嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫構建及兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法
2023-05-31 11:47:06
嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫構建及兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法
【專利摘要】本發明提供一種嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫構建兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法，所要解決的問題是：構建了嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫，從中篩選具有毒力作用的兩種大棚肺致病基因進行體外克隆並誘導兩種大棚肺致病抗原多肽的表達。本發明的要點是：得到有義序列978個，獲得單一基因347個，其中2段基因分別與胸膜肺炎放線菌外膜蛋白、轉鐵蛋白B的同源性為51%和42%，其開放閱讀框長度分別為1554bp和726bp，分別編碼517和241個胺基酸。本發明的用途是：從嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫中篩選具有毒力作用的兩種致病基因進行體外克隆並誘導兩種大棚肺致病抗原多肽的表達，為後續開發新的農民肺診斷方法提供理論和實踐依據。
【專利說明】嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫構建及兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物檢測領域，具體涉及到嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫的構建、表達序列標籤(EST)測序，通過生物信息手段獲得引起機體過敏反應的兩種致病基因，篩選具有毒力作用的兩種致病基因進行體外克隆並誘導兩種大棚肺致病抗原多肽的表達，為後續開發新的農民肺診斷方法提供理論和實踐依據。
【背景技術】
[0002] 1.農民肺疾病發病及檢測現狀
農民肺(Farmer』 s lung disease)是因吸入具有抗原性的有機粉塵(如黴變枯草或其他黴變植物粉塵等)而引起一種外源性變態反應性肺泡炎，通常在暴露於各種發黴植物的農民中發病，故稱之為「農民肺」。其主要臨床表現為咳嗽、呼吸困難、乏力、全身肌肉酸痛等，並可引發不同程度的心、肺功能障礙，重症患者甚至可因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡。農民肺已經成為一種嚴重妨礙廣大農民健康、影響勞動力的職業病，應給予高度重視。大棚作業農民肺一一簡稱「大棚肺」，即為暴露於溫室大棚環境內的一種農民肺，由於大棚種植方式不受氣候因素的影響，且能有效提高土地利用率、增加土地產值、提高農民收入，在農村地區頗受農民的歡迎，已經成為我國農業經濟的重要組成部分，但與此同時，大棚肺患病率與日俱增，對我國東北部分地區從事蔬菜、花卉、蘑菇大棚作業農民的大棚肺流行病學進行調查，其結果顯示:我國東北地區大棚肺的患病率約為5.7%，其患病與多種因素有關。考慮到我國龐大的大棚從業農民數量，大棚肺已成為威脅大棚從業農民呼吸系統的主要疾病之一。
[0003]農民肺按病理改變可分為支氣管血管周圍單核細胞浸潤的急性期、肉芽腫形成的亞急性期、最終發展成為肺纖維化病變的慢性持續期。急性期、亞急性期大棚肺臨床症狀無特異性，需結合病史以及短時間內重複性進行血清生化學、肺功能、CT等檢查才能確診。因基層醫院醫生對大棚肺認知不足，常被誤診為普通感冒、哮喘等延誤了最佳治療時機，導致大棚肺患者反覆入院，診療成本增加，加重了患病農民的經濟負擔和相應的社會負擔。因此，臨床上迫切需要一種快速、敏感、特異的用於大棚肺急性期、亞急性期的快速篩查及輔助診斷的檢查方法，做到大棚肺的早期防治，解決患大棚肺農民「看病難、看病貴」的問題，減少大棚肺的患病率。
[0004]2.cDNA文庫的構建及嗜熱吸水鏈黴菌在農民肺疾病診斷治療中的重要作用
從1976年Hofstetter成功的構建了第一個cDNA文庫以來，cDNA文庫已成為研究功能基因組學的基本手段之一，通過構建cDNA文庫不僅可保護瀕危珍惜生物資源，通過對遺傳信息的功能注釋可以對農作物進行遺傳改良、對家畜進行品種優化，也是分析真菌基因表達圖譜、功能和結構的重要資源，同時通過構建腫瘤組織的cDNA文庫並獲得大量的相關腫瘤抗原，將為腫瘤的治療提供新的思路。全長cDNA文庫的構建、測序和功能注釋是了解生物體結構和功能的重要方法之一，有助於鑑定其基因組序列中的外顯子及內含子的邊界，可以從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因，並直接用於該目的基因的表達。
[0005]引起農民肺的病原體主要是嗜熱放線菌，其中嗜熱吸水鏈黴菌是我國農民肺的主要病原菌，放線菌孢子作為一種外源性物質具有抗原性，被患者吸入體內後引發免疫反應，當再次吸入抗原後，抗原抗體在體內形成免疫複合物並沉積於肺部，引起炎症反應，放線菌表面特異性抗原可能是引起農民肺的重要因素之一，同時，機體過敏反應可能與菌體表面致毒性物質有較大關係。我們通過構建嗜熱吸水鏈黴菌的cDNA文庫，通過生物信息手段獲得引起機體過敏反應的兩種致病基因，並將該致病基因進行體外表達，以期為農民肺的血清學檢驗奠定基礎。
【發明內容】
[0006]本發明目的是:構建嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫及兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法。
[0007]本發明技術方案的理論基礎:
(I)引起農民肺的病原體主要是嗜熱放線菌，其中嗜熱吸水鏈黴菌是我國農民肺的主要病原菌。
[0008](2)cDNA文庫的構建、測序和功能注釋是了解生物體結構和功能的重要方法之一，高質量的cDNA文庫在生物保護、遺傳育種、病原診斷及腫瘤治療等方面起有重要作用。
[0009]本發明的技術方案是:
構建的嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫是，得到有義序列978個，獲得單一基因347個，其中2段基因中的一段基因與胸膜肺炎放線菌外膜蛋白的同源性為51%，其開放閱讀框(ORF)長度為1554 bp和，編碼517個胺基酸；另一段基因與轉鐵蛋白B的同源性為42%，其開放閱讀框(ORF)長度為726 bp，編碼241個胺基酸。
[0010]所說的從中篩選出具有毒力作用的基因進行體外克隆並誘導表達是，將所說的2段基因亞克隆入原核表達載體中，IPTG誘導表達產物的相對分子質量分別為63 000和30000多肽。
[0011]嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫構建及兩種大棚肺致病抗原多肽的表達和表達方法包括下列步驟是:
1、嗜熱吸水鏈黴菌CDNA文庫的構建
採用TRIZOL進行嗜熱吸水鏈黴菌總RNA的提取並經01igoteXTMmRNA純化試劑盒純化為mRNA ;利用多聚腺嘌呤脫氧核苷(PolyA)聚合酶進行3』末端加尾，按照SMART? cDNA文庫構建試劑盒說明書合成雙鏈cDNA ;產物經蛋白酶K處理後用sfil酶切，過吸附柱CHROMASPIN-400進行分級，分離後的cDNA連入(λ TriplEx2)載體中，噬菌體包裝蛋白進行包裝構成cDNA原始文庫並以大腸桿菌XL-1 Blue為受體菌擴增文庫。
[0012]2、cDNA文庫質量及插入片段鑑定
將原始及擴增文庫稀釋成不同倍數於溶菌肉湯(LB)平板上培養過夜；文庫滴度(PFU/ml) =噬菌斑數X稀釋倍數XlO3/所 用稀釋文庫液體積(μ?);向噬菌體與大腸桿菌XLl-Blue混合液的上層瓊脂中加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)培養過夜，進行藍白斑篩選，重組率(％)=白斑/ (白斑+藍斑);根據λ TriplEx2多克隆位點序列設計引物(5，端:5』 -GCCATTGTGTTGGTACCC-3』，3』端:5』 -TAATACGACTGACTATAGGGC-3』)，將LB/四環素瓊脂平板平均分成8個扇形區域，每個區域選取3個共24個獨立的噬菌斑進行聚合酶鏈式反應(PCR)鑑定；反應結束後取10 μ?產物進行瓊脂糖凝膠電泳。
[0013]3、EST測序及序列分析
將構建好的啫熱吸水鏈黴菌cDNA文庫中的全部克隆進行編號，取前1020編號的克隆，提取質粒，PCR鑑定，將含插入片段的克隆委託生工生物工程(上海)有限公司進行5』端測序，測序引物為質粒通用引物；對獲得的表達序列標籤(EST)序列按照以下步驟進行分析，利用Cross match及repeat masker軟體去除載體片段、短於100 bp的序列及汙染序列，得到高質量的EST數據集；利用聚類比對工具對以上數據進行聚類分析，降低數據冗餘性；使用Phrap軟體對聚類後的集群進行拼接，得到一致性序列；將得到的一致性序列與SwissProt資料庫進行同源比對、功能注釋，根據功能注釋在基因功能預測(GO)分類資料庫中進行功能分類描述；利用美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站上的相似性比較工具(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi),對於相似度可靠性評價值(E 值)<
0.1，同源性>30%的基因提取注釋信息，進一步利用DNAMAN6.0軟體進行胺基酸翻譯及序列比對，從中篩選引起機體過敏反應的兩種致病基因。
[0014]4、目的基因的體外表達
針對目的基因設計轉鐵蛋白B引物，上遊引物:CGAGCTCGCATGCCGCCCCCGTGG，下遊弓丨物:TTGCGGCCGC AATCAAAGGCAAGAAAAGTGG ;外膜蛋白引物，上遊引物:CGGATCCGATGGCCATTGGCGAACATCG,下遊引物:TTGCGGCCGCAATCACGTCCGGATCC ;構建表達載體，PCR擴增目的基因，雙酶切回收目的片段連接入pET-28a載體並轉化大腸桿菌DH5a，PCR鑑定重組子，挑取含有目的片段的單克隆測序；將陽性重組子轉化入BL21(DE3)大腸桿菌並接種於含卡那黴素的LB平板培養過夜；挑取活化的單菌落在LB液體培養基中擴增培養，600 nm處吸光度值達1.5左右時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度達I mmol/L,誘導4 h ;超聲波破碎菌體,離心收集上清,混入上樣緩衝液,沸水浴加熱5 min,進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，電泳結束後，考馬斯亮藍G250染色，冰醋酸脫色後，凝膠成像系統拍照保存。
[0015]本發明的有益效果:
1.cDNA文庫質量及插入片段長度分析
經瓊脂糖凝膠電泳檢測，合成的雙鏈DNA彌散範圍為250~2000 bp。原始cDNA文庫及擴增文庫滴度分別為5.6 X IO5 PFU/ml和6.2 X IO5 PFU/ml。藍白斑篩選法計算得到文庫的重組率為96.3%。構建原始cDNA文庫後隨機挑選24個單克隆進行PCR檢測，結果顯示，所挑取克隆均含有重組片段，其大小為500~4000 bp。
[0016]2.嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫的EST序列分析
1020個克隆的序列已測定完成，得到有義序列978個，長度為500~2000 bp，平均為495 bp，對其進行聚類分析及拼接，獲得347個單一基因，分別與美國國立生物技術信息中心網站的核酸序列及SwissPiOt蛋白資料庫進行同源比對(E值〈0.1)，相似度高於30%者提取注釋信息，同時進行基因功能預測(表1)。對獲得的EST序列進行功能分類，發現有2段基因與報導的豬胸膜肺炎放線菌外膜蛋白及轉鐵蛋白B具有較高的同源性，推測其可能與嗜熱吸水鏈黴菌引起的免疫反應有關。利用DNAMAN6.0軟體將這2條基因翻譯成2條完整的胺基酸序列，並分別定名為ST-omlA和ST-tbpB。其開放閱讀框長度分別為1554 bp和726 bp，分別編碼517和241個胺基酸，序列分析結果分別與胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白(GenBank 登錄號:AY278560.1)以及轉鐵蛋白(GenBank 登錄號:GQ465206.1，GQ465204.1，GQ465205.1)的同源性為51%和42%。
[0017]表1熱吸水鏈黴菌EST序列GO分類結果
【權利要求】
1.一種構建的嗜熱吸水鏈黴菌CDNA文庫，其特徵是:得到有義序列978個，獲得單一基因347個，其中2段基因中的一段基因與胸膜肺炎放線菌外膜蛋白的同源性為51%，其開放閱讀框長度為1554 bp和，編碼517個胺基酸；另一段基因與轉鐵蛋白B的同源性為42%，其開放閱讀框長度為726 bp，編碼241個胺基酸。
2.從權利要求1所述的構建的嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫中篩選出兩種大棚肺致病抗原多肽的表達，其特徵是:將所說的2段基因亞克隆入原核表達載體中，IPTG誘導表達產物的相對分子質量分別為63 OOO和30 000多肽。
3.嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫構建兩種大棚肺致病抗原多肽的表達方法，其特徵是: (1)嗜熱吸水鏈黴菌cDNA文庫的構建 採用TRIZOL進行嗜熱吸水鏈黴菌總RNA的提取並經01igoteXTMmRNA純化試劑盒純化為mRNA;利用多聚腺嘌呤脫氧核苷(PolyA)聚合酶進行3』末端加尾，按照SMART? cDNA文庫構建試劑盒說明書合成雙鏈cDNA ;產物經蛋白酶K處理後用sfil酶切，過吸附柱CHROMASPIN-400進行分級，分離後的cDNA連入λ TriplEx2載體中，噬菌體包裝蛋白進行包裝構成cDNA原始文庫並以大腸桿菌XL-1 Blue為受體菌擴增文庫； (2)cDNA文庫質量及插入片段鑑定 將原始及擴增文庫稀釋成不同倍數於溶菌肉湯平板上培養過夜；文庫滴度PFU/ml=噬菌斑數X稀釋倍數X IO3/所用稀釋文庫液體積μ? ;向噬菌體與大腸桿菌XLl-Blue混合液的上層瓊脂中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)培養過夜，進行藍白斑篩選，重組率(％)=白斑/ (白斑+藍斑);根據λ TriplEx2多克隆位點序列設計引物(5，端:5』 -GCCATTGTGTTGGTACCC-3』，3』端:5』 -TAATACGACTGACTATAGGGC-3』)，將LB/四環素瓊脂平板平均分成8個扇形區域，每個區域選取3個共24個獨立的噬菌斑進行聚合酶鏈式反應鑑定；反應結束後取10 μ?產物進行瓊脂糖凝膠電泳； (3)EST測序及序列分析 將構建好的啫熱吸水鏈黴菌cDNA文庫中的全部克隆進行編號，取前1020編號的克隆，提取質粒，PCR鑑定，將含插入片段的克隆委託生工生物工程(上海)有限公司進行5』端測序，測序引物為質粒通用引物；對獲得的表達序列標籤EST序列按照以下步驟進行分析，利用Cross match及repeat masker軟體去除載體片段、短於100 bp的序列及汙染序列,得到高質量的EST數據集；利用聚類比對工具對以上數據進行聚類分析，降低數據冗餘性；使用Phrap軟體對聚類後的集群進行拼接，得到一致性序列；將得到的一致性序列與SwissPiOt資料庫進行同源比對、功能注釋，根據功能注釋在基因功能預測GO分類資料庫中進行功能分類描述；利用美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站上的相似性比較工具，對於相似度可靠性評價值〈0.1，同源性>30%的基因提取注釋信息，進一步利用DNAMAN6.0軟體進行胺基酸翻譯及序列比對，從中篩選出引起機體過敏反應的兩種致病基因； (4)目的基因的體外表達 針對目的基因設計轉鐵蛋白B引物，上遊引物:CGAGCTCGCATGCCGCCCCCGTGG，下遊弓丨物:TTGCGGCCGCAATCAAAGGCAAGAAAAGTGG ;外膜蛋白引物，上遊引物:CGGATCCGATGGCCATTGGCGAACATCG,下遊引物:TTGCGGCCGCAATCACGTCCGGATCC ;構建表達載體，PCR擴增目的基因，雙酶切回收目的片段連接入pET-28a載體並轉化大腸桿菌DH5a，PCR鑑定重組子，挑取含有目的片段的單克隆測序；將陽性重組子轉化入BL21(DE3)大腸桿菌並接種於含卡那黴素的LB平板培養過夜；挑取活化的單菌落在LB液體培養基中擴增培養，600 nm處吸光度值達1.5左右時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度達1 mmol/L,誘導4 h ;超聲波破碎菌體,離心收集上清,混入上樣緩衝液,沸水浴加熱5 min,進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，電泳結束後，考馬斯亮藍G250染色，冰醋酸脫色後，凝膠成像系統拍照保存。
【文檔編號】C07K14/36GK103484942SQ201210349127
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年9月20日 優先權日:2012年9月20日
【發明者】王笑歌, 王玲玲, 劉朔 申請人:中國醫科大學附屬第四醫院