高效快速的膀胱癌尿檢試劑盒及尿液細胞活性保存液的製作方法

2023-07-03 23:24:11

專利名稱：高效快速的膀胱癌尿檢試劑盒及尿液細胞活性保存液的製作方法
技術領域：
本發明涉及到生物醫學領域，特別是涉及到一種高效快速的膀胱癌尿檢試劑盒及尿液細 胞活性保存液。
背景技術：
尿樣品中含有生理性代謝廢棄物質包括含有機、無機類成分以及含微量元素的電解質成 分， 一些尿液中會含有蛋白類及糖類物質，屬於病理性代謝產物；由於尿液排出前會經過一 系列組織如膀胱，因此尿液中還會含有少量的組織脫落細胞，鑑於尿液與人體代謝的密切關 系，因此用於很多分析實驗或臨床檢測。然而也正是由於尿樣中豐富的成分，使細菌能夠快 速地繁殖於其中，當尿樣不能及時進入檢測程序時，細菌與其中的一些成分會使尿液中反映 病理狀況的成分失活或者變態，導致後續檢測結果不能準確反映患者的生理狀況。
目前監測早期惡性腫瘤的檢測化驗大多還需有創傷地取待檢器官的活組織或細胞，隨著 癌症等惡性疾病高頻發生，人們的健康危機意識明顯提高，越來越多的人按期體檢、提前預 症，希望能清楚自己的身體狀況，找安心的同時也能早發現早治療，但有創性檢測為癌症早 期監測帶來了障礙，幸運的是，近年來人們對於端粒酶活性與癌症發生發展關係的研究成果 證明，端粒酶活性與大多數癌症的發生有密切關係。如2007年，許寧等的《膀胱癌組織端粒 酶活性表達及其與臨床病理特徵關係的研究》報導"實驗組中端粒酶活性表達率為96%，
對照組無表達，實驗組端粒酶活性高於對照組(P<0.001);端粒酶活性臨床病理分期T2高 於T1、 T3髙於T2 (P<0 01)，晚期組高於早期組(P<0.001);端粒酶活性病理分級G2 高於G1、 G3高於G2 (P<0.01)。結論是端粒酶活性高表達並與膀胱癌臨床病理分期、 病理分級呈正相關，端粒酶激活可能在膀胱癌的發生及發展過程中起重要作用，端粒酶可作 為膀胱癌早期診斷及判定預後的分子生物學標記"，如2004年，範德厚等人(範德厚[1]陳仕 平P，尿液端粒酶活性檢測對膀胱癌的診斷價值《福建醫科大學學報》2004年第38巻第2期)， 研究結果顯示72例膀胱癌患者尿液中66例檢出端粒酶，活性陽性率為91. 5% (P<0. 01,XA2=17. 17);因此尿液脫落細胞中的端粒酶活性檢測就是一種無創性檢測手段， 尿液細胞中超過正常水平的端粒酶活性表示可能發生了與端粒酶活性相關疾病，如膀胱癌， 檢測結果可提醒患者儘早進行更為可靠的鑑別診斷，從而贏得治療時機，同時對於已確診的 病人的臨床治療效果定期隨訪也是一種方便可行的檢測手段，即無論對於排除性檢測還是跟 蹤檢測，對尿液的端粒酶活性檢測這種無創檢測方式都易於被接受，成本低而且無心理負擔， 這對於預防膀胱癌，提高膀胱癌存活率的關鍵一環，膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，在我國佔男性惡性腫瘤的第七位，死亡率在男性居肺、肝、胃、食管、結直腸、血病、鼻咽 癌之後，居第八位，女性居第10位，發病率約為7.4/10萬；膀胱癌早期診治的五年存活率為 93%，但若不能及時發現確診治療，晚期病人的五年存活率僅為6%，死亡率遠遠大於惡性度 高於膀胱癌的其它腫瘤。膀胱癌的一個顯著臨床特點是容易復發，術後五年內的復發率高達 70%，且有10%-20%發展為浸潤性膀胱癌，因此，定期隨訪並早期發現復發在膀胱癌的治療 中佔有重要地位。
膀胱癌預測依賴的尿樣品，保存尿液中細胞活性是獲得可靠數據的關鍵。由於尿液中脫 落細胞濃度非常低，而端粒酶由三個亞基組成 一個RNA組分(hTR)可作為DNA複製的模 板； 一個功能未知的端粒末端轉移酶關聯蛋白(TP1);—個具催化活性的端粒末端轉移酶反轉 錄酶(hTERT)。其中RNA組分和反轉錄酶組分就極不穩定，特別是早期癌變細胞的端粒酶 活性表達量非常低，稍微存放，就容易被尿液中的其他成分和繁殖的細菌破壞失活或者降解， 最終導致檢測的假陰性或檢測值偏低，因此急需一種保存液能保持尿液中的物質不發生結構 和功能的變化，特別是其中的端粒酶活性，這對於無創性、準確監測膀胱癌早期發生或病情 發展有極大的促進作用。目前未見到有效的類似保存液。
檢測端粒酶活性的方法是目前醫學生物學研究的熱點，並報導了很多高特異性高靈敏度 的檢測方式，特別是傳統的端粒擴增法(TRAP)與實時定量PCR結合的檢測方法，如專利 號為200380107388.5，名稱為"檢測端粒酶活性的方法和組合物"的專利申請。結合添 加內標的方式如專利號為00111629.0，名稱為"端粒酶活性的定量測定方法"的專利申請， 其技術方案中提供了非常理想的引物、內參引物及內標模板，能夠很好地避免假陰性結果和 引物二聚體引起的非特異性擴增等缺陷，由於當時還沒有發展螢光定量PCR技術，因此，無 法精確定量檢測底物，而結合現代的PCR螢光技術，將能夠靈敏特異地檢測定量細胞中的端 粒酶活性。

發明內容
本發明針對上述領域的缺陷及需求提供一種高效快速的膀胱癌尿檢試劑盒及尿液細胞活 性保存液，該試劑盒包括尿液細胞活性保存液，同時，結合傳統的端粒擴展法與實時定量PCR 的原理檢測尿液中端粒酶的活性，可準確地、無創性地監測膀胱癌早期的發生或後期的發展。 該試劑盒中的尿液細胞活性保存液可保證待測尿液中膀胱脫落細胞中端粒酶活性穩定，並收 集到足夠多的活性細胞以保證獲得準確的檢測數據。
一種尿液細胞活性保存液，包含下列含量的組分每毫升保存液中0.02ng 0.4ng表皮生 長因子、0.08~0.17ng糖類物質、0.00085 0.0018timo1磷酸根、0.8X 10-4 1.67X 10 mol 氯化鈣、0.45X 1(T4 0.92X lO"Vmol氯化鎂；佔保存液總重量0.01%-25%的白蛋白和0.1%-50%的二甲基亞颯，PH7.2-7.4，溶劑為雙蒸水。
所述保存液，包含有下列含量的組分每亳升保存液中含0. 08ng表皮生長因子，0.1 0. 2 mg IX Dulbecco氏磷酸鹽緩衝液；佔保存液總重量0. 5%的白蛋白和3%的二甲基亞颯，溶 劑為雙蒸水；所述IX Dulbecco氏磷酸鹽緩衝液的配方為磷酸二氫鉀1. 47mM和磷酸氫二 鈉8. 06mM，氯化鈣0. 901mM，氯化鎂0. 493mM，氯化鉀2. 67mM，氯化鈉137. 93mM, D-葡 萄糖5. l處pH7. 2 7. 4。
所述1 X Dulbecco氏磷酸鹽緩衝液的加入量為每毫升保存液中含0.18mg.
所述白蛋白指牛血清白蛋白。
所述的尿液保存液在保存待測端粒酶活性的細胞中的應用。
一種高效快速的膀胱癌尿檢試劑盒，其特徵在於包含所述的尿液細胞活性保存液和如下 引物序列
延伸引物FP:5， FAM-ATTGCCAATCCGTCGAGCAGAGTT-DABSYL ， 反向引物RP: 5, GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC ， 內標對照引物CP: 5 ， ROX-ATCGCTTCTCGGCCTTT-DABSYL， 內標序列ITC: 5， AATCCGTCGAGCAGAGTTMAAGGCCGAGAAGCGAT; 所述延伸引物FP的5'端偶聯有螢光基團FAM， 3'端偶聯有卒滅基團DABSYL 所述對照引物CP的5 ，端偶聯有螢光基團R0X， 3'端偶聯有卒滅基團DABSYL。
所述的試劑盒，還包括如下試劑核苷三磷酸，Taq聚合酶，與Taq聚合 酶配套使用的緩衝液，雙蒸水，陽性對照標準品。
所述陽性對照標準品指293細胞提取物。
所述試劑指10XTaq聚合酶緩衝液，50XdNTPMix， FP100ng/ul， RP100ng/ul， CP 100 ng/ul， ICT 0.01 amol/ul， Taq聚合酶2 Units/ul，雙蒸水，陽性對照標準品 250cells/ul。
本發明提供的尿液細胞活性保存液，主要作用在於收集早期膀胱癌患者的尿液中的膀胱 脫落細胞，由於早期癌細胞在端粒酶活性表達量非常低， 一次尿液以及普通條件下保存的尿 液很難保證檢測出其中僅存的少量端粒酶活性，為了給膀胱癌檢測提供性質穩定，足量的檢 測底物，本發明提供了本保存液，其含有表皮生長因子，磷酸根，糖類物質，氯化鈣、氯化 鎂、白蛋白和二甲基亞颯等成分。
本該保存液中表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)是一種小肽,由53個氨基 酸殘基組成，是類EGF大家族的一個成員，是一種多功能的生長因子，在體內體外都對多 種組織細胞有強烈的促分裂作用，有研究發現表皮生長因子EGF是一種刺激皮膚癌形成的蛋白質，端粒酶是一種與癌症發生正相關的複合大分子，因此推測EGF對於刺激端粒酶活性 和維持端粒酶活性方面起作用。
二甲基亞颯，是一種表面活性物質，能夠很快透過細胞膜，將溶於其中的化學物質 代入細胞深部提高各種成分的作用。選自常用的市售產品，關於濃度，二甲基亞颯濃度 低於0."/。(W/W)將起不到表面活性的作用，導致細胞保存能力降低；相反，如果濃度超 過保存液總量的50% (W/W)，則作用不再改變，從性價比的角度考慮，二甲基亞颯的濃度 確定為3% (w/w)。
白蛋白是由動物肝實質細胞合成，在血漿中含量最多的蛋白，是含有585個氨基 酸殘基的單鏈多肽，具有維持血漿膠體滲透壓的作用，並與小分子有機物和無機離子非 專一性地結合，作為這些物質的運輸載體，白蛋白的減少會引起很多物質的代謝失衡， 在本發明中，起著維持尿液細胞生理活性和提供細胞代謝所需營養的作用；本發明中的 白蛋白優選採用牛血清白蛋白BSA， BSA易於獲得，經濟實用。也可以使用任何種類的 純度相當於片段V的精製白蛋白。關於保存液中白蛋白的濃度，低於0.001% (W/W)的 白蛋白無效，而且如果白蛋白濃度超過25Q/o(w/w)，其作用不再改變。因此，考慮經濟 效率和操作性質，優選0.5。/。(w/w)的白蛋白性價比最高。
鈣、鎂離子在維持細胞膜滲透平衡、維持蛋白構象與活性方面起著重要作用，使凍 存的細胞從低溫復原時細胞膜迅速恢復活性從而提高細胞存活率(有效細胞率)。
糖成分能夠防止細胞在凍融過程中臨界溫度附件產生冰晶，冰晶會破壞細胞內細胞 器、大分子物質發生不可逆轉的結構性改變，細胞內稍高含量的糖成分能夠避免冰晶的 產生，從而具有使保存的細胞復原時提高活細胞率(有效細胞率)的功能。
本保存液採用Dulbecco氏磷酸鹽緩衝鹽水提供磷酸根、糖類物質、氯化鉀、氯化鈉、 氯化鈣、氯化鎂等成分，該緩衝液中還含有有利於細胞生理活性的鈉鹽、鉀鹽等物質，是目 前釆用的細胞保存液，可直接購買，簡化了配製程序。其配比為磷酸二氫鉀Potassium Phosphate monobasic (KH2P04), 1.47mM和磷酸氫二鈉Sodium Phosphate dibasic (Na2HP04-7H20), 8.06mM，氯化鈣Calcium Chloride (CaCI2)， 0.901mM，氯化鎂 Magnesium Chloride (MgCI2-6H20), 0.493mM，氯化鉀Potassium Chloride (KCI)， 2.67mM，氯化鈉Sodium Chloride (NaCI)， 137.93mM， D-葡萄糖D-Glucose， 5.1mM， PH 7.2~7.4。
本發明的保存液用於保存尿樣品，使其中的細胞端粒酶活性保存良好，從實驗數據 可以看出使用本發明尿液細胞活性保存液的尿樣本在-75'C儲存條件下端粒酶活性保持 至少一年沒有明顯降解(one way ANOVA， p>0.5)，而直接使用1X Dulbecco氏磷酸鹽緩衝保存的尿液樣本保存至3個月時，已出現顯著的端粒酶活性下降，6個月時已降至幾
乎為零(one wayANOVA， p< 0.0001)如圖1所示。
本發明獲得的尿液細胞活性保存液目的在於使尿液中的膀胱脫落細胞中端粒酶活性 得以穩定保存，但不限於保存尿液中的細胞，其他用來做端粒酶活性檢測的細胞一樣可 以採用本保存液進行保存待檢測。所述的尿液細胞活性保存液在保存待測端粒酶活性的 細胞中的應用。
本發明的一個很主要目的在於還提供一種膀胱癌尿檢試劑盒。該試劑盒包含上述尿液細 胞活性保存液，能夠無創地採集到疑似早期膀胱癌患者的尿液細胞，並積攢到足夠多，由於 保存液的作用，積攢過程中細胞內含物不易變性，然後用於後續檢測實驗，能準確檢測到細 胞中少量存在的端粒酶活性。由於本試劑盒主要通過檢測尿液細胞端粒酶活性來監測早期膀 胱癌的發生，因此其中還包含檢測端粒酶活性所需的引物；本發明的試劑盒檢測端粒酶活性 的方法採用前人發表過的傳統的端粒擴展法(TRAP)，如專利申請號00111629.0中的檢測方 法，並結合了螢光定量pcr的方法；引物設計上略作改動，在延伸引物FP的5'端加上一個發 夾結構並偶聯了螢光團，3'端偶聯DABSYL淬滅團(4 -二甲胺-偶氮苯磺酸)，反應前發卡 結構使螢光基團與淬滅團非常靠近，因此不發光，當該引物參與PCR反應生成雙鏈PCR反應 物時，髮夾展開使兩個基團遠離，於是螢光團不再受淬滅團的控制而發出螢光。內標引物CP 偶聯了與延伸引物發不同光色的螢光團，內標螢光的應用可以提示人們檢測結果是否存在假 陰性可能，內標模板還可與延伸引物嚴格配對，因此能競爭性地抑制非特異性反應，因此本 試劑盒中的螢光定量pcr反應的敏感性和特異性非常高，能夠精確定量待測樣品中的端粒酶活 性狀況，如圖3所示。本發明的試劑盒的PCR檢測原理如圖2所示。
為了提供更為高效、實用的試劑盒，本發明優選在試劑盒中加入pcr反應所需的試劑核 苷三磷酸、Taq聚合酶，與Taq聚合酶緩衝液，雙蒸水，陽性對照標準品等成分，並經過多 次試驗得出特異性敏感性的最佳的pcr反應體系和程序。
本發明的試劑盒的檢測試驗步驟如下
(1) 取晨首次尿液，按尿液:保存液為100:1的比例第一次加入尿液細胞活性保存液，室溫下 2000g，離心30min沉澱尿樣細胞;棄清液，然後加入尿液細胞活性保存液重懸尿樣細胞，加入 量為第一次加入量的10倍，進入下一檢測或者-75'C貯存；
(2) 將上一步得到的尿樣於4。C8000g離心5min，儘量棄上清；
(3) 在RNA酶抑制劑為100-200 units/mL的常規細胞裂解液中裂解細胞；
(4) 在一個PCR管中，加入上步獲得的細胞裂解液或陽性對照標準品2pL，和如下成份10X Taq聚合酶緩沖液5.0pL， 50X dNTP Mix* 1.0 pL， FP100ng， RP100ng， CP ， 100 ng,
7ICT0.01amo1， Taq聚合酶2 Units,添力口dH20至50ijL，混勻PCR程序30°C， 30分鐘； 94X/30秒，59X/30秒，and 72。C/1分鐘，30-33個循環。 (5) PCR產物進行光度測量，螢光激發光/壓制光波長設定fluorescein : 495nm/516nm,sulforhodamine : 600nm/620nm。綜上所述使用本試劑盒能夠對取自尿液的細胞進行端粒酶活性檢測從而高效準確地檢 測出患者是否發生了與端粒酶活性相關的疾病，如膀胱癌，本試劑盒中的尿液保存液是一個 關鍵的因素，由於早期癌症患者的端粒酶活性表達量較低，少量供試細胞難以檢測出其中的 酶活性，該尿液保存液能夠使收集到的尿液細胞保存良好的活性，從而為收集足夠多的活性 細胞提供了充足的時間，這對於準確檢測出早期膀胱癌症患者非常有意義，同時該試劑盒及 其尿液保存液為無創性監測膀胱癌的發生提供了一條確實可行的途徑。


圖l:尿液細胞活性保存液與對照普通磷酸緩衝液保存的尿樣中端粒酶活性比較 縱坐標為端粒酶濃度，橫坐標表示尿液的保存時間，黑色柱代表使用尿液細胞活性保存液的 樣品，黑白方格代表對照。 圖2.端粒酶活性檢測原理虛線框外橫線表示30攝氏度條件下端粒酶延伸產物。虛線框內表示端粒酶活性的實時定量P C R反應系統，第一條以端粒酶延伸產物為模板 的擴增用於定量端粒酶活性，第二條為內標ITC以CP為引物的擴增，用於監測實時定量pcr的 有效性，第三條，顯示內標參與競爭實時定量PCR的引物FP,因此能夠抑制非特異性擴增。 圖3.群體樣品端粒酶活性檢測的ROC曲線。橫坐標表示特異性，即假陽性率；縱坐標表示敏感度，即真陽性率。 圖4.重點螢光值與陽性細胞數相關標準曲線。縱坐標ZFAM/」ROX的比率來表示重點螢光值，』FAM是在FAM反應管測出的重點螢光 值減去相應的陽性對照值；」ROX是在ROX反應管測出的螢光值減去無Taq酶的陰性對照值。 橫坐標為細胞活性細胞數 圖5.重點螢光值與酶活性單位相關標準曲線。縱坐標同圖5，橫坐標表示相應活性細胞數對於的酶活性。 圖6.聚丙烯醯胺凝膠電泳驗證分析部分結果。1—7泳道從左至右依次為1.陽性對照293細胞(1000個)提取液2.引物二聚體/PCR 汙染對照。3.陽性對照293細胞(50個)提取液。4.陽性對照293細胞(125個)提取液5. 陽性對照293細胞(250個)提取液。6. 陽性對照293細胞(500個)提取液。7. DNA marker 。
具體實施方式
實施例1 .配製尿液細胞活性保存液及應用試驗步驟l:配製保存液，按表l所列成分，溶劑為雙蒸水，PH7.2-7.4。獲得的保存液命名為Cellock液。 表l成分配比成分來源表皮生長因子0. 08ng/mL市售，Sigma/E9644BSA白蛋白0.5% (w/w)市售二甲基亞颯3% (w/w)市售Dulbecco氏磷酸 鹽緩衝液 (DPBS)0. 18mg/mL商購於Sigma， pH7.2-7.4，包括磷酸二氫鉀 Potassium Phosphate monobasic (KH2P04), 1.47mM和磷酸氫二鈉Sodium Phosphate dibasic (Na2HP04-7H20)， 8.06mM，氯化鈣Calcium Chloride (CaCI2)， 0.901mM ， 氯化鎂 Magnesium Chloride (MgCI2-6H20) ， 0'493mM ， 氯化鉀 Potassium Chloride (KCI), 2.67mM，氯化鈉 Sodium Chloride (NaCI)， 137.93mM， D-葡 萄糖D-Glucose， 5.1mM。步驟.2尿樣細胞處理，2. l每個病例取晨首次尿200 mL於尿杯中，10例為實驗組，每個尿樣中立即加入2mLCellock;在室溫下2000g離心30min沉澱尿樣細 胞，棄掉上清液，將實驗組沉澱的尿樣細胞重懸於10mlCellock液中，將每例細胞混合液分 成5份，每份2mL轉至2.5mL的冷凍管中。各留取一管樣品立即進行端粒酶活性測量，其餘的4 管置於-75'C儲存。凍存的樣品每三個月各取出一管將細胞解凍後進行端粒酶活性檢測。另外10例為對照組，每個尿樣中立即加入1X Dulbecco氏磷酸鹽緩衝鹽水2mL。都在室溫 下2000g離心30min沉澱尿樣細胞，棄掉上清液，將沉澱的尿樣細胞重懸於10 ml Dulbecco氏 磷酸鹽緩衝鹽水液中，將每例細胞混合液分成5份，每份2mL轉至2.5mL的冷凍管中。各留取一 管樣品立即進行端粒酶活性測量，其餘的每例4管置於-75'C儲存。凍存的樣品每三個月各取 出一管將細胞解凍後進行端粒酶活性檢測。2.2待檢尿樣放入4。C8000g離心5min，儘量棄上清，立即重懸細胞於20 ^L的1X細胞裂解液中。在1X細胞裂解液中加入RNA酶抑制劑，使其終濃度達100-200 imits/mL。 IX細胞裂解液配方10 mMTris-HCl,pH 7.5; 1 mM MgCl2 (氯 化鎂)；1 mMEGTA (乙二醇雙四乙酸)；0.1 mM Benzamidine (苯甲脒)；5 mM |3-mercaptoethanol (p-巰基乙醇)；0.5% CHAPS; 10% Glycerol (丙三醇)2.3使用本發明實施例2中的試劑盒檢測端粒末端轉移酶的活性，以任意酶濃度(AEU)作為單位。結果證明，使用本發明尿液細胞保存液的樣本在-75'C儲存 條件下端粒酶活性保持至少 一年沒有明顯降解(one way ANOVA， p>0. 5)，而 使用一般PBS的尿液樣本保存至3個月時，已出現顯著的端粒酶活性下降，6個月 時已降至幾乎為零(one way ANOVA， p< 0.0001)，見圖1 。實施例2組配試劑盒所用試劑Taq聚合酶及10XTaq聚合酶緩衝液、50X dNTP Mix*、 trypsin—versene (EDTA)以及配置PBS緩衝液的化學藥品都在市場上可買到。表2 試劑盒成份1. Cellock液(由實施例l獲得)_2. 反應混合液FP引物100ng/|jLRP引物100ng/ijL CP引物100ng/|jL ICT模板0.01 amol / |jL 50X dNTP Mix* Taq聚合酶2 Units / nL 10XTaq聚合酶緩衝液 PCR級別水3. 陽性對照標準品250ceHs/|jL_1. 引物序列如下，由生物公司合成FP: 5，[FAM]ATTGCCAATCCGTCGAGCAGAGTT[-DABSYL] RP: 5， GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC CP: 5， [ROX]ATCGCTTCTCGGCCTTT[-DABSYL]ITC:5，AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT2. PCR級別水去離子水，無蛋白酶、無DNA酶和RNA酶汙染。3. Taq聚合酶及10XTaq聚合酶緩衝液、50X dNTP Mix^為普通PCR反應中所用，在市場 上可以購買到。4. 陽性標準品製備293細胞提取物作為陽性標準品對照。 將293細胞在常規標準條件下使用培養至單層鋪滿培養皿的80-90%時，棄去培養液，用PBS洗盤後加入室溫狀態的細胞消化液trypsin—versene (EDTA) (5mL)孵育3.5分鐘使細胞浮起，收集全部細胞混懸液立即加入5mL293細胞培養液中和消化液的作用，離心(2000g離心30rain)、然後用PBS洗滌沉澱，細胞重懸於1ml PBS中，倒置顯微鏡下進行293細胞計數，並用加入適量PBS將細胞數調至每微升250個細胞的濃度。PBS緩沖液配方137mMNaCl， 2.7 mM KC1， 10mMNa2HPO4， 1.8mMKH2P04， pH=7.4， 4°<:或室溫保存。293細胞培養液為DMEM (Dubelco，s Modified Eagles Medium)加10 %胎牛血清(FBS) 細胞培養液，4° P09327/txs 4 Patentln version 3.3 1 24 DNA延伸引物FP DNA〈213〉反向引物rp<400〉 2gcgcggctta cccttaccct taccctaacc 30 3 〈211〉 17 〈212〉 DNA〈213〉內標對照引物CP <400〉 3atcgcttctc ggccttt 17<210〉 4〈211〉 36〈212〉脆〈213〉 內標序列ITC〈400〉 4satccgtcga gcagagttaa 3aggccgaga 3gcgat 3權利要求
1.一種尿液細胞活性保存液，包含下列含量的組分每毫升保存液中0.02ng～0.4ng表皮生長因子、0.08～0.17ng糖類物質、0.00085～0.0018μmol磷酸根、0.8×10-4～1.67×10-4μmol氯化鈣、0.45×10-4～0.92×10-4μmol氯化鎂；佔保存液總重量0.01％-25％的白蛋白和0.1％-50％的二甲基亞颯，PH7.2-7.4，溶劑為雙蒸水。
2. 根據權利要求1所述的尿液細胞活性保存液，包含下列含量的組分每毫升保存液中 0. 08ng表皮生長因子，0. 1 0. 2 mg 1 Dulbecco氏磷酸鹽緩衝液；佔保存液總重量0. 5% 的白蛋白和3%的二甲基亞颯，溶劑為雙蒸水；所述lXDulbecco氏磷酸鹽緩衝液的配方 為磷酸二氫鉀1.47mM和磷酸氫二鈉8.06mM，氯化鈣0. 901mM，氯化鎂0. 493mM，氯化 鉀2. 67mM，氯化鈉137. 93mM， D-葡萄糖5. lraM， PH7. 2-7. 4。
3. 根據權利要求2所述的尿液細胞活性保存液，所述1 X Dulbecco氏磷酸鹽緩衝液的加入 量為每毫升保存液中含0.18mg。
4. 根據權利要求1至3任一所述的尿液細胞活性保存液，所述白蛋白指牛血清白蛋白。
5. 權利要求1至4任一所述的尿液細胞活性保存液在保存待測端粒酶活性的細胞中的應用。
6. —種高效快速的膀胱癌尿檢試劑盒，其特徵在於包含權利要求1至4任一所述的尿液細 胞活性保存液和如下引物序列延伸引物FP: 5 ， FAM-ATTGCCAATCCGTCGAGCAGAGTT-DABSYL ，反向引物RP: 5 ， GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC ，內標對照引物CP: 5， ROX-ATCGCTTCTCGGCCTTT-DABSYL，內標序列ITC:5 ， AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT;所述延伸引物FP的5'端偶聯有螢光基團FAM, 3'端偶聯有卒滅基團DABSYL所述對照引物CP的5'端偶聯有螢光基團ROX， 3'端偶聯有卒滅基團DABSYL。
7. 根據權利要求6所述的試劑盒，還包括如下試劑核苷三磷酸，Taq聚合酶，與T叫聚合 酶配套使用的緩衝液，雙蒸水，陽性對照標準品。
8. 根據權利要求7所述的試劑盒，所述陽性對照標準品指293細胞提取物。
9. 根據權利要求7或8所述的試劑盒，所述試劑指10X Taq聚合酶緩衝液，50X dNTP Mix， FP 100 ng/ul， RP 100 ng/ul， CP 100 ng/ul， ICT 0. 01 amol/ul， Taq聚合酶2 Units/ul， 雙蒸水，陽性對照標準品250cells/ul。
全文摘要
本發明涉及一種「高效快速的膀胱癌尿檢試劑盒及尿液細胞活性保存液」，屬於生物醫學領域。一種高效快速的膀胱癌尿檢試劑盒，其包含有尿液細胞活性保存液與用於檢測端粒酶活性的特異性螢光標記引物，使用本試劑盒能夠對取自尿液的細胞進行端粒酶活性檢測從而高效準確地檢測出患者是否發生了與端粒酶活性相關的疾病，如膀胱癌，本試劑盒中的尿液保存液是一個關鍵的因素，由於早期癌症患者的端粒酶活性表達量較低，少量供試細胞難以檢測出其中的酶活性，該尿液保存液能夠使收集到的尿液細胞保存良好的活性，從而為收集足夠多的活性細胞提供了充足的時間，這對於準確檢測出早期膀胱及無創性監測膀胱癌的發生提供了一條確實可行的途徑。
文檔編號A01N1/02GK101601378SQ20091008882
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月20日 優先權日2009年7月20日
發明者焦守恕, 程根宏 申請人:同昕生物技術(北京)有限公司