一種修復硝基甲苯汙染土壤的菌劑及使用方法
2023-07-04 01:45:56 1
專利名稱：一種修復硝基甲苯汙染土壤的菌劑及使用方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，具體涉及一種修復硝基甲苯汙染土壤的菌劑及其使用方法。
背景技術：
TNT(2，4，6三硝基甲苯)是目前產量最高的生產炸藥，近年來彈藥車間中TNT的製造、加工和包裝已經導致土壤高濃縮的汙染，最終將導致地下水的汙染。人長期暴露於硝基甲苯會增加患貧血症和肝功能不正常的機會。注射了或吸入三硝基甲苯的動物亦發現會影 響血液和肝臟、脾臟發大和其他有關免疫系統的壞影響。亦有證據證明了 TNT對男性的生殖功能有不良影響，而TNT也被列為一種可能致癌物。目前，該類汙染物處理難度較大。現有技術中對硝基甲苯汙染處理的方式主要有物理方法吸附法和萃取法；化學法濃縮焚燒法、紫外照射法、臭氧及組合臭氧氧化法等；然而，物理方法、化學方法處理三硝基甲苯廢水，操作複雜，費用貴，治理不徹底，效果令人不堪滿意。生物法是利用生物的新陳代謝作用對廢水中的汙染物進行轉化，使之無害化的處理方式。硝基甲苯類化合物降解菌對硝基甲苯的徹底降解是十分必需的。許多化工廠已經應用降解性微生物處理硝基甲苯，並且已經取得了顯著的效果。但是還不能完全滿足實際的需要，因此，開發一種建設投資少、運行成本低、處理效率好的修復硝基甲苯汙染土壤的方法迫在眉睫。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於修復硝基甲苯汙染土壤的菌劑和利用高效複合菌劑處理汙染土壤的方法。本發明的高效複合微生物菌劑，各菌種之間合理配伍，共生協調，互不拮抗，其製備方法簡便，方法易行，其操作簡便，利於生產。本發明是採用如下技術方案實現的—種修復硝基甲苯汙染土壤的菌劑，該菌劑的活性成分包括下列重量百分比的原料亞硝化菌30 %，枯草芽孢桿菌15 %，糞產鹼桿菌10 %，銅綠假單孢菌10 %，釀酒酵母10%，紅球菌10%，巨大芽孢桿菌8%，黑麴黴7%。上述菌劑中所述亞硝化菌優選為亞硝化菌(Nitrosomonas europaea) CCTCC No M2010002 (CN101955885 公開使用)；所述枯草芽孢桿菌優選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) CGMCC No 0954(CN1554744 公開使用)；所述幾產喊桿菌優選為幾產喊桿菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 31555(例如參見文獻 Structural studies of an extracellular polysaccharide (S-130) elaboratedby AlcaligenesATCC31555, Carbohydrate Research,1986)；
所述銅綠假單孢菌優選為銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC15442 (例如參見文獻 Adaptation of Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 todidecyIdimethyIammonium bromide induces changes in membrane fatty acidcomposition and in resistance of cells, Journal of Applied Microbiology,2001);所述釀酒酵母優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCTCC No M208110 (CN101434911 公開使用)；所述紅球菌優選為紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC 15906(例如參見Cloning and Characterization of Benzoate Catabolic Genes in the Gram-PositivePolychlorinated Biphenyl DegraderRhodococcus sp.Strain RHAl, J.Bacteriol.November 2001)；所述巨大芽孢桿菌優選為巨大芽孢桿菌(Bacillus megatherium) CGMCC No:2267(CN101215532)；所述黑麴黴優選為黑麴黴(Aspergillusnige)CCTCC No :M206034(CN1924000)。本發明所述菌種均可以從中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)以及美國模式培養物集存庫(ATCC)、中國典型培養物保藏中心(CCTCC)購買得到。其中各菌種發酵液製備步驟是I、各種菌種的單獨擴大培養A、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的培養將枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌試管種首先接種在牛肉膏蛋白腖培養基上，28-30°C，作一級斜面培養，然後接種到三角瓶裡做振蕩二級液體培養，然後轉入液體發酵罐做三級液體培養，最後接種到固體培養基上作四級培養，至產品中活菌數達到2. 0-4. OXlO8個/克。 B、紅球菌的培養將紅球菌菌種分別接種在營養肉湯培養基(參照微生物學試驗課本)上，28-30°C，作一級斜面培養，然後二級種子培養、混合發酵培養等至產品中活菌數達到 2. 0-5. OX IO8 個 / 克。C、釀酒酵母或黑麴黴的培養釀酒酵母或黑麴黴首先接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上，28-30°C，作一級斜面培養，然後二級種子培養、混合發酵培養等至產品中活菌數達到I. 0-5. OXlO8個/克。D、銅綠假單孢菌培養或糞產鹼桿菌銅綠假單孢菌或糞產鹼桿菌首先在培養基上，28-30°C，作一級斜面培養，然後二級種子培養、混合發酵培養等至產品中活菌數達到
I.0-5. OXlO8 個 / 克，所述培養基成分為=NH4Cl I. 0g, CH3COONa 3. 5g, MgCl2 0. lg, CaCl2
0.lg, KH2PO4 0. 6g, K2HPO4 0. 4g，酵母膏 0. lg，水 IOOOmI，ρΗ7· 2。Ε、亞硝化菌的培養亞硝化菌首先在培養基上，28_30°C，作一級斜面培養，然後二級種子培養、混合發酵培養等至產品中活菌數達到I. 0-5. OX IO8個/克，所述培養基成分為2%葡萄糖(w/v)，I. 5%牛肉膏(w/v), I. 5%蛋白腖(w/v),0. 058%硫酸鎂(w/v)，O. 025%硫酸錳(w/v),0. 22%乙酸鈉(w/v),0. 2%磷酸氫二鉀(w/v)，溶劑為水；將以上亞硝化菌、枯草芽孢桿菌、糞產鹼桿菌、銅綠假單孢菌、釀酒酵母、紅球菌、巨大芽孢桿菌、黑麴黴，所培養的菌液按照質量比例混合得到液體菌劑；F、取上述液體菌劑與載體攪拌混合，優選以硅藻土(40-80目)為載體，按照菌劑載體為3-4 I的重量比混合。乾燥將混合好物料進行乾燥，乾燥溫度為20-50°C，乾燥後含水量為20-30% ;檢驗、包裝按質量標準檢驗，成品按重量進行包裝，即得固體製劑。注，上述步驟中菌種擴大培養及製備固體製劑的方法不是唯一的，本領域技術人員可以根據常識選擇合適的培養基及擴大培養方法，使活菌數達到IO8個/克，以及按照常規製備微生物固體製劑的方法製備。本發明的複合菌劑將各種能形成優勢菌群的菌種，配製成高效微生物製劑，能夠加速微生物對汙染物的降解，以提高系統的生物處理效率，保證系統穩定運行。其含有多種對難降解汙染物有優良降解能力的微生物，各菌種之間合理配伍，共生協調，互不拮抗，活性高，生物量大，繁殖快，對硝基甲苯汙染土壤有良好的降解效果。
具體實施方式
實施例I :一種修復硝基甲苯汙染土壤的菌劑，該菌劑的活性成分包括下列重量百分比的原料亞硝化菌30 %，枯草芽孢桿菌15 %，糞產鹼桿菌10 %，銅綠假單孢菌10 %，釀酒酵母10%，紅球菌10%，巨大芽孢桿菌8%，黑麴黴7%。上述菌劑中所述亞硝化菌優選為亞硝化菌(Nitrosomonas europaea) CCTCC No M2010002 (CN101955885 公開使用)；所述枯草芽孢桿菌優選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CGMCC No :0954 ；所述幾產喊桿菌優選為幾產喊桿菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 31555 ；所述銅綠假單孢菌優選為銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC15442 ；所述釀酒酵母優選為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CCTCC No M208110 ；所述紅球菌優選為紅球菌(Rhodococcusrhodochrous) ATCC15906 ；所述巨大芽孢桿菌優選為巨大芽孢桿菌(Bacillus megatherium) CGMCC No:2267 ；所述黑麴黴優選為黑麴黴(Aspergillusnige)CCTCC No :M206034。本發明所述菌種均可以從中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)以及美國模式培養物集存庫(ATCC)、中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)購買得到。其中各菌種發酵液製備步驟是I、各種菌種的單獨擴大培養A、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的培養將枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌試管種首先接種在牛肉膏蛋白腖培養基上，28-30°C，作一級斜面培養，然後接種到三角瓶裡做振蕩二級液體培養，然後轉入液體發酵罐做三級液體培養，最後接種到固體培養基上作四級培養，至產品中活菌數達到2. 0-4. OXlO8個/克。B、紅球菌的培養將紅球菌菌種分別接種在營養肉湯培養基(參照微生物學試驗課本)上，28-30°C，作一級斜面培養，然後二級種子培養、混合發酵培養等至產品中活菌數達到 2. 0-5. OX IO8 個 / 克。C、釀酒酵母或黑麴黴的培養釀酒酵母或黑麴黴首先接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上，28-30°C ，作一級斜面培養，然後二級種子培養、混合發酵培養等至產品中活菌數達到I. 0-5. OXlO8個/克。D、銅綠假單孢菌培養或糞產鹼桿菌銅綠假單孢菌或糞產鹼桿菌首先在培養基上，28-30°C，作一級斜面培養，然後二級種子培養、混合發酵培養等至產品中活菌數達到
I.0-5. OXlO8 個 / 克，所述培養基成分為=NH4Cl I. 0g, CH3COONa 3. 5g, MgCl2 O. lg, CaCl2
O.lg, KH2PO4 O. 6g, K2HPO4 O. 4g，酵母膏 O. lg，水 IOOOmI，ρΗ7· 2。Ε、亞硝化菌的培養亞硝化菌首先在培養基上，28_30°C，作一級斜面培養，然後二級種子培養、混合發酵培養等至產品中活菌數達到I. 0-5. OX IO8個/克，所述培養基成分為2%葡萄糖(w/v)，I. 5%牛肉膏(w/v), I. 5%蛋白腖(w/v),O. 058%硫酸鎂(w/v)，
O.025%硫酸錳(w/v), O. 22%乙酸鈉(w/v), O. 2%磷酸氫二鉀(w/v)，溶劑為水；將以上亞硝化菌、枯草芽孢桿菌、糞產鹼桿菌、銅綠假單孢菌、釀酒酵母、紅球菌、巨大芽孢桿菌、黑麴黴，所培養的固體菌劑按照質量比例混合得到液體菌劑；F、取上述液體菌劑與載體攪拌混合，優選以硅藻土(40-80目)為載體，按照菌劑載體為3-4 I的重量比混合。乾燥將混合好物料進行乾燥，乾燥溫度為20-50°C，乾燥後含水量為20-30% ;檢驗、包裝按質量標準檢驗，成品按重量進行包裝，即得固體製劑。注，上述步驟中菌種擴大培養及製備固體製劑的方法不是唯一的，本領域技術人員可以根掘常識選擇合適的培養基及擴大培養方法，使活菌數達到IO8個/克，以及按照常規製備微生物固體製劑的方法製備。實施例2硝基甲苯汙染土壤修復實驗將三硝基甲苯TNT200g+ 二硝基甲苯DNT200g+硝基甲苯IOOg總質量為500g，於I立方米的無汙染土壤混合均勻，攪拌乾燥，過20目篩後備用。首先將上述汙染土壤鋪展30釐米厚度的薄層，將實施例I製備的菌劑均勻撒於本實驗所製備的硝基甲苯汙染土壤表層，其中菌劑和土壤的重量比例為I : 2000，然後噴灑水，保持土壤含水量為30%，48小時後，檢測硝基甲苯的含量，三硝基甲苯TNT為Og/立方米、二硝基甲苯為2. Ig/立方米以及硝基甲苯的含量為O. 5g/立方米，說明該菌劑已經基本上完全降解了土壤中的硝基苯類物質。實施例3採用本發明實施例I製備的菌劑處理某炸藥廠附近的汙染土壤，經檢測土壤中三硝基甲苯的含量為320g/立方米、二硝基甲苯為72g/立方米以及硝基甲苯183g/立方米；首先將土壤翻鬆平整，噴灑水，保持土壤含水量為30%，然後按照每立方米土壤使用500g菌劑的添加量播撒菌劑，2天後，檢測硝基苯的含量，其中，三硝基甲苯的含量為Og/立方米、二硝基甲苯為I. 3g/立方米以及硝基甲苯O. 6g/立方米。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方式
對本案作了詳盡的說明，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所作的修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
權利要求
1.一種修復硝基甲苯汙染土壤的菌劑，該菌劑的活性成分包括下列重量百分比的原料 亞硝化菌30 %，枯草芽孢桿菌15 %，糞產鹼桿菌10 %，銅綠假單孢菌10 %，釀酒酵母10%，紅球菌10%，巨大芽孢桿菌8%，黑麴黴7%。
2.如權利要求I所述的菌劑，其特徵在於 所述亞硝化菌優選為亞硝化菌(Nitrosomonas europaea) CCTCC No M2010002 (CN101955885 公開使用)； 所述枯草芽孢桿菌優選為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) CGMCC No :0954 ； 所述幾產喊桿菌優選為幾產喊桿菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 31555 ； 所述銅綠假單孢菌優選為銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 15442 ； 所述釀酒酵母優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCTCC No M 208110 ； 所述紅球菌優選為紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) ATCC 15906 ； 所述巨大芽孢桿菌優選為巨大芽孢桿菌(Bacillus megatherium)CGMCC No :2267 ； 所述黑麴黴優選為黑麴黴(Aspergillus nige)CCTCC No :M206034。
3.權利要求1-2任一菌劑在硝基甲苯汙染土壤處理中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種修復硝基甲苯汙染土壤的菌劑及使用方法，它由下述重量百分比原料配製而成亞硝化菌30％，枯草芽孢桿菌15％，糞產鹼桿菌10％，銅綠假單孢菌10％，釀酒酵母10％，紅球菌10％，巨大芽孢桿菌8％，黑麴黴7％。本發明的菌劑各菌種之間合理配伍，共生協調，互不拮抗，對硝基甲苯類難降解的化合物有良好的降解效果。
文檔編號C12R1/11GK102864108SQ20121036449
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者馬小傑, 閆家怡 申請人:馬小傑