與雞產蛋量相關的mhcb－lb基因pcr－rflp標記的製作方法

2023-05-31 14:07:06 2

專利名稱：與雞產蛋量相關的mhc b－lb基因pcr－rflp標記的製作方法
技術領域：
本發明屬於動物基因工程技術領域，具體地說，涉及利用雞MHC B-LB基因的PCR-RFLP多態性與雞的產蛋量相關聯性能進行檢測的方法，本發明還涉及到與雞的產蛋性相關聯的DNA序列以及應用該關聯基因製備的檢測診斷試劑盒。
背景技術：
近年來，國內外學者對雞遺傳標記與生產性能的關係進行了大量的研究。合適的遺傳標記對於開展標記輔助選擇，實行早期選種，提高選種準確性和選育效率以及加速遺傳進展具有特別重要的意義。
產蛋量既是雞的最重要生產性狀之一，又是衡量其繁殖力的重要指標。國內外的許多新培育品種或品系，通過常規育種方法(如個體選擇和家系選擇等)，在產蛋量性狀上均得到了大幅度選育提高。但由於雞的產蛋量遺傳力很低，只有0.09～0.27(Besbes，B等，用簡化的多性狀動物模型最大似然法對蛋雞產蛋性能遺傳參數的估計.InProceedings 42ndAnnual Meeting European Association of Animal Production，Session IV，Berlin，Germany.Page 1-9.，1991)，表型選擇的遺傳改進效果緩慢，常常會造成大量人力，物力和財力消耗。此成為制約家禽育種工作開展的主要影響因素之一，並一直受到動物遺傳育種工作者和研究者們的關注。隨著分子生物技術的應用研究和發展，分子標記輔助選擇(Marker assisted selection，MAS)在動物遺傳育中的應用為顯著地改良如雞的產蛋量這類遺傳力較低的生產性狀提供了新途徑。但要有效地利用分子標記輔助選擇，必須對與雞的產蛋性狀相關的等位基因等進行研究。近幾十年來，人們對此主要從如下兩方面進行了大量研究。
一、關於血液蛋白多態性(等位酶)，即生化標記鹼性磷酸酶(AKP)的多態性發現得較早。1965年Law和Munro發現AKP的變異型(Law，G.R.J.et al.1965.Science，1491518)。AKP是一個位點上具有顯隱性關係的一對等位基因(Ap2、Ap4)控制。Wilcox(1966)完成了分型工作，並將AKP分為移動快的(F)和慢的(S)兩種帶型(Wilcox，F.H.1966.genetics，53799-805)。Shukla(1982)報導了白來航雞AKP快慢兩型間產蛋率無差異，AKP活力與產蛋率相關為-0.34(Shukla，R.K.1982，白來航雞血清鹼性磷酸酶水平及其與某些經濟性狀相關的研究.2ndworldcongression on genetics applied to livestock production，813-818)。孫憲如等(1989)認為，快型(F)雞產蛋力強於慢型雞(孫憲如等，雞血清鹼性磷酸酶變化規律的研究，獸醫大學學報，1989，9(3)237-241)。吳偉(1991)指出，快型(F)和慢型(S)表型個體在生產能力方面具顯著差異(吳偉，鹼性磷酸酶同功酶與產蛋性能的關係，中國畜牧雜誌，1991，27(1)15-17)。
周勤等曾報導武定雞農大I系血液蛋白多態性與生產性能之間存在著一定的相關效應，雞血液Akp-1s、酯酶Es-1cc、澱粉酶Amy-1AB對產蛋性能可能有促進作用(周勤等，武定雞農大I系血液蛋白多態性與生產性能關係的研究，雲南農業大學學報，2002，17(1)33-38)。
儘管大量研究報導已表明，雞血液蛋白多態性(等位酶)與其產蛋性能有著密切的相關，但由於缺乏大樣本重複印證等原因，迄今，血液蛋白多態性(等位酶)作為一種重要的生化遺傳標記能具體應用於家禽育種選育實踐者實屬少見。
二、關於DNA分子標記分子標記指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特徵的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。與上述生化標記相比較，DNA分子標記具有許多明顯的優越性，表現為(1)直接以DNA的形式表現，在生物體的各個組織、各個發育階段均可檢測到，不受性別和時空限制，不存在表達與否等問題；(2)數量豐富，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；(3)多態性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創造；(4)表現為共顯性標記特點，可以區別純合子和雜合子；(5)表現為中性，不影響目標性狀的表達；(6)可以解釋家系內某些個體的遺傳變異。
分子標記大多以電泳譜帶的形式表現，大致可分為三大類。第一類是以分子雜交為核心的分子標記技術，包括限制性片段長度多態性標記(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、DNA指紋技術(DNA Fingerprinting)、原位雜交(in situ hybridization)等；第二類是以聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)為核心的分子標記技術，包括隨機擴增多態性DNA標記(Randomamplification polymorphism DNA，RAPD)、簡單序列重複標記(Simple sequence repeat，SSR)或簡單序列長度多態性(Simple sequence length polymorphism，SSLP)，也稱微衛星(Microsatellite)，擴增片段長度多態性標記(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、序列示蹤位點(Sequencetagged sites，STS)、序列特徵化擴增區域(Sequence charactered amplified region，SCAR)等；第三類是一些新型的分子標記，如單核苷酸多態性(Single nuleotide polymorphism，SNP)、表達序列標籤(Expressed sequences tags，EST)等，有些分子標記已被廣泛用於畜禽標記輔助選擇等方面。本發明是以雞MHC為其產蛋性狀的侯選基因進行研究的。
雞主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex，MHC)，又稱B複合體，位於雞的第16號染色體上，是由緊密連鎖的高度多態的基因位點所組成的染色體上的一個遺傳區域，它包括I類(B-F)，II類(B-LB)和IV類(B-G)基因，與核仁組織區(NOR)相連鎖，具有高度的多態性和保守性(Pink，J.等，雞主要組織相容性複合體的三位點模式.Immungenetics.5203-216，1977.；Briles，W等，抗惡性腫瘤基因在主要組織相容性複合體(B)亞區的定位.Science.219977-979，1983.；Guillemot，F.等，雞主要組織相容性複合體II類β基因家族與I類基因和核仁組織區緊密連鎖的分子圖譜.EMBO Journal.72775-2785。1988)。早期對雞MHC的研究，是從雞的B血型系統開始的，通過血型標記把雞的B血型系統分為39類血型因子，如B2、B13、B15、B19和B21等，廣泛探討了不同血型因子與免疫特性和生產性能間的關係。Nordskog等(1973)認為B2、B21型產蛋率和成活率最高，B1型的較差(Nordskg，A等，自來航雞B血型系統對成年雞死亡率和產蛋量的影響.Genetics，75181-189，1973)。後來，英國利用MHC B血型系統進行定向選育，培育出了具有B7血型因子繁殖力強的D系，具有B2、B14因子產蛋率高的M系。
對雞MHC的大量研究表明，MHC不僅與雞的抗病性和免疫應答有關，與雞的生產性能也密切關聯(Briles，W.等，雞主要組織相容性複合體B在抗病性和易感性等位基因上的效應.Science.195193-195，1977.；Lamont，S.等與雞飼料轉化率和產蛋性能相關的主要組織相容性複合體不同基因頻率.Poul.Sci.66819-8241，987.；Abplanal，H.等，主要組織相容性複合體不同單倍型純系白來航雞的繁殖性能.Poul.Sci.719-17，1992.)。Lamont(1996)、Lakshmana(1997)和Lgesias(2003)等以白來航雞和肉雞為實驗材料，用單核苷酸鏈構象多態性標記(single-strand conformation polymorphism，SSCP)和限制性片段長度多態性標記(RFLP)方法對MHC(B-F、B-L和B-G)進行了遺傳分型研究，並認為某些特定的基因型與雞的產蛋性能相關(Lamont，S.等，與家禽數量性狀相連鎖的遺傳標記.Anim.Genet.271-8，1996.；Lakshmana，L.等，雞馬立克氏病高抗性和高產蛋品系主要組織相容性複合體II類基因的多態性研究.Poul.Sci.761517-1523，1997.；Lglesias，G.等，考姆波羅斯(Comperos)肉雞主要組織相容性複合體(B和Rfp-Y)的遺傳變異.Animal Genetics.3488-95，2003)。
國內也有類似報導，以PCR-RFLP方法，用四種內切酶(HhaI、EcoRV、HaeIII、XbaI)對已知報導(Rima Zoorob等，雞主要組織相容性複合體II類B基因(相連鎖的等位基因和基因座)序列變異分析.Eur.J.Immunal，1993，231139-1145)的白來航雞B12單倍型的主要組織相容性複合體B-LIIB序列進行分析來實現對絲羽烏骨雞MHC的分型，結果表明，雞MHC與其產蛋性能相關(歐陽建華等，中國泰和烏骨雞MHC與其繁殖性能相關和研究，江西農業大學學報，2000，22(1)98-101)。
但目前國內外對與雞產蛋量相關的MHC B-LB基因PCR-RFLP標記的研究和應用上還是空白。

發明內容
本發明的目的在於尋找一種與雞產蛋量相關的MHC B-LB基因PCR-RFLP標記方法，即，在體外檢測MHC B-LB基因中限制性內切酶BsuR I PCR-RFLP(BPR)等位基因的存在。擴增、克隆雞MHC B-LB基因第2外顯子和內含子的特定片段(如序列表SEQ ID NO3所示)，並對該基因片段進行限制性酶切，尋找其PCR-RFLP多態性及其與雞產蛋量的相關。應用PCR-RFLP的方法檢測雞MHC B-LB基因的多態性，並根據其基因型，初步判斷雞的產蛋量。為雞產蛋性狀的分子標記輔助選擇提供了一個新的遺傳標記。同時本發明的目的還在於在體外檢測診斷與雞產蛋量相關的MHC B-LB基因PCR-RFLP標記方法，該方法在雞產蛋量性狀的檢測方面，以及應用上述標記基因製備一種用於檢測雞產蛋量性狀的試劑盒。
本發明通過以下技術方案實現這是一種與雞產蛋量相關的MHC B-LB基因PCR-RFLP標記方法，其特徵在於首先從雞中提取的DNA，例如從雞的全血或組織中提取DNA，通過測序和/或RFLP和凝膠電泳進行BPR等位基因的檢測，優選的是通過RFLP和凝膠電泳，在體外檢測MHC B-LB基因中限制性內切酶BsuR I PCR-RFLP(BPR)等位因的存在。
以上所述的檢測方法主要還包括基因組DNA在檢測前進行預擴增，經擴增的DNA片段含有MHCB-LB基因第二外顯子、內含子和第三外顯子的全部或部分序列，其長度為359bp。在擴增獲得的MHC B-LB基因序列中存在27個鹼基突變位點，其中第111位鹼基處有一個鹼基突變C111T，導致BsuR I PCR-RFLP多態性；其中第265位鹼基處有一個G265鹼基插入，導致了第265位鹼基處內切酶BsuR I識別位點的消失，但沒有導致該酶切位點的多態性(詳細情況見序列表SEQ ID NO3所示)。
這種與雞產蛋量相關的MHC B-LB基因PCR-RFLP標記，關鍵含有如序列表SEQ ID NO1和SEQ IDNO2所示的引物對。
申請人經過大量的生物學實驗，已經證實應用上述方法可以應用於與雞產蛋量性狀相關聯的遺傳檢測，其中，由BPR等位基因所產生的基因型AA型與高產蛋量有顯著關聯，AB和BB型與低產蛋量顯著關聯。
利用上述製備方法，申請人已經製成了用於檢測與雞產蛋量相關的MHC B-LB基因PCR-RFLP診斷試劑盒，該試劑盒至少包括了如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的引物對，該試劑盒的組成如下序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的引物對的每種引物濃度為10μmol/L；1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas公司生產或者從商業上獲得)；10mmol/L dNTP(從商業上獲得)；10×buffer(MBIFermentas公司生產或者從商業上獲得)；25mmol/L MgCl2((從商業上獲得))。
以上所述的一對引物對的DNA序列如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。
本發明的具體技術方案是1、雞MHC B-LB基因第2外顯子和內含子的特定片段的擴增和克隆(1)雞基因組DNA的提取分別從8個中國地方品種雞藏雞(263隻)、狼山雞(57隻)、泰和烏骨雞(46隻)、固始雞(24隻)、仙居雞(44隻)、白耳雞(33隻)、滿雞(20隻)和鬥雞(34隻)翅靜脈無菌採血，每隻雞採血約1ml，用10ml 10mmol/L EDTA(pH8.0)裂解液(含有10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)和2％SDS)混合血樣，按Briles等(1993)報導的基因組DNA提取方法進行(Briles，W.E.，R.W Goto，C.Auffray and M.M.Miller.1993.與雞主要組織相容性複合體相關而在遺傳上獨立的多態系統.Immunogenetics.37408-414)。
(2)引物設計用GenBank收錄的雞的MHC B-LB DNA序列(GenBank收錄號M_26306)為信息，利用Primerpremier5.0(Microsoft Corp.)引物設計程序，根據該DNA序列特點設定待設計引物參數，最終設計並篩選特異引物序列(即所述的引物對)如下5』-GCAGAGTGCCACTACCTG-3』((正向引物)，5』-GCCGAGACCCTCACCTTG-3』(反向引物)(3)PCR反應條件PCR儀為PTC-100TM(MJ Research，Inc)，反應總體積為20μl，其中雞基因組DNA約50-60ng，1×buffer(MBI Fermentas)，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，每種引物濃度為0.1μmol/L，1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)。PCR擴增程序95℃預變性5min，然後95℃ 40s，59℃ 30s，72℃ 30s，35個循環，最後72℃延伸4min。PCR反應產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(3)PCR擴增產物的純化、克隆和測序PCR擴增產物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，於70℃溫育至凝膠完全融化，然後用PCR產物純化試劑盒(Promega)，按試劑盒說明書對PCR產物進行純化。具體步驟在每300μl融化的凝膠中加入1ml清洗液(Resin液)，混勻20s，將Resin/DNA混合物裝入注射器，使漿液通過親和層析柱(Minicolumn柱)擠出。再在注射器中加入80％的異丙醇2ml，輕推活塞使異丙醇通過Minicolumn擠出，取下Minicolumn裝入1.5ml Ependorff管中，10,000g離心2min以乾燥Resin，將Minicolumn裝入另一個乾淨的1.5ml離心管(Ependorff管)中，加入30～50μl滅菌水，靜置1min，10,000g離心20s，將DNA洗脫於Ependorff管中。
PCR產物的克隆、測序連接反應將純化過的PCR產物與pGEM-T載體連接，連接反應總體積是5μl，其中包括2.5μl2×buffer，0.5μl T載體，0.5μl純化PCR產物，0.5μl T4連接酶，最後加入1μl滅菌水置4℃水浴過夜。
感受態細胞的製備從37℃培養了16～20h的新鮮平板上挑取一個DH5α單菌落接種於2ml LB中，於37℃振蕩培養3h，轉接1ml菌液於含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續在37℃振蕩培養約4h，待OD600達到0.3～0.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10～15min，然後將菌液轉入離心管中於4℃ 4,000g離心10min以收集細胞，將離心管倒置以棄去培養液，用10ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉澱，冰浴30min，重複4℃ 4,000g離心10min一次，用4ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉澱，置4℃保存備用。
轉化無菌狀態下取100～120μl感受態細胞於1.5ml Ependorff管中，將5μl的連接產物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出後冰浴3～4min，加入400μl無抗生素的LB液體培養基，37℃振蕩培養45min。取100μl塗布於已提前4h塗布了異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)和X-gal的瓊脂平板上，37℃平放1h後倒置培養。
質粒的小量製備挑取平板上的單菌落，接種子2～3ml LB中，37℃300r/min培養過夜。用1.5ml EP管12000r/min離心數秒收集菌體。每管加入100μl用冰預冷的溶液I[50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris.HCl pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]，渦旋振蕩至菌體充分懸浮。加入新配製的溶液II
200μl，快速顛倒混勻，冰浴5min，然後加入預冷的溶液III[5mol/L乙酸鉀，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml]150μl，混勻後冰浴5min，12000r/min離心5min，將上清轉至另一EP管中，加入苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)500μl，渦旋振蕩，離心後小心吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉澱30min，12000r/min離心5min，沉澱用70％乙醇洗滌2次，抽乾，加入含有RNA酶的TE 20μl。
重組質粒的酶切鑑定取3μl質粒DNA與適量的雙蒸水混勻，使其總體積為15μl，加入2～3U限制性內酶EcoR I及2μl相應的10×限制性內切酶反應緩衝液，輕彈管壁混勻並離心，置37℃水浴1～2小時，取2～3μl反應液於瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切結果與預計完全相同者，即為目的重組質粒。重組質粒採用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上進行測序，序列測定由上海博亞生物技術有限公司完成。
(4)DNA序列同源性檢索鑑定通過美國國家生物技術信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov)網站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟體，將測序後獲得的DNA序列與GenBank資料庫中公布的已知基因進行序列同源性比較，以鑑定所獲得的DNA序列。
2、PCR-RFLP方法的建立PCR產物酶切反應體積是10μl，其中1×buffer 2μl，PCR產物3μl，限制性內切酶BsuR I為0.5μl(5U)，雙蒸水4.5μl，將樣品混勻後離心，37℃水浴4h，用3％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，用凝膠成像系統(Syngene)拍照。
3、PCR試劑盒的製備(試劑盒組成、使用劑量及測定方法)試劑盒的組成(1)本發明的每種引物濃度為10μmol/L，(2)1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)，(3)10mmol/L dNTP，(4)10×buffer(MBI Fermentas)，(5)25mmol/L MgCl2。
使用劑量和測定方法每20μl反應體積需本發明的上、下遊引物(10μmol/L)各0.2μl，(2)1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)，(3)10mmol/L dNTP 0.2μl，(4)10×buffer(MBI Fermentas)2μl，(5)25mmol/LMgCl21.2μl。加雙蒸水至19μl，再加1μl雞基因組DNA混合均勻後，即可據前述的PCR反應條件進行PCR擴增。
4、標記性狀關聯分析供試雞來自中國西藏自治區一種地方雞種—藏雞的一個自然群(規模為207隻藏雞)，每隻雞採取一份DNA樣品，共獲得207個DNA樣品用於基因型檢測。
本發明的效果1、雞MHC B-LB基因片段的擴增、克隆PCR擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示均為特異的PCR產物(如圖1所示)。將PCR產物回收純化後克隆測序，測序結果顯示PCR產物長度為359bp。
將該片段DNA序列在GenBank中進行同源性檢索，結果表明(如圖2所示)，該片段每個引物序列與目的基因MHC DNA(GenBank收錄號M26306)完全一致，該PCR產物序列對應於目的基因的第2外顯子(pos.317-563th)、第2內含子(pos.564-646th)和第3外顯子的5′端的25個核苷酸序列(pos.647-671th)。且該片段359個核苷酸序列中在分別對應於目的基因限制性內切酶BsuR I兩個識別位點(GG^CC)424-427th和577-580th上，有一個鹼基發生轉換，即111C→T，因此產生一個內切酶BsuR I多態識別位點；在另一位點上有一個鹼基插入，即G265插入，此引起該處內切酶BsuR I識別位點的消失。
2、PCR-RFLP診斷方法建立用引物擴增雞基因組DNA得到了359bp特異性擴增片段。序列分析結果表明在109bp處存在1個BsuRI酶切位點(GG^CC)，該基因座由兩個等位基因控制，A等位基因只有359bp一個片段，B等位基因有250bp+109bp兩個片段。這兩個等位基因可組成三種基因型AA，AB，BB。
2、藏雞的基因頻率和基因型頻率分析表1藏雞的基因頻率和基因型頻率分布

從表1可見，在該西藏藏雞群體中，儘管等位基因A和B的基因頻率為中等，但在基因型頻率分布上，AB基因型佔優勢，為主導等位基因，AA基因型和BB基因型頻率較低。
4、標記性狀關聯分析對雞MHC B-LB基因BsuRI-RFLP多態性位點基因型檢測結果表明在207個個體中AA基因型有19個，AB基因型有178個個體，BB基因型有10個個體。在與部分生產性狀進行關聯分析中，所分析的性狀是產蛋量(32周齡至54周齡累計161天的產蛋數)、蛋重和50周齡時的體重。基因型間性狀的簡單均數和標準差分析結果總結於表1。關聯分析結果表明(見表2)，AA基因型雞的產蛋量極顯著(P＜0.01)高於其它基因型，在蛋重和體重兩性狀上不同基因型間均無顯著差異(P＞0.05)。
表2雞MHC B-LB基因BsuRI-RFLP基因型與部分生產性狀的關聯分析

注表中上標a表示相應基因型的性狀值顯著高於其它基因型的性狀值(P＜0.01)，在其它性狀的基因型間無顯著差異(P＞0.05)，N為樣本含量，M為平均觀察值，S為標準差。
序列表

序列表SEQ ID NO1是本發明用於進行PCR-RFLP檢測雞產蛋量MHC B-LB基因多態性的引物對中的正向引物序列；序列表SEQ ID NO2是本發明用於進行PCR-RFLP檢測雞產蛋量MHC B-LB基因多態性的引物對中的反向引物序列。
序列表SEQ ID NO3是本發明利用PCR-RFLP進行雞產蛋量檢測的MHC B-LB基因部分DNA序列。
圖1是本發明的技術流程2是用於進行PCR-RFLP檢測雞產蛋量MHC B-LB基因多態性的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
圖3是該發明中PCR產物序列以及該序列中的27個新鹼基突變(在這27個突變鹼基中，24個出現在外顯子，其中一個為C或T插入突變；另3個突變出現在內含子中，且均為插入突變)。圖中下畫線的片段為引物序列，*表示與基因庫(GenBank accession numberM26306)序列一致的MHC B-LB基因的核苷酸，突變鹼基用字母表示出，BsuR I內切酶識別位點中的突變鹼基用方框表示。
具體實施例方式
實施例1雞MHC B-LB基因PCR-RFLP-BsuRI多態性在3個中國地方雞品種中的分布檢測分析(1)引物序列5』-GCAGAGTGCCACTACCTG-3』(正向)，5』-GCCGAGACCCTCACCTTG-3』(反向)(2)PCR擴增條件PCR反應總體積為20μl，其中雞基因組DNA約50-60ng，含1×buffer(MBI Fermentas)，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，每種引物濃度為0.1μmol/L，1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)。PCR擴增程序95℃預變性5min，然後95℃ 40s，59℃ 30s，72℃ 30s，35個循環，最後72℃延伸4min。PCR反應產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(3)RFLP檢測條件PCR產物酶切反應體積是10μl，其中1×buffer 2μl，PCR產物3μl，限制性內切酶BsuR I為0.5μl(5U)，雙蒸水4.5μl，將樣品混勻後離心，37℃水浴4h，用3％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，用凝膠成像系統(Syngene)拍照。檢測結果如表3所示表3 PCR-RFLP-BsuR I多態性在3個雞品種中的分布

根據表2的基因型和基因頻率的結果顯示，在所檢測的3個雞品種中，都是B等位基因佔優勢。
實施例2申請人用建立起的PCR-RFLP診斷方法，對一個藏雞群(207隻規模)的207份DNA樣品進行MHC-B-L-RFLP-BsuRI的基因型檢測。檢測方法採用了如實施例1所述的操作步驟。
檢測結果表明，在207個個體中AA基因型有19個，AB基因型有178個，BB基因型有10個個體。在與產蛋量的關聯分析中，基因型間性狀的簡單均數和標準差分析結果總結於表4。關聯分析結果表明，AA與AB基因型、AA與BB基因型雞的產蛋量呈極顯著差異(P＜0.01)，AB與BB基因型雞的產蛋量間無顯著差異(P＞0.05)。如表4所示表4雞MHC B-L基因BsuR I-RFLP基因型與產蛋量的關聯分析

注表中AA基因型雞的產蛋量顯著高於AB和BB基因型的產蛋量(P＜0.01)，在AB和BB基因型間的產蛋量無顯著差異(P＞0.05)。
實施例3PCR-RFLP-BsuR I多態性在仙居雞、固始雞和泰和烏雞的分布的檢測分析。操作步驟應用了如實施例1所述的步驟，其結果如表5所示表5 PCR-RFLP-BsuR I多態性在3個雞品種中的分布

從表5可見，在仙居雞、固始雞和泰和烏雞3個中國地方雞種中，B等位基因佔優勢，為主導等位基因。
實施例4PCR-RFLP檢測雞MHC B-L基因的多態性及PCR-RFLP-BsuR I多態性在中國地方雞種的分布檢測分析。操作步驟應用了如實施例1所述的步驟，其結果如表6所示表6 MHCB-L基因PCR-RFLP-BsuR I多態性及在5個雞品種中的分布

在上述6個地方雞種的自然群體中，A等位基因在鬥雞品種佔優勢，B等位基因在泰和烏雞、狼山雞和仙居雞三個雞品種中佔優勢，而在該西藏藏雞群體中，等位基因A和B的基因頻率為中等。
雞產蛋量相關的MHC B-LB基因序列表110華中農業大學120與雞產蛋量相關的MHC B-LB基因PCR-RFLP標記130
1412004-04-141603170PatentIn version 3.1210121118212DNA213雞(Gallus gallus)220
221exon222(1)..(18)223
4001gca gag tgc cac tac ctg18Ala Glu Cys His Tyr Leu1 5210221118212DNA213雞(Gallus gallus)
220
221exon222(1)..(18)223
4002gcc gag acc ctc acc ttg18Ala Glu Thr Leu Thr Leu1 52103211359212DNA213雞(Gallus gallus)220
221gene222(1)..(359)223
220
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4003gcagagtgcc actacctgaa cggcaccgag cgggcgaggt atctggwcag gyawrtctac 60aaccggcags agtwcgcgca cttcgacagc gacgtgggga aayacgtggc tgatacaccg120ctgggtgagc cgcaggctga aatctggaac agcaacgccg agattctgga gacccgaatg180aatgaagtgg acasgtwctg ccggcacaac tacggggttg tggagytcct tcacggtgca240gaggagcggt gagtgccgcg gggcgcagcg cgcacgcacg ggcaggcgcc gcgctctggc300ggtcggtccg cagcgctccc cccgtgcccc gcagtggagc ccaaggtgag ggtctcggc 359
權利要求
1.一種與雞與蛋量相關的MHC P-LB基因PCR-RFLP標記方法，其特徵在於在體外檢測MHC B-LB基因中限制性內切酶BsuR I PCR-RFLP(BPR)等位基因的存在。
2.根據權利要求1的方法，其特徵在於通過測序和/或RFLP和凝膠電泳進行BPR等位基因的檢測，優選的是通過RFLP和凝膠電泳進行BPR等位基因的檢測。
3.根據權利要求1-2之任一項的方法，其特徵在於從雞的全血或組織中提取基因組DNA進行檢測。
4.根據權利要求2或3的方法，其特徵在於基因組DNA在檢測前預擴增。
5.根據權利要求4的方法，其特徵在於經擴增的DNA片段含有MHC B-LB基因第二外顯子、內含子和第三外顯子的全部或部分序列，其長度為359bp。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，擴增獲得的MHC B-LB基因序列中存在27個鹼基突變位點，其中第111位鹼基處有一個鹼基突變C111T，導致BsuR I-RFLP多態性。
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，其中第265位鹼基處有一個G265鹼基插入，導致了第265位鹼基處內切酶BsuR I識別位點的消失，但沒有導致該酶切位點的多態性。
8.一種與雞產蛋量相關的MHC B-LB基因PCR-RFLP標記，含有如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的引物對。
9.用於權利要求1-8中任一項的方法，其特徵在於應用於與雞產蛋量相關聯的遺傳檢測。
10.試劑盒.其中包括權利要求8的引物對。
全文摘要
本發明屬於動物基因工程技術領域，涉及一種利用分子生物學技術檢測雞的產蛋量的方法。更具體地說，本發明建立了一種利用雞MHC B－LB基因的PCR－RFLP多態性對雞的產蛋性能進行檢測技術及其應用。本發明還涉及到一種用於檢測與雞產蛋量的試劑盒。其主要步驟包括從雞血液或組織中提取基因組DNA、設計引物、獲得MHC B－LB基因部分序列，然後進行PCR產物克隆測序、BsuR I－RFLP多態性檢測、RFLP多態性與產蛋量的關聯分析，這些結果證實了BPR等位基因的存在與雞產蛋量之間有顯著關聯。本發明還公開了用於擴增MHC B－LB基因片段特定序列的一對引物，以及該基因片段的所有的鹼基突變位點和BsuR I－RFLP多態性在檢測雞產蛋量上的應用，本發明為雞的標記輔助選擇提供了有用的分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK1683554SQ20041001303
公開日2005年10月19日 申請日期2004年4月14日 優先權日2004年4月14日
發明者劉榜, 徐日福, 李奎, 強巴央宗, 陳國宏, 莫德林, 餘梅, 樊斌, 王克華, 熊統安, 朱猛進, 李長春 申請人:華中農業大學