設計用於以高靈敏度檢測擴增子的捕獲分子的製作方法

2023-05-31 18:05:41

專利名稱：：設計用於以高靈敏度檢測擴增子的捕獲分子的製作方法設計用於以高靈敏度檢測擴增子的捕獲分子
背景技術：
：1.發明領域本發明屬診斷領域，涉及設計和/或製備捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用於檢測和/或定量樣品中由引物對擴增所產生的潛在的核苷酸序列。通過本發明的方法設計出的捕獲分子尤其適用於鑑定和/或定量同一屬或科的微生物或鑑定和/或定量存在於生物樣品中的特定生物體中的相關基因。2.
背景技術：
：生物晶片技術的發展使可在給定實驗中同時檢測多個核苷酸序列，從而使可鑑定相應生物體或部分生物體。陣列是在表面含有一系列栽有捕獲分子(或探針)的離散區域的固體支持物，可結合(通過雜交)可能存在於待分析樣品中的相應靶核苷酸序列。如果靶序列在反轉錄過程中或在所述序列的擴增過程中被經修飾的核苷酸標記，便可在結合位置檢測和測量到信號。可通過所述信號強度估計樣品中靶序列的存在量。此技術使得可診斷或篩選目的鑑定和/或定量物種或基因。AffymetrixInc.公司已開發出一種在固體支持物的特定位置直接合成寡核苷酸的方法，此過程的每一步都使用罩子。所述方法包括，向延伸中的寡核苷酸加入新核苷酸，以在所需位置得到所需序列。此方法源自光刻技術，並結合使用了於新核苷酸加入前釋放的光保護基團(EP-Al-0476014，美國專利No.5,445,934、美國專利No.5，143，854和美國專利No.5,510,270)。然而，只有小的寡核苷酸存在於表面上，所述方法主要被應用於測序或鑑定陽性樣點圖譜，所述陽性樣點圖譜對應於結合於陣列上的每個特定寡核苷酸。可通過比較所述圖譜與參照而鑑定靶序列。所述技術被應用於鑑定結核分枝桿菌r戸5基因(wo97/29212和W098/28444)，其中所述捕獲分子含有少於30個核苷酸，且可分析兩個相差一個核苷酸的不同序列(SNP或基因型的鑑定)。優選小捕獲分子(長度10-20核苷酸之間)，因為長度越短，相差一個鹼基的兩個寡核苷酸之間的差別越大。所述方法的局限性在於無法直接檢測由基因擴增(PCR)產生的擴增子。在使用具有T3或T7序列的引物進行雙擴增後，使用RNA聚合酶反轉錄至單鏈RNA後方可進行檢測。在陣列上檢測前，將所述RNA序列切成約40個鹼基的片段(WO97/29212的實施例1)。長DNA或RNA片段與表面上的捕獲分子雜交甚慢，或根本不雜交。因此，使用所述方法檢測同源序列較複雜，因為同源性隨序列而變，使得部分所述片段可雜交至同一捕獲分子。所以所述方法需要有複合的計算機軟體以重建序列及解析結果。當使用小捕獲分子陣列時，基於mRNA的cDNA拷貝的基因表達陣列也遇到了同樣的問題雜交速度低。因此，片段被切成更小的片段庫，且所述方法要求使用幾個捕獲分子，以得到證實給定基因存在的信號圖鐠(WO97/10364和W097/27317)。所述切割也降低經標記的核苷酸數，從而降低所得信號。在這種情況下，使用長捕獲分子可提供更好的檢測靈敏度。在多基因表達應用中，當待檢測的cDNA源自序列不同的基因時，由於相互之間無交叉反應，所以使用長捕獲分子不是個問題。雖然長捕獲分子可提供所需靈敏度，但當存在同源序列存在的可能性時，它們不能被使用，因為它們會雜交至同一捕獲分子而使檢測非特異，已有人建議使用膜和尼龍支持物，通過在支持物和捕獲分子間摻入間隔區，以提高固體支持物上檢測的靈敏度。VanNess等人(NucleicAcidsResearch,Vol.19，p.3345，1991)描述了用於結合DNA與尼龍膜的聚(乙撐亞胺)臂。歐洲專利申請EP-0511559描述了用於結合小寡核苷酸與膜的作為間隔區的六乙二醇衍生物。當將膜(如尼龍)用作支持物時，無法控制固體支持物和寡核苷酸間的結合位點。已觀察到polydT尾增加固定產率，所得雜交產率也增加(WO089/11548)。使用存在於多聚物中的重複捕獲序列也可得到相似結果(美國專利No.5，683，872)。Guo等人(NucleicAcidsResearch,Vol.22，p.5456，1994)教導了以更高雜交靈敏度將寡核苷酸結合至玻璃的15個鹼基的polydT作為間隔區的用途。PCT申請WO99/16780描述了尼龍載波片上基因Fe附J的4個同源序列的檢測。但沒有提供有關方法和檢測的靈敏度的數據。在所述文件中，捕獲分子含有15-350個鹼基，與共有序列的同源性小於50%。Anthony等人的文章(Journalofclinicalmicrobiology,Vol.38，p.7817,2000)描述了膜陣列在以低靈敏度分辨源自幾種相關生物體的同源序列中的用途。待檢測的靶是通過共有PCR從細菌擴增出的rDNA，可在含有用於所述細菌的捕獲分子的尼龍陣列上檢測到，其中使所述捕獲分子長20-30個鹼基，並共價連接到尼龍上。無法控制可雜交的序列部分。Peytavi等人的文章(BioTechniques,Vol.39，p.89,2005)討論了有關402和432bpermB產物與20-mer寡核苷酸捕獲分子的雜交效率的實驗。報導的結果表明，由於游離的5'突出端與第二條擴增子鏈復性，導致被捕獲的鏈不穩定。因此，仍然需要設計捕獲分子的方法，所述方法需要在保持檢測特異性的同時，以高產量高速度地在被固定的捕獲分子上檢測存在於溶液中的雙鏈擴增序列。所述設計方法同時應該考慮由於引物對的選擇對其造成的限制。本發明通過提供簡單有效的設計捕獲分子的方法應對所有所述限制，所述捕獲分子被用於檢測經固定的捕獲分子上的PCR擴增序列。發明目的本發明旨在提供設計和/或製備捕獲分子的新方法，所述捕獲分子被用於通過引物對擴增後或過程中的大量(微)生物體或部分(微)生物體的簡便鑑定(檢測和/或定量)。本發明還旨在提供允許要求在擴增步驟中使用單個引物的簡化的技術，允許通過在所述微陣列上鑑定和/或記錄單個點信號鑑定(檢測和/或定量)特異的靶序列，所述信號只來自靶序列與它對應的捕獲分子的特異結合。發明概述本發明在一個實施方案中涉及設計多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用於檢測與之雜交的擴增子，所述擴增子的一條鏈作為待檢測和/或定量的靶，所述方法包括以下步驟a)選擇引物對定義擴增子；b)在擴增子內選擇10-100個核苷酸的特異序列，使所述特異序列定義擴增子的兩個非互補末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補，所述間隔區部分含有至少20個核苷酸；d)在擴增子的兩個非互補末端中分別鑑定出間隔區末端和非間隔區末端，使所述間隔區末端不與所述捕獲分子的所述間隔區部分互補，且所述間隔區末端比所述非間隔區末端多出至少50個鹼基。本發明在另一個實施方案中設計製備多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用於檢測與之雜交的擴增子，所述擴增子的一條鏈作為待檢測和/或定量的靶，所述方法包括以下步驟a)選擇引物對定義擴增子；b)在擴增子內選擇10-100個核苷酸的特異序列，^使所述特異序列定義擴增子的兩個非互補末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補，所述間隔區部分含有至少20個核苷d)在擴增子的兩個非互補末端中分別鑑定出間隔區末端和非間隔區末端，使所述間隔區末端不與所述捕獲分子的所述間隔區部分互補，且所述間隔區末端比所述非間隔區末端多出至少50個鹼基；e)合成所述捕獲分子。本發明還在另一個實施方案中涉及可通過上述方法得到的捕獲分子。本發明在第4個實施方案中涉及在檢測擴增子的方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包含通過本發明的方法設計的捕獲分子。附圖簡述可參照下列附圖更好地理解本發明的特徵和優點，其中圖1示在實施例1的實驗中使用的靶擴增子鏈中的不同捕獲分子的位置。圖示具有互補的反義特異捕獲部分(CAS)的捕獲分子上的正義靼鏈(S)的位置和具有互補的正義特異捕獲部分(CS)的捕獲分子上的反義乾(AS)的位置。指示了每個構型的游離非間隔區末端和游離間隔區末端的長度(核苷酸)。所有已描述的相互作用的擴增子和捕獲分子鏈的5，-3，方向都相同。不同的捕獲分子的間隔區部分(90個核苷酸)和捕獲部分(27個核苷酸)長度相同。圖2示螢光強度與正義靶鏈(圖2A)和反義鏈(圖2B)在各自捕獲分子(la，2a，3a)和(ls，2s，3s)上的游離間隔區末端(核苷酸)長度間的相關性。所述實驗設計顯示於圖1。圖3示間隔區部分長度(核苷酸)對如實施例2中提供的雜交產率(螢光強度)的影響。使用本發明的間隔區部分長度不同的捕獲分子進行所述實驗。間隔區部分長度為20-95個核苷酸及特異於靶分子的27個鹼基的恆定捕獲部分。實施方案詳述以下結合實施例(僅用作實施例)與附圖描述本發明的某些實施方案。術語"核酸"、"寡核苷酸"、"陣列"、"探針"、"靶核酸"、"基本結合"、"特異雜交"、"背景"和"定量"如通過引用併入本文的國際專利申請W097/27317中所述。術語"核苷三磷酸"、"核苷酸"和"引物序列，，如通過引用併入本文的文獻WO00/72018中所述。術語"同源序列"和"共有序列，，如通過引用併入本文的歐洲專利申請W001/77372中所述。術語"同源性"指一個多核普酸序列與另一個多核苷酸序列間的同一性程度。兩個或多個多核苷酸之間可完全同源(即，100%的同一性)。可在序列比對後通過本領域技術人員熟知的任何方法測定而計算同源性程度。本文所述"捕獲分子"指能夠特異性結合一個靶分子或一個家族的靶分子或多個靶分子中的一個或多個成員或其部分的分子、或分子的複合體或組合體。捕獲分子優選是核酸，既可在支持物表面原位化學合成，也可易位合成後隨即固定在支持物上。核酸結合是通過兩個多核苷酸間的鹼基配對實現的，其中一個是經固定的捕獲分子，另一個是待檢測的靶。捕獲分子也包括核酸的衍生物，如PNA或LNA，只要其可特異性結合靶多核苷酸分子。術語"單個捕獲分子種(siglecapturemoleculespecies)，，是用於通過鹼基配對雜交或通過多肽或蛋白質之間的分子識別檢測給定序列的相關多核苷酸的組合物。多核苷酸可化學合成或酶學合成，或從樣品中分離，但合成或分離並不總是完美的，捕獲分子會被其他相關分子，如較短的多核苷酸汙染。本發明的捕獲庫的基本特徵是整個庫都可用於捕獲給定靶核苷酸分子。本文描述的術語"與一個或多個基因或基因組序列互補的多核苷酸序列，，指在嚴格條件下可與所述基因或基因組或其拷貝的至少部分核普酸序列雜交的多核苷酸。多核苷酸也包括可用於特定的條件的寡核苷酸(含有2個以上，100個以下的鹼基)。所述可雜交多核苷酸一般在核苷酸水平表現出與所述基因或基因組至少約75%的序列同一性，優選與所述基因或基因組約80%或95%的序列同一性或優選95%以上的核苷酸序列同一性。根據實驗的特異性和敏感性要求，它們一般由15-30個鹼基，或更長的30-100個鹼基，或再長的100-800個鹼基長的小序列構成。"微陣列"指固定有多個捕獲分子以可結合給定的特定靶分子的支持物。微陣列優選由存在於支持物表面或內部或覆蓋支持物的基質上特異定位區域中的捕獲分子構成。特異定位區域是含有特異於已確定的靶分子的結合有捕獲分子的表面上的區域。特異定位區域是通過建立微陣列的方法知曉的，或在檢測過程中或檢測後確定的。樣點是有特異靶分子固定於其捕獲分子上的，可通過檢測器觀察到的區域。樣點是有特異靶分子固定於其捕獲分子上的，可通過檢測器觀察到的區域。在本發明的特別的申請中，只要不同的支持物含有特定的捕獲分子並可相互區分，以可定量特定靶分子，捕獲分子的微陣列也可提供在不同的支持物上。這可通過使用具有特別特徵和能相互識別以定量結合的分子的珠混合物來實現。然後可將一個珠或一群珠作為具有特異於靶分子的捕獲分子的樣點。本發明的"擴增子，，指由存在於生物材料中的核苷酸分子的PCR擴增產生的靶核苷酸分子。發明人發現大幅度地簡化在許多其他具有同源序列的(微)生物體中鑑定一個和幾個(微)生物體的過程是可能的，方法是通過將使用通用引物對進行單一擴增與通過檢測和可能記錄陣列上只來自捕獲序列及其相應靶序列間的結合的單個信號的存在而進行的可能的(微)生物體的鑑定結合，並將所檢測的把序列的存在與特異於所述(微)生物體的遺傳序列的鑑定相關聯。本發明的方法和裝置尤其允許容易地在同源序列中鑑定/檢測特定序列，及可能定量(鑑定許多拷貝或在生物樣品中所述生物體的存在)把序列，所述乾序列具有特異於所述(微)生物體的核苷酸序列。可通過檢測或可能記錄特定位置處(有捕獲分子預先結合)的單個樣點信號直接或在洗掉可能的汙染物(未結合序列)後得到所述鑑定結果。特定序列的鑑定結果不是通過進行本領域現有技術推薦的微陣列分析特定圖鐠得到的。因此，所述方法和裝置無需通過圖像處理和軟體分析對所述圖傳進行詳細分析。如果捕獲分子具有本發明公開的特別的特徵，可通過使用結合的所述捕獲分子以高靈敏度陣列區分靶序列與其它同源序列，所述捕獲分子由至少兩部分構成，一部分是通過單個且優選預定(定義的)的連接子結合至支持物(優選非多孔支持物)上的間隔區部分，其他部分是可與核苷酸靶序列雜交的特異性核苷酸序列(捕獲部分)，以上發現使得所述檢測成為可能。本發明公開經特定設計的捕獲分子的特別的特徵，有助於以高靈敏度並快速檢測存在於溶液中的擴增子。發明人發現，欲使用固定的捕獲分子以高靈敏度、高速檢測包括PCR擴增產物在內的擴增子，需特定設計捕獲分子。本發明涉及設計和/或製備多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用於檢測與之雜交的擴增子，所述擴增子的一條鏈作為待檢測和/或定量的靶。所述方法包括以下步驟a)選擇引物對定義擴增子；b)在擴增子內選擇10-100個核苷酸的特異序列，使所述特異序列定義擴增子的兩個非互補末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補，所述間隔區部分含有至少20個核苷酸；d)在擴增子的兩個非互補末端中分別鑑定出間隔區末端和非間隔區末端，使所述間隔區末端不與所述捕獲分子的所述間隔區部分互補，且所述間隔區末端比所述非間隔區末端多出至少50個鹼基。本發明在第二個實施方案中涉及製備捕獲分子的方法。本發明在第三個實施方案中涉及可通過上述方法得到的捕獲分子。本發明在第四個實施方案中涉及使用所述捕獲分子檢測擴增子的方法。本發明在第五個實施方案中涉及檢測擴增子的試劑盒，所述試劑盒包含捕獲分子。應理解，在許多情況下，引物對的選擇很大程度受到期望的反應條件和對共有引物的需要的影響。引物的選擇反過來限定了待產生的擴增子。接下來，在擴增子上鑑定用於與捕獲分子的選擇性雜交的序列。需要在擴增子上選擇可能與同源擴增子的對應區域不同的區域。為達本發明的目的，有必要將選定的序列定位在與擴增子末端確定的距離處。選定的序列確定了擴增子的兩個末端，一個末端比另一個長。較長的末端將成為間隔區末端；較短的末端將成為非間隔區末端。間隔區末端比非間隔區末端長至少50個鹼基。捕獲分子包含捕獲部分和間隔區部分。捕獲部分一般與所述擴增子的選定序列互補，以保證擴增子與捕獲分子的最佳雜交。間隔區部分也是多核苷酸，但不與擴增子的間隔區末端互補(當然也不與非間隔區末端互補)。在優選的實施方案中，捕獲分子固定在固體支持物上，其間隔區部分定位於支持物一側，而特異於擴增子的捕獲分子的序列(即，捕獲部分)定位於游離末端。換言之，間隔區部分定位於固體支持物和捕獲部分之間。可通過任何本領域已知方法附著於固體支持物上。應理解，捕獲分子的間隔區部分可從捕獲部分的5，末端或其3，末端延伸。這是由需要擴增子的間隔區末端比其非間隔區末端更長(至少長50個鹼基)決定的。如果捕獲分子的間隔區部分在捕獲部分的5，末端，則捕獲分子附著於固體表面是在捕獲分子的5，末端或附近。相反，如果間隔區部分在捕獲部分的3，末端，則捕獲分子通過其3，末端或附近附著於固體支持物上。在另一個實施方案中，捕獲分子的間隔區部分的遠端具有含有游離氨基的核苷酸，待用於在優選含有胺可在其上反應的醛或環氧化合物官能團或其他化學基團的活化的支持物上反應，以能在捕獲分子和支持物之間或在覆蓋支持物的材料上形成共價鍵。本發明的方法給出的最佳結果是檢測長度至少200個核苷酸，優選至少300個，更優選多於400個核苷酸的擴增子。所以優選所述長度的擴增子。發明人發現使用長間隔區部分可顯著提高檢測速度和產率。捕獲分子的捕獲部分與固體支持物表面優選被至少約6.8nm(相當於在雙螺旋形式的至少20個鹼基對長的核苷酸的距離)的間隔區部分隔開。在優選的實施方案中，捕獲分子的間隔區部分是由至少20個核苷酸，優選40個以上，更優選60個以上和最優選90個核苷酸以上的核苷酸序列構成的多核苷酸鏈。在優選的實施方案中，捕獲分子具有與如下序列具有至少60%同源性的間隔區部分5，GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGTTCAATGGAAGGAAGCG3'(SEQIDNO:l)(40個鹼基)。所述同源性更優選至少80%，最優選至少90%。在另一個實施方案中，捕獲分子具有與如下序列具有至少60%的同源性的間隔區部分5，AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTCCTATATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC3，(SEQIDNO:2)(90個鹼基)。所述同源性更優選至少80%，最優選至少90%。在優選的實施方案中，捕獲分子具有與如下序列具有至少60%的同源性的間隔區部分5，ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTAT丁CACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA3'(SEQIDNO:3)(95個鹼基)。所述同源性更優選至少80%，最優選至少90%。本發明的另一個重要方面是使用固體支持物的表面上的特定濃度的捕獲分子。如果這一濃度太低，結合產率就低，還可能檢測不到。將捕獲分子固定到固體支持物的過程中，點樣溶液中捕獲分子的濃度優選約600-約3000nM。但在有利的情況(當共價固定的產率高；或當待檢測的靶是單鏈，並以高濃度存在時)下，低如約100nM濃度仍可給出陽性結果。所述低點樣濃度給出的捕獲分子的密度低如20fmoles/cm2。另一方面，更高密度在測定中只受到捕獲溶液濃度的限制，但高於3000nM的濃度仍可給出好結果。表面密度通常不超過2000fmoles/cm2。如本發明所述使用所述非常高的濃度、長間隔區部分和特別設計的捕獲分子是本發明出乎意料的特徵。DNA雜交理論提示，溶液中兩個DNA互補序列之間的雜交速度與DNA長度的平方根成正比，較小的是限制因素(WetmurandDavidson,J.Mol.Biol，Vol.3，p.584，1968)。為達到所需檢測特異性，捕獲分子的特定序列(捕獲部分)不得不短於靶，因為較長的序列有更多機會與非特異序列發生交叉反應。因為它們小，所以其與互補序列的反應速度低。另外，捕獲分子還在支持物上，由於擴散限制，固體表面的存在甚至更加降低了反應速度。由於靶是PCR擴增得到的，並是雙鏈，所以它們在溶液中復性比它們與固定於固體支持物上的小序列雜交快得多，在固體支持物上的擴散較小，從而甚至更加減低了反應速度。本發明出乎意料地觀察到擴增子在如此短的特異序列上有如此大的雜交產率。這樣出乎意料的效果的原因還不清楚。可能的解釋之一是以下列方式由所述間隔區部分的核苷酸序列的擴增子鏈穩定化的出乎意料的效果，DNA雜交過程分為兩步成核和扣緊。在成核步驟中，靶的約5個鹼基的短序列伸展沿著捕獲分子序列相互作用，直到發現完美的匹配。這一步驟是雜交的限制步驟。多核苷酸間隔區部分的存在可在成核過程中起穩定因子的作用。即便間隔區部分不與靶互補，它也將與在鄰近定位並將導致一些相互作用的穩定化的靶的一些鹼基相互作用。一旦完成成核，鄰近鹼基的雜交就非常快(zippering，扣緊)，且雙螺旋的增殖穩定雜交。本發明的方法可通過提供包含實施本方法所必需的特定成分的試劑盒來實施。所述試劑盒特別包含通過本發明的方法設計的捕獲分子。所述試劑盒還可包含固體支持物。所述固體支持物可經預處理，以與捕獲分子的間隔區部分反應，或者所述固體支持物可有捕獲分子固定於其上。另外，所述試劑盒還可含有用於進行擴增子與捕獲分子的雜交的工具和/或用於進行PCR的引物和標記工具和/或洗滌溶液。在優選的實施方案中，所述試劑盒至少含有不可溶的固體支持物，面)，其中所述微陣列為至少4個捕獲分子/cm2，優選至少10，16，20，50,100，1000，4000，10000或更多不同捕獲分子/em2固體支持物表面o捕獲分子長度優為約30-約600個鹼基，優選30-300個鹼基，更優選40-150個鹼基(包括間隔區部分)，並含有約10-約100個鹼基的捕獲部分，所述捕獲部分特異於靶(這意味著所述序列的所述鹼基可通過互補雜交與其靶序列上的互補鹼基結合)。所述雜交優選在嚴格條件下(在本領域技術人員熟知的條件下)進行。在本發明的方法中，與所述靶互補的捕獲分子的所述部分(或其部分)含有10-100個核苷酸，優選15-40個核苷酸，更優選20-30個核苷酸。所述核苷酸優選為位於或靠近捕獲分子末端的連續序列。這一序列被認為是用於檢測的特異序列(捕獲部分)。在優選的實施方案中，捕獲部分可區分靶序列與至少與所述靶的同源性不到85%的另一個序列。在另一個實施方案中，用於檢測兩個不同的擴增子的兩個捕獲分子的所述捕獲部分相差10%以上，甚至優選20%以上。本發明設計的捕獲分子可使鑑定從(微)生物體或其部分得到的靶序列，尤其是可能存在於來自至少4個其他同源(微)生物體或其部分的生物樣品中的基因，所述其他(微)生物體可能存在於所述相同的生物樣品中並具有與靶同源的核苷酸序列。通過首先使用通用引物對所述核苷酸序列(乾及其同源序列)進行基因擴增，然後再(洗滌後)區分所述經擴增的可能不同的把而進行所述鑑定。可優選通過在給定位置含有特異於靶(特異於每個可能存在於生物樣品中的(微)生物體)的捕獲分子的陣列表面進行雜交，再通過鑑定和可能的記錄來自所述靶與其對應的捕獲分子在預期位置上的特異性結合的信號(特異於靶的單個定位信號)鑑定所述特異靶而進行所述區分。根據本發明，優選的基因擴增的方法是使用可識別所有所述靶同源核苷酸序列的兩個反向共有引物的PCR。選擇所述引物，從而使得到的擴增子至少含有200bp，優選至少300bp，更優選至少400bp;所述擴增子優選不超過2000bp。本發明的方法還包括將所述檢測信號(可能記錄)與下列的存在相關聯的步驟特定(微)生物體、序列的遺傳特徵、序列多態性、遺傳疾病的診斷誘因或演化(檢測)，所述遺傳疾病包括已從中得到生物樣品的患者(包括人)的癌症。(微)生物體可存在於任何得到遺傳物質的生物物質(病毒，真菌，細菌，植物，或動物細胞，包括人)中。生物樣品也可為任何培養基質，其中存在微生物、異生素，汙染物，以及從植物或動物(包括人)器官、組織、細胞或生物液體(血液，血清，尿等)得到的提取物。本發明的方法尤其適用於鑑定可能存在於至少存在4，l2，15或甚至更多的同源序列的生物樣品中的靶，所述靶優選是(微)生物體或其部分。由於高度同源，可使用通用引物擴增所述序列，從而可通過乾與相應的捕獲分子結合後的所述區分特異性地鑑定所述靶，其中所述捕獲分子預先結合於所述微陣列的給定位置上。若將捕獲分子通過機器手高密度陣列點樣於固體支持物表面，也可大大提高靈敏度。本發明的優選實施方案在於將可至約0.01-5pmole序列等同物/cm2固體支持物表面的捕獲分子點樣到陣列上。本發明的試劑盒也可摻入各種用於實施本發明的方法的介質或裝置。所述試劑盒(或裝置)也可包含於用於檢測和/或定量存在於待分析的生物樣品中的多個核苷酸序列的自動儀器(如高通量篩選儀器)中。可使所述試劑盒或儀器適用於實施本發明的方法的所有步驟或僅幾個特定步驟。如果待檢測的序列之間同源性低(30-60%)，可將每個序列中均分。但i難尋找足夠保守至可設計可、:^增或拷貝所有所需序列的"共有，，序列的部分序列。如果一對共有引物不足以擴增所有同源序列，則為了完成所需擴增，可加入兩個或多個引物對的混合物。在共有擴增中，通過所述相同共有引物擴增的同源序列的最小數是2，但此數無上限。如果所述序列顯示出高度同源性(大於60%,甚至大於90%)，則容易尋找共有引物的通用序列，但選擇捕獲部分將變得更難。在優選的實施方案中，用於共有擴增的引物對可擴增至少同源性達60%以上，甚至90%以上的兩個乾同源序列，且所述捕獲分子可特異性檢測兩個同源的靶。在本發明的另一個優選實施方案中，所述捕獲分子是化學合成的寡核苷酸序列(易於在程序化的自動合成儀上合成)。所述序列可帶有用於以高濃度共價附著於支持物上的官能團，且通常短於200個鹼基。優選通過PCR擴增(對摻入含有捕獲分子的特異部分(捕獲部分)和非特異部分(間隔區部分)的質粒中的序列)合成更長的捕獲分子。本發明的方法適用於檢測和/或定量由DNA或RNA(包括在總長度上部分或完全同源的序列)構成的靶。甚至當靶與其他分子間的同源性(或序列同一性)大於30%，大於60%，甚至大於80%時，仍可實施本發明的方法。在本發明的方法中，所述捕獲分子益如下文所述優選通過其末端共價結合(或固定)至不溶的固體支持物上。本發明的方法給出了顯著的結果，允許鑑定(檢測和定量)溶液中濃度低於約10nM，低於約lnM，優選低於O.lnM及更優選低於約O.OlnM(=1fmole/100nl)的擴增子。"結合"至樣點的靶量相比存在的捕獲分子量是非常小的。因此捕獲分子大大過量，甚至如果捕獲分子量更大，也沒有理由得到結合。可於擴增或拷貝後檢測全長序列，且當通過摻入標記核苷酸進行標記時，已雜交的把上存在的更多標記，使檢測變得更加靈敏。基因檢測也是本發明優選的應用。可通過先反轉錄mRNA，再使用如本發明所述的共有引物進行擴增來檢測同源基因。本發明給出的雜交速度及產量的提高尤其適用於檢測存在於溶液中的單鏈DNA或RNA;本發明益應用於檢測來自mRNA的cDNA轉錄物，用於檢測使用T7聚合酶測定進行擴增產生的RNA。在微生物領域，可使用特異於微生物各科或屬的共有引物，再使用本發明的捕獲分子鑑定陣列中的所述各科的一些或所有種。益於同一陣列上檢測其他序列(即，通過使與用於定量的標準核苷酸序列、與用於相同或不同的微生物菌林的共有捕獲分子、與可通過微生物檢測可能的抗生素抗性基因或或用於雜交的陽性或陰性對照序列雜交)。陣列上也可存在用於與來自相同科或屬的微生物的所有序列雜交的作為共有捕獲分子的長捕獲分子，從而給出生物樣品中是否存在所述科、屬的微生物的信息。所述陣列也可載有特異於細菌組(革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌林或甚至所有細菌)的捕獲分子。另一應用是使用特定捕獲分子(含或不含用於可能存在於生物樣品中的所有細胞色素的共有捕獲分子)檢測來自同種共有蛋白(如各種細胞色素P450)的同源基因。通過反轉錄成cDNA而在基因水平進行所述檢測。本發明的固體支持物可為選自下列的材料，或可由選自下列的材料製成凝膠層、玻璃、電子裝置、矽或塑料支持物、多聚物、緻密圓盤、金屬支持物或其混合物(參見EP0535242，美國專利No.5，736，257、W099/35499、美國專利No.5，552，270等)。所述固體支持物益為可包括其他配置(條碼，標記等)或用於改進本發明的方法的介質的單個栽波片。所述固體支持物優選珠形式。用於本發明的方法的擴增步驟益使用本領域熟知的擴增方法，優選選自PCR、RT-PCR、LCR、CPT、NASBA、ICR或雪崩DNA(AvalancheDNA)技術。在特定實施方案中，所述捕獲分子檢測PCR擴增過程中的擴增子。在另一個特定實施方案中，使所述捕獲分子跟蹤PCR循環過程中產生的擴增子。在一個實施方案中，所述捕獲分子被用於實時PCR檢測擴增子。實時檢測在連續PCR循環過程中產生的擴增子。在另一個實施方案中，所迷捕獲分子被用於陣列上的實時PCR檢測。在PCR擴增過程中檢測擴增子是本發明的主要特徵之一。通過設計所述捕獲分子可使其結合在不同擴增循環中形成的擴增子。所述結合除需要在PCR循環過程中以任何方式進行的兩條鏈的解離及為得到特異和快速雜交的正確條件(溫度和鹽濃度)外，無需對所述擴增子進行任何特殊處理。本領域技術人員可易於確定所述條件。由於本發明避免了為在捕獲分子上檢測而切割擴增子的可能性，使所述實施方案成為可能。可以與單鏈捕獲分子雜交前，標記所述待鑑定的靶。優選於變性(如果本方法包括擴增步驟)前在所述擴增序列上進行所述標記(用本領域技術人員已知的技術)。根據本發明的再一方面，本發明的方法益被用於鑑定一起或分別生物樣品的同源器官的不同的葡萄球菌種或變體，優選為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、人葡萄球菌或溶血性葡萄球菌，通過優選使用FemA基因序列中的通用位置來檢測所述不同種中的FemA基因的遺傳變體而進行所述檢測。所述用於得到擴增產物的引物和FemA序列的特異部分優選為下文實施例l和2中描述的引物和FemA序列的特異部分。已將所述引物選為用於擴增所有15個被測試的葡萄球菌的FemA基因的共有引物，所述引物可能會擴增所有其它可能的葡萄球菌種的FemA(實施例3)。實施例4中描述了根據本發明檢測12個MAGE-A。所述陣列允許通過觀察栽有特定捕獲分子信號的陽性線讀取MAGE數量。本發明另一方面涉及含有本發明的捕獲分子的生物晶片或微陣列的任何部分。再一方面是用於鑑定特異於科型微生物的靶序列(通過列)的通用篩選方法。可在陣列上雜交後，通過現有技術檢測所述乾序列。無需標記，優選的方法是通過已適用於陣列的質讒分析法(美國專利No.5，821，060)，或通過嵌入劑，隨即用螢光檢測(W097/27329或Fodoretal，Nature,Vol.364，p.555，1993)來鑑定所述乾。有許多基於標記的檢測方法。有關不同標記分子的綜述見W097/27317。它們是使用經標記的引物或在拷貝或擴增過程中摻入經標記的核苷酸而得到的。也可通過將可檢測的部分連至待測RNA或DNA(通過連接酶連於序列末端的經標記的寡核苷酸)而進行標記。也可使用激酶、轉移酶或類似酶將經標記的核苷酸摻於RNA或DNA片段的5，OH或3'OH末端。最常用的標記是適用於在商品化的陣列掃描儀(GeneralScanning,GeneticMicrosystem)上分析陣列的螢光染料，如Cy3、Cy5和Cy7。常用方法為放射性標記、冷標記或使用小分子間接標記後使用特定配體(鏈黴抗生物素或抗體)識別。所得固定於陣列上的靶信號是擴散得到的螢光或色度、電子發光、生物或化學發光、磁、電(如阻抗或電壓電流)(美國專利No.5，312，527)。優選的方法使用金標記結合的靶以得到沉澱或易於隨後用掃描儀檢測和定量的銀染。定量需考慮的不僅是陣列上的雜交產率和檢測規模(對靶和參比序列是相同的)，而且還要考慮提取、擴增(或拷貝)及標記步驟。本發明的方法還可包括通過使用以已知濃度加入的標準核苷酸序列(外部或內部標準物)定量靶核苷酸序列的工具。陣列上也可存在捕獲分子，以在與所述靶相同的條件下固定所述標準物(可能在擴增或拷貝後)；為定量生物樣品中待檢測和/或定量的原核苷酸序列的存在，所述方法包括定量來自通過捕獲分子和所述標準物之間的互補鹼基配對形成的雙鏈核苷酸序列形成所得信號的步驟，和對所述雙鏈核苷酸序列形成所得信號與來自通過捕獲分子和靶之間的互補鹼基配對形成的雙鏈核苷酸序列所得信號進行相關性分析的步驟。可以將所述標準物加入初始生物樣品中，或在提取步驟後加入所述初始生物樣品中，並使用相同的引物進行擴增或拷貝，和/或所述標準物與所述靶的長度和GC含量相同，或相差不超過20%。可更優選竟爭性內部標準物。所述內部標準物，其部分序列與靶相同，特異部分與耙不同。其兩端或靠近兩端的序列與用於擴增或拷貝靶的兩個引物互補，且GC含量相似(WO98/11253)。在本發明的優選實施方案中，所述標準物和靶的共同部分指與使用相同引物擴增的所有靶同源的核苷酸序列(即屬於待定量的相同科或生物體)。所述標準物通過所述特異序列的雜交產率優選與靶序列的雜交產率相同或相差不超過20%，並如W098/11253所述進行雜交。也可以將所述標準核苷酸序列、外部和/或內部標準物包含於本發明的試劑盒中，可能含有實施本發明的不同步驟必需的所有介質和工具(雜交和培養介質、聚合酶及其他酶、標準序列、標記分子等)。生物晶片也可以載有含有各種濃度(實施例4)經標記的捕獲分子的樣點。用已知濃度的溶液點樣所述經標記的捕獲分子。可通過其信號將雜交結果轉化為絕對量。也可評估所述檢測的再現性。可將所述固體支持物(生物晶片)通過基於顯微流技術的溶液控制插入與另一個室和自動機器連接的支持物中。由於被插入所述微型實驗室系統中，因此可對其進行自動化的溫浴、加熱、洗滌和標記，甚至可以及之前的步驟(如DNA提取，PCR擴增)或之後的步驟(標記和檢測)。所有這些步驟均可在相同的固體支持物上進行。以下將參考附圖與下列非限制性實施例詳細說明本發明。實施例實施例1.捕獲分子在擴增子鏈內的位置對其在微陣列上的雜交效率的影響在此實施例中，我們檢測了捕獲分子相比擴增子序列的位置對本發明所述的雜交效率的影響。將促旋酶基因用作基因靶。我們製備了定位於擴增子的不同區域的捕獲分子的捕獲部分(27個核苷酸)靶定的915bp的促旋酶擴增子(圖1)。這些捕獲分子也包括90bp的間隔區部分。將所述捕獲分子陣列固定於固體支持物上。將所述捕獲分子中的3個(la、2a、3a)設計為與正義鏈互補，而使3個其他的捕獲分子(ls，2s，3s)靶定同一區域，但與反義鏈雜交(圖1)。細菌菌林參比窗林金黃色葡萄球菌ATCC25923得自DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ，德國)。DNA純化在需氧條件下，37'C，於LB培養基(10g蛋白腖，5g酵母提取物，和5gNaC1/1)中，從單菌落過夜生長細菌菌林。通過離心(5000g,5min)沉澱過夜培養物的等分試樣(O.lml)。將細菌沉澱重懸於300jd的含有100ng的溶葡萄球菌素(Sigma，Mo，USA)和100jig的RNase的溶菌緩沖液(50mMTrisHClpH8.0、100nMEDTA、150mMNaCl、1%SDS)中，並在37'C溫浴30分鐘。在200ng蛋白酶K(Boehringer，Mannheim，德國)存在下，於37'C，溫浴30分鐘及煮沸5分鐘完成溶菌。於4000g離心溶菌物5分鐘，根據產品說明書，通過吸附於NucleospinC+T柱(Macherey-Nagel，Duren，德國)上，從200^1上清液提取DNA。用200jU的無菌水洗脫DNA，並保存於-20'C。PCR擴增使用下列共有引物PCR擴增部分^v""w爿(GYR)基因gyrl5，GCNGCDGCRATGCGTTATAC3，gyr35，GAACCHYKACCTGTTTCATA3'N-A、G、T、CD=G、A、TR=A、GH=A、T、CY=C、TK=G、T所述引物是為擴增來自不同細菌的多個促旋酶而設計的共有引物。用於檢測促旋酶擴增子的捕獲分子的捕獲部分的序列如下捕獲分子名促旋酶A基因的捕獲部分(5，->3，)laTTCTTGTCACGAACGAGCT2aGAAAGTTTGAAGCGTTGTTG3aTCCTCTAAGTCTTCAAATCCIsAGCTCGTTCGTGACAAGAA2sCAACAACGCTTCAAACTTTC3sGGATTTGAAGACTTAGAGGA微陣列裝配於捕獲部分的5'末端延伸如下序列的90bp的間隔區部分:5，胺-TATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC3，(SEQIDNO:2)間隔區的最後一個核苷酸在其5，末端被胺化。所述陣列也含有雜交陽性對照和雜交陰性對照，前者是雜交至其對應的捕獲分子上的CYP2B2擴增子，後者是CYP2B2不能結合於其上的NFKB序列的捕獲分子。在所述陣列上還有對應於生物素化的CMVDNA的檢測對照捕獲分子。捕獲分子的固定根據Schena等人(Pro"Natl.Acad.Sci.USA,Vol.93，p.10614,1996)所述方案，將胺化的DNA接合到醛化玻璃(aldehydederivatizedglass)上。用濃度為3000nM的溶液中的於5，末端被胺化的捕獲分子進行點樣。使用自製的機器手裝置(250jimpin，Genetix(英國))將捕獲分子印到微型載波片上。所述微型栽波片是如申請WO02/18288所述帶有醛基的載波片。樣點直徑為400nm，分配的體積約0.5nl。在室溫下乾燥載波片，於4'C保存，待用。PCR擴增在含有4mMMgCh、10mMTrispH8.4、50mMKCl、0.5nM每種引物、50nM每種dNTP、10nM生物素-16-dATP和生物素-16-dCTP、1.5U的TaqDNA聚合酶超級工具、lOjd提取的DNA的50^1體系中，對從參比菌林提取的DNA進行PCR。樣品首先於94。C變性3分鐘。然後進行35個循環的擴增，所述擴增由94BC30秒，55'C30秒，72。Cl分鐘構成，最後於72。C延伸10分鐘。將水對照用作擴增的陰性對照。靼擴增子的大小是915bp。雜交向35jd的雜交溶液(Eppendorf，Hamburg,德國)中加入20^1的擴增子，並在雜交室框定的陣列上加栽所述溶液。對於陽性對照，向所述溶液中加入50nM的375bp的生物素化的CYP2B2擴增子；將其對應的捕獲分子點樣於陣列。用蓋子蓋住所述室，並於95'C變性栽波片5分鐘。於65。C雜交2小時。用洗滌緩衝液洗滌樣品4次。焚光檢測於室溫下用經綴合Cy3的IgG抗生物素(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc#200-162-096)稀釋1/1000X的綴合物-Cy3，於阻斷緩沖液中避光溫浴玻璃樣品45分鐘。將栽波片經洗滌後乾燥，並於室溫下保存。用雷射共聚焦掃描儀"ScanArray"(Packard,美國)進行檢測。然後，使用特定的定量軟體定量每個載波片。經洗滌和分析後觀察到每個捕獲分子的螢光信號都不相同。繪出雜交螢光強度對被捕獲分子識別的擴增子區域的關係曲線，發現在螢光強度和擴增子游離間隔區末端長度之間具有相關性(圖2)。最強的雜交信號總是與靶定在間隔區部分側具有非常長的游離末端的擴增子鏈的捕獲分子(捕獲分子la和3s)相關。在捕獲分子3a和lS的情況中，乾的游離末端非常短，幾乎不與間隔區部分接觸。在捕獲分子2a和2s的情況中，乾的游離末端是中間體，間隔區部分的穩定子效果是可變的。如下表格概括了捕獲分子的捕獲部分與正義或反義擴增子鏈的間隔區末端(3，末端)和非間隔區末端(5，末端)的距離。也顯示了螢光信號強度。tableseeoriginaldocumentpage26實施例2:間隔區部分的長度對在陣列上檢測同源FemA序列的靈敏度的影響在這一實施例中，我們檢測了在根據本發明的捕獲分子的設計中，間隔區部分的長度對雜交效率的影響。將Fe附^基因用作基因靼。我們製備了定位於距離正義擴增子鏈的游離3，末端(間隔區末端)415bp處的27個鹼基的捕獲分子的互補捕獲部分乾定的585bp的表皮葡萄球菌擴增子。27個鹼基的捕獲部分於其5，末端含有不同長度(20、40、85和95個鹼基)的間隔區部分。PCR擴增所述靶是使用如下共有引物進行PCR擴增產生的表皮葡萄球菌的Fem^基因序列的片段AP畫3-1:5'TAAYAAARTCACCAACATAYTC3'AP函3-2:5'TYMGNTCATTTATGGAAGATAC3'Y=C、TR=A、GM=A、CN-A、G、T、C在含有3mMMgCl2、lmMTrispH8、lnM每種引物、200nMdATP、dCTP和dGTP、150jiMdTTP、50fiM生物素-16-dUTP、2.5U的TaqDNA聚合酶(BoehringerMannheim,德國)、1U的不耐熱的尿嘧啶-DNA-糖基化酶(BoehringerMannheim，德國)、lng含有/^w^基因的質粒的100nl體系中進行所述PCR。樣品首先在94'C變性5分鐘。然後進行40個循環的擴增，所述循環由94aC1分鐘、50。C1分鐘、72°C1分鐘構成，最後於72'C延伸10分鐘。將水對照用作擴增的陰性對照。當捕獲分子是47，67，112或122個鹼基的含有27個鹼基的捕獲部分和長度可變(20，40，85或95個鹼基)的間隔區部分的單鏈DNA時，把擴增子長585bp。微陣列裝配所用捕獲分子序列如下命名序列(5，->3，)捕獲分子ATepi03GAATTCAAAGTTGCTGAGAAATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAGATepi04GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGTTCAATGGAAGGAAGCGATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAGATepi06CATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCAATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAGAtepi08ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTAATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAG間隔區部分的序列有下劃線。生物晶片也含有陽性對照和陰性對照，前者是與其對應的捕獲分子雜交的CMV擴增子，後者是CMV不能結合於其上的HIV-I序列的捕獲分子。如實施例1所述固定所迷捕獲分子。雜交向65jil的雜交溶液(Eppendorf，Hamburg,德國)中加入5^1的擴增子，向雜交室框定的陣列上加載所述溶液。對於陽性對照，向溶液中加入2nM的437bp的生物素化的CMV擴增子；將其對應的捕獲分子點樣於陣列。用蓋子蓋住所述室，於95"變性所述栽波片5分鐘。於60'C雜交2小時。用洗滌緩衝液洗滌樣品4次。螢光檢測於室溫下將所述玻璃樣品與800jU經花青苷3或花青苷5標記的鏈黴抗生物素溫浴45分鐘。將所述載波片經洗滌後乾燥，再於室溫下保存。用陣列掃描儀GSM418(GeneticMicrosystem,Woburn，Mass"美國)進行檢測。然後使用特定的定量軟體定量每個載波片。如圖3所示，當相對擴增子的捕獲部分的設計保持不變時，95個核苷酸的間隔區部分的雜交速度比20個核苷酸的間隔區部分高5倍。實施例3:設計用於在陣列上檢測15個同源FemA序列的捕獲分子我們製備了定位於距離正義擴增子鏈的游離的3'末端415bp的27個鹼基的捕獲分子的互補捕獲部分靶定的585bp的葡萄球菌擴增子。其構型與圖1的捕獲分子la相似。如實施例2所述進行擴增、雜交和檢測。捕獲分子的捕獲部分如下tableseeoriginaldocumentpage28松鼠葡萄球菌(S.sciuri)GTTGTATTGTTCATGTTCTTTTTCTAA模仿葡萄球菌(S.siinulans)TTCTAAATTCTTTTGTTCAGCGTTCAA瓦氏葡萄球菌(S.warneri)AGTTAAGGTTTCTTTTTCATTATTGAG木糖葡萄球菌(S.xylosus)GCTTAACACCTCACGTTGAGCTTCCAA捕獲分子含有於5，末端固定於支持物上的40個鹼基的間隔區部分(5，胺-GAATTCAAAGTTGC丁GAGAATAGTTCAATGGAAGGAAGCG-3，)(SEQIDNO:1)，及隨後的特異於來自不同葡萄球菌的各基因的捕獲部分。下表概括了捕獲分子的捕獲部分與擴增子鏈的間隔區末端(3，末端)和非間隔區末端(5，末端)之間的距離。同時顯示了與圖1關聯的捕獲分子構型。tableseeoriginaldocumentpage29用比色法進行檢測。比色法檢測於室溫下使所述玻璃樣品與800nl用阻斷緩衝液(馬來酸緩衝液lOOmMpH7.5、NaCl150mM、Gloria奶粉0.1%)稀釋1000倍的膠態金標記的鏈黴抗生物素溫浴45分鐘。在用洗滌緩衝液洗滌5次後，將金的存在用於使用染色顯示溶液(Eppendorf，漢堡，德國)催化銀還原作用。使載波片與800nl的顯示混合物溫浴3次，IO分鐘，然後用水漂洗，乾燥並用微陣列讀數儀分析。然後使用特定的定量軟體定量每個栽波片。結果顯示清楚地鑑定了15個葡萄球菌序列。實施例4:設計用於在微陣列上檢測同源MAGE-A序列的捕獲分子cDNA克隆MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE畫A5、A8、A9、AIO、All、MAGE-A6和A12的cDNA克隆得自Ludwig研究院的布魯塞爾分院。PCR擴增使用如下共有引物對含有MAGE-A1、A2、A3、A4、A5、A6、A8、A9、A10、All或A12的cDNA的重組質粒進行PCR擴增。正義引物DPSCONS25'GGGCTCCAGCAGCCAAGAAGAGGA3'Tm=78°C，定位於每個MAGE-A基因的起始於ATC密碼子的位置234-321的核普酸，。為了提高一些MAGE的PCR效率，加入其他引物作為正義引物。DPSMAGE15'GGGTTCCAGCAGCCGTGAAGAGGA3，Tm=78。CDPSMAGE85'GGGTTCCAGCAGCAATGAAGAGGA3'Tm=740CDPSMAGE125'GGGCTCCAGCAACGAAGAACAGGA3'Tm=76。C反義引物DPASCONB45'CGGTACTCCAGGTAGTTTTCCTGC3'Tm=74°C,，定位於每個MAGE-A基因的起始於ATG密碼子的核苷酸位置734-838。根據MAGE序列，擴增產物的大小約530bp。在含有2.5nL的cDNA、IXPCR緩沖液(75mmol/LTrispH9、50mmol/LKC1、20mmol/L(NH4)2S04、2.5mmol/LMgCl2)、200nmol/L每種dATP、dCTP、和dGTP、150nmol/LdTTP、50nmol/L生物素陽16-dUTP(羅氏)、lnmol/L反義共有引物、0.25阿ol/L包括共有正義引物DPSCONS2(Eurogentec，Seraing，比利時)的每種正義引物、0.625U的DNA聚合酶(Biotools，Madrid,西班牙)，和為防止前面留下的汙染而加入的0.2U的尿嘧咬-DNAGlysosylase(羅氏)的25jiL反應體系中進行擴增。用PTC-200熱循環儀(Biozym,Landgraaf，荷蘭)進行循環。PCR反應物加熱到95'C5分鐘，然後進行30個循環的擴增(94°C30秒，55'C30秒，72'C30秒)，最後於72°C延伸10分鐘。微陣列裝配選擇以下27個核苷酸的捕獲部分用於特異捕獲MAGE序列。tableseeoriginaldocumentpage31a使用。/。GC方法，通過01igo-4軟體(NationalBiosciences,Inc.)計算。b相對每個MAGE-A基因的ATG密碼子給核苷酸編號。如實施例3中提供，捕獲分子含有40個鹼基的間隔區部分。雜交將15nl完全PCR反應物與55jil含有5nmol/L的生物素化的DNA對照的雜交溶液(AAT)混合，將所述混合物加載到雜交室(MJResearchInc.，Watertown,MA，USA)框定的陣列上。用蓋玻片蓋住所述室。於65'C溫浴所述載波片2小時，然後用洗滌緩衝液(AAT)洗滌4次，每次2分鐘。如實施例2所述進行螢光檢測。下表概括了捕獲分子的捕獲部分與擴增子鏈的間隔區末端(3，末端)和非間隔區末端(5，末端)的距離。同時顯示了與圖1關聯的捕獲分子的構型。捕獲分子名稱把鏈與靶的間隔區末端的距離(核苷酸)與把的非間隔區末端的距離(核苷酸)圖l的捕獲分子構型DTAS01(MAGE-A1)正義47132laDTAS02(MAGE-A2)正義47132laDTS0306(MAGE-A3)反以449543sDTAS04(MAGE-A4)正義44063laDTAS05(MAGE-A5)正義44162laDTS06(MAGE-A6)反以3361673sDTAS07(MAGE-A7)正義46538laDTAS08(MAGE-A8)正義46538laDTAS09(MAGE國A9)正義46538laDTAS10(MAGE-A10)正義45944laDTAS11(MAGE-A11)正義46142laDTAS12(MAGE-A12)正義45944除MJ(^-A6擴增子稍交叉雜交至MAGE-A3捕獲部分上外，雜交是特異性的。所述交叉雜交的原因是由於這些序列享有96%的同一性。參考如上討論的一些實施方案描述了本發明。需知可對所述實施方案施以本領域技術人員熟知的各種修改或替代形式。只要不脫離本發明的精神和範圍，還可對本文所述結構和技術作除上所述之外的諸多修改。因此，儘管描述了特定實施方案，但僅用於示例，非為限制本發明的範圍。3權利要求1.設計多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用於檢測與之雜交的擴增子，所述擴增子的一條鏈作為待檢測和/或定量的靶，所述方法包括以下步驟a)選擇定義擴增子的引物對；b)在擴增子內選擇10-100個核苷酸的特異序列，使所述特異序列定義擴增子的兩個非互補末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補，所述間隔區部分含有至少20個核苷酸；d)在擴增子的兩個非互補末端中分別鑑定出間隔區末端和非間隔區末端，使所述間隔區末端不與所述捕獲分子的所述間隔區部分互補，且所述間隔區末端比所述非間隔區末端多出至少50個鹼基。2.製備多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用於檢測與之雜交的擴增子，所述擴增子的一條鏈作為待檢測和/或定量的靶，所述方法包括以下步驟a)選擇定義擴增子的引物對；b)在擴增子內選擇10-100個核苷酸的特異序列，使所述特異序列定義擴增子的兩個非互補末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補，所述間隔區部分含有至少20個核苷酸；d)在擴增子的兩個非互補末端中分別鑑定出間隔區末端和非間隔區末端，使所述間隔區末端不與所述捕獲分子的所述間隔區部分互補，且所述間隔區末端比所述非間隔區末端多出至少50個鹼基。3.可通過權利要求2的方法得到的捕獲分子。4.檢測擴增子的方法，包括使擴增子與權利要求3的捕獲分子雜交的步驟。5.權利要求4的方法，其中所述捕獲分子被固定在固體支持物上，從而使間隔區部分定位於固體支持物與捕獲部分之間。6.權利要求5的方法，其中所述捕獲分子的5，末端被固定。7.權利要求5的方法，其中所述捕獲分子的3，末端被固定。8.權利要求5-7中任一項的方法，其中所述捕獲分子的間隔區部分的遠端具有含有游離氨基的核苷酸。9.權利要求4-8中任一項的方法，其中所述擴增子長度至少為200bp，優選至少為300bp、更優選至少為400bp。10.權利要求4-9中任一項的方法，其中所述擴增子長度不超過2000bp。11.權利要求4-10中任一項的方法，其中所述間隔區部分是多核普酸鏈，長度至少為40個核苷酸、優選至少為卯個核苷酸。12.權利要求4-11中任一項的方法，其中所述捕獲分子包含間隔區，所述間隔區與如下序列具有至少60%同源性，優選具有至少80%同源性，更優選具有至少90%同源性，5'AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTCCTATATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC3，(SEQIDNO:2)(卯個鹼基)。13.權利要求4-12中任一項的方法，其中所述捕獲分子包含間隔區，所述間隔區與如下序列具有至少60%同源性，優選具有至少80%同源性，更優選具有至少90%同源性，5'ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA3，(SEQIDNO:3)(95個鹼基)。14.權利要求4-13中任一項的方法，其中所述捕獲部分含有10-100個核苷酸、優選15-40個核苷酸，更優選20-30個核普酸。15.權利要求5-14中任一項的方法，其中所述捕獲分子在支持物上的密度是20-2000fmoles/cm2。16.權利要求5-15中任一項的方法，其中所述捕獲分子以微陣列形式被固定在固體支持物的具體定位的區域中，其中所述微陣列為至少4個間隔區分子/cm2，優選至少20個間隔區分子/cm2、更優選至少100個間隔區分子/cm2。17.權利要求5-16中任一項的方法，其中所述固體支持物是珠形式。18.權利要求4-17中任一項的方法，其中用至少兩種捕獲分子檢測至少兩種擴增子，其中所述至少兩種捕獲分子的所述捕獲部分相差至少10%、優選至少20%。19.權利要求4-18中任一項的方法，其中所述捕獲部分能夠區分靶序列和與所述靶具有少少85%的同源性的其他序列。20.權利要求4-19中任一項的方法，包括使用共有引物對和捕獲分子，所述共有引物對能夠擴增同源性大於60%、優選大於卯％的至少兩種靶序列，所述捕獲分子能夠檢測兩種靶序列中的一種。21.權利要求4-20中任一項的方法，其中在所述擴增子於溶液中的濃度小於10nM,優選小於lnM，更優選小於O.lnM及更加優選小於O.OlnM時予以檢測。22.權利要求4-21中任一項的方法，其中隨著在系列PCR循環過程中產生所述擴增子而實時予以檢測。23.在檢測擴增子的方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包含權利要求3的捕獲分子。24.權利要求23的試劑盒，還包含用於固定捕獲分子的固體支持物，預處理所述固體支持物以使其與捕獲分子的間隔區部分反應。25.權利要求23的試劑盒，還包含固定有捕獲分子的固體支持物。26，權利要求23-25中任一項的試劑盒，還包含進行擴增子與捕獲分子的雜交所必要的工具。27.以上權利要求中任一項的試劑盒，還包含用於進行PCR的引物對和標記工具。全文摘要本發明涉及設計和/或製備多核苷酸捕獲分子的方法，所述捕獲分子被用於檢測與之雜交的擴增子，所述擴增子的一條鏈作為待檢測和/或定量的靶，所述方法包括以下步驟a)選擇引物對定義擴增子；b)在擴增子內選擇10-100個核苷酸的特異序列，使所述特異序列定義擴增子的兩個非互補末端；c)定義具有捕獲部分和間隔區部分的捕獲分子，所述捕獲部分與步驟b)中選擇的特異序列互補，所述間隔區部分含有至少20個核苷酸；d)在擴增子的兩個非互補末端中分別鑑定出間隔區末端和非間隔區末端，使所述間隔區末端不與所述捕獲分子的所述間隔區部分互補，且所述間隔區末端比所述非間隔區末端多出至少50個鹼基。文檔編號B01J19/00GK101506377SQ200780025949公開日2009年8月12日申請日期2007年5月15日優先權日2006年5月17日發明者J·利馬科爾,S·海米爾斯申請人:埃佩多夫陣列技術股份有限公司