檢測氯黴素的電導型傳感電極及其分子印跡膜的製備方法

2023-06-01 00:12:46

專利名稱：檢測氯黴素的電導型傳感電極及其分子印跡膜的製備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種檢測技術領域的電極及其製備方法，具體涉及一種檢測 氯黴素的電導型傳感電極及其分子印跡膜的製備方法。
背景技術：
氯黴素(Chloramphenicol, CAP)是一種高效廣譜的抗生素，廣泛用於動物 各種傳染性疾病的治療，但是，氯黴素有嚴重的副作用，能引起人的再生障礙性 貧血和粒狀白細胞缺乏症等疾病，此外，長期微量攝入氯黴素不僅使大腸桿菌、 沙門氏菌等產生耐藥性，而且會引起機體正常菌群失調，使人們易感染各種疾病， 如果氯黴素在食用動物中殘留，可通過食物鏈傳給人類，因此，氯黴素在動物性 食品中的殘留對人類的健康構成了潛在危害，許多國家和地區相繼禁止或嚴格限 制使用氯黴素，我國也規定氯黴素在動物性食品中不得檢出，但是，由於氯黴素 的抑菌效果好，以及相對廉價，目前仍有人將其用於家禽、畜類以及水產品中。 為了保障人民的身體健康以及擴大動物性食品的貿易往來，建立靈敏度高、特異 性強、簡便易行又經濟的氯黴素殘留的分析方法是很有必要的。
在檢測氯黴素方面，國內外學者在熱聚合法製備印跡微粒或電化學法製備印 跡膜的基礎上，建立了檢測生物樣品中氯黴素殘留的新方法。這些分子印跡傳感 裝置的感受器部分，是通過分子印跡微粒或者是電化學方法製備的分子印跡膜組 成的，缺點在於利用分子印跡微粒製備的傳感儀組裝比較複雜，過程繁瑣，且不 適合對多個樣品進行檢測，而利用電化學方法製備分子印跡膜目前還僅限於實驗 室研究階段，由於製備和檢測過程都要在柱狀金屬電極上進行，很難批量製備並 用於重複檢測，因此實際推廣應用價值比較低。
經對現有技術文獻的檢索發現，專利申請號為200810016487. 7的中國專利， 名稱為"檢測痕量環境內分泌幹擾物的分子印跡膜電極製備方法及檢測方法"， 該專利中提出將EDCs模板分子、功能單體、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶 劑按照摩爾比為0. 1 1: 1: 0. 5 6: 35 65: 0. 05 0. 05: 2.0 25配製聚合液，工作電極表面經過打磨、超聲波清洗、酸鹼清洗、雙蒸水清洗以及乾燥，然 後將處理後的工作電極浸泡於聚合液中，取出進行洗脫處理，重複上述操作4 7次，製得分子印跡膜電極。該方法的缺陷在於在其工作電極為玻璃碳電極，成 本較高，在工作電極表面製備分子印跡膜時操作繁瑣，電極處理過程複雜，分子 印跡膜製備過程中需要進行多次洗脫，因而製備過程耗時較長。總之，該分子印 跡膜電極製備成本高、製備時間長，難以實現對大量樣品的檢測，因而在實際應 用中具有很大的局限性。

發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提出了一種檢測氯黴素的電導型傳 感電極及其分子印跡膜的製備方法，電導型傳感電極由兩片絲網印刷電極平行設 置組成，將聚合液在一次性絲網印刷電極表面直接原位聚合過程中嵌埋模板分 子，然後將模板分子洗脫，使分子印跡膜內部形成具有固定大小和形狀的"空穴" 及具有確定排列的功能基團，其對模板分子的立體結構具有記憶性，待測樣品中 的氯黴素分子能夠與這種"空穴"特異性的結合，從而改變分子印跡膜的電化學 性質，造成分子印跡膜的電導率增大，過膜電導增加。
本發明通過以下技術方案實現
本發明所涉及的檢測氯黴素的電導型傳感電極，由兩片絲網印刷電極平行設 置組成，絲網印刷電極包括電極基片、接線端子、電極連線、工作電極、絕緣 層，接線端子、電極連線與工作電極連成一體組成一條電極基體，電極基體印製 在電極基片上，電極連線的表面塗覆一層絕緣體，接線端子是裸露的導電材料薄 膜，兩片絲網印刷電極中的一片的工作電極反應區上覆蓋有氯黴素分子印跡膜， 而另一片中的工作電極為空白電極。
所述絕緣材料為PVC (聚氯乙烯)。
所述氯黴素分子印跡膜，其直徑為5 mm 6mm，厚度為80 100um。 所述電極基片，其材料為聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、基乙烯四種聚合
物的其中之一，上述聚合物為片材或巻材。
本發明所涉及的檢測氯黴素的電導型傳感電極分子印跡膜的製備方法，包括
如下步驟
歩驟一，氯黴素分子印跡膜片的製備稱取氯黴素模板分子與功能單體溶於
溶劑，超聲波震蕩混合均勻後加入交聯劑，再超聲波震蕩混合均勻後加入粘合劑，再經超聲波震蕩混合均勻，然後加入引發劑，超聲波震蕩混合均勻，通氮氣除氧， 將上述操作所製備的溶液滴加到電導型傳感電極中一個絲網印刷電極的工作電 極的反應區，蓋玻片壓蓋，然後將該絲網印刷電極平放在培養皿中，在培養皿周 圍放置冰與乾冰的混合物，並在iooow紫外光聚合，形成內含印跡分子的分子印 跡膜。
步驟二，氯黴素分子印跡膜內部氯黴素分子的去除將步驟一所得的氯黴素 分子印跡膜用體積比為9: 1的甲醇-乙酸混合溶液經索式提取器中反覆洗脫氯黴 素分子，直到最後一次洗脫時洗脫液中檢測不到模板分子存在為止，於雙蒸水中 保存備用。
所述功能單體為甲基丙烯酸、甲基丙烯酸胺、丙烯醯胺中的一種。 所述溶劑為四氫呋喃、二甲亞碸、無水乙醇或甲苯中的一種，溶劑體積為
350ul 400ul。
所述氮氣除氧，其時間為5分鐘 10分鐘。 所述冰與乾冰的混合物，其中冰與乾冰的質量比為9 15。 所述紫外光聚合其時間為15分鐘 30分鐘。 所述氯黴素模板分子、功能單體與交聯劑的摩爾比為1: 5: 20。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
(1) 本發明的電導型電極構造簡單，不需要價格昂貴的參比電極；採用電 導型電極構造的傳感器其靈敏度顯著高於電流型傳感器；操作簡單，測試不同樣 品時僅需要更換帶有不同分子印跡膜的電導型電極即可；抗幹擾能力強；響應時 間短，檢測在3min內即可完成；
(2) 本發明方法中所用的四氫呋喃、乙二醇二甲基丙烯酸等親水性溶劑作 反應溶劑和制孔劑，所製備的聚合物可直接應用於含水溶劑，降低了分子印跡膜 製備過程及使用過程對條件的要求，擴大了材料的應用範圍；
(3) 本發明方法的反應過程中加入了粘合劑水性聚氨酯，增加了分子印跡 膜的柔韌性，防止了在聚合過程中分子印跡膜出現裂痕的現象，並使所製備的分 子印跡膜空穴分布均勻，十分有利於檢測效果的提高；
(4) 本發明方法的聚合過程中採用冰、乾冰混合冰浴，控制了聚合過程中 溫度恆定，聚合反應在低溫下進行，避免了熱聚合反應的發生，乾冰揮發過程中 釋放大量C02氣體，C02密度大於空氣，可在聚合反應區域周圍形成隔絕氧氣的環境，因而避免了聚合過程中氧化還原反應的幹擾，從而提高了分子印跡膜的特異 性識別能力。
(5)本發明的方法獲得的分子印跡膜片可應用於製備電導型生物傳感器， 本發明加工方法簡便、成本低，用該絲網印刷電極製成的電導型傳感器檢測氯黴 素操作方便，對於不同樣品，只需替換附有氯黴素分子印跡膜的絲網印刷電極即 可，且具有響應時間快、使用壽命長、重現性良好和特異性識別能力強等優點。


圖1為本發明的使用檢測氯黴素的電導型傳感電極的檢測原理示意圖； 圖2為本發明的檢測氯黴素的電導型傳感電極的平面圖； 圖3為本發明的檢測氯黴素的電導型傳感電極的側視圖4為本發明的實施例中使用檢測氯黴素的電導型傳感電極檢測氯黴素的 標準曲線圖。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案 為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體操作過程，但本發明的保護範 圍不限於下述的實施例。 圖1為使用檢測氯黴素的電導型傳感電極的檢測氯黴素的工作原理示意圖， 絲網印刷電極上的分子印跡膜上的特異性空穴選擇性的與氯黴素分子結合，造成 分子印跡膜電化學性質變化，導致高頻電壓激勵下的電導性能變化，電導信號經 電導-電壓轉換器轉化為電壓信號並放大，再經模數轉換器轉化為數位訊號，經 單片機分析處理後，數據在存儲器中保存記錄並可隨時提取，同時氯黴素濃度直 接從液晶顯示電路讀出，數據可通過USB接口傳輸到計算機作長期儲存。
如圖2、 3所示，下述實施例涉及的檢測氯黴素的電導型傳感電極，由兩片 絲網印刷電極平行設置組成，絲網印刷電極包括電極基片l、接線端子2、電 極連線3、工作電極4、絕緣層5，接線端子2、電極連線3與工作電極4連成一 體組成一條電極基體，電極基體印製在電極基片1上，電極連線3的表面塗覆一 層絕緣體5，接線端子2是裸露的導電材料薄膜，兩片絲網印刷電極中的一片的 工作電極反應區上覆蓋有氯黴素分子印跡膜6，而另一片中的工作電極為空白電 極。
所述絕緣層5，其材料為PVC (聚氯乙烯)。所述工作電極4，為邊長5mm的實心矩形。
所述電極基片l，其長度為36mm 40mm、寬8mm 10mm、厚0. 4 0. 45mra; 所述接線端子2，其長度為9 mm 10咖、寬為1醒 1. 2mra; .所述電極連線3，其長度為20 mm 25mm、寬為l腿 1. 2咖； 所述氯黴素分子印跡膜6，其直徑為5mm 6mm，厚度為80 u m 100 u m。 所述電極基片l，其材料為聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、基乙烯四種聚 合物的其中之一，其中優先選擇聚氯乙烯，上述聚合物為片材或巻材。
下述實施例所涉及的檢測氯黴素的電導型傳感電極分子印跡膜的製備方法， 包括如下步驟-
步驟一，氯黴素分子印跡膜片的製備稱取氯黴素模板分子與功能單體溶於 溶劑，超聲波震蕩混合均勻後加入交聯劑，再超聲波震蕩混合均勻後加入粘合劑， 再經超聲波震蕩混合均勻，然後加入引發劑，超聲波震蕩混合均勻，通氮氣除氧， 將上述操作所製備的溶液滴加到電導型傳感電極中一個絲網印刷電極的工作電 極的反應區，蓋玻片壓蓋，然後將該絲網印刷電極平放在培養皿中，在培養皿周 圍放置冰與乾冰的混合物，並在IOOOW紫外光聚合，形成內含印跡分子的分子印 跡膜。
步驟二，氯黴素分子印跡膜內部氯黴素分子的去除將步驟一所得的氯黴素 分子印跡膜用體積比為9: 1的甲醇-乙酸混合溶液經索式提取器中反覆洗脫氯黴 素分子，直到最後一次洗脫時洗脫液中檢測不到模板分子存在為止，於雙蒸水中 保存備用。
所述功能單體為甲基丙烯酸、甲基丙烯酸胺、丙烯醯胺中的一種。 所述溶劑為四氫呋喃、二甲亞碸、無水乙醇或甲苯中的一種，溶劑體積為
350 u 1 400n 1。
所述交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸、3， 5-二丙烯醯胺基苯甲酸中的一種。 所述粘合劑，為水性聚氨酯。 所述引發劑，為偶氮二異丁氰。 所述超聲波震蕩，其時間為5分鐘 15分鐘。 所述氮氣除氧，其時間為5分鐘 10分鐘。
所述將溶液滴加到電導型傳感電極中一個絲網印刷電極的工作電極的反應區，溶液的滴加量為8yl -15lil。
所述冰與乾冰的混合物，其中冰與乾冰的質量比為9 15。 所述紫外光聚合其時間為15分鐘 30分鐘。
所述氯黴素模板分子、功能單體與交聯劑的摩爾比為1: 5: 20。
實施例1
採用絲網印刷技術將導電銀漿在電極基片上印刷電極連線和接線端子的基
體，電極連線表面塗覆一層pvc絕緣體，下端的工作電極採用濺射石墨法塗覆一 層導電石墨。用50%硝酸浸泡處理，再用蒸餾水衝洗3次。晾乾，4'C保存備用。 稱取0. 05g氯黴素和70 u 1甲基丙烯酸功能單體溶於380 n 1四氫呋喃溶劑 中，超聲混合10分鐘後加入乙二醇二甲基丙烯酸交聯劑，超聲混合10分鐘，再 往反應體系中加入70ii 1水性聚氨酯粘合劑，超聲混合10分鐘後加入0. 02g的 引發劑偶氮異丁氰，超聲混合20分鐘後，通氮氣5分鐘，將制好的混合液滴加 10ul到絲網印刷電極工作電極區域，蓋上蓋玻片，冰乾冰質量比為9: l混 合物冰浴、1000W紫外光距離18cm照射15分鐘，重複兩次，得到內含氯黴素的 分子印跡膜。
將所製得的承載分子印跡膜的絲網印刷電極用體積比為9: 1的甲醇-乙酸混 合溶液經索式提取器中反覆洗脫氯黴素分子，直到最後一次洗脫時洗脫液中檢測 不到模板分子存在為止，得到具有氯黴素空間結構空穴的分子印跡膜。通過電鏡 掃描分析、原子力顯微鏡來觀察分子印跡膜的表徵。電鏡掃描與原子力顯微鏡觀 察顯示，該方法製備的印跡膜表面存在大量可以特異性識別模板分子印跡微孔， 直徑介於0. 1 ti m 0. 48 u m之間。
作為優選的實施例，冰乾冰質量比9: 1混合物冰浴、IOOOW紫外光照射
15分鐘，重複兩次聚合成膜，印跡鍵合的效果達到最佳。
檢測樣品，以檢測牛奶樣品中氯黴素殘留量為例
製作標準曲線利用Tris-HCL (IO薩、ph7.4)溶液為支持液，將與電導型 傳感器相連接的分子印跡絲網印刷電極插入到支持液中，使分子印跡膜片完全浸 入到支持液中，磁力攪拌器攪拌條件下加入20"L氯黴素標準液(0.01mg/L)， 通過電導型傳感器進行檢測，記錄結果並分析，檢測結束後，更換帶有分子印跡 膜片的絲網印刷電極條，採用相同操作方法分別加入40wL 、 60yL、 80uL、IOO"L氯黴素標準液，進行檢測，針對每個濃度梯度重複檢測五次，然後根據 五次做出的實驗結果，建立氯黴素檢測的標準曲線，如圖4所示。
樣品處理取經高效液相色譜一質譜聯用技術確證不含有氯黴素殘留的牛奶
樣品5個，用10ml移液器準確移取分別樣品5ml放至10ml離心管中，加入lral 含有60u g/L的氯黴素標準液，振蕩混勻15min,再用6 ml乙酸乙酯進行萃取， 收集含氯黴素的有機相，40 °C、 240mbar條件下蒸發去除有機溶劑，最後加入 5ml乙腈-2M高氯酸水溶液，體積比為3: 2，攪拌20s，振蕩混合均勻作為待測 溶液。
將上述方法製成的絲網印刷電極的分子印跡膜插入龜導型傳感器，浸入 10mL、 Tris-HCL溶液(IO腿、ph7.4)，滴加20"L處理的樣品，測定並記錄讀 數，並計算出氯黴素殘留量。針對同一樣品，更換絲網印刷電極條，連續檢測5 次，以所得的平均值作為檢測值。在本實施例中，所檢測的牛奶樣品中氯黴素的 標加回收率為94.6%，相對標準差為2.73%，所檢樣品中氯黴素的平均含量為 74ng/g。該方法在牛奶樣品中的檢測限為3.6ng/g，線性範圍介於5ng/g 200 ng/g之間，線性方程為Y=0. 0038+0. 00499X， R=0. 99958。將製備好的10個 絲網印刷電極上原位合成的氯黴素分子印跡膜在-4'C條件下保存於雙蒸水中，經 過兩個月之後重新檢測相同濃度的氯黴素標準溶液，檢測的結果表明兩次檢測結 果的相對標準誤差值小於2.6%，因此本實施例中的用於快速檢測氯黴素的電導 型傳感電極具有良好的重複性和穩定性。
實施例2
在氯黴素分子印跡膜的製備過程中，紫外聚合時間為連續照射30min，其他 條件不變。在檢測過程中，標準曲線的製備同實施例1，檢測樣品採用雞肉。
樣品處理取經高效液相色譜一質譜聯用技術確證不含有氯黴素殘留的雞肉 樣品5個，取1克肉樣，放入組織勻漿機的樣品杯中，加入10毫升0. 1 M pH 為7. 2的磷酸鹽緩衝液，攪碎並均質化，將其轉移到15ml離心管中，加入lml含 有40yg/L的氯黴素標準液，再用6 ml乙酸乙酯進行萃取，振蕩混勻15min， 收集含氯黴素的有機相，40 'C、 240rabar條件下蒸發去除有機溶劑，最後加入 乙腈-2M高氯酸水溶液，體積比為3: 2，攪拌20s，振蕩混合均勻作為待測溶液。 在本實施例中，所檢測市售雞肉中氯黴素的回收率為％.2%，所檢樣品中氯黴素的平均含量為57ng/g。用不同濃度的氯黴素標準品進行標加試，並重複三次， 所得的檢測值經統計分析，得出該方法檢測肉品中氯黴素的檢測限為3. 3 ng/g， 線性範圍介於1.0ng/g 250 ng/g之間，線性方程為Y=0. 0087+0. 0063X， R =0.986。穩定性及重複性試驗同實施例1。
實施例3
在氯黴素分子印跡膜的製備過程中，絲網印刷電極接線端子、電極連線、工 作電極均用導電銀漿印製，其他與實施例l同。在檢測過程中，標準曲線的製備 同實施例l，檢測樣品採用雞蛋。
樣品處理取經高效液相色譜一質譜聯用技術確證不含有氯黴素殘留的雞蛋 樣品5個，取5ml放至10ml離心管中，振蕩混勻15min，加入lml含有20y g/L 的氯黴素標準液，再用3ml乙酸乙酯進行萃取，收集含氯黴素的有機相，40 。C、 240mbar條件下蒸發去除有機溶劑，最後加入5ml乙腈-2M高氯酸水溶液，體積 比為3: 2，攪拌20s，振蕩混合均勻作為待測溶液。在本實施例中，所檢測雞蛋 中氯黴素的回收率為93.4%,所檢樣品中氯黴素的平均含量為29 ng/g。用不同 濃度的氯黴素標準品進行標加試，並重複三次，所得的檢測值經統計分析，得出 該方法檢測肉品中氯黴素的檢測限為4.2ng/g，線性範圍介於20ng/g 300g/g 之間，線性方程為Y=0. 00312+0. 00797X， R=0.973。穩定性及重複性試驗同 實施例1。
權利要求
1、一種檢測氯黴素的電導型傳感電極，其特徵在於，電導型傳感電極由兩片絲網印刷電極平行設置組成，絲網印刷電極包括電極基片、接線端子、電極連線、工作電極、絕緣層，接線端子、電極連線與工作電極連成一體組成一條電極基體，電極基體印製在電極基片上，電極連線的表面塗覆一層絕緣體，接線端子是裸露的導電材料薄膜，兩片絲網印刷電極中的一片的工作電極反應區上覆蓋有氯黴素分子印跡膜，而另一片中的工作電極為空白電極。
2、 根據權利要求1所述的檢測氯黴素的電導型傳感電極，其特徵是，所述 氯黴素分子印跡膜，其直徑為5mm 6mm，厚度為8(^m 100nm。
3、 根據權利要求1所述的檢測氯黴素的電導型傳感電極，其特徵是，所述 電極基片，其材料為聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、基乙烯四種聚合物的其中 之一，上述聚合物為片材或巻材。
4、 一種如權利要求1所述的檢測氯黴素的電導型傳感電極分子印跡膜的制 備方法，包括如下步驟步驟一，氯黴素分子印跡膜的製備稱取氯黴素模板分子與功能單體溶於溶 劑，超聲波震蕩混合均勻後加入交聯劑，再超聲波震蕩混合均勻後加入粘合劑， 再經超聲波震蕩混合均勻，然後加入引發劑，超聲波震蕩混合均勻，通氮氣除氧， 將上述操作所製備的溶液滴加到電導型傳感電極中一個絲網印刷電極的工作電 極的反應區，蓋玻片壓蓋，然後將該絲網印刷電極平放在培養皿中，在培養皿周 圍放置冰與乾冰的混合物，並在1000W紫外光聚合，形成內含印跡分子的分子 印跡膜；步驟二，氯黴素分子印跡膜內部氯黴素分子的去除將步驟一所得的氯黴素 分子印跡膜用體積比為9: 1的甲醇-乙酸混合溶液經索式提取器中反覆洗脫氯黴 素分子，直到最後一次洗脫時洗脫液中檢測不到模板分子存在為止，於雙蒸水中 保存備用。
5、 根據權利要求4所述的檢測氯黴素的電導型傳感電極分子印跡膜的製備 方法，其特徵是，所述功能單體為甲基丙烯酸、甲基丙烯酸胺、丙烯醯胺中的一 種。
6、 根據權利要求4所述的檢測氯黴素的電導型傳感電極分子印跡膜的製備 方法，其特徵是，所述溶劑為四氫呋喃、二甲亞碸、無水乙醇或甲苯中的一種， 溶劑體積為350 u 1 400 y 1。
7、 根據權利要求4所述的檢測氯黴素的電導型傳感電極分子印跡膜的製備 方法，其特徵是，所述氮氣除氧，其時間為5分鐘 10分鐘。
8、 根據權利要求4所述的檢測氯黴素的電導型傳感電極分子印跡膜的製備 方法，其特徵是，所述冰與乾冰的混合物，其中冰與乾冰的質量比為9 15。
9、 根據權利要求4所述的檢測氯黴素的電導型傳感電極分子印跡膜的製備 方法，其特徵是，所述紫外光聚合其時間為15分鐘 30分鐘。
10、 根據權利要求4所述的檢測氯黴素的電導型傳感電極分子印跡膜的製備 方法，其特徵是，所述氯黴素模板分子、功能單體與交聯劑的摩爾比為1: 5: 20。
全文摘要
一種生物傳感器領域的檢測氯黴素的電導型傳感電極及其分子印跡膜的製備方法，本發明中，電導型傳感電極由兩片絲網印刷電極平行設置組成，電導型傳感電極中的氯黴素分子印跡膜製備方法如下將聚合液在一次性絲網印刷電極表面直接原位聚合過程中嵌埋模板分子，然後將模板分子洗脫，使分子印跡膜內部形成具有固定大小和形狀的「空穴」及具有確定排列的功能基團，其對模板分子的立體結構具有記憶性，待測樣品中的氯黴素分子能夠與這種「空穴」特異性結合，改變分子印跡膜的電化學性質，造成分子印跡膜的電導率增大，過膜電導增加。本發明加工方法簡便、成本低，用該絲網印刷電極製成的電導型傳感器檢測氯黴素操作方便，響應時間快、使用壽命長。
文檔編號G01N27/02GK101424650SQ20081020301
公開日2009年5月6日 申請日期2008年11月20日 優先權日2008年11月20日
發明者劉國豔, 鋒 李, 李為強, 柴春彥, 莉 王 申請人:上海交通大學