金黃色葡萄球菌引起食物中毒快檢紙片的製作方法

2023-07-04 03:47:11

專利名稱：金黃色葡萄球菌引起食物中毒快檢紙片的製作方法
金黃色葡萄球菌引起食物中毒快檢紙片技術領域 本發明涉及一種金黃色葡萄球菌引起食物中毒快檢紙片。金黃色葡萄球菌是 一種引起人類和動物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。由 金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，在世界各國都極為普遍。特別是在北美及歐洲等地區發病 率更高。在上述這些國家中，每年有金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例，僅次於沙門氏菌， 而在細菌性食物中毒病例排到第2 3位，有此而造成的經濟損失也相當慘重，在我國由金黃 色葡萄球菌引起的食物中毒病例也時有報導，所以目前世界各國都把金黃色葡萄球菌列為食 品衛生的法定檢測項目。我國對金黃色葡萄球菌目前採用的方法是以國家標準GB. 4789-10-84 作為依據。整個檢測過程獲得最終結果須時5天左右，既費時又費力，多年來很多食品微生 物實驗室都在探索和尋找一些準確性高，並快速的檢測方法，傳統常規檢測診斷方法要經過 細菌分離培養及生化鑑定、血清學試驗、腸毒素試驗才能確診。整個檢測過程耗時長、 一般 需要5-6天，靈敏度不高，對快速準確診斷，搶救病人帶來極大的不便，本發明打破傳統常 規分步檢測手段，在快速鑑別診斷食物中毒致病菌金黃色葡萄球菌的應用上具有明顯的優勢。 從而減少由於檢測手段落後而造成對人體健康的危害，具有快速、準確、靈敏度高等特點。 較傳統方法更具有應用價值，對指導臨床診斷和治療，防止濫用抗菌藥物具有重要意義。
背景技術：
本發明的目的在於提供一種金黃色葡萄球菌引起食物中毒快檢紙片。近年 來，美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染佔第二位，僅次於大腸桿菌。金 黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛生問題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒 佔整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，佔45%，我國每年發生的此類中毒事件也非常 多。金黃色葡萄球菌可通過以下途徑汙染食品食品加工人員、炊事員或銷售人員帶菌，造 成食品汙染；食品在加工前本身帶菌，或在加工過程中受到了汙染，產生了腸毒素，引起食 物中毒；熟食製品包裝不嚴，運輸過程受到汙染；奶牛患化膿性乳腺炎或禽畜局部化膿時， 對肉體其他部位的汙染。金黃色葡萄球菌的致病力強弱主要取決於其產生的毒素和侵襲性酶: a.溶血毒素外毒素，分a、 p、 Y、 S四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死；b.殺白細胞素可破壞人的白細胞和巨噬細胞；C.血漿凝固酶當金黃色葡萄 球菌侵入人體時，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積於菌體表面或凝固，阻礙吞噬細胞的 吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關；d.脫氧核糖核酸酶金黃色葡萄球菌 產生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來作為依據鑑定金黃色葡萄球菌；e.腸毒素金黃 色葡萄球菌能產生數種引起急性胃腸炎的蛋白質性腸毒素，分為A、 B、 C、 D、 E及F五種血 清型。腸毒素可耐受100。 C煮沸30分鐘而不被破壞。它引起的食物中毒症狀是嘔吐和腹瀉。 此外，金黃色葡萄球菌還產生溶表皮素、明膠酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。此外，金黃色 葡萄球菌還產生纖維蛋白溶酶、耐熱核酸酶、透明質酸酶和脂酶等多種與細菌的擴散和組織 損傷有關的物質。傳統常規檢測診斷方法是要經過標本採集、分離鑑定、生化鑑定、血清學 試驗、腸毒素、血漿凝固酶試驗才能確診。整個檢測過程耗時長、傳統生化鑑定試驗周期長， 操作繁瑣， 一般需要5-6天，靈敏度不高，試劑質量無法保證，嚴重影響了致病菌確認工作、選擇性分離培養的培養基上挑選可疑菌落需要經驗，存在漏檢的可能，對快速準確診斷，搶 救病人帶來極大的不便，本發明打破傳統常規分步檢測手段，將黃金色葡萄球菌培養基及耐 熱核酸酶，經一定工藝而成一種引起食物中毒黃金色葡萄球菌的快檢紙片，在快速鑑別診斷 食物中毒致病菌金黃色葡萄球菌的應用上具有明顯的優勢。使檢測確診過程縮短至2-6小時， 鑑定的準確率均在97%以上。檢測致病菌時耗時少、靈敏度高，準確性強。包裝袋錶面印有 黃金色葡萄球菌最大可能數(MPN)檢索表，黃金色葡萄球菌的檢測結果可直接在包裝袋檢索， 進行定量分析；確定葡萄球菌耐熱核酸酶和血漿凝固酶的存在。含有中和劑，在檢測中不易 受幹擾因素影響等特點。
發明內容
本發明的要點在於選擇合適的組分，並進行合理混配，經一系列現代生物技 術溶解、校正PH、高溫滅菌、冷卻、加指示劑、浸漬紙片、恆溫烘乾、無菌包裝等工藝而成 一種金黃色葡萄球菌引起食物中毒快檢紙片。本發明選擇的快檢試劑配方如下(克/每升蒸餾水)胰蛋白腖10.0-12.0;牛肉浸膏 5. 0-5. 5;酵母浸膏1. 0-1. 5;甘氨酸10-14;丙酮酸鈉10-12;氯化鋰5. 0-5. 5;卵黃亞碲酸 鹽增菌劑50-60 mL;瓊脂糖0. 08-0. 12;硫代硫酸鈉0. 3-0. 5; 4%四唑指示劑2. 3-2. 8 mL; 4%甲苯胺蘭2. 3-2. 8 mL;甘露醇10-12;磷酸氫二鉀5. 0-5. 5;兔血漿3. 0-4. 0 mL;牛纖維 蛋白原O. 5-0. 6;蒸餾水加至1000 mL，調pH7. 1。耐熱去氧核糖核酸為產毒金葡菌之典型特徵，此酶非常耐熱，在IO(TC加熱30min，不易 喪失活性，在130。C之下，其D值為16.6min，此酶之分子量為16800，等電點PH為9.6，耐 熱去氧核糖酸與檢測血漿凝固酶相似，是一種鑑定金黃色葡萄球菌的方法，在快檢測片上， 耐熱DNA酶反應看起來，呈粉紅色環帶包圍著一個紅色或蘭色的菌落。快檢試劑中含有豐富 的營養成分，其中以氯化鋰代替亞碲酸鉀，使菌落顏色呈黑色，試劑中兔血槳和牛纖維蛋白 原，便於檢測凝固酶活力，胰蛋白腖中的胰酶可以抑制全部或部分圍繞凝固酶陽性菌落周圍 沉澱暈環纖維蛋白的溶解，因此凡存在血漿凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌，將在培養基中呈 現有暈環的黑色菌落，即可確認，並作計數。蛋白腖作為主要的組分，該組分為細菌的氮源， 為培養黃金色葡萄球菌提供其生長所需要的營養和能量；磷酸氫二鉀作為主要的組分，該組 分為緩衝劑，為培養黃金色葡萄球菌提供其生長所需要一定的氫離子濃度，以保持較穩定的 pH環境；瓊脂糖作為主要的組分，該組分為培養基的賦形劑，溶解冷卻後可將培養基中的有 效成分凝固並掛載於紙片上；硫代硫酸鈉作為主要的組分，該組分為中和劑，其作用是中和 祛除樣品殘留物的千擾因素；本發明產品的製備方法是1) 切紙將新華中速定性濾紙，切成10X12釐米，疊成5X6釐米大小的雙層紙片，經 幹烤或高壓滅菌(高壓後於37'C溫箱烘乾)後備用；2) 滅菌將耐高溫的聚丙塑料薄膜袋，可按實驗要求壓合成一定規格的袋，100°C15分 滅菌後備用；3)製備培養基將胰蛋白腖、牛肉浸膏、酵母浸膏、甘氨酸、丙酮酸鈉、氯化鋰、瓊脂、 硫代硫酸鈉、甘露醇、磷酸氫二鉀、牛纖維蛋白原蒸餾水按比例混合加熱溶解，冷後調pH7. 1-7. 2， 10(TC15分滅菌，冷至6(TC左右按量加入4%TTC溶液、4%甲苯胺蘭、卵黃亞碲 酸鹽增菌劑、兔血漿混勻；4) 浸漬紙片用無菌鑷子將紙片排放於消毒的內有製備好培養基的大搪瓷盤內，浸泡後 放4(TC左右恆溫室或37'C溫箱烘乾；5) 包裝將溫箱烘乾的浸漬紙片，無菌操作裝入消毒的塑膠袋內，再裝入包裝袋錶面印 有金黃色葡萄球菌最大可能數(MPN)檢索表的外包裝袋內，封口後放冰箱保存備用。本發明具有以下優點(1)快檢試劑營養豐富、配製簡單；(2)臨床應用效果滿意，解決了床邊接種的困難，汙染小；(3)檢測方法簡單、時間短、選擇性強、檢出率高；(4)接 種樣本8-12小時後，即能觀察菌落生長情況，穩定性好；(5)對快速準確診斷，搶救病人對 指導臨床診斷和治療，防止濫用抗菌藥物具有重要意義具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明按照下表所列數據(克/每升蒸餾水)及其所述步驟進行配置配方一胰蛋白腖10.0-12.0;牛肉浸膏5.0-5.5;酵母浸膏1.0-1.5;甘氨酸10-14;丙酮酸鈉 10-12;氯化鋰5. 0-5. 5;卵黃亞碲酸鹽增菌劑50-60 mL;瓊脂糖0. 08-0. 12;硫代硫酸鈉 0. 3-0. 5; 4%四唑指示劑2. 3-2. 8 mL; 4%甲苯胺蘭2. 3-2. 8 mL;甘露醇10-12;磷酸氫二鉀 5.0-5.5;兔血漿3. 0-4. 0 mL;牛纖維蛋白原0. 5-0. 6;蒸餾水加至1000 mL，調pH7. 1。配方二胰蛋白腖11.0-12.0;牛肉浸膏5. 2-5. 5;酵母浸膏1.3-1.5;甘氨酸12-14;丙酮酸鈉 11-12;氯化鋰5.2-5.5;卵黃亞碲酸鹽增菌劑55-60 mL;瓊脂糖0.09-0.12;硫代硫酸鈉 0. 4-0. 5; 4%四唑指示劑2. 5-2. 8 mL; 4%甲苯胺蘭2. 4-2. 8 mL;甘露醇11-12;磷酸氫二鉀 5.2-5.5;兔血漿3. 5-4. 0 mL;牛纖維蛋白原0. 5-0. 6;蒸餾水加至1000 mL，調pH7. 1。配方三胰蛋白腖10.0-11.0;牛肉浸膏5.0-5.4;酵母浸膏1.0-1.4;甘氨酸10-13;丙酮酸鈉10-11;氯化鋰5.0-5.3;卵黃亞碲酸鹽增菌劑50-58 mL;瓊脂糖0.08-0.11;硫代硫酸鈉 0. 3-0. 4; 4%四唑指示劑2. 3-2. 7 niL; 4%甲苯胺蘭2. 3-2. 6 mL 權利要求
1、本發明涉及一種金黃色葡萄球菌引起食物中毒快檢紙片，特別是引起的食物中毒金黃色葡萄球菌產腸毒素快檢試劑的配方及其製備方法，其特徵在於具有如下配方(克/每升蒸餾水)胰蛋白腖10.0-12.0；牛肉浸膏5.0-5.5；酵母浸膏1.0-1.5；甘氨酸10-14；丙酮酸鈉10-12；氯化鋰5.0-5.5；卵黃亞碲酸鹽增菌劑50-60mL；瓊脂糖0.08-0.12；硫代硫酸鈉0.3-0.5；4％四唑指示劑2.3-2.8mL；4％甲苯胺蘭2.3-2.8mL；甘露醇10-12；磷酸氫二鉀5.0-5.5；兔血漿3.0-4.0mL；牛纖維蛋白原0.5-0.6；蒸餾水加至1000mL，調pH7.1。
2、 一種權利要求1所述金黃色葡萄球菌引起食物中毒快檢紙片的製備方法，其特徵在於 具有如下的步驟1) 切紙將新華中速定性濾紙，切成10X12釐米，疊成5X6釐米大小的雙層紙片，經 幹烤或高壓滅菌(高壓後於37'C溫箱烘乾)後備用；2) 滅菌將耐高溫的聚丙塑料薄膜袋，可按實驗要求壓合成一定規格的袋，100°C15分 滅菌後備用；3) 製備培養基將胰蛋白腖、牛肉浸膏、酵母浸膏、甘氨酸、丙酮酸鈉、氯化鋰、瓊脂、 硫代硫酸鈉、甘露醇、磷酸氫二鉀、牛纖維蛋白原蒸餾水按比例混合加熱溶解，冷後調 pH7. 1-7. 2， 100°C15分滅菌，冷至60。C左右按量加入4%TTC溶液、4%甲苯胺蘭、卵黃亞碲 酸鹽增菌劑、兔血漿混勻；4) 浸漬紙片用無菌鑷子將紙片排放於消毒的內有製備好培養基的大搪瓷盤內，浸泡後 放40。C左右恆溫室或37。C溫箱烘乾；5) 包裝將溫箱烘乾的浸漬紙片，無菌操作裝入消毒的塑膠袋內，再裝入包裝袋錶面印 有金黃色葡萄球菌最大可能數(MPN)檢索表的外包裝袋內，封口後放冰箱保存備用。
全文摘要
本發明涉及一種金黃色葡萄球菌引起食物中毒快檢紙片。特別是由產毒金黃色葡萄球菌的腸毒素引起的食物中毒快檢試劑的配方及其製備方法。本發明打破傳統常規分步檢測手段，利用產耐熱去氧核糖酸，血漿凝固酶的特性，使檢測確診過程縮短至8-12小時，鑑定的準確率均在97％以上。該快檢紙片具有快速、準確、靈敏度高等特點。較傳統方法更具有應用價值，對指導臨床診斷和治療，防止濫用抗菌藥物具有重要意義。在快速鑑別診斷食物中毒致病菌產毒金黃色葡萄球菌的應用上具有明顯的優勢。
文檔編號G01N33/52GK101566622SQ200810093450
公開日2009年10月28日 申請日期2008年4月21日 優先權日2008年4月21日
發明者於維森 申請人:於維森