需氧病原體的穩定敏感性測試的製作方法

2023-05-31 18:03:16

專利名稱：需氧病原體的穩定敏感性測試的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物學領域，且詳細來說涉及用於測定需氧病原體對抗生素敏感性的組合物和方法。本發明的組合物和方法尤其適用於敏感性測試，包括四環素家族抗生素的敏感性測試，且尤其是涉及經7和9取代的四環素的敏感性測試，且最尤其是涉及替加環素(tigecycline)(TGC)的敏感性測試。
背景技術：
在開發抗生素期間，必須建立敏感性測試的質量控制(QC)範圍(National Committeefor Clinical Laboratory Standards，2003.Methods for Dilution Antimicrobial SusceptibilityTests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved StandardsM7-A6，第6版，第23卷，National Committee for Clinical Laboratory Standards Wayne，PA.，National Committee forClinical Laboratory Standards 2003.Methods for Dilution Antimicrobial Disk SusceptibilityTests；Approved StandardsM2-A8，第8版，第20卷.National Committee for ClinicalLaboratory Standards，Wayne，PA.)，其隨後被臨床微生物實驗室利用以確定患者測試結果是否有效。使用由美國臨床實驗室標準委員會(National Committee for ClinicalLaboratory Standards)(NCCLS)所推薦的選定板的生物體對每種抗生素確定並隨後定義這些QC範圍。
通過一個稱作M23研究的過程建立所述QC範圍，所述過程涉及通過多個實驗室使用不同批次和製造商的培養基進行多天測試來測試(National Committee for ClinicalLaboratory Standards 2003.Development of In Vitro Susceptibility Testing Criteria andQuality Control Parameters；Approved GuidelineM23-A2，第2版，第18卷.NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards，Wayne，PA.)。替加環素是一種目前臨床開發中的甘氨醯四環素(glycylcycline)抗生素，並且是一種具有抵抗易感及多藥物抗性生物體的等量活性的廣譜抗生素(Sum，P.E.和P.Petersen，Bioorganic and MedicinalChemistry Letters 9，1459-1462，1999)。作為廣譜抗菌劑的替加環素具有抵抗許多革蘭氏(gram)陽性和革蘭氏陰性臨床相關病原體的有效活性，所述病原體包括抗性病原體，例如產生MRSA、VRE、PRSP和ESBL的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(Biedenbach D.J.，M.L.Beach和R.N.Jones，Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 40173-177，2001；Cercenado，E.，S.Cercenado，J.A.Gomez和E.Bouza，J.Antimicrob.Chemother.52138-139，2003；Milatovic，D.，F.-J.Schmitz，J.Verhoef和A.C.Fluit，Antimicrob.AgentsChemother.47400-404，2003；以及Petersen，P.J.，N.V.Jacobus，W.J.Weiss，P.E.Sum和R.T.Testa，Antimicrob.Agents Chemother.43738-744，1999)。在當對替加環素進行測試時獲得美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)質量控制生物體的一致質量控制範圍的研究期間，獲得不一致的MIC(最低抑制濃度)值。
本發明概述了對ATCC質量控制生物體提供穩定、一致的敏感性測試值的新穎方法和組合物。
從本發明的下列摘要和描述並且從權利要求書可顯而易見本發明的這些和其他實施例以及特徵。

發明內容
在開發替加環素期間，進行了一些研究以建立用於最低抑制濃度(MIC)測試的QC範圍。在第一項研究中，在預臨床開發所涉及的年間，對所推薦的QC生物體的每一者建立預備QC範圍。隨著替加環素的開發進入第2階段的臨床研究，進行控制充分的NCCLS M23研究。第二項研究(第一M23研究)的結果顯示QC範圍比先前5年預臨床經驗期間所建立的範圍低二分之一。遵循第一M23研究，接受已建立的QC範圍。然而，研究實驗室經驗和進行微生物學測試用於臨床試驗的臨床微生物實驗室經驗均具有QC的變化，其中替加環素因為MIC極高而常常超出範圍。隨後進行第二M23研究。將第二M23研究的結果與研究實驗室和臨床實驗室經驗所建立的QC極限進行比較。這些QC極限對於進行替加環素工作的那些研究人員來說變為可接受值。某些實驗室進一步注意到當對QC生物體進行測試時，替加環素的MIC仍然不同並且產生超出範圍的低值。這些值對應於由第一M23研究所建立的較低範圍。
進一步注意到新鮮的Mueller Hinton肉湯(MHB)中所測定的替加環素MIC與老化MHB中所測定的MIC存在差異。當在新鮮的(＜1周)Mueller Hinton肉湯(MHB)中進行微肉湯(microbroth)稀釋MIC測試時，MIC結果對應於所描述的第一M23研究中所發現的較低範圍。本發明的一優選實施例為當在肉湯微稀釋測試中測試替加環素時，培養基為新鮮製備且不超過12小時，並且當形成滴定板時不存在佐劑。然而，如果MHB老化(＞1周)，那麼MIC結果與所描述的第二M23研究中的較高結果相關。當使用預製備培養基時(通常＞1周)，未觀測到可變性，且可變性與第二M23研究相似。
因此，在技術中需要一種當對替加環素進行測試時，對ATCC質量控制生物體提供標準敏感性測試結果的有效方法。
本發明為所述技術提供當使用Mueller-Hinton II肉湯(MHB)培養基時，對替加環素提供標準MIC值的新穎方法和組合物。
替加環素是一種甘氨醯四環素，且來自於四環素家族並且在7和9位置具有取代基。替加環素進一步稱為GAR-936。
本文所描述的本發明概述了新穎方法和組合物，其中可以表徵細菌對抗生素的敏感性。這些方法和組合物增強抗生素(尤其是四環素抗生素)的效力。
在控制抗生素MIC值的可變性的努力中，發明者吃驚地且出乎意料地發現向培養基中加入佐劑使所測定的MIC標準化。發明者進一步吃驚地且出乎意料地發現向培養基中加入佐劑抑制早期峰的形成，並且使所測定的MIC標準化。
詳細來說，為了控制MIC值的可變性，發明者進一步發現加入來源於例如大腸埃希氏菌(Escherichia coli)(E.coli)的微生物細胞質膜的佐劑使所測定的MIC標準化，所述佐劑充當氧氣淨化劑或還原劑。
本發明的一個實施例為提供對ATCC質量控制生物體提供敏感性測試結果的標準、一致值的培養基組合物。
本發明的另一個實施例為提供當對四環素進行測試時，對ATCC質量控制生物體提供敏感性測試結果的標準、一致值的培養基組合物。
本發明的另一個實施例為提供當對經7和9取代的四環素進行測試時，對ATCC質量控制生物體提供敏感性測試結果的標準、一致值的培養基組合物。
本發明的另一個實施例為提供當對替加環素進行測試時，對ATCC質量控制生物體提供敏感性測試結果的標準、一致值的培養基組合物。
廣泛方面來說，本發明的方法和相關組合物提供對四環素，並且尤其是對在7和9位置經取代的四環素，且特別是對替加環素的標準敏感性測試結果。
已發現含有新替加環素(TGC)的組合物。當測試時，本發明組合物對ATCC質量控制生物體提供標準敏感性測試結果。
提供包含替加環素、培養基和佐劑作為組份的組合物。當測試時，本組合物對ATCC質量控制生物體提供標準敏感性測試結果。
本發明進一步包含用於測定微生物敏感性的套組，所述套組包含密封或與培養基和佐劑接近的一種或一種以上抗生素。
在各種條件下，使用NCCLS程序通過肉湯微稀釋測定TGC的MIC。將MHB在2℃、室溫下無氧儲存，並且加入Oxyrase以測定各種條件的影響。用殺菌時間動力學證實用肉湯微稀釋液所觀測到的老化與新鮮培養基結果間的MIC差異。
當在新鮮製備的培養基中測試時，與用粉末商業製備和老化(7天)培養基(MIC分別為0.03-0.12和0.12-0.25μg/ml)相比，2至3倍稀釋的TGC對參照菌株更具活性。在測試之前儲存在無氧條件下的老化培養基與新鮮的培養基相似(MIC 0.03-0.12μg/ml)。加入Oxyrase導致與新鮮培養基相似的MIC(MIC 0.06-0.25μg/ml)。當在新鮮與老化培養基中測試TGC時，殺菌時間動力學證明活力生長有顯著(＞3log10)差異(圖1)。
本文所揭示及所主張的本發明提供這些和其他實施例。


圖1展示新鮮和老化Mueller-Hinton肉湯中替加環素(TGC)抵抗大腸埃希氏菌ATCC 25922的抗菌活性。
圖2展示向培養基中加入Oxyrase的HPLC分析和早期峰形成的抑制。
圖3展示向新鮮和老化培養基中加入Oxyrase的HPLC分析和早期峰形成的抑制。
圖4展示早期峰的質子核磁共振譜。
具體實施例方式
在以下描述中，利用了醫藥學技術中所使用的許多術語和活體外敏感性測試。為了清楚並一致地理解包括對所述術語所給範疇在內的說明書和權利要求書，提供下列定義。
佐劑意謂增強醫學治療效力的物質，並且進一步意謂自身可能具有或不具有抗菌活性但與足量抗生素組合用於穩定和增強敏感性測試的物質。佐劑包括選自以下各物質的群組的那些物質半胱氨酸、巰基乙酸鹽、抗壞血酸、丙酮酸鹽和觸酶。本文所描述的方法和組合物包括使用來源於例如大腸埃希氏菌的微生物的細胞質膜的佐劑，所述佐劑用作穩定劑。OXYRASE是由Oxyrase，Mansfield，OH 44901銷售的微生物(例如大腸埃希氏菌)的細胞質膜的商標，其在本文中進一步稱為Oxyrase或Oxyrase酶系統。Osyrase也稱為生物催化氧還原劑。此外，為氧還原劑並且為那些來源於微生物(例如含有氧氣淨化膜片段的大腸埃希氏菌)的細胞質膜的物質的佐劑可單獨使用或與其他佐劑組合使用。
佐劑作用意謂在佐劑存在下，所選抗生素的效力增加。此作用可通過培養微生物來展示，諸如(例如)在有和沒有佐劑的情況下於有效含量的一種或一種以上抗生素存在下能夠生長的傳染劑或臨床分離株，或其可行的提取物。存在佐劑增加抗生素，特別是四環素家族抗生素，且尤其是經7和9取代的四環素，且特別是替加環素的效力。可以定性或定量的術語描述細菌生長。定量結果的一實例可以簡單地指示可以由肉眼真實確定的生長或無生長。如所述技術所了解，定量結果的一實例可以比較在培養基中的天數與生長指數。生長指數的實例包括簡單等級符號(例如「-、+-、1+、2+、3+和4+」)和數字標記(例如0至999)，例如由BACTEC 12B培養系統所產生的符號和標記(BectonDickinson，Cockeysville，Md.，USA)。佐劑作用的顯著方面在於微生物的生長特徵存在可觀察的改變，所述改變自身揭示於本發明敏感性測試的內容中。
佐劑敏感性測試意謂在活體外檢驗中組合使用佐劑與四環素抗生素以用於建立微生物的抗生素敏感性圖案的目的。在佐劑敏感性測試中，將含有微生物(例如，微生物的同源群體或微生物的類型/變體/分離株等的混合物)的樣品暴露於包含抗生素、佐劑和培養基的組合物中，並且基於樣品中微生物的生活力測定樣品中微生物對所述抗生素的敏感性。佐劑敏感性測試是本發明方法的一個實施例。所述敏感性測試可以在如所述技術已知的包括Mueller-Hinton瓊脂或Mueller-Hinton肉湯的標準固體或肉湯培養基中或者在其他等效培養基中完成。所述培養基形式必須補充有如本文所討論的以適當組合形式且適當濃度的適當抗生素與佐劑。敏感性測試的目的在於測定對四環素，且尤其是對經7和9取代的四環素，並且進一步特別是對替加環素的抗菌敏感性。
如所述技術中所了解，敏感性微生物意謂微生物以使得所述臨床分離株或傳染劑無感受態、無感染性或無活力的方式受抗生素有害地影響(Yao，J.D.C.等人，InMurray，P.R.等人編輯，Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第1039-1073頁)。
如本文所使用的敏感與敏感性同義。當確定例如臨床分離株或傳染劑的微生物對所給抗生素敏感時，所述抗生素被說成具有抵抗所述分離株或傳染劑的活性，或對所述分離株或傳染劑呈活性。
敏感性測試意謂活體外檢驗，其中如技術中所了解，測定例如臨床分離株或傳染劑的微生物對一系列抗菌化合物(尤其是四環素，包括經7和9取代的四環素並且特別是替加環素)的敏感性(Jorgensen，J.H.等人，InMurray，P.R等人編輯的Manual of ClinicalMicrobiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第1102-1107頁；Jorgensen，J.H.等人，InMurray，P.R.等人編輯的Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第1108-1127頁)。(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2003.Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved StandardsM7-A6，第6版，第23卷，National Committee for Clinical LaboratoryStandards Wayne，PA.，National Committee for Clinical Laboratory Standards 2003.Methodsfor Dilution Antimicrobial Disk Susceptibility Tests；Approved StandardsM2-A8，第8版，第20卷.National Committee for Clinical Laboratory Standards，Wayne，PA.)。本文所描述的敏感性測試的目標為更精確地測定包括經7和9取代的四環素的四環素抗生素，且特別是替加環素的抗菌敏感性測試結果。
如所述技術中所了解，抗生素意謂所述技術所已知的對傳染劑的生活力、完整性、傳染性或感受態具有有害影響的化合物的任一者(參看Yao等人，InMurray，P.R.等人編輯的Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第1039-1073頁和Inderlied，C.B.等人，InMurray，P.R.等人編輯的Manual of ClinicalMicrobiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第1149-1177頁)。(Kucers，A.等人，The Use of Antibiotics第4增刊J.B.Lippincott Co.Philadelphia，Pa.(1987)；和Lorian，V.編輯的Antibiotics in Laboratory Medicine第2增刊，Williams Wilkins，Baltimore，Md.)。詳細來說，一類重要的抗生素是四環素，包括經7和9取代的四環素，且特別是替加環素。術語抗生素與如本文所用的抗菌劑、治療劑或藥物同義。所有抗生素都是藥物或治療劑，但不是所有藥物或治療劑都是抗生素。
如本文所使用的四環素或者尤其是四環素家族抗生素意謂如所述技術所了解的具有氫稠四苯結構作為核的抗生素(Yao，J.D.C.等人，InMurray，P.R.等人編輯，Manual ofClinical Microbiology，ASM.Press，Washington，D.C.(2003)第1051-1052頁)。(Kucers，A.等人，The Use of Antibiotics第4增刊J.B.Lippincott Co.Philadelphia，Pa.(1987)第979-1044頁)，並且尤其是經7和9取代的四環素和甘氨醯四環素。適用於本發明方法的四環素的實例包括(但不限於)四環素、氯四環素、氧四環素、二甲基氯四環素、去甲金黴素、甲烯土黴素(methacycline)、賴氨四環素(lymecycline)、氯莫環素(clomocycline)、脫氧土黴素(doxycycline)和米諾環素(minocycline)適用於本發明方法的甘氨醯四環素的實例包括(但不限於)N，N-二甲基甘氨醯基醯氨基9-氨基米諾環素(DMG-Mino)、N，N-二甲基甘氨醯基醯氨基9氨基-6-脫甲基-6-脫氧四環素(DMG-DMDOT)和替加環素。相當期望具有與上文指定的四環素或甘氨醯四環素化合物的任一者同源的化學結構的四環素和甘氨醯四環素亦可用於本發明的方法。
臨床分離株意謂引起感染的細菌劑的純化菌株，所述臨床分離株來源於受所述傳染劑感染的患者。一種或一種以上臨床分離株可來源於相同患者，或者相同的分離株可來源於不同患者，例如醫院發作期間所見(Pittet等人，Archives of Internal Medicine1551177-1184，(1995))。所述臨床分離株通常由樣本處理和培養方法的組合來純化。同樣地，這些臨床分離株有活力，並且因此可用於關於活體外檢驗(例如敏感性測試)中的抗生素敏感性作進一步分析和測試。用於純化這些臨床分離株的程序包括所述技術中所已知的方法和程序，尤其是那些由Kent，P.T.等人，″Public Health MycobacteriologyAGuide for the Level III Laboratory″，U.S.Department of Health and Human Service，Centersfor Disease Control，Atlanta，Ga.(1985)第31-70頁所描述且用於分離分枝桿菌(Mycobacterium)的方法和程序或由Pfyffer，G.E.等人，InMurray，P.R.等人編輯的Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第532-559頁))和Brown，J.M.等人，InMurray，P.R.等人編輯的Manual of Clinical Microbiology，ASMPress，Washington，D.C.(2003)第502-531頁))所概述的用於分離諾卡氏菌屬(Nocardiaspp.)的方法和由Funke，G.等人，InMurray，P.R.等人編輯的Manual of ClinicalMicrobiology，ASM Press，Washington，D.C.(2003)第472-501頁))所概述的用於分離棒狀桿菌(Coryneform)革蘭氏陽性杆狀病毒的方法。
如所述技術所了解，傳染劑意指傳染微生物，尤其是傳染細菌。根據本發明方法，尤其相關的傳染劑包括那些引起疾病的傳染劑(Isenberg，H.D.等人，InMurray，P.R.等人編輯的Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.1995第5-18頁)。據說具有由所述傳染劑引起的疾病的人類或動物患者具有由所述傳染劑引發的傳染，或者將受所述傳染劑傳染。據說引起疾病的傳染物為致病性。據說通常不為致病性的細菌與患者正常細菌叢的部分為共生體。在一些情形下，例如當患者免疫功能不全(immune compromise)或受到免疫抑制時(例如，受HIV感染，或者具有AIDS複合體，或者在經歷器官移植之後)，所述共生微生物可引起傳染。患者可感染一種或一種以上傳染劑。
最低抑制濃度(MIC)是肉眼所探測的完全抑制生物體在微滴定孔中生長的抗菌劑的最低濃度(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2003.Methods forDilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；ApprovedStandardsM7-A6，第6版，第23卷，National Committee for Clinical Laboratory StandardsWayne，PA.)。
將含有微生物的樣品暴露於本發明的組合物意在混合微生物與組合物，或者另外提供微生物與組合物之間的接觸。
因此，在本發明的最廣泛實施例中，本發明涉及一種用於表徵微生物對抗菌化合物的敏感性的方法。在另一個實施例中，受測試的微生物是傳染劑或臨床分離株。在另一個實施例中，待測試的微生物是從採集自被懷疑受非所需細菌感染或處於受非所需細菌感染風險下或被鑑定為受非所需細菌感染的患者的樣品中獲得。本發明的敏感性測試在本文中稱為佐劑敏感性測試。所述敏感性測試的結果表現存在於樣品中的受調查微生物(例如臨床分離株或傳染劑)關於本文所描述的佐劑作用的特徵。也就是說，本發明的佐劑敏感性測試鑑定存在於樣品中的微生物是否對受測試抗生素具敏感性。優選地，由於本發明的佐劑敏感性測試的結果，抗生素，且尤其是包括經7和9取代的四環素的四環素且特別是替加環素被鑑定為對存在於樣品中的微生物具敏感性。然而，同樣重要的是，由於本發明的敏感性測試的結果，其中抗生素，尤其是與佐劑組合的四環素被鑑定為對存在於樣品中的微生物具敏感性。
本發明進一步涉及一種用於穩定ATCC質量控制生物體的敏感性測試結果的液體或固體培養基組合物。已經發現向培養基中加入來源於例如大腸埃希氏菌的微生物的細胞質膜的佐劑使ATCC質量控制生物體的敏感性測試結果穩定。儘管不受理論限制，但是將氧還原劑用作佐劑減小了培養基中的含氧量，並且使(尤其是)ATCC質量控制生物體的敏感性測試結果穩定。詳細來說，如HPLC所測定，加入氧還原劑作為佐劑抑制早期峰的形成。
培養基組合物包含營養培養基、佐劑和精選的抗生素。所述佐劑視情況可以是氧還原劑，包括Oxyrase。其他佐劑是選自以下各物質的群組半胱氨酸、巰基乙酸鹽、抗壞血酸、丙酮酸鹽和觸酶，其範圍為培養基組合物的約0.0005％至約5.0％重量/體積[下文稱為w/v]，優選地範圍為約0.005％至約0.5％(w/v)，並且最優選地範圍為約0.05％(w/v)。
已經發現包括佐劑作為氧還原劑，且尤其是作為氧還原劑(例如來源於例如大腸埃希氏菌的微生物的細胞質膜的那些佐劑)使得當對(尤其是)經7和9取代的四環素進行測試時對ATCC質量控制微生物所測定的敏感性測試結果標準化。當所述佐劑來源於例如大腸埃希氏菌的微生物的細胞質膜，且尤其是Oxyrase時，所述佐劑範圍為培養基組合物的約0.5％至約10.0％體積/體積[下文稱為v/v])，優選地為約1.0％至約4.0％(v/v)，並且最優選地為約2.0％(v/v)。
製備敏感性測試培養基的方法為下列步驟a.通過向1.0升蒸餾水中加入22克粉末狀培養基來製備Mueller Hinton肉湯II培養基；b.高壓滅菌(121℃，15psi，15分鐘)並且冷卻所述培養基；c.加入高至約10％最終體積的Oxyrase，並且在培養箱中於35-37℃下保持30分鐘；
d.向96孔微滴定板的每孔中加入約50μL；e.將藥物稱重，並且將所述肉湯加入藥物中以達到約(標準128μg/ml)；f.向所述滴定板的第一列加入50μL所述藥物；g.通過在所述板間或所述板下進行兩倍連續稀釋來稀釋；h.製備108CFU/ml的PromptTM接種液；i.在所述肉湯中以1∶100(10μL/9.9ml(1∶100))稀釋接種液，形成106個菌落形成單元(CFU)的經調節的接種液；j.向所述微滴定板的孔中加入50μL經調節的接種液；k.將所述板在35-37℃下培養18-22小時；和l.肉眼讀出MIC。
本發明中所利用的營養培養基是適用於敏感性測試的任何液體或固體製劑。
本文中所描述的營養培養基優選地尤其適用於敏感性測試，包括四環素家族抗生素的敏感性測試，且尤其是涉及經7和9取代的四環素並且特別是替加環素的敏感性測試。
固體培養基通常由經例如瓊脂或明膠的試劑固化(也就是「凝膠」)的液體培養基組成。在本發明中適用於穩定ATCC質量控制生物體的臨界點的通常可利用的培養基的實例包括(但不限於)Brain Heart Infusion、Brucella、CDC Anaerobe、Nutrient、Schaedler、Thioglycollate、HTM(Haemophilus Test Medium)或Trypticase Soy.(Difco Manual第11版.1998.Difco Laboratories.Division of Becton Dickinson Company Sparks，Maryland)。這些均為肉湯或瓊脂形式，並且可以補充血液用於需要其他營養物質的複雜營養型生物體的生長。
通過使用購自Oxyrase，Inc.of Mansfield，Ohio的Oxyrase酶系統可無氧製得所述培養基。就這點來說，「用於瓊脂的Oxyrase.」是用於在許多細菌瓊脂培養基中製造無氧條件的過濾酶添加劑。類似地，「用於肉湯的Oxyrase.」是用於在細菌肉湯培養基中製造無氧環境的酶添加劑。這些培養基均以無菌(EC)和非無菌(EC/NS)形式購得。
上文所鑑定的Oxyrase酶系統由來源於例如大腸埃希氏菌的微生物的細胞質膜的酶系統組成。市售試劑由0.2微米或更小的膜粒子的緩衝懸浮液組成。酶系統在廣pH值和溫度範圍內具有活性。還原培養基中的氧所需的含有膜的酶系統的精確量因許多參數而變化，包括pH值、溫度、所存在的底物的種類和量、容器的表面與深度比和頂部空間體積。
用作本發明佐劑的優選Oxyrase酶系統包含含有電子傳遞系統的氧淨化膜片段，所述電子傳遞系統在存在氫供體下將氧還原成水。這些氧淨化膜片段可以來源於細菌的細胞質膜和/或許多較高等非細菌生物體的線粒體細胞器的膜。儘管通常並不是優選，但是例如葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、觸酶等的其他已知生物催化氧還原劑也可用於補充或用於本發明。
適用於本發明的優選Oxyrase酶系統包括使用來源於具有膜的細菌的無菌膜片段，所述無菌膜片段含有在營養培養基中存在氫供體下將氧還原成水的電子傳遞系統。已知許多細菌具有含有電子傳遞系統的細胞質膜，如果培養基中存在合適氫供體，那麼所述電子傳遞系統有效地將氧還原成水。細菌來源選自以下各細菌的群組大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。這些細菌膜可高度有效地將氧從培養基和其他含水和半固體環境中移除。
本發明尤其適用於測定ATCC質量控制生物體的敏感性測試結果，並且進一步用於表徵和測試臨床分離株或者治療由傳染微生物所引起的疾病。
本發明的方法涉及一種其中測試微生物對抗生素的敏感性的方法。在本發明的一個實施例中，所述微生物是臨床分離株。在本發明的一個優選實施例中，所述微生物是ATCC質量控制生物體。所述測試程序或療法適用於任何所需微生物，並且尤其適用於任何所需細菌。
本發明的方法(尤其是敏感性測試)也通過以套組形式提供所述方法中所用的試劑來便捷地實施。所述套組優選地含有適當的生長培養基(液體或固體)和作為所述套組對照物的佐劑與測試生物體或其組合、抗生素或其組合，以及(如果需要)適當純度的水。集合中的對照生物體、佐劑、培養基和/或抗生素可以是不特製用於一特定微生物的物質，或者是特製用於一特定微生物的物質。如果需要，那麼特異套組可特別含有特定生物體以(優選地)用作標準物。在所述套組中，如果非細菌組份並未如其可能的那樣已混合在一起，那麼所述組份通常相互之間緊密靠近(即使封閉在獨立的容器或包裝中)，並且與套組中所提供的任何細菌樣品緊密靠近，所述細菌樣品視情況可以是ATCC質量控制生物體。
所屬領域技術人員應了解在不影響本發明的精神或範疇或者其任何實施例的情況下，可在廣泛和等效範圍內的條件、參數和類似情況下實施本發明。
下列非限制性實例說明本發明的某些方面。
材料與方法生物體所使用的細菌分離株是由NCCLS推薦用於敏感性測試的質量控制的那些細菌分離株。(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2003.Methods for DilutionAntimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved StandardsM7-A6，第6版，第23卷，National Committee for Clinical Laboratory Standards Wayne，PA.，National Committee for Clinical Laboratory Standards 2003.Methods for DilutionAntimicrobial Disk Susceptibility Tests；Approved StandardsM2-A8，第8版，第20卷.National Committee for Clinical Laboratory Standards，Wayne，PA.)。標準的細菌分離株包括大腸埃希氏菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 29213、糞腸球菌(E.faecalis)ATCC 29212、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)ATCC 49247和流感嗜血桿菌(H.influenzae)ATCC 49247。大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌(S.pyogenes)、黏膜炎莫拉菌(M.catarrhalis)和流感嗜血桿菌的臨床分離株獲自Wyeth General Culture Collection。先前已經描述表達特徵性四環素抗性決定子的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌株(Petersen，P.J.，N.V.Jacobus，W.J.Weiss，P.E.Sum，和R.T.Testa，Antimicrob.Agents Chemother.43738-744，1999)。
抗生素與化學物質替加環素的標準粉末獲自Wyeth Research，Pearl River，NY。米諾環素、四環素、L-半胱氨酸、L-抗壞血酸、丙酮酸鈉、觸酶和巰基乙酸鈉購自Sigma/Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，Mo.)。Oxyrase購自Oxyrase Inc，Mansfield，OH。
敏感性測試如NCCLS所推薦，通過肉湯微稀釋方法測定替加環素和對照抗生素的活體外活性。(National Committee for Clinical Laboratory Standards，2003.Methods for DilutionAntimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved StandardsM7-A6，第6版，第23卷，National Committee for Clinical Laboratory Standards Wayne，PA.)用於標準程序。具有5％經溶解的馬血的MBH用於測試肺炎鏈球菌，且嗜血桿菌(Haemophilus)測試培養基用於測試流感嗜血桿菌。根據製造商說明書通過向50ml培養基中加入1ml Oxyrase來使用Oxyrase(Oxyrase Inc，Mansfield，OH)。通過在多個燒瓶中製備MHB，接著將培養基儲存於各種條件下來進行培養基老化研究。通常在每一測試天以一式兩份的方式進行MIC。無氧條件下的儲存在無氧室中進行(MACS MG1000，Don Whitley Scientific LTD)。通過pH計(Corning430)測定培養基的pH值。表1展示具有和不具有Oxyrase的通過瓊脂和肉湯稀釋法的替加環素抵抗臨床分離株的活體外活性的比較。
表1
具有和不具有Oxyrase的通過瓊脂和肉湯稀釋的替加環素抵抗臨床分離株的活體外活性的比較

表2展示Oxyrase對替加環素、其他甘氨醯四環素和米諾環素的活體外活性(MIC，μg/ml)的影響。
表2Oxyrase對替加環素和其他甘氨醯四環素與米諾環素的活體外活性(MIC，μg/ml)的影響

老化與新鮮培養基的殺菌時間實驗。
根據NCCLS指導通過肉湯巨稀釋方法進行殺菌時間檢驗(NCCLS.1999.Methodsfor Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents；Approved GuidelinesM26-A，第19卷.National Committee for Clinical Laboratory Standards，Wayne，PA.)。這些檢驗中採用大約為106CFU/ml的起始接種液，和最終濃度等於MIC四倍的抗生素。含有50mlMHB II和適當抗菌劑的燒瓶培養有50ml處於對數生長期的測試生物體。測試燒瓶(250ml)在35℃水浴中振蕩(150RPM)培養。移除等分試樣以測定0、2、4、6和24小時處的活菌計數。在無菌的0.85％氯化鈉溶液中製備連續稀釋液。用螺旋接種儀(plater)(Don Whitley Scientific LTD)將經稀釋的樣品(0.05ml)塗於適當瓊脂板胰酶解酪蛋白大豆瓊脂(TSA)上。所述板在周圍空氣中於35℃下培養18-22小時，並且在ProtoCOL讀板器接種儀上測定菌落數目(Don Whitley Scientific LTD)。通過對log10CFU/ml與24小時中的時間作圖來構造殺菌曲線，並且確定細菌濃度的變化。圖1以圖形方式展示數據。表3展示培養基年齡(新鮮對老化)與Oxyrase對替加環素活性的影響的最小抑制濃度結果。
如表3所示，補充有Oxyrase的老化培養基中所測定的替加環素的MIC與新鮮培養基中所測定的MIC幾乎相同。此外，也補充有Oxyrase的新鮮培養基中所測定的替加環素的MIC與未補充的新鮮培養基中所測定的MIC無顯著差異。
表3培養基時間與Oxyrase對替加環素活性的影響

培養基時間對替加環素的MIC的影響。
為了確定培養基時間對替加環素的活體外活性的影響，製備MHB並將其在室溫或2℃下儲存28天。在0、7、14、21和28天製備替加環素、米諾環素和四環素的微肉湯稀釋MIC塔板。如表4所示，在每一測試天平行測定6個樣品的MIC。如表4進一步所示，在四周的測試時期內，替加環素的MIC中存在可再現的3至4次稀釋增加。與儲存於室溫下的培養基相比，儲存於4℃下的培養基老化稍許緩慢。
如表4所示，其顯示第0天至第28天的間隔時間內，培養基時間、製備和儲存對替加環素抵抗參照生物體ATCC 25922、ATCC29213和ATCC29212的活體外活性(MIC，μg/ml)的影響。
表4培養基時間、製備和儲存對替加環素抵抗ATCC參照生物體大腸埃希氏菌ATCC25922(N＝6)的活體外活性(MIC，μg/ml)的影響

a室溫表6培養基來源、時間和儲存條件對替加環素活性的影響

如表5所示，新鮮培養基中所測定的替加環素MIC比老化培養基中所測定的替加環素MIC低1至3倍。為了進一步確定此影響，用大腸埃希氏菌ATCC25922在0.12和0.1μg/ml替加環素的新鮮與老化培養基中進行殺菌時間實驗，此代表老化培養基中所測定的所述生物體的1×和4×MIC。如圖1所示，當在新鮮培養基中測試時，0.12和0.1μg/ml替加環素均抑制大腸埃希氏菌ATCC25922的生長。然而，當在老化培養基中進行測試時，暴露於0.12μg/ml替加環素6h後菌株出現再生長。進一步參看表5，為了確定老化培養基的影響是否受QC生物體限制，在新鮮製備的肉湯中測定MIC，並且將所測定的MIC與使用一板包括肉湯臨床分離株與表達各種四環素抗性決定子的菌株的生物體在室溫(RT)下儲存2周的肉湯中所測定的那些MIC進行比較。
因為培養基的pH在時間上不存在改變，所以這不能解釋新鮮培養基中所測定的替加環素的MIC與老化培養基中所測定的那些MIC相比的差異。因此，儘管不受理論限制，但是其假定新鮮與老化培養基間的差異起因可歸因於氧化降解的加速和早期峰的形成，可由在儲存期間內所發生的肉湯培養基中所溶解的氧量增加所引起。因為顯示肉湯培養基中所溶解的氧濃度受替加環素MIC影響，所以進行研究以評估老化對已經在無氧室內儲存的培養基的影響。如表6所示，經商業製備的培養基和在RT下於室內空氣中老化2周的培養基導致替加環素MIC比新鮮製備培養基高1-4倍。相反，無氧條件下儲存的培養基導致替加環素的MIC與新鮮培養基中所獲的結果幾乎相同。
為了測試所述假設，在水、新鮮MHB和老化MHB中製備替加環素溶液。將所述溶液在RT下儲存隔夜，接著使其經受HPLC分析以觀測替加環素的降解。如圖2所示，HPLC分析展示在約11.5至12.0分鐘的保留時間內溶離的早期峰。如圖3所示，新鮮培養基的早期峰量約為水的早期峰量的12倍，而在老化培養基中所述比率約為35。此證實在老化培養基中替加環素的早期峰的形成加速。
高壓液相色譜法(HPLC)
在實驗1中，檢測三個實驗測試樣品的替加環素的早期峰形成。在實驗2中，評估六個實驗測試樣品以測定在24小時內發生的替加環素早期峰。結果如下列出實驗1媒劑實驗2媒劑1.新鮮的Mueller Hinton II 1.具有2％Oxyrase的新鮮Mueller Hinton II2.老化的Mueller Hinton II 2.不具有Oxyrase的新鮮Mueller Hinton II3.僅為水 3.具有2％Oxyrase的老化Mueller Hinton II4.不具有Oxyrase的老化Mueller Hinton II5.含有2％Oxyrase的水6.僅為水製備在上述媒劑的每一者中濃度為1mg/mL的替加環素，在0時和第1天時於RT下進行檢驗。
HPLC參數如下列出HPLC管柱Luna C18(2)，5μm，4.6×150mm探測250nm下的UV流率1.5mL/min注射體積＝30μL流動相A950mL水中6.8g KH2PO4，用KOH將pH調至6.2，與50mL乙腈混合流動相B500mL水中6.8g KH2PO4，用KOH將pH調至6.2，與500mL乙腈混合梯度時間(min) A％ B％0 95 5基線2060 40線性5 0100線性1 0100固持0.1 95 5基線據信早期峰具有下列結構式A，其特徵性質子核磁共振譜如圖4所示。
結構式A也可能互變異構形式存在，並且所述互變異構體如下所述 表5培養基時間對替加環素抵抗臨床分離株的活體外活性的影響最低抑制濃度(μg/ml)

為了確定肉湯培養基中所溶解的氧濃度是否可以由向培養基中加入還原劑來控制，在存在0.05％(w/v)L-半胱氨酸、0.05％L-抗壞血酸、0.05％丙酮酸鈉、0.05％觸酶和0.05％巰基乙酸鈉的情況下測定MIC，所有這些物質先前均報導為細菌病原體生長培養基中的還原劑。表7顯示還原劑對替加環素、米諾環素和四環素的活體外活性的影響。
表8與9總結Oxyrase對NCCLS質量控制菌株的影響-從9個調查者的許多獨立實驗組合的數據。
表7各種還原劑對替加環素、米諾環素和四環素的活體外活性的影響


表8使用Mueller Hinton肉湯或具有Oxyrase的Mueller Hinton肉湯的替加環素抵抗ATCC質量控制菌株a-j的MIC(μg/ml)分布

a.大腸埃希氏菌ATCC25922Mueller Hinton肉湯b.大腸埃希氏菌ATCC25922Mueller Hinton肉湯+Oxyrasec.金黃色葡萄球菌ATCC29213Mueller Hinton肉湯d.金黃色葡萄球菌ATCC29213Mueller Hinton肉湯+Oxyrasee.糞腸球菌ATCC29212Mueller Hinton肉湯f.糞腸球菌ATCC29212Mueller Hinton肉湯+Oxyraseg.肺炎鏈球菌ATCC49619Mueller Hinton肉湯h肺炎鏈球菌ATCC49619Mueller Hinton肉湯+Oxyrasei流感嗜血桿菌ATCC49247Mueller Hinton肉湯j流感嗜血桿菌ATCC49247Mueller Hinton肉湯+Oxyrase表9使用Mueller Hinton肉湯或具有Oxyrase的Mueller Hinton肉湯的替加環素抵抗ATCC質量控制菌株的MIC(μg/ml)分布

A大腸埃希氏菌ATCC 25922Mueller Hinton肉湯B大腸埃希氏菌ATCC 25922Mueller Hinton肉湯+OxyraseC金黃色葡萄球菌ATCC 29213Mueller Hinton肉湯D金黃色葡萄球菌ATCC 29213Mueller Hinton肉湯+OxyraseE糞腸球菌ATCC 29212Mueller Hinton肉湯F糞腸球菌ATCC 29212Mueller Hinton肉湯+Oxyrase
權利要求
1.一種用於測定ATCC質量控制生物體的敏感性測試的培養基組合物，其中所述培養基組合物包含營養培養基、抗生素和量足以穩定並增強敏感性測試的佐劑。
2.根據權利要求1所述的培養基組合物，其中所述佐劑選自以下各物質的群組半胱氨酸、巰基乙酸鹽、抗壞血酸、丙酮酸鹽和觸酶。
3.根據權利要求1所述的培養基組合物，其中所述佐劑來源於微生物的細胞質膜。
4.根據權利要求2所述的培養基組合物，其中所述佐劑的存在範圍為所述培養基組合物的約0.0005％至約5.0％重量/體積。
5.根據權利要求4所述的培養基組合物，其中所述佐劑的存在範圍為約0.005％至約0.5％ w/v。
6.根據權利要求4所述的培養基組合物，其中所述佐劑以約0.05％ w/v存在。
7.根據權利要求3所述的培養基組合物，其中所述佐劑的存在量為所述培養基組合物的約0.5％至約10.0％體積/體積。
8.根據權利要求3所述的培養基組合物，其中所述佐劑的存在量為約1.0％至約4.0％(v/v)。
9.根據權利要求3所述的培養基組合物，其中所述佐劑以約2.0％(v/v)存在。
10.根據權利要求1至9中任一權利要求所述的培養基組合物，其中所述抗生素是四環素。
11.根據權利要求10所述的培養基組合物，其中所述抗生素是經7，9-取代的四環素。
12.根據權利要求9所述的培養基組合物，其中所述四環素抗生素選自以下各物質的群組四環素、氯四環素、氧四環素、二甲基氯四環素、去甲金黴素、甲烯土黴素(methacycline)、賴氨四環素(lymecycline)、氯莫環素(clomocycline)、脫氧土黴素(doxycycline)、米諾環素(minocycline)、N，N-二甲基甘氨醯基醯氨基9-氨基米諾環素(DMG-mino)、N，N-二甲基甘氨醯基醯氨基9氨基-6-脫甲基-6-脫氧四環素(DMG-DMDOT)和替加環素(tigecycline)。
13.根據權利要求9所述的培養基組合物，其中所述四環素抗生素是替加環素。
14.根據權利要求3至13中任一權利要求所述的培養基組合物，其中所述微生物選自以下各微生物的群組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。
15.根據權利要求14所述的培養基組合物，其中所述微生物是大腸埃希氏菌。
16.一種穩定ATCC質量控制生物體的最低抑制濃度(MIC)測試值的方法，其包含下列步驟a.向培養基中加入量足以穩定並增強敏感性測試的佐劑和抗生素以形成用於測試的培養基；b.向所述用於測試的培養基中加入測試生物體；c.培養所述測試培養基；d.讀取所述MIC值。
17.一種穩定ATCC質量控制生物體的最低抑制濃度(MIC)測試值的方法，其包含以下步驟a.通過向1.0升蒸餾水中加入22克粉末狀培養基來製備Mueller Hinton肉湯II培養基；b.高壓滅菌(121℃，15psi，15分鐘)並且冷卻所述培養基；c.加入高至約10％最終體積的佐劑，並且在培養箱中於35-37℃下保持30分鐘；d.向96孔微滴定板的每孔中加入約50μL；e.將抗生素稱重，並且將所述肉湯加入藥物以達到約(標準128μg/ml)；f.向所述滴定板的第一列加入50μL所述抗生素；g.通過在所述板間或所述板下進行兩倍連續稀釋來稀釋；h.製備108CFU/ml的接種液；i.在所述肉湯中以1∶100(10μL/9.9ml(1∶100))稀釋接種液，形成106個菌落形成單元(CFU)的經調節的接種液；j.向所述微滴定板的所述孔中加入50μL所述經調節的接種液；k.將所述板在35-37℃下培養18-22小時；和l.肉眼讀取所述MIC。
18.根據權利要求16或17所述的方法，其中所述佐劑來源於微生物的細胞質膜。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述佐劑的存在量為所述培養基組合物的約0.5％至約10.0％體積/體積。
20.根據權利要求18所述的方法，其中培養基中所述佐劑的存在量為約1.0％至約4.0％(v/v)。
21.根據權利要求18所述的方法，其中所述佐劑以約2.0％(v/v)存在。
22.根據權利要求16至21中任一權利要求所述的方法，其中所述抗生素是四環素。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述抗生素是經7，9-取代的四環素。
24.根據權利要求22所述的方法，其中所述四環素抗生素選自以下各物質的群組四環素、氯四環素、氧四環素、二甲基氯四環素、去甲金黴素、甲烯土黴素、賴氨四環素、氯莫環素、脫氧土黴素、米諾環素、N，N-二甲基甘氨醯基醯氨基9-氨基米諾環素(DMG-mino)、N，N-二甲基甘氨醯基醯氨基9氨基-6-脫甲基-6-脫氧四環素(DMG-DMDOT)和替加環素。
25.根據權利要求22所述的方法，其中所述四環素抗生素是替加環素。
26.根據權利要求18至25中任一權利要求所述的方法，其中所述微生物選自以下各微生物的群組大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、氧化葡萄糖酸桿菌和綠膿桿菌。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述微生物是大腸埃希氏菌。
28.一種用於測定ATCC質量控制生物體的敏感性測試的培養基組合物，其中所述培養基組合物包含營養培養基、佐劑和抗生素，其中所述佐劑的存在量足以抑制通過高壓液相色譜法以約11.5-12.0分鐘的保留時間所測定的早期峰的形成。
29.根據權利要求28所述的培養基組合物，其中所述佐劑來源於微生物的細胞質膜。
30.根據權利要求29所述的培養基組合物，其中培養基中所述佐劑的存在量為約0.5％至約10.0％。
31.根據權利要求29所述的培養基組合物，其中培養基中所述佐劑的存在量為約1.0％至約4.0％。
32.根據權利要求29所述的培養基組合物，其中所述佐劑以約2.0％存在。
33.根據權利要求28至32中任一權利要求所述的培養基組合物，其中所述抗生素是四環素。
34.根據權利要求33所述的培養基組合物，其中所述抗生素是經7，9-取代的四環素。
35.根據權利要求33所述的培養基組合物，其中所述四環素抗生素選自以下各物質的群組四環素、氯四環素、氧四環素、二甲基氯四環素、去甲金黴素、甲烯土黴素、賴氨四環素、氯莫環素、脫氧土黴素、米諾環素、N，N-二甲基甘氨醯基醯氨基9-氨基米諾環素(DMG-mino)、N，N-二甲基甘氨醯基醯氨基9氨基-6-脫甲基-6-脫氧四環素(DMG-DMDOT)和替加環素。
36.根據權利要求33所述的培養基組合物，其中所述四環素抗生素是替加環素。
37.根據權利要求33所述的培養基組合物，其中所述微生物選自以下各微生物的群組大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、氧化葡萄糖酸桿菌和綠膿桿菌。
38.根據權利要求33所述的培養基組合物，其中所述微生物是大腸埃希氏菌。
39.一種用於測定ATCC質量控制生物體的敏感性測試的培養基組合物，其中所述培養基組合物包含營養培養基、佐劑和四環素抗生素，其中所述佐劑的存在量足以抑制通過高壓液相色譜法所測定的早期峰的形成。
40.一種用於測定ATCC質量控制生物體的敏感性測試的培養基組合物，其中所述培養基組合物包含營養培養基、佐劑和經7，9-取代的四環素抗生素，其中所述佐劑的存在量足以抑制通過高壓液相色譜法所測定的早期峰的形成。
41.一種用於測定ATCC質量控制生物體的敏感性測試的培養基組合物，其中所述培養基組合物包含營養培養基、佐劑和替加環素抗生素，其中所述佐劑的存在量足以抑制通過高壓液相色譜法以約11.5-12.0分鐘的保留時間所測定的早期峰的形成。
42.一種用於測定ATCC質量控制生物體的敏感性測試的培養基組合物，其中所述培養基組合物包含新鮮的營養培養基和抗生素以穩定並增強敏感性測試。
43.根據權利要求42所述的培養基組合物，其中所述新鮮的營養培養基不超過12小時。
44.根據權利要求42所述的培養基組合物，其中所述抗生素是替加環素。
全文摘要
本發明涉及一種用於測定ATCC質量控制生物體的敏感性測試的培養基組合物，其中所述培養基組合物包含營養培養基、抗生素和量足以穩定並增強敏感性測試的佐劑。
文檔編號C12Q1/04GK1890378SQ200480036523
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月9日 優先權日2003年12月11日
發明者帕特裡夏·安·布拉德福德, 彼得·詹姆斯·彼得森 申請人:惠氏控股公司