促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR-Fc融合蛋白疫苗的製作方法

2023-07-03 20:20:11 1

專利名稱：促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR-Fc融合蛋白疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學領域，涉及到一種能夠促進中樞神經再生與功能恢復的 hNgR-Fc融合蛋白疫苗。
背景技術：
膠體金(Colloidal gold, CG)是指納米金顆粒的一種存在狀態，即金粒子粒徑大 小約為1 IOOnm之間，存在於溶液中。膠體金是氯金酸的水溶液，屬懸膠液，為帶負電的 膠體。膠金粒和其它膠一樣也具有雙層電結構，中心為許多金分子構成的膠金核，其外為 AuO2-及部分反離子形成的吸附層，膠金核同吸附層一起組成膠金粒。膠體金如其它納米顆 粒一樣屬單晶和多晶微粒，具有小尺寸效應、良好的表面和界面效應、靶向作用及緩釋作用 等。目前，膠體金主要應用於免疫金標記技術及相關傳感器技術，還沒有應用於免疫佐劑的 研究報導。目前人和動物用的常規免疫佐劑主要是乳化的油_水佐劑、金屬鹽類佐劑(如鋁 佐劑)、完全福氏佐劑(Complete Freund's adjuvant,CFA)和不完全福氏佐劑(Incomplete Freund' s adjuvant, IFA)等。但它們對抗原性較弱的多肽，特別是重組抗原效果不佳，或 存在嚴重的副作用，注射後在注射部位常引起無菌化膿，有時還會形成肉芽腫，且有長期的 油滯留於組織，易引起過敏反應等問題。研究表明，與周圍神經損傷後的成功再生相比，中樞神經(CNS)再生失敗 的主要原因是由於損傷微環境中多種再生抑制分子的存在。目前已發現這種軸突 # ^ Φ ^ ± Jg W H ft :Nogo-A> MAG (Myelin—associated glycoprotein)禾口 OMgp (Oligodendrocyte-myelin glycoprotein)，儘管三者蛋白結構明顯不同，但卻均能通 過一個共同受體Nogo-66受體(Nogo-66rec印tor，NgR)及其下遊可能的信號通路，參與神 經再生的抑制作用。儘管有研究表明採用脊髓組織勻漿或髓鞘提取物免疫動物治療脊髓損 傷(Spinal cord injury, SCI)可通過產生抗體封閉其抑制作用，促進損傷脊髓的恢復，但 脊髓組織勻漿或髓鞘提取物成分特別複雜，誘發自身免疫病的風險極高。鑑於NgR特殊的 靶分子效應，選擇NgR為免疫原既可促進脊髓損傷後軸突再生，對神經元起到保護作用，又 可最大程度地降低誘發自身免疫病的風險性，從而開闢了克服CNS再生失敗的新途徑，為 進一步揭示神經再生機制及相關藥物開發提供了新的契機。

發明內容
本發明的目的是提供一種促進中樞神經再生的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，以提高其 免疫效果，並減小其毒副作用。本發明所述促進中樞神經再生的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，是由下述方法製成的組 合物將純化的hNgR-Fc融合蛋白溶解於緩衝液中，所得溶液與等體積的膠體金混合得 混合液，在混合液中加入穩定劑。
hNgR-Fc融合蛋白在組合物中的濃度為30 60 μ g/ml。所述緩衝液的pH值為4 9。所述緩衝液為濃度為0. 005 0. 015M的檸檬酸鈉緩衝液。
所述膠體金的粒徑為10 50nm。所述穩定劑為聚乙二醇20000，其在組合物中的濃度為200 500 μ g/ml。本發明以hNgR-Fc (Fragment cristallizable)融合蛋白作為免疫原，並採用膠 體金作為蛋白疫苗的免疫佐劑。受體-Fc融合蛋白已經被證實是除了抗體藥物以外，清 除體內多餘配體分子的又一有效手段。受體結構域在融合蛋白中執行結合配體的功能， 而Fc部分可有多種作用，如可使用通用的標記二抗進行檢測，可通過與protein A的結合 而使用親和層析方便地純化，大大延長藥物在體內的半衰期，可提供額外的生物學效應， 如補體激活、抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)等免疫調節活性。與抗體藥物相比，受體-Fe融合蛋白可不必進行繁 瑣的抗體篩選和人源化過程，並具有親和力高、免疫源性低等優勢。膠體金顆粒標記蛋白質(抗體、抗原)是通過異性電荷吸引產生的結合，這種結合 不影響蛋白質生物活性和免疫活性，這為膠體金作為免疫佐劑提供了理論依據。納米顆粒 均勻性好，以其作為佐劑，可有效避免載體效應，延緩抗原的釋放，持久增強機體體液免疫 和刺激淋巴細胞增殖，更重要的是它包裹的抗原顆粒是巨噬細胞(ΜΦ)和樹突狀細胞(DC) 的首選吞噬目標，為實現機體的有效免疫反應邁出重要一步。納米顆粒還可形成水凝膠，特 別適合做蛋白質/多肽類藥物載體，且不需要交聯別的試劑或佐劑。製備膠體納米金顆粒有多種不同的方法，本發明採用檸檬酸三鈉還原法製備不同 粒經的納米金顆粒。為驗證檸檬酸三鈉還原法製備的納米金的可靠性，利用抗壞血酸還原 法製備粒徑相近的納米金作對照實驗。通過裸眼觀察、丁達爾現象、可見光光譜法和掃描電 鏡鑑定製備的納米金顆粒的粒徑大小及均勻度。為觀察納米金顆粒對大鼠免疫功能的影響，本發明設計了三種均勻度較好的不同 粒徑和三種劑量9個組合的納米金對SD(Sprague-DawIey)大鼠進行肌肉注射，並設計了 一組正常對照實驗；同時觀察有無實驗性變態反應性腦脊髓炎(Exprerimental allergic encephalomyelitis, EAE)的發生，以證明用納米金免疫大鼠的安全性。採用噻唑藍 (Thiazolyl blue,MTT)比色法測定外周血和脾臟淋巴細胞的增殖情況。由於IL-2是T淋 巴細胞增殖的關鍵免疫促進因子，而活化的T細胞產生IL-2能力的強弱又可作為評價機體 免疫功能的一項重要指標，本發明採用ELISA法檢測外周血分離血清及脾臟淋巴細胞中的 IL-2水平。結果表明不同粒徑和劑量的納米金均可不同程度促進SD大鼠外周血和脾臟 淋巴細胞的增殖，其中15nm/0. 6ml劑量組和25nm/0. 4ml劑量組對大鼠外周血淋巴細胞增 殖有較強的促進作用，而15nm/0. 6ml劑量組則對脾臟淋巴細胞增殖促進作用最強。與正常 對照組相比，不同粒徑不同劑量的膠體金均可促進外周血和脾臟淋巴細胞IL-2的分泌，其 中外周血15nm/0. 6ml劑量組促進作用最為明顯，脾臟中則15nm/0. 6ml和25nm/0. 6ml劑量 組促進作用較強。納米金的安全性評價結果證實，納米金作為免疫佐劑具有很強的安全性。為獲得大量天然表達的hNgR-Fc融合蛋白，本發明以真核表達載體 pcDNA-hNgR-Fc質粒(本實驗室保存)為模板，經PCR擴增得到hNgR-Fc片段。所用引物如 下
Forward primer 5' GGAATTCCATATGAAGAGGGCGTCCGCTGG 3『Nde I酶切位點Reverse pr imer 5' CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3'Xho I酶切位點引物兩端分別引入Nde I和Xho I酶切位點，PCR擴增的hNgR-Fc片段，經Nde I和 Xho I雙酶切後回收純化並將其克隆於同樣雙酶切的pET30a+表達載體(Invitrogen)中， 獲得pET-hNgR-Fc重組表達質粒。經PCR、酶切和測序鑑定正確後將重組質粒轉化至E. coli BL-2IpLys感受態細胞中誘導表達，並通過SDS-PAGE對表達的目的蛋白進行鑑定。然後通 過Protein A親和柱來富集並純化破菌上清中的目標蛋白hNgR-Fc，並進行SDS-PAGE分析 禾口 Western blot 鑑定。以獲得的hNgR-Fc融合蛋白作為疫苗的主要組分，以15nm膠體金作為免疫佐劑制 備hNgR-Fc融合蛋白疫苗，並通過體外、體內實驗初步對獲得的疫苗進行效應學觀察。


現結合附圖對本發明作進一步詳細說明。圖IA是粒徑為15nm膠體金的電鏡掃描圖片；圖IB是粒徑為50nm膠體金的電鏡掃描圖片；圖2是納米金溶膠的光譜掃描曲線圖，檸檬酸三鈉還原法製備的直徑10、15、25、 50、60、70、98、147、160nm的膠體金顆粒與抗壞血酸還原法製備的直徑8 13nm的膠體金顆 粒紫外_可見吸收光譜檢測；圖3A是外周血淋巴細胞增殖與納米金顆粒直徑之間的關係圖(與正常對照組比 氺氺，P < 0. 01 ;氺，P < 0. 05)；圖3B是脾臟淋巴細胞增殖與納米金顆粒直徑之間的關係圖(與正常對照組比較， 氺氺，ρ < 0. 01 ;氺，ρ < 0. 05)；圖4A是血清中IL-2水平與納米金顆粒直徑之間的關係圖(與正常對照組比較， **，ρ < 0. 01)；圖4B是脾臟淋巴細胞中IL-2水平與納米金顆粒直徑之間的關係圖(與正常對照 組比較，**，P < 0.01)；圖5A是重組質粒pET-hNgR-Fc的PCR鑑定結果圖，其中1、2分別為假陽性和陽性 克隆，M 為 Wide Range DNA Marker (500-15000)；圖5B是重組質粒pET-hNgR-Fc酶切鑑定結果圖，其中M :DNA MarkerLamda-Hind III Digest ;1 :pET-30a(+) ;2 :pET-hNgR-Fc ;3 :pET-hNgR-Fc XhoI 單酶切；4 pET-hNgR-Fc Nde I+Xho I 雙酶切；圖5C是重組hNgR-Fc融合蛋白的原核表達和純化的SDS-PAGE結果圖，其中 1 誘導的菌體破菌上清；2 誘導的全菌裂解液；3 未誘導的全菌裂解液；4 純化的重組 hNgR-Fc融合蛋白；圖5D是重組hNgR-Fc融合蛋白的Western blot鑑定結果圖，其中1 未誘導的全 菌裂解液；2 誘導的全菌裂解液；3 未誘導的菌體破菌上清；4 誘導的菌體破菌上清；圖6是疫苗穩定性的光譜掃描檢測曲線圖7是ELISA法檢測免疫大鼠血清中的抗NgR抗體滴度的結果圖；圖8A是hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫血清可中和抑制分子MAG對神經突起的抑制 作用，在預先用MAG處理的培養液中培養新生大鼠背根節神經元(Dorsalroot ganglia, DRG)，分別加入未經hNgR-Fc疫苗免疫的對照血清、hNgR-Fc疫苗免疫血清及NgR抗體培養 24h後，神經元突起的生長情況圖，標尺25 μ m ；圖8B是hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫血清可中和抑制分子MAG對神經突起的抑制 作用，各組神經元平均突起長度的統計分析圖，其中數據表示為均數士標準誤(與MAG+ 對照血清組相比，#，P < 0. 01)；圖9A是脊髓半橫切損傷模型行為學檢測結果，BBB評分結果圖，(與單純損傷 (SCI)組相比，*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01)圖9B是脊髓半橫切損傷模型行為學檢測結果，網格步行結果圖，(與SCI組相比， *，ρ < 0. 05 ；**，ρ < 0. 01)圖9C是脊髓半橫斷模型行為學檢測結果，足跡試驗結果圖(紅色標記大鼠前掌， 藍色標記後掌)；圖9D是脊髓半橫切損傷模型行為學檢測結果，足跡法結果圖，(與SCI組相比，**， ρ < 0. 01)；圖IOA是核黃(Nuclear yellow, NY)逆行示蹤標記SCI組和SCI+hNgR-Fc免疫 組損傷部位頭側(距損傷部位中心上遊約5mm處)脊髓冠狀(橫切)和縱切切片圖，結 果顯示hNgR-Fc融合蛋白疫苗接種可促進脊髓損傷後軸突的再生，標尺分別為300μπι和 149. 82ym ；圖IOB是核黃(Nuclear yellow,NY)逆行示蹤結果顯示hNgR-Fc融合蛋白疫苗接 種可促進脊髓損傷後軸突的再生，以脊髓內的逆行標記的再生軸突纖維的螢光強度表示軸 突的再生情況(與SCI組相比，**，P <0. 01)；圖11是組織學觀察hNgR-Fc融合蛋白疫苗接種對損傷脊髓神經元影響的結果 圖，結果顯示hNgR-Fc融合蛋白疫苗接種對損傷脊髓神經元具有明顯的保護作用，標尺 100 μ m0具體實施方法實施例1 檸檬酸三鈉還原法製備納米金先將0. lg/Ι的HAuCl4水溶液50ml加熱至沸騰，隨即迅速在攪拌下加入10g/l檸 檬酸三鈉水溶液，根據加入檸檬酸三鈉水溶液量的不同可分別製備不同粒徑的納米金。為進一步驗證檸檬酸三鈉還原法製備納米金的可靠性，本發明設計用抗壞血 酸還原法製備納米金作為對照實驗。將在4°C預冷的HAuCl4水溶液lml、0. 2mol/l K2CO3L 5ml、雙蒸水25ml混勻。在攪拌下加入Iml 0. 7%抗壞血酸水溶液，立即呈現紫紅色。 加雙蒸水至100ml，加熱至溶液變為透明紅色為止，膠體金顆粒直徑為8 13nm。通過裸眼觀察、丁達爾現象、可見光光譜法和掃描電鏡鑑定製備的納米金顆粒的 粒徑大小及均勻度。結果表明製備的納米金顆粒的粒徑大小及均勻度均符合要求。實施例2 免疫動物本發明選取8 10周齡正常成年SD大鼠60隻，體重200 220g，雌雄不拘。採 用三種粒徑均勻度較好納米金，每種粒徑三種劑量，共9個組合，外加一個對照實驗組，共10個處理。處理1 3組合分別注射直徑為IOnm的納米金0. 2ml、0. 4ml和0. 6ml三種劑 量組，處理4 6組合分別為15nm的0. 2ml,0. 4ml和0. 6ml三種劑量組，處理7 9組合 分別為25nm的0. 2ml,0. 4ml和0. 6ml三種劑量組。處理10為正常對照組，不做任何處理。 每組6隻，飼餵普通塊狀飼料，自由飲食進水。免疫方式為後肢肌肉多點注射，每兩天注射 1次，共注射4次，在第四次注射後7d進行處理。實施例3 納米金的安全性評價考慮到納米金有可能會刺激機體產生針對腦脊髓正常組織的自身免疫反應，誘發 大鼠變態反應性腦脊髓炎(Experimnetal allergic Enc印halomyelitis，EAE)，從而發生 一系列的毒副作用症狀，本發明同時觀察了大鼠EAE的發生情況。結果表明，所有大鼠在免 疫後第二天均出現活動、飲食減少，維持一天後逐步緩解，此後體重逐漸增加，無死亡大鼠。 首次免疫至免疫全過程均未出現EAE症狀及表現。證實納米金未誘導出大鼠EAE，具有較好 的生物安全性。實施例4 =MTT法檢測淋巴細胞的增殖1、取材(1)將SD大鼠用戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，75%酒精消毒後，打開腹腔；注射 器快速抽取心臟血液3 4ml。其中Iml轉移到有抗凝劑肝素鈉的EP管中，保存在4°C冰 箱中；Iml轉移到不加抗凝劑的EP管中，常溫放置，凝集後2000rpm離心20min，吸取血清於 EP管中-20°C保存備用。(2)快速取大鼠的脾臟，立即於PBS液中清洗。隨後快速取0. Ig於Iml EP管中並 於液氮中速凍後轉入-70°C冰箱中保存備用。(3)另稱取脾臟0. lg，用Hank' s液繼續清洗後轉入5ml離心管中，加RPMI1640 培養液，4°C保存待取脾臟淋巴細胞時用。2、外周血淋巴細胞的MTT檢測(1)取抗凝血Iml與Hank' s液1 1混勻於5ml離心管中後，小心加入盛有2ml 細胞分離液的5ml離心管中，以2000rpm離心15min，收集上清；(2)放入含Hank' s液的5ml離心管中，充分混勻後，以1500 2000rpm離心 IOmin0吸去上清液，沉澱經反覆洗2次即得到所需細胞；(3)加Iml RPMI1640培養液(含10%小牛血清)懸浮細胞；(4)於96孔無菌培養板內加入細胞懸液200 μ 1(設復孔)，每孔加MTT溶液15 μ 1。 輕輕振蕩後，37 °C溫育3h ；(5)每孔加入二甲基亞碸(DMSO)IOOy 1，輕輕振蕩。待甲膊顆粒完全溶解後，用酶 標儀於590nm波長測量OD值。3、脾臟淋巴細胞的MTT檢測(1)在超淨工作檯中將培養液中的脾臟取出後置於培養皿中，剔除脾臟周圍組織， 用剪刀反覆剪切至糊狀，置於200目的細胞篩上用注射器芯輕研脾臟，培養液衝洗濾過細 胞篩於另一培養皿中，收集於離心管中；(2) 1500rpm離心lOmin，棄上清，加入少許滅菌的氯化銨溶液以溶解紅細胞，5min 後，同樣離心棄上清，細胞用無血清的1640液洗滌一遍；(3)用Iml RPMI1640培養液(含10%小牛血清)懸浮細胞，於96孔無菌培養板內加入細胞懸液200 μ 1 (設復孔)，每孔加MTT溶液12 μ 1，輕輕振蕩後，37°C溫育3h ； (4) 每管加入適量二甲基亞碸100 μ 1，輕輕振蕩，待甲膊顆粒完全溶解後，用酶標儀於590nm波 長測量OD值。結果表明，不同直徑和劑量的納米金對SD大鼠外周血和脾臟淋巴細胞的增殖均 有不同程度的影響，其中15nm/0. 6ml劑量組和25nm/0. 4ml劑量組對大鼠外周血淋巴細胞 增殖有較強的促進作用，而15nm/0. 6ml劑量組則對脾臟淋巴細胞增殖促進作用最強。實施例5 IL-2水平的檢測膠體金免疫大鼠後，無菌條件下通過心臟取血分離血清，同時取脾臟，分離淋巴細 胞。採用IOml含5% FBS的PRMI 1640培養液製成細胞懸液，離心lOmin。經0. 17M的NH4Cl 裂解紅細胞，PRMI 1640培養液洗滌，以臺盼蘭液檢測細胞活性，確定活細胞超過90%。用 10% FBS的PRMI 1640調整脾細胞終濃度至5X 106/ml，接種於48孔培養板中，置37°C 5% 的CO2培養箱中培養48h。室溫離心lOmin，收集上清。ELISA法檢測血清和細胞培養上清中 IL-2的含量。實驗方法按試劑盒說明進行實驗前20min從冰箱中取出試劑盒，平衡至室 溫；按試劑盒說明將標準品稀釋至不同濃度，設空白對照，同時將待測樣品按1 50稀釋； 除空白孔外，分別將不同濃度標準品和稀釋樣品ΙΟΟμ 1/孔加入相應孔中，封板膠封住反 應孔，37°C孵育90min ；用洗滌液充分洗滌酶標板4 6次，濾紙上印幹；除空白孔外，每孔 加入生物素化一抗工作液ΙΟΟμ 1 ；充分混勻後封板膠封住反應孔，37°C孵育60min ；按上述 方法洗板4 6次；除空白孔外，每孔加酶標抗體工作液100μ 1，封板膠封住反應孔，37°C 孵育30min ；洗板同前；加入顯色劑100μ 1/孔，避光37°C孵育10 15min ；加入終止液 100μ 1/孔，混勻後即刻(5min內)測量450nm處吸光值。根據標準品的吸光值及相應的濃 度作標準曲線，並根據樣品的吸光值在標準曲線上讀取IL-2對應的濃度。結果表明，與正 常對照組相比，不同粒徑不同劑量的膠體金均可促進外周血和脾臟淋巴細胞IL-2的分泌， 其中15nm/0. 6ml劑量組對大鼠外周血淋巴細胞IL-2的分泌促進作用最強，而15nm/0. 6ml 劑量組和25nm/0. 6ml劑量組則對脾臟淋巴細胞IL-2的分泌均有較強的促進作用。實施例6 人NgR-Fc原核表達載體的構建及鑑定為獲得大量天然表達的人NgR-Fc融合蛋白，本發明以真核表達載體 pcDNA-hNgR-Fc質粒(本實驗室保存)為模板，經PCR擴增得到hNgR-Fc片段。所用引物如 下Forward pr imer 5' GGAATTCCATATGAAGAGGGCGTCCGCTGG 3'Nde I酶切位點Reverse primer 5' CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3『Xho I酶切位點引物兩端分別引入Nde I和Xho I酶切位點，PCR擴增的hNgR-Fc片段，經Nde I 和Xho I雙酶切後回收純化並將其克隆於同樣雙酶切的pET30a+表達載體(Invitrogen) 中，獲得pET-hNgR-Fc重組表達質粒，並進行PCR、酶切和測序鑑定驗證構建載體的正確性。實施例7 人NgR-Fc可溶性融合蛋白的表達、純化及鑑定將經酶切和測序鑑定正確的重組質粒轉化至E. coli BL_21pLys感受態細胞中，用 LB培養基擴增，並在0D_達到0. 8左右時加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，誘導表達3h， 通過SDS-PAGE初步檢測目標蛋白hNgR-Fc的表達情況。然後通過Protein A親和柱來富集並純化破菌上清中的目標蛋白hNgR-Fc，並進行SDS-PAGE分析和Western-blot (用抗人 Fc的抗體作為一抗)鑑定。最終獲得了純度較高的人NgR-Fc融合蛋白。實施例8 hNgR-Fc融合蛋白的疫苗化將純化的hNgR-Fc融合蛋白與15nm膠體金混合形成hNgR-Fc融合蛋白疫苗。考 慮到膠體金的穩定性，選用0. OlM檸檬酸鈉緩衝液(pH = 6. 0)溶解hNgR-Fc抗原，並在與 15nm膠體金混合等體積混合後加入穩定劑聚乙二醇20000 (PEG20000)至終濃度500 μ g/ ml。選用0. OlM檸檬酸鈉緩衝液(pH = 6. 0)原因如下一、製備膠體金時採用檸檬酸三鈉 還原法，該緩衝液主要成分為檸檬酸三鈉，沒有引入新離子，對膠體金穩定性幹擾小；二、檸 檬酸三鈉作為一種臨床用抗凝劑，無毒性；三、膠體金的PH與該緩衝液pH相近。hNgR-Fc融合蛋白疫苗化過程及組分如下取50 μ g純化的hNgR-Fc融合蛋白溶 解於0. 6ml的0. OlM檸檬酸鈉緩衝液(pH = 6)後，與0. 6ml 15nm膠體金(含0. 05% PEG) 等體積混合，最後加入穩定劑PEG20000至終濃度500 μ g/ml。實施例9 動物免疫及抗體滴度檢測用純化的50 μ g hNgR-Fc融合蛋白作為抗原按上述方法製備蛋白疫苗，並採用後 肢肌肉多點注射法免疫SD大鼠(n = 6隻)。首次免疫2周後，加強免疫一次，1周後再加 強免疫一次。同時設弗氏佐劑(Freund' s adjuvant,FA)和膠體金(Colloidal gold,CG) 對照。弗氏佐劑初次免疫時採用50 μ g hNgR-Fc與完全弗氏佐劑(CFA)，加強免疫時用不完 全弗氏佐劑(IFA)，免疫方法相同。加強免疫2次後，通過心臟取血分離血清並採用ELISA法檢測抗體效價。方法 如下預先包被酶標板，用包被緩衝液(0. 05M碳酸鹽緩衝液，pH9. 6)將抗原NgR其稀釋 為lyg/ml，每孔100μ 1，空白對照不包被，4°C過夜。棄液體後用洗滌液(PBS_T，0.05% Tween-20)將包被好的酶標板洗滌3次，每次2min。每孔加入100 μ 1 1 %的BSA封閉液， 37°C封閉lh。棄去封閉液，洗滌3次。加入不同稀釋度的抗血清，每孔100 μ 1，37°C孵育 lh。洗滌3次後加入1 10000稀釋的羊抗大鼠IgG-HRP(北京中杉)，每孔100μ 1，37°C 孵育lh，洗滌4次後，每孔加入100 μ 1 11^顯色液，371顯色201^11後，每孔加入5(^1終 止液(2Μ濃硫酸)終止反應。用酶標儀在450nm波長處讀取吸光度值(0D值)。OD值大於 陰性孔3倍以上判斷為陽性。以免疫前血清為陰性對照。結果表明，所有經hNgR-Fc融合 蛋白免疫的大鼠均產生抗NgR抗體，效價均大於1 6400且納米金免疫佐劑明顯優於弗氏 佐劑；膠體金對照組大鼠血清中NgR抗體檢測呈陰性。實施例10 抗血清對神經元突起生長的影響在解剖顯微鏡下，於無菌預冷的D-Hank' s液中逐個摘取新生SD大鼠背根神經 節(Dorsal root ganglia，DRG)，轉入2ml 0. 25%胰蛋白酶消化液中，37°C培養箱中作用 20min ；IOOOrpm離心5min，吸去胰酶消化液，加入FBS終止消化；IOOOrpm離心5min，吸去 FBS，加入DMEM/F12培養基(含FBS)製成單細胞懸液，接種在未包被的35mm Corning 培養皿內，置於37°C培養箱中孵育50min ；收集未貼壁的細胞懸液，IOOOrpm離心5min，換入 Neurobasal (NB)培養基吹打均勻，細胞計數後以IO6個/ml細胞密度接種在多聚賴氨酸包 被的24孔培養板中。預先用PBS將MAG蛋白濃度調至IOOng/ μ 1。待上述培養的DRG神經元貼壁後換 液，每孔400 μ 1 ΝΒ。隨機分為3組，每組重複2次。第一組加入1 μ 1 MAG與未經hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫的對照血清(1 100)；第二組加入1 μ 1 MAG與hNgR-Fc融合蛋白疫苗 免疫血清(1 100)；第三組加入Iyl MAG與NgR抗體(1 1000)。上述各組細胞在培 養24h後用4%多聚甲醛固定，採用Image-ProPlus 5. 0軟體測量培養24h後的突起長度， 進行神經元突起生長分析(Neuriteoutgrowth assay)。為減少誤差，每次實驗在200倍倒 置顯微鏡下隨機選取10個視野進行測量，實驗重複3次，每次復孔檢測，取平均值進行統計 分析。結果表明，hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫血清可中和MAG對神經元突起生長的抑制作 用。實施例11 在體觀察疫苗接種對損傷脊髓的修復作用用製備的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，接種大鼠，接種方法同前。免疫2周後，製備大鼠 脊髓半橫切損傷模型，結合束路追蹤、組織學觀察和行為學檢測技術，於6周後盲法觀察損 傷脊髓頭側神經纖維的再生情況、神經元存活情況及脊髓損傷後的功能恢復情況。詳細操 作過程如下脊髓背柱損傷後，各組動物在灌注前16 18h，在坐骨神經注射核黃(Nuclear yellow, NY)，以脊髓內的逆行標記的再生軸突纖維的螢光強度表示軸突的再生情況。組 織學觀察則分別採用HE和尼氏染色法觀察損傷神經元的存活情況。同時採用行為學方法 (BBB評分、網格步行、足跡試驗)檢測傷側後肢功能的恢復情況。結果表明，hNgR-Fc融合 蛋白疫苗既可促進脊髓損傷後軸突的再生，又對神經元具有明顯的保護作用，還可促進脊 髓損傷後功能的恢復。
權利要求
促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR Fc融合蛋白疫苗，其特徵在於，是由下述方法製成的組合物將純化的hNgR Fc融合蛋白溶解於緩衝液中，所得溶液與等體積的膠體金混合得混合液，在混合液中加入穩定劑。
2.根據權利要求1所述促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 徵在於hNgR-Fc融合蛋白在組合物中的濃度為30 60 μ g/ml。
3.根據權利要求1所述促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 徵在於所述緩衝液的pH值為4 9。
4.根據權利要求1或3所述促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR-Fc融合蛋白疫苗， 其特徵在於所述緩衝液為檸檬酸鈉緩衝液。
5.根據權利要求2所述促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 徵在於所述緩衝液為濃度為0. 005 0. 015M的檸檬酸鈉緩衝液。
6.根據權利要求1所述促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 徵在於所述膠體金的粒徑為10 50nm。
7.根據權利要求1所述促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 徵在於所述穩定劑為聚乙二醇20000。
8.根據權利要求6所述促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 徵在於所述穩定劑為聚乙二醇20000，其在組合物中的濃度為200 500 μ g/ml。
全文摘要
本發明屬於生物醫學領域，涉及到一種能夠促進中樞神經再生與功能恢復的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，是將純化的hNgR-Fc融合蛋白溶解於緩衝液中，所得溶液與等體積的膠體金混合得混合液，在混合液中加入穩定劑所得到的組合物。該疫苗具有較好的免疫效果，能促進中樞神經再生與功能恢復，且毒副作用小。
文檔編號A61K39/39GK101897960SQ20101014665
公開日2010年12月1日 申請日期2010年4月14日 優先權日2010年4月14日
發明者伍亞民, 周新富, 曾琳, 朱楓, 李紅運, 王永堂, 魯秀敏, 龍在雲 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學野戰外科研究所