地溝油快速檢測方法
2023-05-31 11:03:06 2
專利名稱：地溝油快速檢測方法
技術領域：
本發明屬於地溝油檢測技術領域，具體涉及一種地溝油快速檢測方法。
背景技術：
現有的各種地溝油檢測方法主要有常規油脂理化指標法(參見潘劍宇，尹平河， 餘漢豪.2003.潲水油、煎炸老油與合格食用植物油的鑑別研究.食品科學24 27-29以及張漩，餘漢豪，單習章.2004.餐飲業廢油脂有害成分及特徵指標研究.廣州環境科學19: 29-31.)、膽固醇含量判定法(張蕊，祖麗亞，樊鐵.2006.測定膽固醇含量鑑別地溝油的研究.中國油脂31 :65-67)、薄層色譜檢測極性物法(尹平河，潘劍宇，趙玲.2004.薄層色譜法快速鑑別潲水油和煎炸老油的研究.食品科學29 47-49)、電導率法(朱銳，王睿，王小京.2008.電導率測定在鑑別食用植物油摻偽應用研究.糧食與油脂11 :42-43)、頂空-氣相色譜聯用質譜檢測油脂的揮發性成分(全常春，尹平河.2004.精煉餐飲業地溝油揮發性危害成分的GC/MS靜態頂空分析.食品科學25 =128-134)、脂肪酸相對不飽和度(蘭慶豐， 梁敏.2006.氣相色譜法鑑別摻假食用油的研究.刑事技術I :37-39)、測真菌毒素法(黃軍，熊華，李亮.2008.潲水油在精煉中衛生指標的檢測與分析.中國油脂33 :70-74)、表面活性劑殘留法(曹文明，薛斌，楊波濤，丁丹華，孫禧華.2011.地溝油檢測技術的發展與研究.糧食科技與經濟36 42-44以及張清，沈群.2010.我國食用植物油中地溝油檢測技術回顧.食品科技35 :311-314)等。方法考察的對象多為地溝油中的特徵化學成分，涉及的技術手段也主要為分析化學方法如螢光光譜、氣相色譜、原子吸收光譜等。現有的各種檢測方法都存在或特徵指標專一性不強，或檢測靈敏度不高，或檢測準確性不高，僅能在一定範圍內適用特定類型的地溝油的檢測判定的特點。由於地溝油不是一種化學組分固定不變的物質，因來源不同、精煉加工程度不同，其內在物質組成會呈現或多或少的差異。因此，包括以上列舉的現有檢測技術，都未能針對地溝油獨有的特徵指標及其量值來進行檢測判斷，檢測結果的判定不能適用所有類型的地溝油(曹文明，薛斌，楊波濤，丁丹華，孫禧華.2011.地溝油檢測技術的發展與研究.糧食科技與經濟36 :42-44)。 用分析化學的方法去測定地溝油中有害殘留的成分，容易出現漏檢和對不同有害成分檢測靈敏度不夠的情況。地溝油成分的複雜性，又導致了無法根據分析化學所測定的各項指標而制定一個統一的，切實可行的地溝油檢測標準。換句話說，要根據有害物質殘留量來制定地溝油標準是極其困難的，甚至是不可能的。因此，要解決地溝油檢測這一技術問題，必須另闢蹊徑。
發明內容
本發明目的在於提供一種地溝油快速檢測方法，解決了現有技術中地溝油檢測方法中以特定的化學組分為目標化合物為檢測目標導致檢測方法只能在一定範圍內適用特定類型的地溝油的缺陷。為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是
一種地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(I)按照常規細胞培養方法在培養基中進行正常細胞的培養，當正常細胞達到預定數量時加入待測地溝油樣品繼續培養；(2)對培養後的細胞死亡或存活情況進行統計或對細胞毒性進行檢測，根據培養後的細胞毒性或細胞死亡或存活情況判斷待測地溝油樣品是否為地溝油。優選的，所述方法步驟(I)待測地溝油樣品在加入培養基前進行過濾處理。優選的，所述方法步驟(I)中常規細胞培養方法培養正常細胞的時間控制在I 36小時。優選的，所述方法步驟(I)中加入的待測地溝油樣品的體積為O. lmL。優選的，所述方法步驟(I)中加入待測地溝油樣品繼續培養的時間控制在24 48 小時。優選的，所述方法步驟(2)中細胞死亡情況統計是採用考馬斯亮藍染色、活/死細胞染色方法處理繼續培養的細胞後，通過檢測藍染的細胞數量進行死亡細胞統計。優選的，所述方法還包括在步驟(I)進行正常細胞的培養後加入常用食用油進行繼續培養，以常用食用油為對照，通過檢測常用食用油與待測地溝油樣品進行對比檢測。優選的，所述方法步驟(2)中判斷待測地溝油樣品是否為地溝油是通過先分別採用地溝油與常用食用油處理細胞培養後的細胞存活或死亡情況進行對比統計，獲得常用食用油與地溝油間的閾值；根據待測地溝油樣品處理細胞培養後的細胞存活或死亡情況與閾值的比較判斷待測地溝油樣品是否為地溝油。優選的，所述方法步驟(2)中設置若干個閾值將地溝油分為低度毒性地溝油、中度毒性地溝油和高度毒性地溝油。優選的，所述方法步驟(2)中對培養後的細胞死亡或存活情況進行統計是通過計算機圖像處理技術進行統計的。眾所周知，地溝油問題的關鍵是它對人體健康的潛在危害。凡對人體健康有毒害的物質，必然對細胞有毒害作用，因為細胞對環境有毒物質的敏感度要大大高於人體。因此，本發明提出了一個生物方法來鑑定地溝油，即用人的細胞(肝臟細胞和腎臟細胞等) 來鑑定地溝油是否具有毒性。實際上，用細胞系統對化合物進行毒理鑑定，已在國外藥物公司新藥開發中應用 20 多年之久(Fang, J. F.，Y. Kitagawa, S. Ishikawa. 1986. Toxicity assessments of chemical substances using primary culture of rat hepatocytes. Sangyo igaku 28:438-444)。本發明提出的地溝油生物細胞檢測體系，正是基於細胞對有毒物質敏感這一特性，將檢測的重點放在是否對細胞有毒這一關鍵問題，而對地溝油可能含有的有毒物質的種類和濃度則予以忽略。這是一個地溝油檢測的新思路。本方法的主要思路為在培養的細胞中加入地溝油，若地溝油中含有有毒物質，細胞的生理和代謝會發生相應的變化。例如，細胞的形態、生長繁殖的速度、細胞炎症分子的表達、細胞代謝物質的分泌等都會發生顯著的變化。這種顯著的變化，可以用相應的儀器設備加以檢測和記錄。利用計算機技術，快速、準確地處理生理生化數據，代謝數據和顯微圖像數據，根據預實驗得到的閾值區分地溝油與健康無害的食用油。本發明中待測地溝油樣品優選進行過濾處理，一般可以待測油樣均經O. 22 μ m無菌針頭過濾器於超淨臺內濾過，室溫暗處保存。如待測地溝油樣品為有明顯白色沉澱的樣品油液，如粗提的地溝油樣品，於4000轉離心I小時，取上清油液，用O. 22 μ m無菌針頭過濾器依次於開放環境及超淨臺內濾過，室溫暗處保存。本發明中細胞培養方法採用常規的細胞培養技術。檢測方法有考馬斯亮藍染色、活/死細胞染色。其中考馬斯亮藍染色方法原理為考馬斯亮藍染料與蛋白質特異性結合，細胞染色後顯微成像呈藍色。地溝油含有的有毒物質對貼壁細胞的生長狀態產生影響，主要表現在貼壁程度以及細胞形態上。染色過程中死細胞或者活力不佳、貼壁不牢的細胞被移出，顯微成像後藍色區域的面積與殘存的活細胞的個數及狀態有關，待測油樣毒性越大其殘存細胞數量越少。該方法可以通過紫外分光光度法進行驗證。其原理是待測油樣處理後活細胞仍貼附於培養板壁，考馬斯亮藍染色後細胞呈藍色。5% SDS溶液可以提取細胞中的蛋白質，蛋白質提取液因染色而呈藍色，並且於 614nm附近有最大吸收峰。通過測量蛋白提取液的光度值，與預實驗得到的標準曲線對應， 得出殘存細胞的數量。本發明以CHO與NIH3T3細胞株的培養為例進行說明的。CHO與NIH3T3細胞株的正常培養方法如下(I)培養基成分高糖DMEM, 10%新生小牛血清，100units/mL青黴素和100 μ g/mL 鏈黴素。(2)細胞瓶內培養條件正常細胞以適當濃度接種於5mL培養基，25cm2培養瓶內， 置於37°C，5% CO2的恆溫培養箱內培養。培養基每2-3天更換一次。至細胞鋪滿長滿後， 胰酶消化進行下一步的細胞瓶接種以及12孔板接種。(3) 12孔板內培養條件細胞以每孔IO5個的濃度種板，培養基體積為2mL，置於 37°C,5% CO2的恆溫培養箱內培養。注培養基成分和種板濃度需根據細胞株具體特性進行調整，表現在血清的品種、 用量以及細胞濃度的選擇上。預實驗證明上述條件下CHO和NIH3T3細胞株均能保持正常生長狀態。本地溝油檢測方法適用於貼壁細胞，但值得注意的是，正常細胞的培養方法需根據不同的細胞株進行調整。正常條件下培養細胞2小時或者24小時，接著加入待測油樣繼續培養。油作24 小時和48小時後，用倒置顯微鏡拍照。細胞於正常條件下培養2小時的處理組，油作用時長為48小時，正常條件下培養24小時的處理組，油作用時長為24小時。細胞培養後加入油樣後進行48h處理,為正常培養2小時後向培養基加入一定體積的待測油樣,於37°C, 5% CO2恆溫培養箱中繼續培養48小時，即油樣作用(即處理)時間為48小時。食用油對細胞沒有毒性，因而不會影響細胞的活性。而地溝油含有有毒物質，從而使得培養的細胞部分或大部分死亡。通過細胞死亡的量，可以判斷地溝油的毒性。區分地溝油與商品食用油的閾值設置方法如下(I)考馬斯亮藍染色成像後，利用計算機圖像處理技術，分析藍染細胞區域的面積大小。(2)分析空白對照組(正常培養組)、陰性對照組(商品食用油組)、濃度梯度稀釋的陽性對照組(證實有細胞毒性物質，非地溝油)的藍染面積大小，並以空白對照組的數據進行校正，得各組校正值。(例，假設空白對照組面積大小為100pixel2，陰性對照組為95pixel2，校正後空白對照組結果為1，陰性對照組為O. 95)。利用統計軟體，設置置信區間大小，分析組間差異，選擇與商品食用油組相比有統計學差異的陽性對照組的校正值作為低毒、中毒、高毒的閾值，無統計學差異的為安全的閾值。(3)得到閾值後，將地溝油組的校正值與各閾值進行比較，判斷待測油樣的是否有毒性，以及毒性等級。活/死細胞染色、細胞炎症因子表達檢測與考馬斯亮藍染色法類似，均需藉助顯微鏡成像及圖像處理技術。活/死細胞染色是利用活細胞/死細胞特異的螢光染料，如 PI (碘化丙啶，一種不能透過細胞膜的紅色螢光染料)特異性地染色死細胞，而染色活細胞的染料因發射和激發波長不同，兩種螢光信號利用不同的濾光片分離，從而在成像上區分活細胞與死細胞。相對於現有技術中的方案，本發明的優點是I.本發明的檢測方法具有很高的靈敏度。現有的分析化學方法測定地溝油有毒成份的含量，可能出現漏檢或檢測不出來等問題。由於本發明的原理是基於細胞對於有毒物質的反應，只要食用油含有有毒物質，無論有毒物質的種類是什麼，本發明均可以測定出來。2.本發明的檢測方法可靠性強。不管地溝油在加工過程中使用什麼方法，只要其中含有有毒成份，細胞都能檢測出來。3.本發明的檢測方法適應面廣。無論哪種地溝油，只要對細胞有毒性，本方法均可以檢測出來。
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖I為採用考馬斯亮藍法檢測待測地溝油樣品的方法流程圖；圖2為應用紫外分光光度法驗證考馬斯亮藍染色法的方法流程圖；圖3為細胞數與紫外光度值的線性關係及對應的回歸方程(η = 3)。a為小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3)，b為中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。圖4為以商品茶籽油、醫用矽膠片、毒性培養基處理CHO細胞株24和48小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。圖5為以商品茶籽油、醫用矽膠片、毒性培養基處理CHO細胞株24小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。圖6為以商品茶籽油、醫用矽膠片、毒性培養基處理NIH3T3細胞株24和48小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。圖7為以商品茶籽油、醫用矽膠片、毒性培養基處理NIH3T3細胞株24小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。圖8為以商品茶籽油和食堂廢油處理CHO細胞株24和48小時後細胞形態變化以
及考馬斯亮藍染色結果。圖9為以商品茶籽油和食堂廢油處理NIH3T3細胞株24和48小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。圖10為以商品茶籽油和粗提地溝油處理CHO細胞株24小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。圖11為以3種商品食用油處理CHO細胞株24和48小時後細胞形態變化以及考
馬斯亮藍染色結果。圖12為3種商品食用油處理48小時後殘餘細胞數對比。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用於說明本發明而不限於限制本發明的範圍。實施例中採用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進一步調整，未註明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例I商品茶籽油與醫用矽膠對比實驗I、樣品前處理醫用矽膠為預實驗證明有細胞毒性，在此試驗中作為陽性對照組。毒性培養基為取適量醫用娃膠浸泡於15毫升培養基中，浸泡時間不少於24小時,4度保存。待測油樣前處理方法如下I. I待測油樣均經O. 22 μ m無菌針頭過濾器於超淨臺內濾過，室溫暗處保存。除特別說明外，只過濾一次。I. 2有明顯白色沉澱的樣品油液，如粗提的地溝油樣品，於4000轉離心I小時，取上清油液，用O. 22 μ m無菌針頭過濾器依次於開放環境及超淨臺內濾過，室溫暗處保存。2、樣品檢測方法如圖I所示，樣品檢測方法步驟如下(I)正常條件下培養細胞2小時或者24小時；(2)加入O. ImL的待測油樣；(3)油處理24小時和48小時後，用倒置顯微鏡拍照。細胞於正常條件下培養2小時的處理組，油作用總時長為48小時，正常條件下培養24小時的處理組，油作用總時長為 24小時；(4)按照考馬斯亮藍染色、live/dead細胞染色、細胞炎症因子表達檢測等方法的要求處理細胞後，用倒置顯微鏡/倒置螢光顯微鏡拍照；(5)每組處理平行操作3次。如圖2所示，樣品檢測方法的驗證採用紫外分光光度法驗證(以考馬斯亮藍染色法為例)，具體操作步驟如下(I)細胞培養至考馬斯亮藍染色的步驟同前面所述的樣品檢測方法步驟(I) ⑷。(2)將染色液轉移至15mL離心管；(3)用IX PBS潤洗12孔板，回收PBS至⑵步離心管中，重複3次至PBS洗液基本無色，4000rpm離心5分鐘,棄上清；(4)每孔加入ImL 5% SDS，振搖10分鐘，將SDS提取液回收至(3)步離心管中，重複操作3次，至孔內無可見藍色斑塊；(5) 4000rpm離心10分鐘或者用O. 22 μ m針頭過濾器過濾。取上清液或濾液，於 614nm處測其紫外吸收光度值。
2. I中國倉鼠卵巢細胞(CHO)CHO與NIH3T3細胞株的正常培養方法如下(I)培養基成分高糖DMEM, 10%新生小牛血清，100units/mL青黴素和100 μ g/mL 鏈黴素。(2)細胞瓶內培養條件正常細胞以適當濃度接種於5mL培養基，25cm2培養瓶內， 置於37°C，5% CO2的恆溫培養箱內培養。培養基每2-3天更換一次。至細胞鋪滿長滿後， 胰酶消化進行下一步的細胞瓶接種以及12孔板接種。(3)12孔板內培養條件細胞以每孔IO5個的濃度種板，培養基體積為2mL，置於 37°C,5% CO2的恆溫培養箱內培養。注培養基成分和種板濃度需根據細胞株具體特性進行調整，表現在血清的品種、 用量以及細胞濃度的選擇上。預實驗證明上述條件下CHO和NIH3T3細胞株均能保持正常生長狀態。2. 11正常條件下培養2小時處理組結果處24小時後，醫用矽膠組內細胞出現皺縮，毒性培養基組與商品茶籽油組的細胞形態與陰性對照組無可見區別。繼續處24小時後，醫用矽膠組培養基內有大量死細胞團塊漂浮，毒性培養基組與商品茶籽油組均有抑制細胞生長的現象。結果如圖4所示。圖4為以商品茶籽油、醫用矽膠片、毒性培養基處理CHO細胞株24和48小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。陰性對照組為正常培養的細胞。處理前細胞於正常條件下培養2小時。每組處理平行操作3份，實驗重複3次。a :4倍鏡下處24小時後結果； b 4倍鏡下處理48小時後結果；c 4倍鏡下考馬斯亮藍染色結果。2. 12正常條件下培養24小時處理組結果與正常條件下培養2小時處理組相比，醫用矽膠組處理24小時後僅有輕微毒性。 當細胞密度高時，培養基內無可見死細胞團塊漂浮。毒性培養基組和商品茶籽油組與正常條件下培養2小時處理組結果類似，有輕微細胞生長抑制作用。結果如圖5所示。圖5為以商品茶籽油、醫用矽膠片、毒性培養基處理CHO細胞株24小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。陰性對照組為正常培養的細胞。處理前細胞於正常條件下培養24小時。每組處理平行操作3份，實驗重複3次。a :4倍鏡下處理24小時後結果； b 4倍鏡下考馬斯亮藍染色結果。2. 2小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3)2. 21正常條件下培養2小時處理組結果與2. ICHO細胞組相比，處理24小時後，醫用矽膠組有較弱細胞毒性，但繼續處理 24小時後，大部分細胞死亡。陰性對照組、商品茶籽油組以及毒性培養基組，處理24小時和 48小時後，無顯著差異。結果如圖6所示。圖6為以商品茶籽油、醫用矽膠片、毒性培養基處理NIH3T3細胞株24和48小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。陰性對照組為正常培養的細胞。處理前細胞於正常條件下培養2小時。每組處理平行操作3份，實驗重複3次。a :4倍鏡下處理24小時後結果；b 4倍鏡下處理48小時後結果；c 4倍鏡下考馬斯亮藍染色結果。2. 22正常條件下培養24小時處理組結果結果與正常條件下培養2小時處理組類似，但所有處理組對細胞均有輕微毒性。醫用矽膠組對細胞的毒性大於正常條件下培養2小時處理組。值得指出的是，實驗中正常的NIH3T3細胞株貼壁不牢，因此染色過程中潤洗細胞的操作對考馬斯亮藍染色成像有較大的影響。結果如圖7所示。圖7為以商品茶籽油、醫用矽膠片、毒性培養基處理NIH3T3細胞株24小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。陰性對照組為正常培養的細胞。處理前細胞於正常條件下培養24小時。每組處理平行操作3份，實驗重複3次。a :4倍鏡下處理24小時後結果山4倍鏡下考馬斯亮藍染色結果。圖3為健康中國倉鼠卵巢細胞(CHO)與小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3)的細胞數與紫外光度值的線性關係及對應的回歸方程(η = 3)。a為小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3)， b為中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。實施例2商品茶籽油與食堂廢棄油對比試驗樣品預處理、檢測方法類似實施例1，可以採用實施例I相同的條件。樣品來源 食堂廢棄油收集於獨墅湖高教區文星廣場餐館。實驗結果I. I中國倉鼠卵巢細胞(CHO)與商品茶籽油相比，處理24小時以及48小時後，食堂廢油對細胞有較強毒性。結果顯示，CHO細胞株在正常條件下培養24小時後對食堂廢油的靈敏度不及2小時組。結果如圖8所示。圖8為以商品茶籽油和食堂廢油處理CHO細胞株24和48小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。陰性對照組為正常培養的細胞。除食堂廢油24小時組外，其他處理組細胞在加樣前均於正常條件下培養2小時。每組處理平行操作3份。a :4倍鏡下處理 24小時後結果；b 4倍鏡下處理48小時後結果；c 4倍鏡下考馬斯亮藍染色結果。I. 2小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3)結果與中國倉鼠卵巢細胞(CHO)細胞株相似(圖9)，食堂廢油對細胞有較強毒性。 正常條件下培養24小時後細胞對食堂廢油的靈敏度不及2小時組。圖9為以商品茶籽油和食堂廢油處理NIH3T3細胞株24和48小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。陰性對照組為正常培養的細胞。除食堂廢油24小時組外，其他處理組細胞在加樣前均於正常條件下培養2小時。每組處理平行操作3份。a:4倍鏡下處理24小時後結果；b 4倍鏡下處理48小時後結果；c 4倍鏡下考馬斯亮藍染色結果。實施例3商品茶籽油與粗提地溝油對比實驗(CH0細胞株)樣品預處理、檢測方法類似實施例1，可以採用實施例I相同的條件。樣品來源採用粗提地溝油由蘇州市公安局蘇州獨墅湖高等教育區分局取樣，為未經深加工的地溝油， 有異臭。結果顯示(如圖10所示)，細胞經粗提地溝油處理24小時後，培養基內出現大量漂浮的死細胞團塊，細胞死亡。圖10為以商品茶籽油和粗提地溝油處理CHO細胞株24小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。陰性對照組為正常培養的細胞。細胞在處理前於正常條件下培養2 小時。每組處理平行操作3份。a :10倍鏡下處理24小時後結果；b:4倍鏡下考馬斯亮藍染色結果。
實施例43種商品食用油對比實驗(CH0細胞株)樣品預處理、檢測方法類似實施例1，可以採用實施例I相同的條件。樣品來源採用3種商品食用油為茶籽油、葵花橄欖油以及葵花籽油，均為市場流通品種。顯微成像結果顯示(圖11)，陰性對照組、葵花橄欖油、以及葵花籽油組無可見差異。處理48小時後，茶籽油顯示輕微抑制細胞生長作用。應用紫外分光光度法驗證考馬斯亮藍染色方法(圖12)，用One-way ANOVA(SNK)法比較四組結果後，顯示在99%置信區間內(P = O. 01)，各處理組間無顯著統計學差異。圖11為以3種商品食用油處理CHO細胞株24和48小時後細胞形態變化以及考馬斯亮藍染色結果。陰性對照組為正常培養的細胞。細胞在處理前於正常條件下培養2小時。每組處理平行操作3份。a :4倍鏡下處理24小時後結果；b:4倍鏡下處理48小時後結果；c :4倍鏡下考馬斯亮藍染色結果。圖12為3種商品食用油處理48小時後殘餘細胞數對比。上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人是能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(1)按照常規細胞培養方法在培養基中進行正常細胞的培養，當正常細胞達到預定數量時加入待測地溝油樣品繼續培養；(2)對培養後的細胞死亡或存活情況進行統計或對細胞毒性進行檢測，根據培養後的細胞毒性或細胞死亡或存活情況判斷待測地溝油樣品是否為地溝油。
2.根據權利要求I所述的地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法步驟(I)待測地溝油樣品在加入培養基前進行過濾處理。
3.根據權利要求I所述的地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法步驟(I)中常規細胞培養方法培養正常細胞的時間控制在廣36小時。
4.根據權利要求I所述的地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法步驟(I)中加入的待測地溝油樣品的體積為O. I mL。
5.根據權利要求I所述的地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法步驟(I)中加入待測地溝油樣品繼續培養的時間控制在2Γ48小時。
6.根據權利要求I所述的地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法步驟(2)中細胞死亡情況統計是採用考馬斯亮藍染色、活/死細胞染色方法處理繼續培養的細胞後，通過檢測藍染的細胞數量進行死亡細胞統計。
7.根據權利要求I所述的地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法還包括在步驟(I)進行正常細胞的培養後加入常用食用油進行繼續培養，以常用食用油為對照，通過檢測常用食用油與待測地溝油樣品進行對比檢測。
8.根據權利要求I所述的地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法步驟(2)中判斷待測地溝油樣品是否為地溝油是通過先分別採用地溝油與常用食用油處理細胞培養後的細胞存活或死亡情況進行對比統計，獲得常用食用油與地溝油間的閾值；根據待測地溝油樣品處理細胞培養後的細胞存活或死亡情況與閾值的比較判斷待測地溝油樣品是否為地溝油。
9.根據權利要求8所述的地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法步驟(2)中設置若干個閾值將地溝油分為低度毒性地溝油、中度毒性地溝油和高度毒性地溝油。
10.根據權利要求8所述的地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法步驟(2)中對培養後的細胞死亡或存活情況進行統計是通過計算機圖像處理技術進行統計的。
全文摘要
本發明公開了一種地溝油快速檢測方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(1)按照常規細胞培養方法在培養基中進行正常細胞的培養，待正常細胞達到預定數量時加入待測地溝油樣品繼續培養；(2)對培養後的細胞死亡情況進行統計或對細胞毒性進行檢測，根據培養後的細胞毒性或細胞死亡情況判斷待測地溝油樣品是否為地溝油。該方法解決了現有技術中檢測方法只能在一定範圍內適用特定類型的地溝油的缺陷。
文檔編號C12Q1/02GK102605035SQ20121006467
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月13日 優先權日2012年3月13日
發明者呂文進, 孫濤, 張俊龍, 張百靈, 熊伊韋 申請人:西交利物浦大學