一種觀賞魚用紅酵母微生態製劑的製備方法

2023-05-31 19:14:51

專利名稱：一種觀賞魚用紅酵母微生態製劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種分離與製備微生態製劑的技術，尤其是一種觀賞魚用紅酵母微生態製劑的製備方法。
背景技術：
魚類腸道正常菌群是腸道微生物的重要組成成分，是各種生命活動影響因素之一，是在與宿主共同進化過程中形成的，以及二者之間相互作用而成的微生態系，與魚類營養、物質消化吸收、免疫應答、器官的發育及疾病感染有關。腸道菌群跟據其作用可分為固有菌群和非固有菌群，或者分為原籍菌群Autocht honous flora和外籍菌群Allochthonous flora,這種分類只是相對的。紅酵母Rhodotorula廣泛分布於海洋及淡水環境 中，其富含蛋白質、不飽和脂肪酸、多種B族維生素、消化酶及生長因子，同時也能產生一些保健功能活性物質。更為重要的是，紅酵母能合成生產以蝦青素為主的類胡蘿蔔素，是相當優質的微生物飼料。目前人們把海洋紅酵母Rhodotorula glutinis作為一種水產養殖的益生菌來應用。紅酵母屬中有許多種類寄附在魚、蝦和貝類的身體上，與其共生，一般不致病，是魚、蝦、貝的開口餌料。斑馬魚Danio rerio作為一種新型模式生物近年來在研究人類遺傳、免疫、及生理方面倍受關注。利用紅酵母作為觀賞魚和水產品的飼料添加劑，將在防病治病、提高觀賞魚和水產品養殖生產力方面發揮巨大的潛能，並有利於綠色環保型觀賞魚和水產品的生產。

發明內容
為了有效預防觀賞魚及水產品的疾病，減低水產品死亡率，本發明提供一種觀賞魚用紅酵母微生態製劑的製備方法，該方法不僅工藝流程操作簡便，成本低廉，而且本方法製備的觀賞魚的養殖用紅酵母微生態製劑可以起到有效預防觀賞魚和水產品的疾病，增強抗病力的作用，降低病死率，同時不會造成環境汙染和抗生素藥物殘留的問題。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是該觀賞魚用紅酵母微生態製劑的分離、鑑定與製備方法包括以下步驟
(1)紅酵母的分離
無菌操作對斑馬魚的體表用75%的酒精消毒，取其腸道中部，置於盛有IOmL的無菌生理鹽水的離心管中，剪碎混勻，取適量均勻塗布於馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基上，保持培養基內的溫度為恆溫25-28°C，培養3天；挑選典型菌落轉種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基上，反覆傳代2 3次，篩選出目的酵母接種到斜面備用；所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基的成分及製備方法為去皮馬鈴薯190-210g，葡萄糖18-20g及瓊脂13. 5-16. 5g，由去離子水定容至990-1010 mL，PH值為7_8，115-126°C條件下滅菌18-22min ；
(2)紅酵母的鑑定 Φ生理生化實驗酵母菌生化試劑鑑定管購自杭州天和微生物有限公司，酵母糖發酵和碳源同化的實驗按常規方法進行，保持培養基內為恆溫25-30°C，培養2 5天，觀察結果。Φ的聚合酶鏈式反應PCR擴增及序列分析
提取酵母菌DNA後，選取26S rDNA Dl /D2區的PCR反應體系進行PCR擴增，將擴增產物送由生工生物工程上海有限公司進行測序，採用BLAST和Clustalxl. 83程序進行26S rDNA序列比對分析，進而構建系統發育樹和置信度檢測。(3)紅酵母微生態製劑的製備方法
Φ菌株提取
取一株(I)中提取的紅酵母菌Rhodotorula glutinis，保藏號為MCCC2A00030，在PDA培養基上保持恆溫25-30°C培養3天，在發酵培養基中保持恆溫25-30°C、190-210 rpm搖床培養4-6天，該菌26 S rDNA的GenBank登陸號是HQ323251 ;所述的發酵培養基為去皮馬鈴薯 190-210g，葡萄糖 18-22g，蛋白腖 2. 5-3. 5g，KH2PO4 O. 9-1. Ig，MgSO4O. 4-0. 6g，由去離子水定容至990 -1010 mL, PH值為7-8，在115_126°C條件下滅菌18_22min ;
0菌株活化用牙籤從斜面刮取一塊菌種接種於PDA液體培養基試管中保持恆溫25-300C，培養3天，再將其接種於發酵培養基試管中保持恆溫25-30°C，培養3天，接種量為IO6 CFU/ml，反覆 3 次；
@菌株擴培將步驟Θ的液體菌種接種於裝有發酵培養基的三角瓶中，在恆溫25-30°C、200rpm搖床培養5天，接種量為IO6 CFU/ml ；
B菌株收集濃縮在無菌條件下，將步驟 的搖瓶培養菌液用O. 22um微濾膜過濾濃縮成500億CFU/ml菌液，獲得的濃縮菌液為微生態製劑。其中，上述觀賞魚用紅酵母微生態製劑的應用方法發酵完成後，採用65°C以下低溫烘乾粉碎後加水外噴塗使用；對於即時使用的產品，不必進行烘乾處理，這樣可以更好地發揮紅酵母中營養因子的生理活性，也可以減少因烘乾而導致的部分有益微生物的損失；在觀賞魚養殖飼料中微生態製劑的添加量為IO8 109CFU/g。本發明的有益效果是，該方法不僅工藝流程操作簡便，成本低廉，對設備要求低，而且本方法製備的觀賞魚的養殖用紅酵母微生態製劑可以起到有效預防觀賞魚和水產品的疾病，增強抗病力的作用，降低病死率，同時不會造成環境汙染和抗生素藥物殘留的問題；另外，豆柏中大分子蛋白質分解為小分子的肽類，提高了蛋白質的消化吸收率，並通過微生物轉化進一步平衡了胺基酸的營養價值；發酵飼料中補充了由於紅酵母菌代謝引入的蝦青素，提高了飼料的營養價值。


下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。圖I是酵母菌的生理生化特徵。注+為陽性，-為陰性(位置變化)。
具體實施例方式(I)酵母菌的分離
無菌操作對斑馬魚的體表用75%的酒精消毒，取其腸道中部，置於盛有IOmL的無菌生理鹽水的離心管中，剪碎混勻，取適量均勻塗布於馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基上，保持培養基內的溫度為恆溫25-28°C，培養3天；挑選典型菌落轉種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基上，反覆傳代2 3次，篩選出目的酵母，在4°C冰箱內保存備用。將篩選出的酵母菌在平板上四區劃線，在25-28°C恆溫條件下培養2 3天，觀察其菌落形態。該菌株在PDA培養基上培養2天後菌落呈粉紅色圓形、表面光滑、隆起、溼潤、不透明、邊緣整齊；酵母細胞呈橢圓形且較大，大小為4. 0-5. 5X5. 0-7. 5 μ m，進行出芽生殖，載玻片培養未見假菌絲。(2)紅酵母的鑑定
Φ生理生化實驗
酵母菌生化試劑鑑定管購自杭州天和微生物有限公司，酵母糖發酵和碳源同化實驗按常規方法進行，28°C培養2 5天，觀察生理生化特徵結果。酵母菌生理生化特性鑑定指標有碳源發酵測試、碳源同化和肌醇同化測試。本實驗對該株菌分別進行了葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、海藻糖6種碳源的發酵測試。結果顯示，該菌株不發酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖及海藻糖；同化試驗測定結果，見附圖I酵母菌的生理生化特徵。查閱《酵母菌的特徵與鑑定手冊》，判斷該菌株的形態學和各項生理生化檢測結果符合紅酵母Rhodotorula的特徵,初步確定該菌株為紅酵母。Q的聚合酶鏈式反應PCR擴增及序列分析
參照CATB法提取酵母菌DNA後，選取26S rDNA Dl /D2區進行PCR擴增，所用引物為通用引物正向 NL— I: 5 — GCATAT-CAATAAGCGGAGGAAAAG— 3，反向 NL — 4:5 —GGTCCGT-GTTTCAAGACGG — 3，由生工生物工程上海有限公司合成。PCR的反應體系精簡為20 uL: DNA 模板 I. 5 uL, 10 X buffer 2 ul, 10mmol/L dNTP O. 5 ul, 10 pmol /I 引物各O. 5 ul，Taq DNA聚合酶O. 5 ul，加無菌水至20 ul，反應條件94°C 5min預變性，95°C 45s變性，60°C 45s退火，72°C Imin延伸，30個循環。擴增產物送由生工生物工程上海有限公司進行測序，測序獲得642bp目的片段，已被Genbank所接受，登陸號為HQ323251。採用BLAST和ClustalX程序與Genbank資料庫中已收錄的酵母26SrDNA D1/D2區序列比對構建系統發育樹，並通過1000次的自舉分析bootstrap進行置信度檢測，結果表明該酵母菌的26SrDNA序列與斯魯菲亞紅酵母Rhodotorula slooffiae, EU583485序列相似性在99%-100%之間，處於同一分支上，親緣關係最近，據此將該菌鑑定為斯魯菲亞紅酵母 Rhodotorula slooffiae。(3)紅酵母菌的安全性實驗
將紅酵母菌培養，用生理鹽水調節菌液的濃度分別為108、109、101(lCFU/ml ;實驗開始前24h停止投喂，對觀賞用金魚，體重8-10g/尾，採用注射的方法，劑量為50ul/尾，每組用魚10尾，以同濃度的的副溶血弧菌和生理鹽水做對照，每組設5個重複，記錄觀察7天累計死亡情況；對成年斑馬魚，體長3-4cm/尾，採用浸泡感染，浸泡時間為15 min，每組用魚10尾，以同濃度的嗜水氣單胞菌和生理鹽水做對照，每組設5個重複，連續觀察7天記錄累計死亡情況。結果表明，注射108、109、101QCFU/ml副溶血弧菌的金魚全部死亡；浸泡108、109、1010CFU/ml嗜水氣單胞菌的斑馬魚的死亡率分別為80%、90%、100%,注射ΙΟ8、109、1010CFU/ml紅酵母菌的金魚、同濃度的菌液浸泡斑馬魚和空白對照組在實驗期間採食和生長均正常，無死亡。說明紅酵母菌對觀賞魚金魚和斑馬魚安全無毒，可以作為在觀賞魚養殖中具有安全性和潛在應用價值的外源益生菌使用。(4)紅酵母菌微生態製劑的製備方法 Φ菌株提取
取一株(I)中提取的紅酵母菌Rhodotorula glutinis，保藏號為CPCC 360002，在PDA培養基上保持恆溫25-28°C培養3天，在發酵培養基中保持恆溫25-28°C、190-210rpm搖床培養4-6天，該菌26 S rDNA的GenBank登陸號是HQ323251 ;所述的發酵培養基為去皮馬鈴薯 190-210g，葡萄糖 18-22g，蛋白腖 2. 5-3. 5g，KH2PO4 O. 9-1. Ig，MgSO4O. 4-0. 6g，由去離子水定容至990 -1010 mL, PH值為7. 4，在115_126°C條件下滅菌18_22min ;
0菌株活化用牙籤從斜面刮取一塊菌種接種於PDA液體培養基試管中保持恆溫
25-280C，培養3天，再將其接種於發酵培養基試管中保持恆溫25-28°C，培養3天，接種量為IO6 CFU/ml，反覆 3 次；
Θ菌株擴培將步驟@的液體菌種接種於裝有發酵培養基的三角瓶中，在恆溫25-28 V、190-210rpm 搖床培養 4-6 天，接種量為 IO6 CFU/ml ；
&菌株收集濃縮在無菌條件下，將步驟 的搖瓶培養菌液用O. 22um微濾膜過濾濃縮成500億CFU/ml菌液，獲得的濃縮菌液為微生態製劑。在觀賞魚養殖飼料中的應用
飼料配方將粉碎後的豆柏、豬血粉和麩皮，加上魚粉四種成分按2:3:3:1的比例混合均勻，維生素和礦物質5%，加適量榆樹葉粉或小麥粉水溶液作黏合劑，充分揉合後，製成IOOOg固體發酵基料；另將菌劑配成IO8 CFU/g的製劑，並與KH2PO4 l.Og、MgSO4 O. 5g、Nacllg、蔗糖30g及水混合，製成IOOOg營養補充劑，PH值為6.5;固體和液體兩基料按
I.2-2. 2比列混合均勻，40°C條件下發酵2小時，製成固體發酵培養基粉碎再加工成5_的顆粒狀，在固定低溫風乾乾燥床上於35— 60°C溫度下乾燥24— 36小時，即成成品飼料用。發酵完成後，通過血球計數板計算，紅酵母菌菌體數量可達到48億個/克乾重，PH值在
6.5左右，發酵物氣味略酸，色澤較發酵前明顯變淺，呈粉紅色。在本實施例中，也可加入嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌代替一定比例的紅酵母菌，會使味道更佳。用本發明製備的紅酵母菌微生態製劑添加到觀賞魚養殖中，經飼餵實驗證明魚飼料轉化率達到2. 56%，成活率達到97. 6%，死亡率降低了 25. 8% ;對其免疫保護率有一定的提高，從生長性能的指標來看，菌劑的添加可改善觀賞魚的生長性能，提高生長速度。
權利要求
1.一種觀賞魚用紅酵母微生態製劑的製備方法，該製備方法包括紅酵母的分離、紅酵母的鑑定及紅酵母微生態製劑的製備；其特徵是無菌操作對斑馬魚的體表用75%的酒精消毒，取其腸道中部，置於盛有IOmL的無菌生理鹽水的離心管中，剪碎混勻，取適量均勻塗布於馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基上，保持培養基內的溫度為恆溫25-28°C，培養3天；挑選典型菌落轉種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基上，反覆傳代2 3次，篩選出目的酵母接種到斜面備用；所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基的成分及製備方法為去皮馬鈴薯190-210g，葡萄糖18-20g及瓊脂13. 5-16. 5g，由去離子水定容至990-1010 mL, PH值為7-8，115-126°C條件下滅菌18_22min ;紅酵母的鑑定包括生理生化實驗及26S rDNA的聚合酶鏈式反應PCR擴增及序列分析；紅酵母微生態製劑的製備方法包括菌株提取、菌株活化、菌株擴培及菌株收集濃縮。
2.根據權利要求I所述的生理生化實驗；其特徵是酵母糖發酵和碳源同化的實驗按常規方法進行，保持培養基內為恆溫25-28°C，培養2 5天，觀察結果。
3.根據權利要求I所述的26SrDNA的聚合酶鏈式反應PCR擴增及序列分析；其特徵是提取酵母菌DNA後，選取26S rDNA Dl /D2區的PCR反應體系進行PCR擴增，採用BLAST和Clustalxl. 83程序進行26S rDNA序列比對分析，進而構建系統發育樹和置信度檢測。
4.根據權利要求I所述的紅酵母微生態製劑的製備方法；其特徵是①取一株提取的紅酵母菌Rhodotorula glutinis，在PDA培養基上保持恆溫25-28°C培養3天，在發酵培養基中保持恆溫25-28°C、190-210rpm搖床培養4_6天；所述的發酵培養基為去皮馬鈴薯.190-210g，葡萄糖 18-22g，蛋白腖 2. 5-3. 5g，KH2PO4 O. 9-1. Ig，MgSO4O. 4-0. 6g，由去離子水定容至990-1010 mL, PH值為7. 4，在115_126°C條件下滅菌18_22min ;②用牙籤從斜面刮取一塊菌種接種於PDA液體培養基試管中保持恆溫25-28 °C，培養3天，再將其接種於發酵培養基試管中保持恆溫25-28°C，培養3天，接種量為IO6 CFU/ml,反覆3次將步驟§的液體菌種接種於裝有發酵培養基的三角瓶中，在恆溫28°C、200rpm搖床培養5天，接種量為IO6 CFU/ml 在無菌條件下，將步驟'S的搖瓶培養菌液用O. 22um微濾膜過濾濃縮成.500 億 CFU/ml 菌液。
全文摘要
本發明涉及一種觀賞魚用紅酵母微生態製劑的製備方法，該方法包括從斑馬魚的腸道中部分離出紅酵母、通過生理生化實驗和聚合酶鏈式反應PCR擴增及序列分析對紅酵母進行鑑定與對紅酵母微生態製劑進行製備。該方法不僅工藝流程操作簡便，成本低廉，而且本方法製備的觀賞魚的養殖用紅酵母微生態製劑可以起到有效預防觀賞魚和水產品的疾病，增強抗病力的作用，降低病死率，同時不會造成環境汙染和抗生素藥物殘留的問題。
文檔編號C12R1/645GK102715358SQ201210120200
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月24日 優先權日2012年4月24日
發明者呂愛軍, 王藝, 胡宏曉, 胡秀彩 申請人:江蘇師範大學