製備無病毒植物的方法
2023-07-03 22:23:06 3
專利名稱：製備無病毒植物的方法
技術領域：
本發明涉及製備以蒜為代表的蔥屬植物和其他經由鱗莖(scaly bulb)和球根(bulb)繁殖的植物的無病毒植物的方法。更具體地說，本發明涉及通過分離和培養通過培養營養葉基部獲得的圓頂狀組織(dome-shaped tissue)而製備無病毒植物的方法。
另一方面，最近建立起植物的組織培養方法，該方法的應用可以消除通過營養繁殖生長的多種植物的病毒。眾所周知，即使被病毒感染的植物在苗端(分生組織)也沒有病毒。因此，通過培養苗端並由此再分化植物，可以得到沒有被病毒感染的植物(無病毒植物)。還已知通過培養植物組織以形成愈傷組織並再培養該愈傷組織，即可消除病毒。通過再分化來自無病毒愈傷組織的植物，可以得到無病毒植物。
對於以蒜為代表的蔥屬植物，前述方法已被用來消除病毒，並且事實上無病毒蔥屬植物已得到栽培。
然而，通過培養苗端以獲得無病毒蔥屬植物的方法，一個苗端通常僅產生一個或少數幾個植物。為了獲得大量植物，必須摘取很多苗端。而且，由於苗端位於蔥屬小鱗片的基部，其大小約0.5毫米或更小，摘取苗端需在顯微鏡下操作。因此，摘取苗端的操作麻煩且工作效率低。
另一方面，在再分化愈傷組織以獲得無病毒蔥屬植物的方法中，一旦愈傷組織被誘導，可能使愈傷組織大量生長。然而，因為愈傷組織培養期間經常遇到突變，因此很難獲得同種遺傳性狀的蔥屬植物。
因此，開發了大量培養蔥屬植物的組織培養方法，其通過苗端培養使蔥屬植物無病毒，以及開發了利用營養葉基部製備再分化植物的方法，其使從少量材料生長大量無病毒植物成為可能(日本未審查的專利公開6-197650)。然而，這些方法自始至終需要無病毒植物作為材料，因此需要用網室(net house)將所述植物保持在離體培養中。
本發明的公開本發明涉及從感染了病毒的植物的非苗端組織製備無病毒植物的培養方法。
通過培養營養葉基部，可以通過圓頂狀組織誘導植物分化。本發明的發明者已經首次發現圓頂狀組織進行活躍的細胞分裂，並且其中沒有病毒存在，如在苗端中一樣。因此，通過僅分離圓頂狀組織並培養之，就可能製備無病毒植物。由於由一個小鱗片形成多個圓頂狀組織，與常規的苗端培養方法相比，效率大大提高。
因此，本發明提供製備無病毒植物的方法，其特徵在於分離並培養圓頂狀組織，所述圓頂狀組織通過培養外植體而形成，所述外植體包括經由鱗莖或球根繁殖的植物的營養葉基部。
優選地，該外植體是營養葉基部，且已經將苗端和營養葉從其去除，並且在無植物激素的存在下培養該外植體以形成圓頂狀組織。
優選地，營養葉基部是營養葉基至其以下1-3毫米部分的區域。
經由鱗莖或球根繁殖的植物優選是蔥屬植物。
所述蔥屬植物優選是蒜。
(b)外植體的製備作為外植體，本發明使用營養葉基部。從鱗莖或球根摘取營養葉基部的方法包括，例如，用對植物細胞無直接作用的殺菌劑如次氯酸鈉、苯扎氯銨和乙醇等將切成合適大小的鱗莖或球根滅菌，用無菌水適當清洗它們，從其去除貯藏葉以暴露營養葉基部，去除營養葉上部和苗端以後，將剩餘的營養葉基部切成合適大小，例如約1-3毫米，將其進行培養(日本未審查的專利公開6-197650)。大蒜鱗莖中的營養葉基部的位置如
圖1所示。
(c)所用的培養基作為培養基，任何含有植物生長所必需的成分，包括無機鹽、有機鹽如維生素、碳源、植物生長調節劑等的培養基均可使用。根據本發明，可以使用Murashige和Skoog培養基、Linsmaier和Skoog培養基等。
(d)培養將如(b)中描述所製備的外植體植入上述培養基，在適合植物生長的溫度(10-30℃，優選20-26℃)培養，光照為50-15000勒克斯，優選為3000-8000勒克斯(每天9-18小時，優選12-16小時)，在5-7天後形成圓頂狀組織。當繼續培養時，該圓頂狀組織生長成植物。在該培養方法中，將圓頂狀組織從外植體分離並培養。用刀片或解剖刀將在5-7天的培養後形成的圓頂狀組織切下，並將其再次植入(c)中描述的培養基中。通過類似的方式培養，圓頂狀組織變綠，並在約一個月後生長成小植株。當繼續培養時，小植株生根。
(e)栽培將在培養(d)中得到的生根的小植株植入含有合適的盆栽肥料(potting compost)的多盆(polypot)中，並生長到產生幼苗。將長好的小植株植入更大的盆或植入苗圃進行栽培。
(f)病毒檢測在主栽培(main cultivation)中得到的植物接受病毒檢測以確證該植物無病毒。病毒檢測可以通過為每種植物建立的方法進行。對於蔥屬植物，例如，使用抗病毒抗體的檢測方法或通過PCR方法確證病毒基因的存在與否的檢測方法(PHYTOPATHOLOGY，第86卷，第3期，第253-259頁，1996)。
作為用於培養的材料，使用Fukuchi white種和北海道本地蒜。用一種病毒，韭菜黃條紋病毒(LYSV)或兩種病毒，韭菜黃條紋病毒(LYSV)和洋蔥黃矮病毒(OYDV)感染所用的Fukuchi white種株，用四種病毒，大蒜病毒(GarVs)、韭菜黃條紋病毒(LYSV)、洋蔥黃矮病毒(OYDV)和大蒜潛伏病毒(GLV)感染北海道本地株。
1.材料的滅菌將大蒜鱗莖分解成小鱗莖，並去除外皮。然後用苯扎氯銨和水清洗後，將小鱗莖的基部切成1釐米立方塊的部分。將該部分在70％乙醇中浸5分鐘，然後用無菌水清洗。
2.外植體的製備材料的滅菌後，去除餘下的貯藏葉部分，以暴露營養葉。將營養葉上部切掉，以使營養葉約高0.5釐米。垂直劈開成四部分，將剩餘的營養葉削掉，去除苗端。將剩下的基部切成2毫米厚，以製備外植體。
3.培養基將未添加植物激素的Linsmaier和Skoog培養基(本文以下稱為LS培養基)用於培養。
4.培養將所製備的外植體植入LS培養基，並在每天光照16小時的條件下在25℃進行靜置培養。
5.圓頂狀組織形成和離體培養培養開始後一周，直徑約為0.5毫米的圓頂狀組織在一些外植體上形成。每個鱗片上形成20到30個圓頂狀組織。將圓頂狀組織用解剖刀切開，並植入未添加激素的LS培養基，然後在25℃和每天光照16小時的條件下靜置培養。圓頂狀組織變綠，並在2-4周後生長成植物。大約100％的離體圓頂狀組織以這種方式生長。將植物植入新的培養基，植物繼續培養生根。將生根的植物植入填有土的多盆中栽培。
6.病毒檢測病毒檢測所用的樣品是通過圓頂狀組織的離體培養獲得的大蒜葉片。病毒檢測通過RT-PCR進行，以部分病毒基因序列作為引物。
從葉片中提取RNA，用cDNA合成試劑盒從該RNA合成cDNA。以該cDNA做模板，使用病毒檢測的引物進行PCR。基於感染大蒜的病毒的基因的鹼基序列設計引物，從而得到對病毒特異性的擴增產物。為四種病毒中的每種設計特異性引物，四種病毒為大蒜病毒(GarVs)、韭菜黃條紋病毒(LYSV)、洋蔥黃矮病毒(OYDV)和大蒜潛伏病毒(GLV)，並進行PCR反應。PCR反應後，通過瓊脂糖凝膠電泳來研究特異性擴增產物的存在，以檢測病毒的存在。
作為結果，在Fukuchi white種和北海道本地種中的任何一個中，通過圓頂狀組織的離體培養得到的植物沒有發現指示病毒存在的擴增產物。指示病毒存在的擴增產物在沒有分離大蒜材料和圓頂狀組織的連續培養的植物中被確證。因此，確證可以通過營養葉基部的培養形成的圓頂狀組織的離體培養獲得無病毒大蒜。
用於病毒檢測的引物如下
表1引物序列及要擴增的區域
病毒檢測結果如下所示表2每種植物的病毒檢測結果
工業應用性根據本發明的製備無病毒植物的培養方法與苗端培養方法相比，可以得到更大量的無病毒植物。在常規苗端培養方法中，常見的是每個鱗片僅有一個或少數幾個苗端，一個苗端只產生一個植物，因此難以得到大量的無病毒植物。相反，培養營養葉基部的方法產生多個植物在大蒜的情況中，一個鱗片產生20-30個圓頂狀組織。因此，易於無病毒植物的大規模繁殖。
序列表110 湧永製藥株式會社120 製備無病毒植物的方法130 993730160 12210 1211 20212 DNA213 人工序列220221222223 引物400 1cctgctaagc tatatgctga20210 2211 20212 DNA213 人工序列220221222223 引物400 2gtaagtttag cgatatcaac20210 3211 20212 DNA213 人工序列220221222223 引物400 3aagagtcaac acttggtttg20210 4211 20212 DNA213 人工序列220221222223 引物400 4ggtctcaatc ctagctagtc20210 5211 21212 DNA213 人工序列220221222223 引物400 5gaagcgcaca tgcaaatgaa g 21210 6211 20212 DNA213 人工序列220221222223 引物400 6cgccacaact agtggtacac20210 7211 20212 DNA213 人工序列220221222223 引物4007tatgctcgag ctcgtagagc20210821120212DNA213人工序列220221222223引物4008gggtttcaca ttgttacacc20210921120212DNA213人工序列220221222223引物4009aatgggtgtt ctaggagtgc202101021122212DNA213人工序列220221222223引物40010ttaaacctta gtcaagctat tc 222101121124212DNA213人工序列220221222223引物40011tctggtagtc gatttgggtg ggcg 242101221121212DNA213人工序列220221222223引物40012gccgtagcat taggatgtat g 2權利要求
1.製備無病毒植物的方法，其特徵在於分離並培養圓頂狀組織，所述圓頂狀組織通過培養經由鱗莖或球根繁殖的植物的營養葉基部而形成。
2.根據權利要求1的方法，其中在無植物激素的存在下，培養外植體以形成圓頂狀組織，所述外植體包括營養葉基部，且苗端和營養葉已經從營養葉基部除去。
3.根據權利要求1或2的方法，其中所述營養葉基部是從營養葉基到其以下1-3毫米部分的區域。
4.根據權利要求1-3中的任一項權利要求的方法，其中經由鱗莖或球根繁殖的植物是蔥屬植物。
5.根據權利要求4的方法，其中蔥屬植物是蒜。
全文摘要
在通過鱗莖或球根中的營養葉基部的培養形成的圓頂狀組織中,活躍的細胞分裂進行。因此預期該組織無病毒。通過分離並培養該圓頂狀組織可以獲得無病毒植物。
文檔編號A01H4/00GK1356868SQ00809288
公開日2002年7月3日 申請日期2000年6月20日 優先權日1999年6月22日
發明者綾部昌則, 角慎一郎 申請人:湧永製藥株式會社