包含z9cck蛋白的重組大腸桿菌及卵黃抗體與應用的製作方法

2023-06-01 06:30:31 2

專利名稱：：包含z9cck蛋白的重組大腸桿菌及卵黃抗體與應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於本發明屬於農業養殖動物基因工程
技術領域：
。具體涉及一種經大腸桿菌偏愛密碼子優化後的豬膽囊收縮素-33J3)基因多串聯體重組質粒的構建，豬CCK-33多串聯體重組蛋白在大腸桿菌中的表達，Z9CCK(豬CCK-33九串聯體)重組蛋白的純化及其在製備卵黃抗體製品中的應用。
背景技術：
：膽囊收縮素(CCK)是一種被廣泛研究的食慾飽感因子。它廣泛分布於消化系統、中樞及外周神經系統、外周血液及一些組織器官中。CCK前體分子經不同酶切作用形成不同大小的CCK分子形式(LiddleRA.Cholecystokinincells.屍^w!'o/,1997,59:221-242)，其中CCK-33和CCK-8是動物體內最具代表性的兩類分子形式。CCK羧基端第7位酪氨酸殘基硫酸化是CCK是否具有較強生物學活性的的關鍵因素(WilliamsJA.Cholecystokinin:ahormoneandaneurotransmitter,5/。7weii1982,3:107-121)。il酸f七的CCK-8肽Asp-Tyr(S03H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2具有天然CCK的全部活性(RushakoffRJ,GoldfineID,CarterJD,LiddleRA.Physiologicalconcentrationsofcholecystokininstimulateaminoacid-inducedinsulinreleaseinhumans./C""￡W。c"'o/Me喊1987，65(3):395-401)。CCK-5肽Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2與胃泌素羧基端5個胺基酸序列完全相同，CCK-4同樣如此。因此，CCK-4是具有生物活性的最小片段，是保持生物活性所必須的(JensenRT,LempGF,GardnerJD.InteractionofCOOH-terminalfragmentsofcholecystokininwithreceptorsondispersedacinifromguineapigpancreas./5!'o/C&w,1982，257:5554-5559)，而CCK-8則是具有全部生物學活性的最小片段。Pekas禾卩Trout(PekasJC,TroutWE.Stimulationoffoodintakeandgrowthofpigsbycholecystokininimmunization.GrowAZ)ev爿g;"g，1990,54:5卜56)發現，在生長肥育豬的飼養試驗中，用化學合成的非硫酸化的CCK-8與人血清球蛋白(hSG)交聯物作抗原主動免疫生長肥育豬。結果在試驗後期(43-77d),CCK免疫組豬的採食量和增重分別提高了8.2°/。和10.6%(戶<0.01)。他們還發現CCK免疫組採食量和日增重顯著提高與CCK免疫組豬體內CCK抗體滴度成正相關，相關係數分別為0.20(戶=0.14)和0.34CP<0.05)，CCK免疫組豬體內有明顯的CCK抗體產生是在試驗期第29d，第43dCCK抗體滴度達到峰值，此後檢測CCK免疫組豬體內一直存在CCK抗體，直到試驗結束。後來的試驗進一步證實了CCK主動免疫可以顯著提高生長肥育豬的日增重，血液中CCK抗體滴度與體増重成正相關，相關係數為0.44CPO.05),差異顯著。同時在青年母豬中也得到了類似的結果(PekasJC，TroutWE.Cholecystokininoctapeptideimmunization:effectongrowthofbarrowsandgilts.Jy4m'/nSd,1993,71:2499-2505)。譚雪梅(譚雪梅.膽囊收縮素主動免疫及其對豬生產性能和胴體品質的影響.[碩士學位論文].雅安四川農業大學圖書館，2003)用化學合成的CCK-8與人血清白蛋白(hSA)主動免疫生長肥育豬後，試驗豬的日增重比對照組提高21.23%CP=0,104),日採食量比對照組提高16.24%CP=0.152),料肉比下降4.86°/。(ZMU38),但對營養物質的利用率無影響。這表明CCK主動免疫可以提高豬的生產性能。同時，試驗豬的屠宰體重比對照組增加12.68%(P=0.178)。袁中彪(袁中彪.膽囊收縮素主動免疫對豬的營養生理效應及其機制的研究.[博士學位論文].雅安四川農業大學圖書館，2004)第一次試驗用化學合成的未硫酸化的CCK-8與hSA(370ugCCK/mL)主動免疫生長肥育豬後，與對照組相比，試驗豬全期日增重和採食量分別提高了314.29%(屍=0.23)和9.34%(屍=0.34);第二次試驗分別用不同濃度的CCK-8主動免疫主動免疫生長豬，發現250嗎CCK-8主動免疫能顯著提高豬的全期採食量和日增重，與對照組相比分別提高了11.76%(屍<0.05)和14.62%(P<0.05)。姚康(姚康.利用抗食慾抑制因子卵黃抗體提高母豬泌乳期採食量的研究.[碩士學位論文].武漢華中農業大學圖書館，2005)用化學合成的未硫酸化的CCK-8與牛血清白蛋白(BSA)交聯物主動免疫產蛋雞，與對照組相比高峰期產蛋雞採食量提高了9.25%(戶O.Ol),蛋重提高了4.17%(戶o.oi)。Cook等(CookME,MillerCC,PimentelJL.Methodtosuppressappetiteandreduceweightgain.USAPatent,PCT/USO1/00542.1998-10-27)用化學合成的硫酸化的CCK-8和匙孔血藍蛋白(KLH)交聯物免疫產蛋雞，產蛋雞經過受精後收集雞蛋，在雞蛋中存在CCK抗體，小雞從雞蛋中孵化出來，體內帶有CCK母源卵黃抗體，母源抗體一般可以存在15-20d，將孵化出的小雞飼養6個星期發現CCK處理組比對照組釆食量提高了1%，體增重提高了18%，料肉比降低了14%(CookME，MillerCC，PimentelJL.Methodtosuppressappetiteandreduceweightgain.USAPatent,PCT/US01/00542.1998-10-27)。Cook認為，這些試驗結果意味著CCK抗體可以中和動物體內內源性的CCK，減少胃腸道蠕動，從而提高飼料轉化率。分別將0.5%、1%、5。/。的CCK卵黃粉添加到小雞日糧中去，添加5WCCK卵黃抗體粉組的採食量比相應對照組提高了8.43。/。，P/。CCK卵黃抗體粉組的料肉比最低，比相應對照組降低了4.18%。Cook分別添加5。/。和10。/。生大豆到小雞日糧中，研究發現5Q/。生大豆CCK抗體組比對照組料肉比降低了11%,10n/。生大豆CCK抗體組比對照組料肉比降"f氐了190/0(CookME,MillerCC,PimentelJL.Methodtosuppressappetiteandreduceweightgain.USAPatent,PCT/US01/00542.1998-10-27)。丁雪梅(丁雪梅.膽囊收縮素主動免疫產蛋雞的營養生理效應研究.[碩士學位論文].雅安四川農業大學圖書館，2003)在肉雞飼料中添加含有CCK抗體的卵黃粉(100mg/g),可顯著提高l-42日齡肉雞的日增重和飼料轉化率。張曉萍(張曉萍.膽囊收縮素卵黃抗體的生物學活性及其作用機理初探.[碩士學位論文].南京南京農業大學圖書館，2004)分別在基礎日糧中添加O,50,70，90mg/kg的CCK卵黃抗體粉，結果顯示添加50，70，90mg/kg的CCK卵黃抗體粉處理，均能顯著提高肉雞體重和體增重(P<0.05)，其中50mg/kg組差異極顯著(PO.Ol)。姚康(姚康.利用抗食慾抑制因子卵黃抗體提高母豬泌乳期採食量的研究.[碩士學位論文].武漢華中農業大學圖書館，2005)添加1.2°/。的CCK卵黃抗體粉到母豬泌乳期日糧中使母豬採食量提高了3.8n/。，仔豬窩增重提高了3.9n/。，差異均不顯著。劉潔珠(劉潔珠.抗縮膽囊素卵黃抗體的製備及應用研究.[碩士學位論文].廣州華南農業大圖書館，2007)在生長肥育豬飼料中添加CCK抗體的卵黃粉，得到試驗組釆食量比對照組提高了8。/。。目前大多數的研究者用CCK作抗原調節動物釆食量都是用化學合成的CCK-8(硫酸化或未硫酸化)，其缺點是化學合成的CCK-8無論硫酸化或未硫酸化都很昂貴，而且硫酸化的CCK-8更昂貴，不能用於大規模的生產應用中去。以大腸桿菌表達系統為典型代表的原核表達系統具有遺傳背景清楚、操作簡便、可以大規模發酵培養的優點，是現階段最常用的表達系統(謝磊，孫建波，張世清，黃俊生..大腸桿菌表達系統及其研究進展.華南熱帶農業大學學報，2004,10(2):16-20)。因此用大腸桿菌表達系統表達CCK重組蛋白，可以替代昂貴的化學合成的CCK-8，為規模化生產CCK蛋白抗原提供新思路。舒鼎銘(舒鼎銘.雞縮膽囊素基因的表達及免疫原性研究.[博士學位論文].廣州華南農業大圖書館，2004)在大腸桿菌中成功表達出了雞CCK-33多串聯體蛋白。曹軍(曹軍.豬三十九肽膽囊收縮素(CCK39)的基因克隆、表達及其抗體的製備.[碩士學位論文].揚州.揚州大學圖書館，2005)在大腸桿菌中也成功表達出了豬CCK-39與GST(谷光甘肽轉運酶)的融合蛋白。劉潔珠(劉潔珠.抗縮膽囊素卵黃抗體的製備及應用研究.[碩士學位論文].廣州華南農業大圖書館，2007)分別將編碼豬CCK70個胺基酸的功能結構蛋白區和雞CCK-33四串聯體基因與Mj^S基因在大腸桿菌中融合表達，均獲得了具有較好抗原性的CCK融合蛋白。基於以上的發現，我們採用基因工程技術外源表達豬的CCK多串聯體重組蛋白，旨在尋求一種低成本大量生產具有免疫原性的CCK重組蛋白。通過Z9CCK重組蛋白主動免疫產蛋雞，製備CCK卵黃抗體粉，並研究其調節泌乳期母豬採食的效果，從而為開發CCK卵黃抗體粉成為一種促食慾、促生長、提高飼料利用率的飼料添加劑提供試驗依據。
發明內容本發明的目的是在於提供了一種經大腸桿菌偏愛密碼子優化後的豬cc/:-"基因九串聯體的重組質粒pRSET-Z9CCK，將重組質粒pRSET-Z9CCK轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得一種能表達Z9CCK蛋白的重組菌。所述重組質粒的核苷酸序列經大腸桿菌偏愛密碼子優化後，提高了基因表達目的蛋白Z9CCK的表達量；所述重組質粒自帶終止密碼子，提高了目的蛋白Z9CCK表達的終止效率，減少了目的蛋白攜帶的冗餘胺基酸序列。本發明的另一個目的是在於提供了一種誘導重組大腸桿菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK表達的Z9CCK目的蛋白。所述目的蛋白Z9CCK分子量較大，免疫原性較好，生產成本較低。本發明的再一個目的是利用所述的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK在製備CCK卵黃抗體製品中的應用。本發明的第四個目的是利用所述的Z9CCK重組蛋白在製備CCK卵黃抗體製品中的應用。利用所得到的Z9CCK重組蛋白主動免疫生長肥育豬，以提高豬的採食量。利用所得到的卵黃抗體作為飼料添加劑添加到泌乳期母豬日糧中，以提高母豬的採食量。本發明通過以下技術方案實施一種表達豬CCK-33九串聯體(Z9CCK)的重組大腸桿菌Esc^Wcteco/ZBL21(DE3)/pRSET-Z9CCK，已於2008年6月30日遞交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCCNO:M208103本發明克隆的重組質粒，是利用多串聯體構建技術等基因工程技術和利用SaMHl與Bg/II是一對同尾酶的原理，將9個編碼豬CCK-33單體的核苷酸序列和每2個CCK-33單體之間間隔有編碼五個胺基酸連接肽的核苷酸序列插入原核表達載體pRSETB中構建而成的。申請人將該重組質粒命名為pRSET-Z9CCK，CCK九串聯體(Z9CCK)的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。利用所述的重組質粒pRSET-Z9CCK轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，通過誘導表達得到重組蛋白Z9CCK，它的胺基酸序列如SEQIDNO:2所示，利用該重組蛋白主動免疫產蛋雞，得到含有CCK抗體的卵黃抗體全蛋粉；將所述的CCK卵黃抗體作為飼料添加劑添加到泌乳期母豬日糧中，從而顯著提高了泌乳期飼餵母豬的採食量。一種包含Z9CCK蛋白的重組大腸桿菌及卵黃抗體與應用，本發明的技術方案如下(詳細技術步驟參見"具體實施方式"部分)下列具體實施例中未經特別說明的方法均參照[美]J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾(J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯。分子克隆實驗指南(第三版)，北京科學出版社，2002年)。一、優化後的豬cai:-33基因九串聯體重組質粒的構建(見圖i①和圖2)根據GenBank中已報導的豬CCK-33基因序列(登錄號為NM一214237)和參照大腸桿菌密碼子使用資料庫(Codonusagedatabase,網址www.kazusa.or.jp/codon)，設計併合成了大腸桿菌表達系統偏愛的豬CCX-1基因優化序列。設計帶有限制性內切酶酶切位點的引物對A和引物對B，其中在引物對B的下遊引物中引入終止密碼子，引物對C中沒有內切酶酶切位點。以質粒pRESETB為克隆載體，大腸桿菌DH5a為克隆宿主菌，將合成的豬CC尺-W優化序列通過PCR擴增、酶切、連接、轉化克隆至pRSETB質粒上，分別獲得不帶終止子的CCX-W基因單體pRSET-lCCK的重組質粒和帶終止子CCX-W基因單體pRSET-ZlCCK的重組質粒。在此基礎上利用限制性內切酶^wzHI和5g/II是同尾酶的原理，經多次克隆構建了含有優化後的豬CC《-W基因九串聯體重組質粒。對構建好的CCK-33九串聯體基因重組質粒酶切鑑定、測序，證實構建正確，命名為pRSET-Z9CCK。二、CCK-33九串聯體(Z9CCK)重組蛋白的誘導表達及提取純化(見圖1①)將測序正確的重組質粒pRSET-Z9CCK,轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，構建重組菌大腸桿菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK，並利用異丙基-l3-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-D-l-thiogalactopyranoside,IPTG)進行誘導表達。通過對大腸桿菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK表達產物的可溶性分析發現BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK誘導表達產物以包涵體形式存在，釆取超聲波破碎法提取包涵體，通過包涵體的變性和復性純化大腸桿菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK表達產物Z9CCK重組蛋白。SDS-PAGE檢測提純後的Z9CCK重組蛋白純度，Bradford法測定蛋白質濃度。三、Z9CCK重組蛋白的抗原性(見圖l②，③，，⑤)禾ll用網址http:〃www.immuneepitope.org/tools/bcell/tutorial.jsp上介糹召的"BepipredLinearEpitopePrediction"方法對Z9CCK重組蛋白進行抗原性預測，初步驗證了Z9CCK重組蛋白具有良好的抗原性。以兔抗CCK-8陽性抗血清為一抗，以山羊抗兔抗體為二抗，用Western-blot方法(J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯。分子克隆實驗指南(第三版)，北京科學出版社，2002年)證明了Z9CCK重組蛋白具有良好的免疫原性。以化學合成的CCK-8作為包被抗原，用提純的Z9CCK重組蛋白主動免疫生長肥育豬獲得的抗Z9CCK抗體為一抗，以羊抗豬IgG抗體為二抗，用間接ELISA試驗證明了Z9CCK重組蛋白具有較好的抗原性。四、利用Z9CCK重組蛋白主動免疫生長肥育豬，研究該重組蛋白對豬生長性能的影響(見圖1，⑧)向提純的Z9CCK重組蛋白溶液中加入滅菌的吐溫-80(吐溫-80體積比濃度為4%(體積比))，充分混合後再與等體積的白油佐劑(94%(體積比)白油，6°/。(體積比)司本-80，2%(質量體積比)硬脂酸鋁)混合，並充分乳化製成蛋白濃度為500pg/mL的油乳苗。用Z9CCK重組蛋白油乳苗主動免疫生長肥育豬，通過生長肥育豬的飼養試驗研究Z9CCK重組蛋白對豬的採食量和體增重的調節效果。選擇63±3日齡的長新品系生長肥育豬(華中農業大學試驗豬場提供)72頭，按體重相對一致的原則隨機分成2組，每組9個重複，每個重複4頭豬，共36頭/組。試驗組免疫Z9CCK重組蛋白油乳苗2mL(500嗎Z9CCK/mL)，左右頸部肌肉各注射lmL;對照組免疫生理鹽水，左右頸部肌肉各lmL。免疫程序為試驗期第ld進行初次免疫，第29、57d各加強免疫一次。試驗結果表明在試驗後期(29-70天)，試驗組豬體內有較高水平的CCK抗體，試驗組豬採食量和日增重比對照組有提高，差異不顯著。用Z9CCK重組蛋白油乳苗主動免疫生長肥育豬，通過對豬採食前、採食中、採食後血液的動態釆集，研究Z9CCK主動免疫對血清激素及其它成分的影響。Z9CCK主動免疫生長肥育豬飼養試驗結束後，試驗組和對照組各選4頭健康、體重一致的豬，耳靜脈安裝留置針，對其實施採食前0min、開始採食後15min、30min、lh、2h連續動態採血，用相關試劑盒測定血漿中CCK、胰島素、血糖的濃度。試驗結果表明Z9CCK重組蛋白主動免疫對生長肥育豬血液中CCK、胰島素、血糖具有調節作用。五、以Z9CCK重組蛋白為免疫原製備卵黃抗體(見圖l⑦)將Z9CCK重組蛋白油乳苗主動免疫28周齡海藍褐蛋雞750隻，左右胸肌各注射0.5mL/次(500嗎Z9CCK/mL)，免疫程序為試驗期第ld初次免疫和第15、29d各加強免疫1次。2免後一周開始收集雞蛋樣品，以提純的Z9CCK重組蛋白作包被抗原，雞蛋樣品倍比稀釋後作為一抗，鼠抗雞IgY為二抗，採用間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)監測卵黃抗體效價。當CCK抗體效價達到高峰時，收集雞蛋進行噴霧乾燥加工成CCK卵黃抗體全蛋粉，間接ELISA檢測卵黃粉樣品中的CCK抗體效價。六、CCK卵黃抗體在泌乳期母豬日糧中的應用(見圖l，⑦)選擇52頭妊娠後期健康經產母豬，隨機分成2組對照組和處理組，每組26個重複，每個重複l頭母豬。在玉米-豆粕型日糧的基礎上，處理組添加1X的CCK卵黃抗體全蛋粉；對照組添加1%的對照全蛋粉，泌乳期為21天。泌乳期日糧中添加1^的CCK卵黃抗體粉可顯著提高母豬泌乳期採食量，有利於提高仔豬生長性能。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果1、根據大腸桿菌偏愛密碼子設計基因序列，釆用基因工程的方法表達豬CCK-33多串聯體重組蛋白，表達量高、成本低；2、通過3方面的研究證明了Z9CCK重組蛋白具有較好的免疫原性；3、採用基因多串聯體構建技術，實現了豬CCK-33多串聯體重組蛋白的表達，增加了CCK的分子量，Z9CCK重組蛋白可直接作為抗原免疫，克服了小分子CCK-8和CCK-33不能直接作為免疫原，需要與大分子物質(如牛血清白蛋白，人血清球蛋白等)交聯才能作為免疫原的缺點；4、用提純的Z9CCK蛋白溶液與白油等佐劑充分乳化，製備了成本較低的Z9CCK蛋白油乳苗；5、用Z9CCK蛋白油乳苗主動免疫生長肥育豬，有效地提高了豬的釆食量和日增重；6、用Z9CCK蛋白油乳苗主動免疫產蛋雞，製備了高效價的CCK卵黃抗體全蛋粉；7、將製備的CCK卵黃抗體粉添加到泌乳期母豬日糧中，顯著提高了母豬的採食量，有效地提高了仔豬生長性能。8、製備的CCK卵黃抗體可以作為飼料添加劑大規模應用。圖1為一種包含Z9CCK蛋白的重組大腸桿菌及卵黃抗體製備與應用的技術路線方框示意圖。圖2為一種CCK基因及其多串聯體重組質粒的構建示意圖。圖中pRSETB為克隆質粒載體，pRSET-lCCK為插入了CCK-33基因(1CCK)的重組質粒，pRSET-2CCK為插入了CCK-33基因二串聯體(2CCK)的重組質粒，pRSET-Z3CCK為插入了CCK-33基因三串聯體(Z3CCK)的重組質粒,pRSET-Z5CCK為插入了基因五串聯體(Z5CCK)的重組質粒，pRSET-Z7CCK為插入了CCK-33基因七串聯體(Z7CCK)的重組質粒，5amHI、i//"dIII、5g/II、Sacl是質粒上的限制性內切酶位點。圖3為一種用限制性內切酶5側HI禾B歷wdIII分別對CCK多串聯體重組質粒pRSET-2CCK、pRSET-Z3CCK、pRSET-Z5CCK、pRSET-Z7CCK和pRSET-Z9CCK進行雙酶切電泳鑑定示意圖。圖中M為DNA分子量標準DL2000;1泳道為pRSET-2CCK質粒酶切產物，外源片段大小為258bp;2泳道為pRSET-Z3CCK質粒酶切產物，外源片段大小為374bp;3泳道為pRSET-Z5CCK質粒酶切產物，外源片段大小為602bp;4泳道為pRSET-Z7CCK質粒酶切產物，外源片段大小為830bp:5泳道為pRSET-Z9CCK質粒酶切產物，外源片段大小為1058bp。圖4為一種用lmmol/L的IPTG誘導CCK多串聯體重組蛋白表達的表達產物SDS-PAGE檢測示意圖；圖中1泳道為含有CCK-33肽三串聯體表達產物的細菌裂解物，2泳道為含有CCK-33肽五串聯體表達產物的細菌裂解物，3泳道為含有CCK-33肽七串聯體表達產物的細菌裂解物，4泳道為含有CCK-33肽九串聯體表達產物的細菌裂解物，M為蛋白質分子量標準；圖5為一種提純的Z9CCK重組蛋白SDS-PAGE檢測示意圖，圖中l泳道為提純的分子量大小為42.lkD左右的Z9CCK重組蛋白；M為蛋白質分子量標準；圖6為一種Z9CCK重組蛋白抗原性預測示意圖7為一種含有CCK-33的九串聯體誘導表達產物的免疫印跡(Western-blot)分析示意圖，圖中1泳道為九串聯體(Z9CCK)誘導表達產物；M為蛋白質分子量標準。圖8為一種Z9CCK重組蛋白主動免疫誘導生長肥育豬血清中的CCK抗體滴度示意圖，圖中*:顯著；**:極顯著；圖9為_種Z9CCK重組蛋白主動免疫後生長肥育豬血液中CCK濃度的變化規律示意圖；圖10為一種Z9CCK重組蛋白主動免疫後生長肥育豬血液中胰島素濃度的變化規律示意圖，圖中*:顯著；圖11為一種Z9CCK重組蛋白主動免疫後生長肥育豬血液中血糖濃度的變化規律示意圖12為一種Z9CCK重組蛋白主動免疫產蛋雞後，雞蛋中CCK卵黃抗體效價的變化規律示意具體實施例方式下列具體實施例中未經特別說明的方法均參照[美]J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾(J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯。分子克隆實驗指南(第三版)，北京科學出版社，2002年)。實施例l:優化後的豬COT-W基因九串聯體重組質粒的構建(見圖l①和圖2)1、菌株和質粒載體的選擇本實施例使用的質粒載體pRSETB購自美國Invitrogen公司。大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21(DE3)均購自Novagen公司。2、培養基製備LB液體培養基含胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaC110g，加蒸餾水定容至1000mL，調pH至6.8或7.0或7.2,12rC高壓蒸汽滅菌20分鐘或25分鐘或30分鐘，20'C或23'C或25'C保存備用。LB固體培養基含胰蛋白腖10g,酵母提取物5g，NaC110g，加蒸餾水定容至lOOOmL，調pH至6.8或7.0或7.2，另加15g瓊脂粉，12rC高壓蒸汽滅菌20分鐘或25分鐘或30分鐘，傾倒平板，待培養基凝固後倒置於4'C保存備用。若製備抗性平板，則待培養基溫度降至50'C或52'C或55'C時，加終濃度為100ng/mL的氨苄青黴素後傾倒平板即可。3、其他生化試劑製備TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、PCR緩衝液均為美國Fermentas公司產品。DNA分子量標準DL2000、限制性內切酶萬側HI、SacI、5g/II和州wi111，T4DNA連接酶等為寶生物工程(大連)有限公司產品。DNA回收試劑盒、氨節青黴素、異丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、胰蛋白腖、酵母提取物、瓊脂粉等均為上海生工生物工程有限公司產品。4、優化後的豬CCX-B基因多串聯體重組質粒的構建CCK-33多串聯體重組質粒的構建過程見圖2。(1)CCK-33基因DNA模板的製備.根據GenBank中已報導的豬CCX-W基因序列(GenBank登錄號為NM—214237)和大腸桿菌偏愛性密碼子表(參考CodonUsageDatabase)設計優化豬CC"大腸桿菌偏愛密碼子表達基因序列，送上海生工生物工程有限公司合成並插入PUC57質粒(購自北京經科宏達生物技術公司)中，命名為PUC57-CCK33,以此作模板，-20匯保存備用。參照豬CCK-33基因原序列(見GenBank，登錄號為NM_214237)，其核苷酸序列如下所示aaagcaccttctggccgagtatctatgattaagaatctgcagagectggaccccagecacagaataagtgacegggactacatgggctggatggatttt,設計大腸桿菌偏愛密碼子對其序列進行優化。經大腸桿菌偏愛密碼子優化後的豬CCK-33核苷酸序列如下，粗體字母為優化後的大腸桿菌偏愛密碼子)aaagetccgtctggtcgtgtgtctatgattaaaaacctgcagtctctggacccgtctcatcgtatttctgatcgtgattatatgggttggatggatttt(2)引物設計根據優化後的豬CCK-33基因序列，設計帶有限制性內切酶酶切位點的兩對引物，分別命名為引物對A和引物對B(見表l),在引物對A和引物對B的上遊引物(F)和下遊引物(R)中分別引入^wHl和&cI的酶切位點；引物對B中的下遊引物(R)帶有終止密碼子TCA(對應於編碼鏈為反向互補的TGA)。根據載體pRSETB的基因序列設計了另外一對引物，命名為引物對C,該引物對C的上下遊引物(F,R)分別位於載體pRSETB的多克隆位點的兩端。表1CCK基因PCR擴增的引物設計引物名稱引物序列5'-3'退火溫度'CF:CZ4GGATCCGAAAGCTCCGTCTGGTC引物對AR:5awHI52C4CGAGCTCCAAAATCCATCCAACCfeciF:C7MGGATCCGAAAGCTCCGTCTGGTC引物對BR:I52C4CGAGCTCTCAAAAATCCATCCAACCSacI引物對CF:AAATGGGTCGGGATCTGT54R:TCCTTTCGGGCTTTGTTA表l的說明帶下劃線的鹼基為引物對的酶切位點，引物對B下遊引物中粗體字母TCA鹼基為終止密碼子(3)優化後的豬cc/:-B基因重組質粒的構建用引物對A，以PUC57-CCK33作模板，經PCR擴增(94°C，4分鐘；94'C，30秒；52°C,30秒；72'C，35秒；35個循環；72°C，0分鐘；以下相同)、PCR產物純化後得到的基因片段，命名為1CCK，取10nL1CCK基因片段，用SawHI和&cI限制性內切酶雙酶切後再用瓊脂糖凝膠電泳回收1CCK，按40nL體系(1CCK，IO;iL;5訓HI，2|aL;SacI,2jxL;BSA，化L;10x緩衝液K，2jiL;ddH20,20nL)酶切3小時。質粒載體pRSETB用SawHI和&cI限制性內切酶進行雙酶切後再用瓊脂糖凝膠電泳回收pRSETB載體片段，按40|aL體系(pRSETB,6pL;SamHI，2piL;SacI，2pL;BSA,化L;10x緩衝液K,2pL;ddH20,24nL)酶切3小時。回收得到的帶粘性末端的目的基因片段1CCK和pRSETB酶切片段按20pL體系(1CCK,IO(aL;pRSETB,6.5nL;10xT4緩衝液，2pL;T4緩衝液，1.5pL)進行連接。16°C，連接過夜後，取lOfiL轉化DH5a感受態細胞。無菌條件下，在lOOuL的感受態細胞中加入10nL連接產物，混勻後冰浴30分鐘。然後42'C水浴熱擊90s，再迅速冰浴l-2分鐘。每管加400nLLB培養基，37'C復甦45分鐘。5000轉/分鐘離心6分鐘，棄上清400nL,剩餘懸液塗布至含lOO^g/mL氨苄青黴素的LB瓊脂平板上，37'C培養12-16小時。挑取平板上的單菌落於3mL(含100嗎/mL氨苄青黴素)LB液體培養基中，37°C300轉/分鐘振搖培養過夜。取lpL菌液進行PCR檢測。將PCR檢測為陽性的重組大腸桿菌送北京奧科生物技術有限責任公司測序，對測序正確的陽性克隆子，被命名為pRSET-lCCK，提取陽性克隆pRSET-lCCK質粒，-20°0保存備用。(4)CCK-33二串聯體重組質粒的構建用引物對C以重組質粒pRSET-lCCK為模板，PCR擴增(94°C，4分鐘；94°C，30秒；54'C，30秒；72'C，35秒；35個循環；72°C,IO分鐘)、PCR產物純化後得到的基因片段，命名為BH1CCK,BH1CCK與前述的1CCK不同，其序列片段更長，其中含有5awHl和/^"dlII酶切位點。用SamHI和歷mlin內切酶雙酶切BH1CCK後再用瓊脂糖凝膠電泳回收得到BH1CCK小片段，按40nL體系(BH1CCK,IOmL;5awHI,2pL;歷"dIII,2pL;BSA,化L;10x緩衝液K,2pL;ddH20,20^L)進行酶切3小時。用Sg/II和歷^in限制性內切酶雙酶切pRSET-〗CCK後，瓊脂糖凝膠電泳回收含pRSET-lCCK基因的大片段序列，按40jiL體系(pRSET-lCCK,6pL;2^L;M"dIII,2jxL;BSA，化L;10x緩衝液K，2pL;ddH20,24^L)進行酶切3小時。利用5a肌Hl和5g/II是一對同尾酶的原理，將BH1CCK酶切後回收得到的BH1CCK小片段和pRSET-lCCK基因大片段在T4連接酶的作用下連接過夜，按20nL體系(BHCCK，lOpL;pRSET-lCCK大片段，6.5pL;10xT4緩衝液,2pL;T4緩衝液，1.5pL)進行連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，將PCR檢測為陽性的重組大腸桿菌測序，對測序正確的陽性克隆子，被命名pRSET-2CCK,提取陽性克隆pRSET-2CCK質粒，.2(TC保存備用。(5)CCK-33三串聯體重組質粒的構建用引物對B以pUC57-CCK33質粒為模板，經PCR擴增、PCR產物純化後得到得到帶終止密碼子的基因片段，命名為Z1CCK。對ZlCCK用SawHl和SacI雙酶切後、回收Z1CCK,再與pRSETB載體經S^"HI和Sacl雙酶切後，回收pRSETB大片段進行連接，連接產物經轉化、檢測、測序，最後獲得pRSET-ZlCCK陽性克隆。其構建方法與構建pRSET-lCCK方法相同。用引物對C以重組質粒pRSET-ZlCCK為模板，經PCR擴增(94°C，4分鐘；94°C,30秒；54°C,30秒；72°C,35秒；35個循環；72°C,IO分鐘)、PCR產物純化後得到帶終止密碼子的基因片段，命名為BHZ1CCK，BHZ1CCK序列中含有SamHI和州力dIII酶切位點。用5amHI和招"dIII內切酶雙酶切BHZ1CCK後瓊脂糖凝膠電泳回收BHZ1CCK片段，按體系(BHZ1CCK,10nL;AamHI，2|iL;歷'"dIII,2pL;BSA,化L;10x緩衝液K,2|iL;ddH20,20nL)進行酶切3小時。用Sg/II和歷"^III限制性內切酶雙酶切保存的陽性克隆質粒pRSET-2CCK後瓊脂塘凝膠電泳回收pRSET-2CCK大片段，按40|_iL體系(pRSET-2CCK，6|iL;2^L;7/Z"dl11,2pL;BSA,4pL;10x緩衝液K,2jiL;ddH20,24|jL)進行酶切3小時。將pRSET-2CCK回收大片段與BHZ1CCK回收片段連接，按20nL體系(BHZlCCK,lOpL;pRSET-2CCK大片段,6.5nL;10xT4緩衝液,2pL;T4緩衝液，1.5pL)進行連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5cx感受態細胞中，將PCR檢測為陽性的重組大腸桿菌送北京奧科生物技術有限責任公司測序，對測序正確的陽性克隆子，命名為pRSET-Z3CCK,提取陽性克隆pRSET-Z3CCK質粒，-2(TC保存備用。(6)CCK-33五串聯體重組質粒的構建將重組質粒pRSET-2CCK用5gZII和州wdIII限制性內切酶雙酶切後瓊脂糖凝膠電泳回收得到pRSET-2CCK大片段基因序列，按40|aL體系(pRSET-2CCK，6|iL;5g/II，2|JL;i//"dIII,2|iL;BSA,4pL;10x緩衝液K,2nL;ddH20,2化L)進行酶切3小時。用5a/nHI和ffindin限制性內切酶雙酶切pRSET-Z3CCK後，瓊脂糖凝膠電泳，回收小片段基因序列，命名為Z3CCK，按40|iL體系(pRSET-Z3CCK,6|iL;SawHi,2pL;殆VzdIII,2^L;BSA,4(jL;10x緩衝液K,2nL;ddH20,2化L)進行酶切3小時。將pRSET-2CCK酶切回收大片段與pRSET-Z3CCK酶切回收小片段Z3CCK連接，按20pL體系(pRSET-2CCK大片段，6.5^L;Z3CCK小片段，lOpL;10xT4緩衝液，2pL;T4緩衝液，1.5^)進行連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，將PCR檢測為陽性的重組大腸桿菌送北京奧科生物技術有限責任公司測序，對測序正確的陽性克隆子，命名為pRSET-Z5CCK,提取陽性克隆pRSET-Z5CCK質粒，-20匸保存備用。(7)CCK-33七串聯體重組質粒的構建用Bg/II和歷ndni限制性內切酶雙酶切pRSET-2CCK回收pRSET-2CCK大片段基因序列。用SawHI和州'"dlII限制性內切酶雙酶切pRSET-Z5CCK，回收的小片段基因序列，命名為Z5CCK，將pRSET-2CCK酶切回收大片段與酶切回收的Z5CCK小片段連接，按20nL體系(pRSET-2CCK大片段，6.5^iL;Z5CCK小片段，lOpL;10xT4緩衝液，2nL;T4緩衝液，1.5pL)進行連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，將PCR檢測為陽性的重組大腸桿菌送北京奧科生物技術有限責任公司測序，對測序正確的陽性克隆子，命名為pRSET-Z7CCK,提取陽性克隆pRSET-Z7CCK質粒，-20匸保存備用。(8)CCK-33九串聯體重組質粒的構建用5gni禾卩//!力cffll限制性內切酶雙酶切pRSET-2CCK回收pRSET-2CCK大片段基因序列。用5awHI和歷wdIII限制性內切酶雙酶切pRSET-Z7CCK,回收小片段基因序列，命名為Z7CCK，將pRSET-2CCK酶切回收大片段與Z7CCK酶切回收小片段連接，按20jiL體系(pRSET-2CCK大片段，6.5|aL;Z7CCK小片段，10|iL;10xT4緩衝液,2pL;T4緩衝液，1.5pL)進行連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，將PCR檢測為陽性的重組大腸桿菌送北京奧科生物技術有限責任公司測序，對測序正確的陽性克隆子，命名為pRSET-Z9CCK，提取陽性克隆pRSET-Z9CCK質粒，-20匸保存備用。用召amHl禾DffiKdIII限制性內切酶雙酶切CCK多串聯體重組質粒(pRSET-2CCK、pRSET-Z3CCK、pRSET國Z5CCK、pRSET-Z7CCK、pRSET-Z9CCK)，結果見圖3。本發明獲得的CCK-33九串聯體(命名為Z9CCK)重組質粒酶切產物經0.8%(質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳後，觀察到約1058bp與2845bp左右兩條帶(見圖3),表明重組質粒構建正確。將PCR檢測為陽性的pRSET-Z9CCK重組大腸桿菌測序，將測序結果與目的基因序列在NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上進行BLAST比對，結果顯示與預期一致，CCK九串聯體(Z9CCK)核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。實施例2:cck-33九串聯體(z9cck)重組蛋白的誘導表達及提取純化(見圖1①)1、試劑製備胰蛋白腖、酵母提取物、瓊脂粉、異丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、P-巰基乙醇、十二烷基肌氨酸鈉(SKL)、聚乙二醇4000(PEG4000)、氧化型穀胱甘肽、還原型穀胱甘肽均為上海生工生物工程有限公司的產品。2、緩衝液配製緩衝液A:50mol/LTris，0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉，50mol/LNaCl，5%(體積比)甘油，調節pH至8.0，使用時添加0.5mmol/L的二硫蘇糖醇。TE緩衝液(pH8.0):lOmmol/LTris.Cl,lmmol/L乙二胺四乙酸二鈉。磷酸鹽緩衝液(pH7.4):稱取8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04，0.24gKH2PO4,溶於800mLddH20中，調pH至7.2,定容至1000mL。3、Z9CCK重組蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測將重組質粒pRSET-Z9CCK轉化至大腸桿菌BL21(DE3)受體菌中，挑取單菌落接種到裝有3mLLB(含100嗎/mL氨苄青黴素)液體培養基的細菌瓶中，37'C振蕩培養10-14小時。將重組大腸桿菌BL21(DE3)/pRSTE-Z9CCK的培養物以1%(體積比)量分別接種到兩個裝有3mLLB(含100pg/mL氨苄青黴素)液體培養基的細菌瓶中。其中一個37'C振蕩培養7小時，作為未誘導的對照，另一個37'C振蕩培養3小時後開始誘導，添加IPTG至終濃度lmmol/L，繼續37'C振蕩培養4小時。結束後各取出500pL菌液於新的1.5mL離心管中，12000轉/分鐘離心30s。去上清，加入50pL樣品溶解液，用槍吹打均勻。100'C水浴5分鐘，12000轉/分鐘離心5分鐘，取10^上清進行SDS-PAGE檢測。4、Z9CCK重組蛋白可溶性分析將上述誘導表達的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK培養物以1%(體積比)量接種到一個裝有5mLLB(含100嗎/mL氨節青黴素)培養基的細菌瓶中，37'C振蕩培養8小時，4'C放置過夜。將菌液倒入裝有50mLLB(含100ng/mL氨苄青黴素)培養基的鹽水瓶中，在37'C誘導表達。將菌液轉入兩個50mL離心管中，4'C，8G00轉/分鐘離心5分鐘。棄上清，菌體用1/10(體積比)緩衝液A重懸，180w超聲波處理8次，間隔10s/次。4'C,12000轉/分鐘離心10分鐘，將上清轉入另一新的50mL離心管中，沉澱用等體積的緩衝液A重懸。從上清和沉澱中各取50^L加入等體積的樣品溶解液,處理好樣品進行SDS-PAGE檢測。5、Z9CCK重組蛋白的提取純化將200mL的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK培養物5000轉/分鐘離心10分鐘收集菌體，再將菌體重懸於20mL的緩衝液A中，並添加0.05%(質量體積比)的溶菌酶，37'C溫育15分鐘，然後進行超聲波破碎。超聲強度設為180W，冰浴超聲破碎10次左右，每次20秒-30秒，間隔2分鐘，直至溶液變為清亮為佳。將破碎後的混合液12000轉/分鐘離心10分鐘，去上清，磷酸鹽緩衝液緩衝液(pH7.4)洗滌沉澱3次，收集沉澱。，將上述收集的沉澱重懸於含0.3。/。SKL的緩沖液A中，充分振蕩混勻後室溫靜置30分鐘-2小時。將溶液分裝至透析袋內，加入終濃度為0.2%(質量體積比)的PEG4000與lmmol/L氧化型:還原型穀胱甘肽(摩爾比為:4)幫助變性的蛋白質復性即恢復天然構象，用大於20倍體積的TE緩衝液(pH8.0)進行4'C攪拌透析復性、純化，每4小時換液一次，換液6次後收集蛋白溶液，過濾除菌後分裝置-2(TC凍存。用SDS-PAGE檢測提純後的菌毛蛋白純度，Bradford法測定蛋白質濃度。IPTG誘導CCK多串聯體重組大腸桿菌BL21(DE3)/(pRSET-Z3CCK、pRSET-Z5CCK、pRSET-Z7CCK、pRSET-Z9CCK)表達，結果見圖4。將重組質粒pRSET-Z9CCK轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經IPTG誘導後，SDS-PAGE檢測發現，與在42.1kDa左右處出現一條明顯的蛋白帶，與預測的分子量大小一致，其表達量佔大腸桿菌菌體總蛋白的35.6%(見圖4)。申請人將該目的蛋白命名為Z9CCK重組蛋白。在本發明中，Z9CCK重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中主要以包涵體形式存在。本發明構建的Z9CCK重組蛋白的胺基酸序列如下(同時可見序列為SEQIDNO:2所示的胺基酸序列)顯示了Z9CCK重組蛋白的全部胺基酸序列，其中用下劃線表示的為豬CCK-33單體，斜體為連接兩個CCK-33單體的由5個胺基酸組成的連接肽)，共370個胺基酸。用下劃線表示的為已報導的豬CCK-33單體(GenBank，登錄號為NP—999402.1)，斜體為連接兩個CCK-33單體的連接肽。SGRVSMIKNLOSLDPSHRISDRDYMGWMDFZ9CCK重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中主要以包涵體的形式存在，包涵體經洗滌、變性、復性、透析之後可以得到比較純的Z9CCK重組蛋白，分子量大小為42.1kD,與預期一致，見圖5實施例3:Z9CCK重組蛋白的抗原性(見圖1②，③，，)1、Westernblot緩衝液配製電轉緩衝液稱取2.9g甘氨酸，5.8gTris，0.37gSDS，加200mL甲醇，最後定容至1000mL。Tris緩衝生理鹽水(TBS):在95mLddH20中加入1.21gTris鹼，8.77gNaCl，充分溶解，調pH至8.0後，定容至1000mL。TBST緩衝液含0.05%(體積比)Tween-20的TBS。封閉液含1。/。(體積比)牛血清白蛋白(BSA)的TBST。底物液9mL0.01mol/LTris-Cl(pH7.6)溶解6mg二氨基聯苯氨(DAB)，加入lmL0.3%(質量體積比)NiCl2或CoCl2，再加35|^30%(質量體積比)11202,8mLTBS，現配現用。2、Z9CCK重組蛋白抗原性預測(見圖l③)參照網址http:〃tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb一input上介紹的"BepipredLinearEpitopePrediction"預測方法，將Z9CCK重組蛋白胺基酸序列輸入B細胞線性表位預測欄裡，對Z9CCK重組蛋白進行抗原性預測。3、Westernblot檢測Z9CCK重組蛋白的免疫原性(見圖1)(1)電轉化將Z9CCK重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，當電泳將結束時，用蒸餾水淋洗石墨板，用吸水紙擦乾。戴上手套，切6張3MM濾紙和1張硝酸纖維素濾膜。濾紙和膜的大小要和凝膠的大小完全相等或略小於凝膠，否則濾紙邊緣的接觸會造成電流短路。將硝酸纖維素濾膜懸浮於去離子水表面，借毛細作用使膜從下往上潤溼後，將膜完全浸沒於水中，浸泡5分鐘以除去濾膜上殘留的氣泡，用軟鉛筆在濾膜一角做標記。另外，將6張濾紙浸泡於少量電轉緩衝液。戴上手套安裝轉移裝置，平放底部電極(陽極)，石墨一邊朝上，在這一電極上放置3張浸泡過的濾紙，準確對齊，趕盡氣泡，同樣方法將硝酸纖維素濾膜放在濾紙上，確保對齊無氣泡。從電泳槽上取下凝膠，轉移到去離子水中略為漂後，平放於硝酸纖維素濾膜上，凝膠左下角與濾膜標記對齊，同樣對齊並去除氣泡。最後再將另外3張濾紙放在凝膠上方，同樣確準精確對齊無氣泡。將靠上方的電極(陰極)放於夾層物上，石墨一邊朝下，接通電源，根據凝膠面積按0.65-1.0mA/cm2調整電流，電轉2小時左右。13(2)染色SDS-PAGE結束後，切下帶有分子量標準的凝膠直接進行染色脫色，作為分子量對照。電轉後的凝膠放入SDS-PAGE染色液中，染色4小時後置於脫色液中振蕩，每隔一段時間換一次脫色液，直至背景很淺為止，以此判斷電轉的效率。(3)封閉把硝酸纖維素濾膜放入可加熱封接的塑膠袋中，以濾膜面積0.1-0.15mL/cm2的量加入封閉液(含1%(質量體積比)BSA的TBST),儘可能排除氣泡後密閉袋口，平放於搖床上室溫(20°C-25'C，以下相同)溫育0.5-1小時，剪開塑膠袋，棄去封閉液。(4)第一抗體和靶蛋白結合把硝酸纖維素濾膜放入一新的塑膠袋中，按0.1-0.15mL/cn^的量加入用TBST以1:100稀釋的HisTag標籤抗體，排除氣泡後密閉袋口，平放於搖床上室溫溫育1小時。剪開塑膠袋口，將硝酸纖維素濾膜用TBST洗3遍，每次5-10分鐘。(5)酶標二抗與硝酸纖維素濾膜的溫育把硝酸纖維素濾膜放入一新的塑膠袋中，按0.1-0.15mL/cm2的量加入用TBST以1:2500稀釋的辣根過氧化物酶標記的二級抗體，排除氣泡後密閉袋口，平放於搖床上室溫溫育0.5-1小時。剪開塑膠袋口，將硝酸纖維素濾膜用TBST洗3遍，每次5-10分鐘。再用TBS洗2遍，每次5-10分鐘。(6)加入底物顯色把硝酸纖維素濾膜放入10mL底物液中，顯色1-15分鐘，一旦出現蛋白帶，立即用去離子水終止，即可觀察拍照。根據網上在線預測Z9CCK抗原性分析結果(見圖6)，本發明製備的Z9CCK重組蛋白在第48-56,67-77,86-94,105-115,124-132,143-153,162-170,181-191,200-208，219-229,238-246,257-267，276-284,295-305，314-322,333-343,352-360胺基酸序列處具有連續的線性抗原性表位。對於CCK-33單體分子來說，本身具有兩個表位(l-6:PKAPSGR;16-24:SLDPSHRIS),其中1-6的線性表位是和連接每兩個CCK-33單體的由5個胺基酸組成的linker—起組成的抗原表位。每增加一個CCK-33串聯體，就增加兩個抗原決定簇，Z9CCK具有由CCK分子多串聯體提供的18個連續線性抗原表位。另外，在第14-39胺基酸序列位置為與Z9CCK蛋白一起融合表達的蛋白提供的連續線性表位。由此說明Z9CCK重組蛋白經過抗原性預測證明其具有較好的免疫原性。以兔抗CCK-8陽性抗血清(美國sigma公司產品)為一抗，以山羊抗兔抗體(美國SBA公司產品)為二抗，對重組大腸桿菌BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK誘導表達後的全菌總蛋白產物進行Westernblot檢測(見圖7)，在重組大腸桿菌中檢測到大小約為42kD的陽性反應特異性條帶，無其它雜帶，表明BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK誘導表達的Z9CCK重組蛋白能被CCK-8抗體所識別，確證Z9CCK在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達，所表達產物即為本發明的目的蛋白(Z9CCK重組蛋白)。從而完成了用標準抗體來驗證Z9CCK重組蛋白的免疫原性。4、ELISA檢測驗證Z9CCK重組蛋白的抗原性(見圖1)用化學合成的CCK-8標準品作包被抗原，ELISA檢測Z9CCK重組蛋白主動免疫生長肥育豬產生的抗體滴度的結果見實施例4，此方法用標準抗原來檢測Z9CCK抗體，反過來驗證Z9CCK重組蛋白的抗原性。實施例4:利用Z9CCK重組蛋白主動免疫生長肥育豬，研究該重組蛋白對豬生長性能的影響(見圖l，⑧)1、試驗設計試驗於2007年11月到2008年1月在華中農業大學試驗豬場進行。選擇63日齡左右、平均體重22.8kg左右的"長新"二元雜交去勢公豬72頭，按體重日齡基本一致的原則隨機分為兩組，每組9個重複，每個重複4頭豬，共36頭/組，在同一棟豬舍進行試驗，試驗組免疫Z9CCK重組蛋白油乳苗，對照組免疫生理鹽水，飼養試驗為期70d。2、試驗日糧試驗日糧根據NRCU998)各階段豬營養需要配置。試驗組和對照組日糧完全相同，配方見表2。表2試驗日糧組成(％)tableseeoriginaldocumentpage15表2的說明1)預混料提供每千克日糧維生素A8400IU，維生素D31800IU，維生素E150mg,維生素K1.9mg;維生素B11.9mg,維生素B24.5mg，煙酸19mg，D-泛酸6mg,維生素B62.3mg，維生素B120.06mg，D-生物素0.08mg,葉酸9.4mg，鈣5.8g，磷3.4g，鈉0.8g，氯0.6g，銅15mg,鐵38mg，錳23mg,鋅60mg，碘0.6mg。2)預混料提供每千克日糧維生素A9700IU,維生素D32100IU,維生素E160mg，維生素K0.9mg;維生素B11.9mg，維生素824.50^，煙酸13mg,D陽泛酸4mg，維生素B62.0mg,維生素B120.03mg，D-生物素0.04mg，葉酸5.6mg，鈣5.4g，磷2.8g，鈉0.8g,氯0.6g，銅17mg，鐵43mg，錳23mg,鋅68mg，碘0.6mg。3)上述營養水平是計算值。3、飼餵管理飼養試驗期間，日餵豬2次，分別於早上8:00和下午4:00飼喂，每次以吃飽略剩料為限，試驗期間豬自由採食和飲水，豬舍保持清潔衛生及消毒。4、豬生長性能指標測定以欄為單位(4頭豬)記錄每次餵料量，並於第二天早上餵料前對前一天的剩餘料稱重。記錄每欄4頭豬的總體日採食量，日採食量=上午餵料量+下午餵料量-剩餘飼料量。以欄為單位計算每欄4頭豬的2周內的平均日採食量，為1個重複。每個重複的平均日釆食量-4頭豬2周的總採食量/4頭豬/14d;每2周對所有豬稱一次體重，每次對每個欄4頭豬隨機一頭一頭地稱，記錄每頭豬的體重，稱完一個欄的4頭豬後，再稱下一欄。以欄為單位，每欄為l個重複，計算每欄4頭豬的2周的平均日增重，平均日增重=每欄4頭豬2周的總增重/4頭豬/14d;料肉比以欄為單位，每欄為l個重複，料肉比=每欄4頭豬2周的總體採食量/每欄4頭豬2周的總增重。試驗組和對照組各9個重複統計。5、Z9CCK重組蛋白油乳苗的製備向提純後的Z9CCK重組蛋白溶液中加入吐溫-80(吐溫80終濃度為4%(體積比)，已經過121'C高壓滅菌30分鐘)，與等體積的白油佐劑(配製方法94mL白油，6mL司本-80，2g硬脂酸鋁，混合均勻後，12rC高壓滅菌30分鐘，冷卻至室溫備用)，充分混合後乳化製成濃度為50(Hig/mL的重組蛋白油乳苗。6、免疫程序及血液樣品採集分別於試驗期第一天進行初次免疫試驗豬，第29、57d兩次加強免疫。試驗組免疫Z9CCK重組蛋白疫苗，免疫劑量為2mL/頭/次，對照組用免疫2mL生理鹽水代替。試驗期間分別於試驗期第1、15、29、43、57、71d，試驗組、對照組各選取10頭豬前腔靜脈採血一次，3500轉/分鐘離心IO分鐘分離血清，-2(TC保存，用於測定血清中CCK抗體滴度。7、用CCK-8作包被抗原對血清中CCK抗體效價的測定抗原包被聚苯乙烯酶標板先經紫外線照射後，再將含有體積比為0.125%(體積比)戊二醛的磷酸鹽緩衝液(pH7.0)加入酶標板中，反應數小時，洗滌，乾燥，逐孔加入CCK-8溶液(10ng/mL,100nL/孔)，室溫放置過夜，洗滌液洗滌三次，用0.33mol/L的乙醇胺溶液封閉處理後，用洗滌液洗滌3次，再加入用保溫液按l:20稀釋後的待測血清，在37'C孵育2小時，洗滌3次，加入羊抗豬二抗(購自美國SBA公司)，37'C孵育30分鐘，洗滌後加入TMB底物溶液，37'C反應15分鐘左右，每孔加入50nL終止液，在酶標儀以450nm波長測定吸光值，從而確定血液中CCK抗體滴度。8、動態採血及血液指標測定留置針溫州華利醫療器械有限公司生產，產品型號為16G蝴蝶型，套管外徑1.6mm,套管長度51mrn，流量2140ml。飼養試驗結束後，對照組和試驗組各隨機選取體重一致的4頭豬，於限位欄裡單獨飼養。適應3天後，在8頭豬的耳靜脈中安裝留置針，分別於採食前O分鐘採血一次，給足詞料量，讓豬自由採食，再分別於給料後15分鐘、30分鐘、1小時、2小時各採血一次，每次釆血3mL,每次採完血液之後立即注入2%(質量體積比)的肝素鈉2mL,蓋好肝素帽。採集的血液裝在預先加入10%(質量體積比)乙二胺四乙酸二鈉和20nl抑肽酶(500KIU)的離心管中混勻，4'C，3500轉/分鐘離心10分鐘，分離血漿，-SO'C保存，用於測定血液中CCK、胰島素、血糖含量。9、CCK、胰島素和血糖含量的測定均用相關試劑盒測定。CC1^濃度測定用美國ADL公司生產的豬膽囊收縮素ELISA試劑盒分析，操作步驟按試劑盒上的說明書介紹的方法進行。胰島素濃度測定用北京科美東雅生物技術有限公司生產的放免試劑盒分析，操作步驟按試劑盒上的說明書介紹的方法進行。血糖濃度測定用上海名典生物工程有限公司生產的葡萄糖測定試劑盒分析，操作幾驟按試劑盒上的說明書介紹的方法進行。10、試驗結果分析平均日採食量、平均日增重、料肉比、血液中CCK、胰島素、血糖濃度等數據用歹土SD表示，採用SAS8.1統計分析軟體ttest程序進行T檢驗。(1)Z9CCK重組蛋白主動免疫對豬生長性能的影響1-4周，試驗組和對照組採食量和日增重都沒有顯著差異。5-6周，隨著試驗組豬體內CCK抗體的增加，試驗組採食量和日增重與對照組相比又提高的趨勢，分別比對照組提高了3.72%(/M).10)和5.89%(P=0.07)。7-8周試驗組豬體內存在大量CCK抗體，中和了部分內源性的CCK,CCK主動免疫調節動物食慾的效果逐漸明顯。試驗組採食量和日增重分別比對照組提高了5.02%(屍=0.31)和6.38%(屍=0.34)。9-10周試驗組採食量比對照組提高了7.22%(/>=0.09),日增重比對照組提高了3.80%,差異不顯著。全期試驗組採食量比對照組提高了2.23%(屍=0.23)，日增重比對照組提高了2.03%,差異不顯著(見表3)。由此表明Z9CCK重組蛋白主動免疫能提高生長肥育豬的採食量和日增重。表3豬Z9CCK重組蛋白主動免疫對生長肥育豬生長性能的影響tableseeoriginaldocumentpage17(2)Z9CCK主動免疫對生長豬血清中CCK抗體滴度的影響試驗期15d之後，在試驗組豬體內才有CCK抗體產生，此後抗體含量一直上升，試驗期第29d在豬體內可以明顯地檢測到CCK抗體，CCK抗體滴度與對照組相比差異顯著(屍<0.05)。第29d之後，豬體內CCK抗體繼續上升，並在試驗期第43d,CCK抗體滴度達到峰值，與對照組相比差異極顯著(戶O.Ol)。第43d之後，試驗組豬體內CCK抗體水平緩慢下降，但是，第57d、71d試驗組的CCK抗體水平與對照組相比差異仍極顯著(戶<0.01)(見圖8)。(3)Z9CCK主動免疫對豬部分血液生化指標的影響1)對血液中CCK含量的影響對照組採食前O分鐘血液中CCK含量比試驗組低，差異不顯著。隨著採食過程的進行和飽感的逐步產生，試驗組體內CCK含量可能受到CCK抗體的中和作用而降低，對照組採食後CCK升高，15分鐘試驗組血漿中CCK含量比對照組略低一些，差異不顯著。30分鐘時，試驗組血液中CCK比對照組低10.49%差異不顯著(屍=0.22)。1小時時，試驗組血液中CCK仍比對照組分別低4.73。/。(i^0.13)。2小時時，對照組血液中CCK達到峰值，試驗組比對照組低32.65%,差異不顯著(見圖9)。2)Z9CCK主動免疫對胰島素的影響採食前O分鐘時，試驗組和對照組豬都處於飢餓狀態，血液中胰島素沒有顯著差異。餵料後15分鐘，對照組體內胰島素含量上升，試驗組卻下降了一些，試驗組豬體內胰島素含量顯著低於對照組(戶<0.05)，比對照組低31.62%。採食後30分鐘，隨著豬採食飽感的增加，胰島素可能主要受食糜或血糖等其它因素的調節影響，試驗組和對照組體內胰島素都迅速增加，差異不顯著。1小時後，兩組豬都完成了採食，血液中胰島素含量達到頂峰，2小時後開始下降，兩者胰島素濃度差異不顯著(見圖IO)。3)Z9CCK主動免疫對血糖的影響採食前Omin時，試驗組和對照組豬都處於飢餓狀態，體內血糖含量都較低，採食15分鐘後，試驗組豬體內血糖有所上升，對照組上升不明顯，兩組血糖水平沒有顯著差異。釆食30分鐘後，兩組豬體內血糖進一步升高，直到1小時後，兩組豬都結束了採食，體內血糖水平達到頂峰，試驗組比對照血糖濃度高17.35%CP=0.19)。2小時後，兩組血糖濃度都有所下降，試驗組比對照組高10.81%(戶=0.23)(見圖11)。由血糖與胰島素濃度的測定結果可以看出，除了採食後15分鐘時，血糖濃度與胰島素濃度成反比，其它時間點試驗組和對照組相比，血糖濃度和胰島素濃度成正比，這可能是因為血液中胰島素濃度和血糖濃度主要受採食後食物的影響而都升高的原因。實施例5:以Z9CCK重組蛋白為免疫原製備卵黃抗體(見圖l⑦)1、緩衝液配製磷酸鹽緩衝液II:NaC18.0g，KH2PO40.2g，Na2HP04'12H202.9g,KC10.2g,溶於卯OmL蒸餾水中，lmol/LHCl調pH至7.4，用蒸餾水定容至1000mL,於121'C高壓滅菌15-20分鐘備用。磷酸鹽緩衝液III緩衝液NaC18.0g，KH2PO40.2g，Na2HP04'12H202.9g，KC1，0.2g，溶於400mL蒸餾水中，lmol/LHCl調pH至7.2,用蒸餾水定容至500mL，於121'C高壓滅菌15-20分鐘備用。包被液(0.05mol/L碳酸鹽緩衝液)NaHC032.93g;Na2C031.95g;溶於900mL蒸餾水中，10mol/LNaOH調pH至9.6，用蒸餾水定容至1000mL洗滌液(磷酸鹽緩衝液-T):含0.05%(體積比)吐溫-20的磷酸鹽緩衝液II保溫液(磷酸鹽緩沖液-BSA):含3%(質量體積比)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液II底物液鄰苯二胺40mg，溶於100mLpH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩衝液(0.2mol/LNa2HP0451.4mL，0.1mol/L檸檬酸48.6mL，蒸餾水100mL混勻即可)，再加入30%(質量體積比)H2020.15mL即可，現配現用。終止液2mol/LH2S04溶液(濃硫酸22.2mL，蒸餾水177.8mL，混勻即可)，2、Z9CCK重組蛋白油乳苗的製備向提純後的Z9CCK重組蛋白溶液中加入吐溫-80(吐溫80終濃度為4%(體積比)，已經過121'C高壓滅菌30分鐘)，與等體積的白油佐劑(配製方法94mL白油，6mL司本-80，2g硬脂酸鋁，混合均勻後，12rC高壓滅菌30分鐘，冷卻至室溫備用)，充分混合後乳化製成濃度為50(Hig/mL的重組蛋白油乳苗。3、蛋雞的免疫選擇950隻28周齡左右高產海蘭褐蛋雞隨機分為兩組，空白組200隻，試驗組Z9CCK組750隻、對照組每隻雞分別胸肌注射lmL(兩側各500nL)生理鹽水；試驗組Z9CCK則胸肌注射lmL濃度為500呢/mL重組蛋白與白油佐劑等體積混合的油乳苗。首免2周後，各組分別用與白油佐劑等體積混合的500pg/mL抗原加強免疫1次；間隔2周再採用同樣方式進行第三次免疫。2免後每周各組均採集30枚雞蛋樣品，ELISA監測卵黃抗體效價的變化。4、CCK卵黃抗體全蛋粉的製備當ELISA方法(見下描述)監測經Z9CCK重組蛋白油乳苗主動免疫的產蛋雞雞蛋中CCK卵黃抗體效價達到高峰後開始收集雞蛋500kg，按照程學慧(2003)的方法進行噴霧乾燥(14CrC進氣，65'C出氣)加工成全蛋粉。分別採取噴霧乾燥加工過程中卵黃粉出來的前、中、後不同時期的樣品，檢測卵黃粉中CCK抗體效價。收集對照組免疫生理鹽水的產蛋雞產下的雞蛋500kg，按照程學慧(2003)的方法進行噴霧乾燥(140'C進氣，65'C出氣)加工成全蛋粉，作為實施例6中對照組母豬日糧添加用。5、間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗體效價(1)卵黃樣品的處理雞蛋處理雞蛋打破後，除去卵白和卵黃膜，取lmL卵黃液，用lmL磷酸緩衝液m混合，再加入4mL氯仿，室溫放置l小時，然後以3000xg離心20min，取上清用磷酸緩衝液III稀釋20倍，-20°0保存待測。卵黃抗體全蛋粉的處理取lg卵黃粉，用4mL磷酸緩沖液HI混合，再加入8mL氯仿，室溫放置1小時，然後3000xg離心20min,取上清用磷酸緩衝液III稀釋20倍，-20'C保存待測。〔2)卵黃抗體效價的測定用方陣滴定法(吳仁蔚等，2006)確定最佳Z9CCK重組蛋白抗原包被量與抗體稀釋度。取酶標板(8x12孔)，橫排將抗原從l:20倍比稀釋到1:2560,豎排將抗體從l:20倍比稀釋至1:640,進行ELISA試驗。整個實驗重複三次，綜合三次試驗結果，以OD42Q值大幅度降低時抗原稀釋度的前一稀釋度對應的蛋白含量為最佳抗原包被濃度，以最佳抗原包被濃度下陽性抗體OD45。值大幅度降低時血清稀釋度的前一稀釋度對應的為抗體最佳稀釋度。用lOO^L最佳包被濃度的包被抗原溶液包被96孔聚乙烯板，4'C過夜(18小時-24小時)，棄去，用洗滌液沖洗3次，每次3min，棄去，然後用150pL的保溫液37'C溫育1小時，棄去，如前洗滌3次，每孔加入100nL待測抗體(l:10、1:20.......用磷酸緩衝液II稀釋)37'C溫育1小時，棄去，如前洗漆5次，每孔加入100nL辣根過氧化物酶標記的酶標二抗稀釋液(l:15000,洗滌液稀釋)，25'C包被30min，棄去，如前洗滌5次，最後每孔加入100nL底物液，顯色後用50|_iL終止液終止反應，酶標儀檢測OD45o值。樣品OD450值與陰性值之比大於2.1判為陽性，並以出現陽性反應的最高稀釋度為抗體滴度(效價)。2免1周後開始收集雞蛋，每周隨機從試驗組750隻蛋雞的產蛋中收集雞蛋30枚，雞蛋樣品處理後，用提純的Z9CCK重組蛋白作為包被抗原，間接ELISA方法檢測2免1,3,5,7,11，15,22周雞蛋中卵黃抗體的效價。用CCK-8(購自Sigma公司)和牛血清白蛋白交聯物作包被抗原，隨機選取2免15周的24個雞蛋樣品，檢測CCK抗體效價。分別採取噴霧乾燥加工過程中卵黃粉出來的前、中、後不同時期的樣品，共12個，用提純的Z9CCK重組蛋白作為包被抗原，間接ELISA方法檢測抗體效價。從12個樣品中隨機選取3個卵黃粉樣品，用CCK-8和BSA交聯物作包被抗原，檢測卵黃中CCK抗體效價。通過蛋雞免疫試驗證明Z9CCK重組蛋白具有免疫原性，能夠引起蛋雞免疫應答反應，並可以誘導產生抗CCK8特異性卵黃抗體。在首免後第3周，CCK卵黃抗體的平均效價已達到103以上，2免後第5周，也即是3免後1周，CCK抗體水平達到高峰，此後開々臺出現緩慢下降的趨勢。CCK卵黃抗體全蛋粉的平均效價為22627.42(見表4和,12)。_表4復性Z9CCK包涵體導產生的卵黃抗體平均效價抗原2免後時間(周)1357111522Z9CCK2827.454787.4673516.6932000.0017148.3816387.038900.25_±2.09_±2.09_±1.70_±2.34_±2.82_41.70_±1.95用未硫酸化的化學合成的CCK-8與BSA交聯物作包被抗原，ELISA抽樣檢測2免15周CCK抗體效價為3591.88。2免5周之後開始收集雞蛋500kg進行噴霧乾燥，對噴霧乾燥全蛋粉抽樣進行ELISA效價測定(用提純的Z9CCK重組蛋白作包被抗原)，結果表明CCK卵黃抗體全蛋粉的平均效價為22627.42。用CCK-8與BSA交聯物作包被抗原，ELISA抽樣檢測卵黃粉中CCK抗體效價為2000.00。實施例6:CCK卵黃抗體在泌乳期母豬日糧中的應用(見圖l,⑦)1、試驗動物及分組本試驗於2007年9月-10月在武漢中糧公司江夏豬場進行。選取52頭妊娠後期健康經產母豬(3-6胎)，按胎次、體況、體重、往胎產仔數和預產期相近的原則，隨機分成2組，每組26個重複欄，每欄一頭母豬。2、試驗設計與日糧配方試驗採用單因素設計，泌乳期21天。基礎日糧根據美國NRC(1998)豬飼養標準母豬泌乳期營養需要配製玉米-豆粕型日糧。試驗中，處理組和對照組分別在基礎飼糧中添加1X的豬CCK-33多串聯體卵黃抗體全蛋粉和1%的對照全蛋粉，日糧配方和營養水平見表5。3、飼養管理試驗母豬於妊娠期第110天統一稱重、消毒後轉入分娩舍內。母豬每日8:00和16:00各餵料一次，分娩後的前三天適當限制飼養，根據食慾分別飼餵2.0kg、2.5kg、3.0kg左右；第四天起自由釆食(以次日料槽內略有剩料為準)；仔豬從出生後的第7d開始自由採食代乳料，母豬和仔豬均採用鴨嘴式飲水器自由飲水。觀察並記錄母豬乳房炎、便秘和哺乳仔豬的疾病情況並及時治療。其他飼養管理和免疫程序均按規模化豬場統一執行。4、測定指標(1)母豬稱重及體況評分母豬進入分娩舍及斷奶時統一對每頭母豬分別稱重，計算泌乳期失重；觀察並評判記錄母豬體況評分，計算母豬泌乳期體況評分之差。評分採用5分制，其標準為5分為過肥；4分為偏肥；3分為膘情適中；2分為偏瘦；l分為過瘦。(2)母豬生產性能與仔豬生長性能分娩之初，根據母豬產活仔數和乳房情況調整母豬帶仔數，使其在11頭左右。記錄每頭母豬的帶仔數、所帶仔豬個體重、斷奶仔豬數、斷奶仔豬個體重、哺乳日齡、斷奶時間和斷奶後母豬首次發情時間。計算母豬的帶仔窩重、帶仔均重、斷奶窩重、斷奶仔豬個體均重、泌乳期仔豬平均日增重、仔豬斷奶育成率(斷奶仔豬數/帶仔數)、和發情間隔。(3)母豬採食量記錄每頭母豬每日採食量，按周分別統計每頭母豬的平均日採食量和哺乳全期平均日採食量。表5泌乳期日糧組成與營養水平(風乾基礎)tableseeoriginaldocumentpage21表5的說明:1)泌乳期每千克全價料含銅21mg,碘0.84mg，鐵119mg，錳56mg，硒0.3mg,鋅140mg，維生素A18000IU，維生素D3000IU,維生素E40IU，維生素K6mg，維生素B12.5mg，維生素B29mg,維生素B64.5mg，維生素B120.0315mg，生物素0.6mg,葉酸5mg,煙酸50mg。2)營養水平數據為計算值。5、統計分析所有試驗數據均採用SAS8.0軟體進行統計分析，處理間的差異採用t檢驗，百分數數據採用卡方檢驗。除百分數以外，所有數據均以平均數i標準差表示，PO.01為差異極顯著，PO.05為差異顯著。試驗過程中，處理組中1頭母豬產後無乳，1頭母豬不吃粉料，1頭母豬多次連續高燒，淘汰後剩下23頭；對照組中l頭母豬早產，l頭母豬臨產前後高燒、不採食而淘汰後，剩下24頭。共剩下47頭母豬參與統計分析。(1)日糧中添加CCK卵黃抗體對母豬採食量的影響試驗中添加1XCCK卵黃抗體粉的處理組與對照組相比，母豬的平均日釆食量在泌乳期的第一周和第二周分別提高5.卯％、4.74%，但均差異不顯著(P>0.05):第三周和整個泌乳期，處理組採食量分別提高7,63%、7.00%,且均差異顯著(PO.05)(見表6)。表6母豬泌乳期各階段平均採食量項目對照組處理組P值1-7天3.99±0.764.22±0.550.22968-14天6.20±1.066.49士0.850.299515-21天6.05±0.816.51±0.690.04121-21天5.41±0.735.79±0.520.0466(2)日糧中添加CCK卵黃抗體對母豬生產性能的影響與對照組相比，添加1%CCK卵黃抗體粉的處理組母豬泌乳期失重、體況評分損失分別降低了10.14%和27.76%，但均差異不顯著(P>0.05);母豬發情間隔處理組要比對照組延長0.22天,但差異不顯著(P>0.05)(見表7)表7CCK卵黃抗體對母豬體重、體況和發情間隔的影響項目對照組處理組P值母豬初始重1)257.22±31.39257.06±22.910.9693母豬斷奶重247.04±28.55247.9]±26.960.8768母豬體重變化-10.18±14.67-9,15±12.320.7956入試時體況評分3.42±0.883.26±0.860.5437斷奶時體況評分2.88±0.612.87±0.630.9761泌乳期吋體況評分之差-0.54±0.66-0.39士0.720.4592發情間隔(天)4.76±0.834.98±0.730.3500表7的說明1)母豬初始重=母豬入試重一胎衣重一所產仔豬重(活仔、死胎和木乃伊)。(3)日糧中添加CCK卵黃抗體對仔豬生長性能的影響與對照組相比，添加1XCCK卵黃抗體粉的處理組仔豬21日齡平均日增重、21日齡斷奶仔豬均重分別提高了1.82%和1.37%,差異不顯著(PX).05);處理組仔豬21日齡窩增重、21日齡斷奶窩重分別比照組提高了6.58%(P>0.05)和5.96%(P>0.05)，；仔豬斷奶育成率，處理組較對照組提高1.44%(P>0.05)(見表8)。試驗中，仔豬斷奶窩重提高了3.63kg，窩斷奶仔豬數提高了0.51頭，表明添加CCK卵黃抗體有利於母豬生產性能的發揮。表8日糧中添加CCK卵黃抗體對仔豬生長性能的影響項目對照組處理組P值母豬帶仔數11.29±1.0411.65±1.110.2573帶仔窩重(kg)16.38±2.7417.08±2.84.-0.3959帶仔均重(kg)1.47±0.351.47±0.330.9064斷奶仔豬數10.71±1.3011.22±1.170.1654斷奶窩重l)(kg)62.61±8.1566.34±8.210.1251斷奶均重l)(kg)5.85±1.485.93±1.280.4915平均日增重(g)208.61±62.32212.41±53.810.4595窩增重(kg)46.23±6.7349.27±7.500.1513斷奶育成率(％)94.8396.270.4399表8的說明1)斷奶日齡調整為21d後的數據。SEQUENCELISTING<110〉<130〉<170〉<211〉〈213〉<220〉<221〉tgMetgatAspaaaLystatTyr60ggtGlycgtArggatAsptctSeratgMet140atgMetgetAlagacAsp肌cAsn45￡ltgMetcgtArgattlieccgProctgLeu125g￡ltAsplieageSerga>tAsp30ctgLeuatgMet15犯g匕yscagGinactThrgatAsptctSerggttgga_tgGlyTrpMetgtgValtctSeraaaLys110gacAsptctSergstAsp95getAlaccgProatgMet80cgtArgccgProtctSertttggagetPheGlyAlaaaaaacctgLysAsnLeu4896144192240288336384432■23145cagtctGinSerctgLeutggatggatTrpMetAsptctatgSerMetgatcgtAspArg210attlie195gatAspg￡LCAsptttPhe180a犯LysccgPro165g印Glyaa_cAsn150tctSercatHiscgtArggetcgagatAlaArgAsptata_tgTyrMetctg3LeuggtGlycagGintggTrp215tctSer200已tgMetattlieccgPro185ctgLeugatAsptctSer170aaa匕ysgacAspUtPhe155gatAspgetAlaccgProggaGlycgtArgccgProtctSergetAla220gattstAspTyrtctSercatHis205cgaArgggtGly190cgtArgAspatgMet175cgtArg160ggtGlygtgValatttctlieSerccg犯3ProLys528576624672getccgAlaPro225ccgtctProSerggagetGlyAlaaacctgAsnLeuatgggtMetGly290cgtgtgArgValatttctlieSerccg犯3ProLysctggacLeuAspgattttAspPhe370tctSercatHiscgaC3gGin275tggTrpggtGlycgtArggatAsp260tctSeratgMetgetAlaccgPro355ccgPro340tctSercgtArgattlie245ccgProgtgVal230tctSer犯a匕ysctggscLeuAspgattttAspPhetctatgSerMetgatcgtAspArgattliegatAsp325tctSercatHisLys310tatTyrggtGlycgtArgtctSergatAspgetAlaccgProggaGly295a_acAsnatgMetcgtArgattlieatgMetcgtArgccgProtctSer280getAlactgLeuggtGlygtgValtctSer360liegatAsptctSer265catHis犯aLystatTyr250ggtGlycgtArgAsn235atgMetcgtArgattliecgagatccgArgAspProcagGintggTrptctSer345gatAsptctSeratgMet3303tgMetcgtctgLeu315gfitAspattliegatAspctgLeuggtGlygtgValtctSeraaaLys300gacAspcagGintggTrptctSergatAsp285getAlaccgProtctSeratgMetatgMet270cgtLystatTyrAsnatgMet365ctgLeug￡LtAsp255attliegatAspgacAsp240tttPhea肌LystatTyrccgtctggtProSerGlytttggaPheGlytctSergetAlactgLeu350ggtGlycatHiscgaArg335cagGintggTrpcgtArg320gatAsptctSeratgMet72076881686491296010081056110411102<211〉370<212〉PRT<213〉豬膽囊收縮素-33(CCK-33)2SerHisHisHisHisMetArg1GlyGlyProLysLeuAsp50AspPhe65lieLysAspTyrSerGlyHisArg130ArgAsp145GinSerTrpMetSerMetAspArg210AlaPro225ProSerGlyAlaAsnLeuMetGly290ArgValGlyGinAla35ProGlyAsnMetArg115lieProLeuAsplie195AspSerHisArgGin275TrpSerGin20ProSerAlaLeuGly100ValSerLysAspPhe180LysTyrGlyArgAsp260SerMetMet5MetSerHisArgGin85TrpSerAspAlaPro165GlyAsnMetArglie245ProLeuAsplieGlyGlyArgAsp70SerMetMetArgPro150SerAlaLeuGlyVal230SerLysAspPheLysArgArglie55ProLeuAsplieAsp135SerHisArgGinTrp215SerAspAlaProGly295AsnAspVal40SerLysAspPheLys120TyrGlyArgAspSer200MetMetArgProSer280AlaLeu九串聯體(Z9CCK)HisHisGlyMetAlaAspAsplieLysAspLeu25SerHis10TyrAspAlaProGly105AsnMetArgliePro185LeuAsplieAspSer265HisArgGinMetArgProSer90AlaLeuGlyValSer170LysAspPheLysTyr250GlyArgAspSerSer75HisArgGinTrpSer155AspAlaProGlyAsn235MetArglieProLeuTyr60GlyArgAspSerMet140MetArgProSerAla220LeuGlyValSerLys300AspAspAsn45MetArglieProLeu125AsplieAspSerHis205ArgGinTrpSerAsp285AlaProSerMetThr15AspLysAsp30LeuGinSerGlyTrpMetValSerMet80SerAspArg95LysAlaPro110AspProSerPheGlyAlaLysAsnLeu160TyrMetGly175GlyArgVal190ArglieSerAspProLysSerLeuAsp240MetAspPhe255MetlieLys270ArgAspTyrProSerGlySerHisArg305310315320lieSerAspArgAspTyrMetGlyTrpMetAspPheGlyAlaArgAsp325330335ProLysAlaProSerGlyArgValSerMetlieLysAsnLeuGinSer340345350LeuAspProSerHisArglieSerAspArgAspTyrMetGlyTrpMet355360365AspPhe370權利要求1、一種分離的重組蛋白，其序列為SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2、一種表達Z9CCK重組蛋白的大腸桿菌五^/^n'c/n'aco/z'BL21(DE3)/pRSET-Z9CCK，含有權利要求1所述的核苷酸序列，CCTCCNO:M208103。3、一種分離的重組蛋白，其序列為SEQIDNO:2所示的胺基酸序列。4、權利要求2所述的重組大腸桿菌在製備卵黃抗體製品中的應用。5、權利要求3所述的重組蛋白在製備卵黃抗體製品中的應用。全文摘要本發明公開了一種包含Z9CCK蛋白的重組大腸桿菌及卵黃抗體與應用，一種經大腸桿菌偏愛密碼子優化後的豬膽囊收縮素-33(CCK-33)基因多串聯體重組質粒的構建，豬CCK-33多串聯體重組蛋白在大腸桿菌中的表達，Z9CCK(豬CCK-33九串聯體)重組蛋白的純化及其在製備卵黃抗體製品中的應用。利用多串聯體構建技術等基因工程技術構建了重組質粒pRSET-Z9CCK，將所述的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，誘導重組大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)/pRSET-Z9CCK表達Z9CCK蛋白，從3個方面驗證了Z9CCK重組蛋白具有良好的抗原性。利用所述的Z9CCK重組蛋白主動免疫生長肥育豬，研究了其對豬生長性能及部分血液生化指標的影響；利用所述的Z9CCK重組蛋白主動免疫產蛋雞，製備了CCK卵黃抗體全蛋粉，利用所述的CCK卵黃抗體提高哺乳期母豬的採食量、仔豬的生長性能。文檔編號C12N1/21GK101307104SQ200810048379公開日2008年11月19日申請日期2008年7月11日優先權日2008年7月11日發明者健彭,羅何峰,苟鍾勇,蔣思文申請人:華中農業大學