酶和胭脂氨酸合酶終止區。還見Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell64:671-674；Sanfacon等(1991)GenesDev.5141-149;Mogen等(1990)PlantCell2:1洸1_1272;Munroe等(1990)Gene91:151-158；Ballas等(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903；和Joshi等(1987)NucleicAcidRes.15:9627_9639。適當時，可以優化一個或多個基因用於提高在轉化的宿主細胞中的表達。即可以13用宿主細胞優選的密碼子來合成基因，或可以按宿主優選的密碼子選擇頻率用密碼子來合成基因，以改進表達。參見,例如Campbell和Gowri(1990)，PlantPhysiol.92:1-11關於宿主優選密碼子使用的討論。一般，可以提高基因的GC含量。可在本領域內獲得用於合成植物優選的基因的方法。見例如美國專利號5，380，831和5，436，391，和Murray等(1989)NucleicAcidsRes.17:477_498，其在此引用作為參考。在一個實施方案中，將δ-內毒素靶向至葉綠體進行表達。在不直接將δ-內毒素插入葉綠體的此方式中，表達盒可額外包含編碼轉運肽來將S-內毒素導向葉綠體的核酸。這類轉運肽為本領域已知。見例如VonHeijne等(1991)PlantMol.Biol.Rep.9104-126；Clark等(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等(1987)PlantPhysiol.84:965-968；Romer等(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；禾口Shah等(1986)Science233:478-481。可以針對在葉綠體中的表達優化待靶向至葉綠體的δ-內毒素基因，以補償植物細胞核和該細胞器間密碼子選擇的差異。在此方式中，可以用葉綠體優選的密碼子合成目的核酸。見例如美國專利號5，380，831，其在此引用作為參考。棺物轉化本發明的方法涉及將核酸構建體引入植物。「引入」是指以這樣的方式將核酸構構建體遞呈至植物，使得該構建體可以接近該植物細胞內部。本發明的方法不要求使用用於將核苷酸構建體引入植物的特定方法，只要核苷酸構建體可以接近該植物的至少一個細胞的內部。將核苷酸構建體引入植物的方法為本領域已知，其包括但不限於穩定轉化法、瞬時轉化法和病毒介導法。「植物」是指整株植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物細胞、繁殖體、胚及這些的子代。植物細胞可以是分化的或未分化的(例如愈傷組織、懸浮培養細胞、原生質體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、花粉)。「轉基因植物」或「轉化植物」或「穩定轉化」植物或細胞或組織指已將外源核酸序列或DNA片段摻入或整合入植物細胞的植物。這些核酸序列包含外源的或不存在於未轉化的植物細胞中的核酸序列，以及可以是內源的或存在於未轉化的植物細胞中的核酸序列。「異源的」一般指這樣的核酸序列，其不是細胞內源的或不是其存在於其中的天然基因組的部分，且已通過感染、轉染、顯微注射、電穿孔、顯微投影等加入至該細胞。可以通過本領域已知的幾種技術之一達到植物細胞的轉化。可以修飾本發明的S-內毒素基因以獲得或增強在植物細胞中的表達。通常，表達這種蛋白質的構建體可包含驅動該基因轉錄的啟動子，以及允許轉錄終止和多聚腺苷化作用的3'非編碼區。這類構建體的組織為本領域熟知。在一些情況下，改造基因使得產生的多肽分泌或以其他方式在植物細胞內靶向可以是有用的。例如，可以將基因改造為包含信號肽，以便於該肽轉移至內質網。還可以優選將植物表達盒改造為包含內含子，使得內含子的mRNA加工為表達所需。通常可將該「植物表達盒」插入「植物轉化載體」。該植物轉化載體可以包含達到植物轉化所需的一個或多個DNA載體。例如，利用包含一個以上毗連DNA片段的植物轉化載體是本領域中常見的實施。這些載體在本領域中通常稱為「二元載體」。二元載體以及具有輔助質粒的載體最常用於農桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化，其中達到有效轉化所需的DNA片段的大小和複雜性非常大，且將功能分開在獨立的DNA分子上是有利的。二元載體通常包含含有T-DNA轉移所需的順式作用序列(如左邊緣和右邊緣)的載體、改造為能夠在植物細胞中表達的選擇標記和「目的基因」(改造為能夠在希望針對其產生轉基因植物的植物細胞中表達的基因)。細菌複製所需的序列也存在於該質粒載體上。順式作用序列按允許有效轉移進入植物細胞並在其中表達的方式排列。例如，選擇標記基因和S-內毒素位於左邊緣和右邊緣之間。第二質粒載體通常包含介導T-DNA從農桿菌屬轉移至植物細胞的反式作用因子。如本領域中所理解(Hellens和MullineauxQOOO)TrendsinPlantScience5:446-451)，該質粒通常包含允許通過農桿菌屬感染植物細胞和通過在邊緣序列切割和vir介導的轉移來轉移DNA的毒力功能。幾種類型的農桿菌屬菌株(例如LBA4404、GV3101、EHAlOUEHA105等)可以用來進行植物轉化。第二質粒載體不是通過其他方法如顯微投影、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇等轉化植物必需的。一般，植物轉化方法涉及轉移異源DNA進入靶植物細胞(例如未成熟的或成熟的胚、懸浮培養物、未分化的愈傷組織、原生質體等)，然後應用最大閾值水平的適當的選擇(取決於選擇標記基因)從一組未轉化的細胞群集回收轉化的植物細胞。通常將外植體轉移至新鮮補給的相同培養基並進行常規培養。隨後，轉化的細胞在放置在補充有最大閾值水平的選擇劑的再生培養基上之後分化為苗。然後將苗轉移至選擇性生根培養基進行有根苗或小植物的恢復。然後將轉基因小植物培育為成熟植物並產生可育種子(例如Hiei等(1994)ThePlantJournal6:271-282;Ishida等(1996)NatureBiotechnology14:745-750)。通常將外植體轉移至新鮮補給的相同培養基並進行常規培養。用於產生轉基因植物的技術和方法的一般描述見於Ayres和Park(1994)CriticalReviewsinPlantScience13:219-239和Bommineni和Jauhar(1997)Maydica42:107-120中。由於轉化的物質包含許多細胞；轉化和非轉化細胞都存在於任意一片其所屬的靶愈傷組織或組織或細胞群中。殺死非轉化細胞和允許轉化細胞增殖的能力產生轉化植物培養物。通常，除去非轉化細胞的能力是快速回收轉化植物細胞和成功產生轉基因植物的限制。取決於靶向轉化的植物或植物細胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)，轉化流程以及將核苷酸序列引入植物的流程可以不同。轉基因植物的產生可以通過幾種方法之一進行，其包括但不限於顯微注射、電穿孔、直接基因轉移、通過農桿菌屬將異源DNA引入植物細胞(農桿菌屬介導的轉化)、用粘附至粒子的異源外源DNA轟擊植物細胞、彈道粒子加速、氣溶膠束轉化(美國公開申請號20010(^6941；美國專利號4，945，050；國際公開號WO91/00915；美國公開申請號2002015066)、Lecl轉化和多種其他非粒子直接介導的轉移DNA的方法。用於葉綠體轉化的方法為本領域已知。見例如Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917;Svab和Maliga(1993)EMBOJ.12:601_606。該方法依賴於DNA的粒子槍遞送，該DNA包含選擇標記並通過同源重組將該DNA靶向至質體基因組。此外，通過核編碼和質體導向的RNA聚合酶的組織優選表達，通過攜帶轉基因的沉默質體的反式激活可以實現質體轉化。這種系統已報導於McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305中。將異源外源DNA整合入植物細胞後，在培養基中應用最大閾值水平的適當的選擇來殺死未轉化的細胞，並通過定期轉移至新鮮培養基來分離和增殖從該選擇處理存活的推定的轉化細胞。通過連續傳代並用適合的選擇挑戰來鑑定並增殖用質粒載體轉化的細胞。15然後可以用分子和生物化學方法來確認整合進入該轉基因植物基因組的異源目的基因的存在。可以按照常規方式將已轉化的細胞培養為植物。見例如McCormick等(1986)PlantCellReports5:81_84。然後可以培養這些植物，並用相同的轉化品系或不同品系對其授粉，鑑定具有所希望的表型特徵的組成性表達的雜種。可以培養兩代或多代以確保所希望的表型特徵的表達穩定維持和遺傳，然後收穫種子以確保已達到所希望的表型特徵的表達。在此方式中，本發明提供具有穩定整合入其基因組的本發明的核苷酸構建體，例如本發明的表達盒的轉化種子(也稱為「轉基因種子」)。棺物轉化的評估異源外源DNA引入植物細胞後，通過多種方法，如對與所整合的基因相關的核酸、蛋白質和代謝物的分析來確認異源基因在該植物基因組中的轉化或整合。在移植入土壤前的更早階段，PCR分析是針對整合基因的存在篩選轉化的細胞、組織或苗的快速方法(Sambrook禾口Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)。用對目的基因或農桿菌屬載體背景等特異的寡核苷酸引物進行PCR。可以通過基因組DNA的DNA印跡分析確認植物轉化(Sambrook和Russell，2001，上文))。一般，從轉化體提取總DNA，用適合的限制酶消化，在瓊脂糖凝膠中分級分離並轉移至硝酸纖維素膜或尼龍膜。然後按照標準技術(Sambrook和RUSSell，2001，上文)，用例如放射性標記的32P靶DNA片段探測膜或「印跡」，以確認所引入的基因整合入該植物基因組。在RNA印跡分析中，按照本領域中常規使用的標準方法(Sambrook和Russell，2001，上文)，從轉化體的特定組織分離RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠中分級分離並印跡在尼龍濾膜上。然後通過將濾膜與通過本領域已知的方法(Sambrook和Russell，2001，上文)從δ-內毒素衍生的放射性探針雜交來測試由δ-內毒素編碼的RNA的表達。可以通過標準方法(Sambrook和Russell，2001，上文)，用與存在於δ-內毒素蛋白質上的一個或多個表位結合的抗體在轉基因植物上進行蛋白質印跡、生化測定等，以確認由S-內毒素基因編碼的蛋白質的存在。植物中的殺蟲活性在本發明的另一個方面中，可以產生表達具有殺蟲活性的δ-內毒素的轉基因植物。上文以實例的方式描述的方法可以用來產生轉基因植物，但產生轉基因植物細胞的方式對本發明並不重要。可以按照實驗者的判斷使用本領域已知或已描述的方法，如農桿菌屬介導的轉化、生物射彈轉化和非離子介導的方法。可以通過本領域中所描述的常見方法分離表達S-內毒素的植物，例如通過轉化愈傷組織、選擇轉化的愈傷組織和從這種轉基因愈傷組織再生可育植物。在這種方法中，可以用任意基因作為選擇標記，只要其在植物細胞中的表達賦予鑑定或選擇轉化細胞的能力。已發展了許多標記用於植物細胞，如對氯黴素、氨基糖苷類G418、潮黴素等的抗性。其他編碼涉及葉綠體代謝的產物的基因也可以用作選擇標記。例如，提供對植物除草劑如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮的抗性的基因可以具有特定用途。已報導了這類基因(Stalker等(1985)J.Biol.Chem.263:6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；禾口Sathasivan等(1990)Nucl.AcidsRes.18:2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因))。此外，用本文所公開的基因作標記來評估細菌或植物細胞的轉化。用於檢測轉基因在植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物細胞、繁殖體、胚或這些的子代中的存在的方法為本領域熟知。在一個實施方案中，通過測試殺蟲活性來檢測轉基因的存在。可以針對殺蟲活性測試表達δ-內毒素的可育植物，並選擇顯示最佳活性的植物進行進一步繁殖。本領域中可獲得測定害蟲活性的方法。一般，將蛋白質混合併用於攝食測定。見例如Marrone等(1985)J.ofEconomicEntomology78:290—293。本發明可以用於任意植物種類的轉化，其包含但不限於單子葉植物和雙子葉植物。目的植物的實例包含但不限於玉米(玉蜀黍)、高粱、小麥、向日葵、西紅柿、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸草、大麥、油菜、芸苔屬物種(Brassicasp.)、苜蓿、黑麥、蜀、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑桔樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果、澳洲堅果(macadamia)、杏、燕麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。蔬菜包含但不限於西紅柿、萵苣、菜豆、利馬豆、豌豆和黃瓜屬(Curcumis)的成員如黃瓜、稜瓜和甜瓜。觀賞植物包含但不限於杜鵑花、繡球花、木槿、玫瑰、鬱金香、水仙花、喇叭花、康乃馨、一品紅和菊花。優選地，本發明的植物是作物植物(例如玉蜀黍、高粱、小麥、向日葵、西紅柿、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸草、大麥、油菜等)。在害蟲控制中的用塗在殺蟲劑控制或改造其他生物體為殺蟲劑中使用包含本發明的核苷酸序列或其變體的菌株的一般方法為本領域已知。見例如美國專利號5，039，523和EP0480762A2。包含本發明的核苷酸序列或其變體的芽孢桿菌屬菌株或已遺傳改造為包含殺蟲基因或蛋白質的微生物可以用來保護作物或農產品免受害蟲危害。在本發明的一個方面中，當將細胞應用於一種或多種靶害蟲的環境時，用延長細胞中產生的毒素的活性的試劑處理產生毒素(殺蟲劑)的生物體的整個(即未裂解的)細胞。備選地，通過將δ-內毒素基因引入細胞宿主來產生殺蟲劑。δ-內毒素基因的表達直接或間接導致該殺蟲劑的胞內產生和維持。在本發明的一個方面中，當將細胞應用於一種或多種靶害蟲的環境時，隨後在延長細胞中產生的毒素的活性的條件下處理這些細胞。產生的產物保留毒素的毒性。然後可以按照常規技術配製這些天然封裝的殺蟲劑應用於具有靶害蟲的環境，例如土壤、水和植物的葉。見例如EPA0192319和本文引用的參考文獻。備選地，可以這樣配置表達本發明的基因的細胞，使得允許將產生的物質作為殺蟲劑應用。殺蟲組合物本發明的活性成分通常以組合物形式應用，並可以與其他化合物同時或順次地應用於作物區或待處理的植物。這些化合物可以是肥料、除草劑、冷凍保護劑、表面活性劑、去汙劑、殺蟲皂、休眠噴灑油、聚合物和/或單次應用該製劑後允許靶區域的長期給藥的延時釋放(time-release)或生物可降解載體製劑。它們還可以是選擇性除草劑、化學殺蟲劑、殺病毒劑、殺微生物劑、殺變形蟲劑、殺蟲劑、殺真菌劑、殺菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或幾種這些製劑的混合物，如果希望，它們可與製劑領域通常使用的其他農業可用載體、表面活性劑或應用促進佐劑一起。合適的載體和佐劑可以是固體或液體的，對應於製劑技術中通常使用的物質，例如天然或再生的礦物質、溶劑、分散劑、潤溼劑、膠黏劑、黏合劑或肥料。類似地，製劑可製成可食用的「誘餌」或塑造成害蟲「陷阱」的形式，以使得殺蟲製劑的靶害蟲進食或攝食。應用本發明的活性成分或包含至少一種由本發明的細菌菌株產生的殺蟲蛋白的本發明的農用化學品組合物的方法包括葉應用、種子包被和土壤應用。應用數目和應用比率取決於被對應的害蟲侵襲的強度。組合物可以配製為粉末(powder)、粉劑(dust)、丸、顆粒、噴霧、乳劑、膠體、溶液等，且可以通過常規方法，如脫水、冷凍乾燥、勻漿、提取、過濾、離心、沉降或濃縮包含多肽的細胞培養物來配製。在包含至少一種這種殺蟲多肽的所有這類組合物中，該多肽可以按從約Iwt%至約99wt%的濃度存在。可以通過本發明的方法在給定區域中殺死鱗翅目、鞘翅目或線蟲類害蟲或降低其數量，或者可以預防性地應用於環境區域以防止被易感害蟲侵襲。優選地，害蟲攝食或接觸殺蟲有效量的多肽。「殺蟲有效量」是指能夠引起至少一隻害蟲死亡或顯著降低害蟲的生長、進食或正常生理髮育的殺蟲劑的量。此量可取決於以下這類因素而不同，例如待控制的具體靶害蟲、具體環境、位置、植物、作物、或待處理的農業場所、環境條件、和方法、比率、濃度、穩定性、和殺蟲有效的多肽組合物的應用量。製劑還可以依氣候條件、環境考慮和/或應用頻率和/或害蟲侵襲的嚴重度而不同。可以通過用所希望的農業可用載體配製細菌細胞、晶體和/或孢子懸液或分離的蛋白質成分來產生所述殺蟲組合物。可以用適當的方法在施用前配製組合物，如低壓凍幹、冷凍乾燥、脫水、或在水性載體、培養基或適合的稀釋液，如鹽水或其他緩衝液中。所配製的組合物可以是粉劑或顆粒材料的形式，或在油(植物或礦物)或水或油/水乳劑中的懸液，或作為可溼性粉，或與任意其他適合用於農業應用的載體材料組合。適合的農業載體可以是固體或液體且為本領域熟知。術語「農業可用載體」包含通常用於殺蟲劑製劑技術的所有佐劑、惰性成分、分散劑、表面活性劑、膠黏劑、黏合劑等；這些是殺蟲劑製劑領域技術人員熟知的。製劑可以與一種或多種固體或液體佐劑混合和通過多種方法製備，例如通過使用常規製劑技術將殺蟲組合物與適合的佐劑均質地混合、搗碎和/或研磨。適合的製劑和應用方法描述於美國專利號6，468，523中，其在此引入作為參考。「害蟲」包含但不限於昆蟲、真菌、細菌、線蟲、蟎、蜱等。昆蟲害蟲包含選自鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、風目(Anoplura)、聖目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等目，尤其是鞘翅目、鱗翅目和雙翅目的昆蟲。鞘翅目包含肉食亞目(Acbphaga)和多食亞目(Polyphaga)。肉食亞目包含步甲總科(Caraboidea)和鼓甲總科(Gyrinoidea)，而多食亞目包含牙甲總科(Hydrophiloidea)、隱翅蟲總科(Staphylinoidea)、花螢總科(Cantharoidea)、郭公蟲總科(Cleroidea)、叩頭蟲總科(Elateroidea)、花甲總科(Dascilloidea)、泥甲總科(Dryopoidea)、丸甲總科(Byrrhoidea)、扁甲總科(Cucujoidea)、芫菁總科(Meloidea)、花蝨總科(Mordelloidea)、擬步行蟲總科(Tenebrionoidea)、長蠢總科(Bostrichoidea)、金龜子總禾鬥(Scarabaeoidea)、天牛總禾鬥(Cerambycoidea)、葉甲總禾鬥(Chrysomeloidea)禾口象18蟲總科(Curculionoidea)。步甲總科包含虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)和龍蝨科(Dytiscidae)。鼓甲總科包含鼓甲科(Gyrinidae)。牙甲總科包含牙甲科(Hydrophilidae)。隱翅蟲總科包含埋葬蟲科(Silphidae)和隱翅蟲科(Maphylinidae)。花螢總科包含花螢科(Cantharidae)和螢科(Lampyridae)。郭公蟲總科包含郭公蟲科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩頭蟲總科包含叩甲科(Elateridae)和吉丁甲科(Buprestidae)。扁甲總科包含瓢蟲科(Coccinellidae)。芫菁總科包含芫菁科(Meloidae)。擬步行蟲總科包含擬步行蟲科(Tenebrionidae)。金龜子總科包含黑蜣科(Passalidae)和金龜子科(Scarabaeidae)。天牛總科包含天牛科(Cerambycidae)。葉甲總科包含葉甲科(Chrysomelidae)。象蟲總科包含象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。雙翅目包含長角亞目(Nematocera)、短角亞目(Brachycera)和環裂亞目(Cyclorrhapha)。長角亞目包含大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、搖蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和癭蚊科(Cecidomyiidae)。短角亞目包含水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、劍虻科(Therevidae)、食蟲虻科(Asilidae)、擬食蟲虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和長足虻科(Dolichopodidae)。環裂亞目包含無縫組(Aschiza)和無縫組(Aschiza)。無縫組包含蚤蠅科(Phoridae)、食蚜蠅科(Syrphidae)和眼蠅科(Conopidae)。無縫組包含無瓣類(Acalyptratae)和有瓣類(Calyptratae)。無瓣類包含斑蠅科(Otitidae)、實蠅科(T印hritidae)、潛蠅科(Agromyzidae)和果蠅科(Drosophilidae)。有瓣類包含蝨蠅科(Hippoboscidae)、狂蠅科(Oestridae)、寄蠅科(Tachinidae)、花蠅科(Anthomyiidae)、#|科(Muscidae)、麗科(Calliphoridae)禾口麻科(Sarcophagidae)。鱗翅目包含鳳蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛺蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蠶蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、燈蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾禾鬥(Tineidae)。線蟲類包含寄生線蟲類如根結線蟲類、包囊線蟲類和根腐線蟲類(root-knot，cyst,andlesionnematodes)，其包含棘皮線蟲屬物種(Heteroderaspp·)、根結線蟲屬物種(Meloidogynespp.)和球胞囊線蟲屬物種(Globoderaspp.)；尤其是包囊線蟲類的成員，其包含但不限於大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)；甜菜胞囊線蟲(Heteroderaschachtii)；M1MMM^A(Heteroderaavenae)；禾口g#■t_&(Globoderarostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(Globoderapailida)(馬鈴薯包囊線蟲)。根腐線蟲類包括短體線蟲屬物種(Pratylenchusspp.)。本發明的主要作物昆蟲害蟲包含玉蜀黍玉米螟(Ostrinianubilalis)，歐洲玉米螟(Europeancornborer)；小地老虎(Agrotisipsilon)；玉米穗蛾(Helicoverpazea)；秋夜蛾(Spodopterafrugiperda),草地夜蛾(fal1armyworm)；西南玉米稈草螟(Diatraeagrandiosella)，西南玉米螟(Southwesterncornborer)；小玉米蓮蟲主ji,(Elasmopalpuslignosellus)；胃_(Diatraeasaccharalis)；HR^ΞΕIHBf甲(Diabroticavirgifera)匕方玉f口十甲(Diabroticalongicornisbarberi)；南方玉fIflBfEp(Diabroticaundecimpunctatahowardi)；口口禾中(Melanotusspp.),蟲；北方圓頭犀金龜(Cycloc^phalaborealis)(白蠐螬)；南方圓頭犀金龜(Cycloc^phalaimmaculata)(白M蟲曹)；臼本U金龜(Popilliajaponica)；玉米足兆甲(Chaetocnemapulicaria)!EEfH(Sphenophorusmaidis)；玉f卩十蟲牙(Rhopalosiphummaidis)；玉米t艮蟲牙(Anuraphismaidiradicis)；麥長蟲春(Blissusleucopterusleucopterus)；紅腿幢(Melanoplusfemurrubrum)；遷徙蚱錳(Melanoplussanguinipes)；種蠅(Hylemyaplatura)；玉米斑潛蜆(Agromyzaparvicornis)；美洲錐形薊馬(Anaphothripsobscrurus)；竊蟲義(Solenopsismilesta)；二點紅葉蟎(Tetranychusurticae)；高梁高梁螟(Chilopartellus)；秋夜蛾；玉米穗蛾；小玉米莖蛀蟲；粒膚地老虎O^eltiasubterranea)；白M蟲曹(Phyllophagacrinita)；偽金針蟲屬(Eleodes)、金針蟲屬(Conoderus)和Aeolus物種，金針蟲；橙足負泥蟲(Oulemamelanopus)；玉米跳甲；玉米谷象；玉米葉蚜；蔗黃偽毛蚜(Siphaflava)；麥長蝽；高粱癭蚊(Contariniasorghicola)；硃砂Bf蟲茜(Tetranychuscinnabarinus)；二^紅Bf蟲茜；小麥:衝亍軍蟲(Pseudaletiaunipunctata)；秋夜蛾；小玉米莖蛀蟲；西方灰地老虎(Agrotisorthogonia)；小玉米蓮蛀蟲；橙足負泥蟲；車軸草葉象甲(Hyperapunctata)；南方玉米根葉甲；俄羅斯麥蚜；麥二叉蚜(Schizaphisgraminum)；麥長管蚜(Macrosiphumavenae)；紅腿蝗；長額負蝗(Melanoplusdifferentials)；遷徙蚱蜢；黑森癭蚊(Mayetioladestructor)；麥紅吸菜蟲(Sitodiplosismosellana)；美洲麥稈蠅(Meromyzaamericana)；冬作種蠅(Hylemyacoarctata)；菸草薊馬(Frankliniellafusca)；麥蓮蜂(Cephuscinctus)；鬱金香瘤蟎(Aceriatulipae)向日葵向日葵芽蛾(Suleimahelianthana)；向日葵斑螟(Homoeosomaelectellum)；向曰葵葉甲(Zygogrammaexclamationis)；古月蘿蔔金Ii1(Bothyrusgibbosus)；(H^ff^4(Neolasiopteramurtfeldtiana)棉花綠棉鈴蟲(Heliothisvirescens)；棉鈴蟲(Helicoverpazea)；舌甘菜夜蛾(Spodopteraexigua)；棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)；棉鈴象甲(Anthonomusgrandis)；棉蚜(Aphisgossypii)；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelisseriatus)；帶狀翅白粉蝨(Trialeurodesabutilonea)；牧草盲蝽(Lyguslineolaris)；紅腿幢；長額負幢；棉薊馬(Thripstabaci)；菸草薊馬；硃砂葉蟎；二點紅葉蟎蔗螟；秋夜蛾，草地夜蛾；玉米穗蛾；葡萄肖葉甲(Colaspisbrunnea)；稻水象甲(Lissorhoptrusoryzophilus)；米象(Sitophilusoryzae)；黑尾葉蟬(^photettixnigropictus)；麥長蝽；喜綠蟲春(AcrosternumhiIare)；大豆大豆夜娥(Pseudoplusiaincludens)；梨豆夜娥(Anticarsiagemmatalis)；苜蓿綠夜蛾(Plathypenascabra)；玉米螟,歐洲玉米螟；小地老虎；甜菜夜蛾；綠棉鈴蟲；棉鈴蟲；墨西哥豆瓢蟲(Epilachnavarivestis)；桃蚜(Myzuspersicae)；馬鈴薯微葉蟬(Empoascafabae)；喜綠蝽；紅腿蝗；長額負蝗；種蠅；大豆薊馬(Sericothripsvariabilis)；豐帛J馬；草_蟲朱蟲菌(Tetranychusturkestani)；二；^紅卩十蟎；M玉米螟，歐洲玉米螟；小地老虎；麥二叉蚜；麥長蝽；喜綠蝽；褐臭蝽(Euschistusservus)；灰地種蠅(Deliaplatura)；黑森癭蚊；麥巖蟎(Petrobialatens)油菜甘藍蟲牙(Brevicorynebrassicae)；跳甲(Phyllotretacruciferae)；披肩粘蟲(Mamestraconfigurata)；菜蛾；地種蠅屬(Delia)物種，根蛆。提高棺物產量的方法20[0102]提供用於提高植物產量的方法。該方法包括將包含本文所公開的殺蟲序列的多核苷酸引入植物或植物細胞。如本文所定義，植物的「產量」指由植物產生的生物量的質量和/或數量。「生物量」是指任意測量的植物產物。生物量產生的提高是所測量的植物產物產量的改善。提高植物產量具有幾種商業應用。例如，提高植物葉生物量可以提高用於人或動物消費的多葉蔬菜的產量。此外，提高葉生物量可以用來提高植物衍生的藥物或工業產物的產生。產量的提高可以包含任意統計上顯著的提高，其包含但不限於與不表達殺蟲序列的植物相比產量具有至少的提高、至少3%的提高、至少5%的提高、至少10%的提高、至少20%的提高、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%更大的提高。在具體方法中，植物產量由於表達本文所公開的殺蟲蛋白的植物的改進的害蟲抗性而提高。殺蟲蛋白的表達導致害蟲侵襲或攝食植物的能力降低，從而改進植物產量。以說明的方式而不是限制的方式提供以下實施例。實施例棚列1.減用以下步驟從表1中所列的細菌菌株鑑定新的殺蟲基因從包含通常含有δ內毒素基因的質粒的菌株製備染色體外DNA;機械剪切染色體外DNA以產生大小不一的片段；克隆染色體外DNA的2Kb至IOKb的片段；長出1500個染色體外DNA的克隆；用克隆載體特異的引物對1500個克隆進行部分測序(末端閱讀)；通過用MiDAS法(按美國專利公開號20040014091中所述，其在此完整引入作為參考)進行同源性分析來鑑定推定的毒素基因；對包含推定的目的毒素基因的片段的克隆進行序列補全(步行)。表1.從蘇雲金芽孢桿菌分離的新基因列表。權利要求1.分離的核酸分子，其包含選自以下的核苷酸序列a)SEQIDNO:1-60和124-132中的任意核苷酸序列；b)與SEQIDNO:1-60和124-132中任意核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有殺蟲活性的多肽；c)編碼包含SEQIDNO:61-121和133-141中任意胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；和d)編碼與SEQIDNO:61-121和133-141中任意胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有殺蟲活性。2.權利要求1的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列是已設計用於在植物中表達的合成序列。3.權利要求2的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列選自SEQIDNO:142-283中的任一個。4.載體，其包含權利要求1的核酸分子。5.權利要求4的載體，其還包含編碼異源多肽的核酸分子。6.宿主細胞，其包含權利要求4的載體。7.權利要求6的宿主細胞，其是細菌宿主細胞。8.權利要求6的宿主細胞，其是植物細胞。9.轉基因植物，其包含權利要求8的宿主細胞。10.權利要求9的轉基因植物，其中所述植物選自玉蜀黍、高粱、小麥、甘藍、向日葵、西紅柿、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸草、大麥和油菜。11.具有殺蟲活性的分離的多肽，其選自以下a)包含SEQIDNO:61-121和133-141中的任意胺基酸序列的多肽；b)包含與SEQIDNO:61-121和133-141中任意胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的多肽；c)由SEQIDNO:1-60,124-132^P142-283中任意核苷酸序列編碼的多肽；禾口d)由與SEQIDNO:1-60、124-132和142-283中任意核苷酸序列至少90%相同的核苷酸序列編碼的多肽。12.權利要求11的多肽，其還包含異源胺基酸序列。13.抗體，其選擇性結合權利要求11的多肽。14.組合物，其包含權利要求11的多肽。15.權利要求14的組合物，其中所述組合物選自粉末、粉劑、丸、顆粒、噴霧、乳劑、膠體和溶液。16.權利要求14的組合物，其中通過脫水、冷凍乾燥、勻漿、提取、過濾、離心、沉降或濃縮蘇雲金芽孢桿菌細胞培養物製備所述組合物。17.權利要求14的組合物，其包含約至約99wt%的所述多肽。18.用於控制鱗翅目或鞘翅目害蟲群體的方法，其包括使所述群體與殺蟲有效量的權利要求11的多肽接觸。19.用於殺死鱗翅目或鞘翅目害蟲的方法，其包括用殺蟲有效量的權利要求11的多肽接觸所述害蟲，或飼餵所述害蟲。20.用於產生具有殺蟲活性的多肽的方法，其包括在表達編碼所述多肽的核酸分子的條件下培養權利要求6的宿主細胞。21.包含編碼具有殺蟲活性的蛋白質的核苷酸序列的DNA構建體已穩定摻入其基因組的植物，其中所述核苷酸序列選自a)SEQIDNO:1_60、124-132和142-283中的任意核苷酸序列；b)與SEQIDNO:1-60、124-132和142-283中任意核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有殺蟲活性的多肽；c)編碼包含SEQIDNO:61-121和133-141中任意胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；和d)編碼與SEQIDNO:61-121和133-141中任意胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有殺蟲活性；其中所述核苷酸序列有效連接至驅動編碼序列在植物細胞中表達的啟動子。22.權利要求21的植物，其中所述植物是植物細胞。23.權利要求22的植物的轉基因種子。24.用於保護植物免受害蟲的方法，其包括將至少一個包含編碼殺蟲多肽的核苷酸序列的表達載體引入所述植物或其細胞，其中所訴核苷酸序列選自a)SEQIDNO:1_60、124-132和142-283中的任意核苷酸序列；b)與SEQIDNO:1-60、124-132和142-283中任意核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有殺蟲活性的多肽；c)編碼包含SEQIDNO:61-121和133-141中任意胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；和d)編碼與SEQIDNO:61-121和133-141中任意胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有殺蟲活性；25.權利要求對的方法，其中所述植物產生具有針對鱗翅目或鞘翅目害蟲的殺蟲活性的殺蟲多肽。專利摘要本發明提供用於賦予細菌、植物、植物細胞、組織和種子殺蟲活性的組合物和方法。本發明提供包含δ-內毒素多肽的編碼序列的組合物。該編碼序列可用於在植物和細菌中轉化和表達的DNA構建體和表達盒中。該組合物還包含轉化的細菌、植物、植物細胞、組織和種子。具體而言，本發明提供分離的δ-內毒素核酸分子。此外，本發明涵蓋對應於多核苷酸的胺基酸序列和特異性結合那些胺基酸序列的抗體。具體而言，本發明提供分離的核酸分子，其包含編碼SEQIDNO61-121和133-141中所示的胺基酸序列的核苷酸序列，或SEQIDNO1-60、124-132和142-283中所示的核苷酸序列，及其變體和片段。文檔編號C12N15/82GKCN102066408SQ200980122563公開日2011年5月18日申請日期2009年6月25日發明者B·麥克納爾蒂,C·坎貝爾,D·J·湯姆索,K·S·桑普森,S·阿加瓦爾申請人:阿森尼克斯公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan