一種肝癌組織特異性rna幹擾系統及其建立和應用方法
2023-05-31 11:31:06
專利名稱：一種肝癌組織特異性rna幹擾系統及其建立和應用方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學技術領域，涉及一種肝癌組織特異性RNA幹擾系統及其建立和應用方法。
背景技術：
原發性肝癌是嚴重威脅人類健康的惡性疾病。其發病率雖只列惡性腫瘤發病率的第六位，但是死亡率卻高居第三位。中國是原發性肝癌高發國，發病人數約佔全球的55%。全國第三次死因回顧抽樣調查報告顯示:肝癌是我國惡性腫瘤相關死亡的第二位死因(在城市和男性則是首位死因)。肝癌在診斷時多已晚期，其治療方法有限，如何有效治療肝癌是我國目如亟需解決的重大問題。近年來，RNA幹擾成為一種潛在的癌治療方法。RNA幹擾是一種特異性的基因沉默方法。自發現以來已經迅速發展成為基因研究的有力工具並成為一種具有極大潛在價值的治療方法。迄今為止已有的研究已證實其在疾病治療方面的有效性和可行性。肝癌是一種基因功能改變引起的疾病。近年來，系統生物學水平的研究取得前所未有的巨大進展，確立了諸多重要的致癌基因，這些癌相關基因的發現為肝癌治療提供了前所未有的巨大機遇。此外，因為RNA幹擾物質易於給入肝臟，肝腫瘤適合進行RNA幹擾治療(肝腫瘤動物模型已作為一個優良的研究模型廣泛用於RNA幹擾治療的研究)。因此，RNA幹擾治療在肝癌治療方面具有巨大的潛能。可以 預見的是在不遠的將來RNA幹擾治療一定會廣泛應用於肝癌治療。但是，儘管RNA幹擾作為一種治療方法具有巨大潛力，要使其成為一種有效的治療方法必須解決幾個問題。這些問題包括RNA幹擾的特異性，RNA幹擾作用的持續性，RNA作用的效能等。RNA幹擾表達必須局限於肝癌細胞內，非肝癌細胞(如正常肝細胞)應免於RNA幹擾作用已避免和消除RNA幹擾的副作用。這對於肝癌患者特別重要，因為肝癌患者多伴有肝硬化，剩餘的正常功能肝細胞減少，肝功能儲備有限。目前最常用的RNA幹擾藥物是化學合成的小RNA(SiRNA)和基於質粒的III型啟動子(Pol III啟動子，如U6或Hl)驅動的shRNA。siRNA和III型啟動子驅動shRNA沒有組織特異性，會沉默任何類型細胞的靶基因，因而可能會在RNA幹擾治療作用時不僅作用靶細胞，同時作用於非靶細胞。此外，siRNA或III型啟動子驅動shRNA的作用時間短(很少超過一周或幾周，而癌治療作用必須能夠維持至少更長的時間)；同時兩者的轉染效率低，細胞的攝入有限，這些是目前RNA幹擾治療應用的重要挑戰。為了獲得組織特異性、長期和高效的RNA幹擾，一個可能的解決方案是應用組織特異性啟動子(限制治療性RNA幹擾表達於靶細胞)結合慢病毒載體(藉助慢病毒載體特性獲得高轉染效能和穩定長效的RNA幹擾作用)來實現。AFP啟動子是肝癌細胞的組織特異性啟動子，高度特異於肝癌細胞，可以實現肝癌組織特異性表達。但是AFP啟動子是II型啟動子(Pol II)，雖可驅動基因過表達，但卻不能直接驅動幹擾物質shRNA的表達，本發明創造性地應用Cre/LoxP開關系統結合AFP啟動，採用一種創新的設計，實現了 AFP驅動shRNA表達。慢病毒載體是一種能夠獲得長期、高效體內外RNA幹擾作用的強大工具，目前已被廣泛應用於基礎研究和轉化醫學研究。慢病毒幹擾載體可以高效感染靶細胞(> 99% )將RNA幹擾結構(如shRNA)整合入靶細胞的基因組，實現穩定表達，產生長效的RNA幹擾基因沉默。
發明內容
本發明的目的在於提供一種肝癌組織特異性的RNA幹擾系統及其建立和應用方法，該系統可以肝癌組織特異性地、高效地、長效地沉默靶基因，從而為RNA幹擾治療提供了一種有效的治療工具，使肝癌RNA幹擾治療成為可能,為RNA幹擾治療應用於肝癌治療鋪平道路。為了達到上述目的，本發明提供了一種肝癌組織特異性RNA幹擾系統(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統)，其特徵在於，由AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體組成(圖1 (A))，AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體均由慢病毒載體構建而成，其中，AFP-Cre載體含有一個AFP啟動子和位於其下遊的Cre重組酶基因(稱為AFP-Cre結構)，LoxP-shRNA載體含有一個經過改造的U6啟動子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)和位於其下遊的shRNA序列(稱為LoxP-shRNA結構)，LoxP-shRNA載體中所含的經過改造的U6啟動子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)為在 U6 啟動子中插入一個可指示 AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統是否工作的結構的U6啟動子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統是否工作的結構為LoxP-CMV-eGFP-LoxPo優選地，所述的shRNA序列為針對靶基因的shRNA序列。本發明的肝癌組織特異性 RNA幹擾系統(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統)能夠特異性地工作於肝癌組織細胞，特異性地在肝癌組織細胞中發揮RNA幹擾作用，而對於非肝癌組織細胞則無作用。其工作原理如下:AFP-Cre/LoxP-shRNA系統感染肝癌細胞組織，感染後AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體憑藉其慢病毒特性將AFP-Cre結構和LoxP-shRNA結構整合入宿主細胞基因組並使其在宿主細胞內穩定表達。AFP-Cre中的AFP啟動子驅動其下遊的Cre重組酶基因表達產生Cre重組酶，Cre重組酶剪切LoxP-shRNA中的U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6啟動子中的LoxP-CMV_eGFP-LoxP結構，恢復U6啟動子正常結構，激活U6啟動子活性，活化的U6啟動子驅動其下遊shRNA表達，shRNA表達後沉默靶基因。本發明所述的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統含有指示結構(LoxP-CMV-eGFP-LoxP)，具有自動指示功能，可依靠GFP螢光之減弱有無指示系統是否工作。若AFP-Cre/LoxP-shRNA系統感染靶細胞後GFP螢光減弱/消失則表明系統已工作，反之則系統未工作。其原理如下:AFP-Cre/LoxP-shRNA系統感染靶細胞後，系統中的LoxP-shRNA載體立即表達(LoxP-shRNA載體無特異性，在任何組織細胞中均可表達)，其含有的指示結構(LoxP-CMV-eGFP-LoxP)中的CMV啟動子驅動eGFP表達，使細胞組織產生GFP綠色螢光，螢光顯微鏡或活體成像可檢測到GFP綠色螢光表達。若所感染的靶細胞為肝癌細胞，AFP-Cre/LoxP-shRNA系統所含的AFP-Cre會表達，AFP-Cre表達後，其AFP啟動子驅動Cre表達，剪切LoxP-CMV-eGFP-LoxP結構，使得GFP不再表達，GFP螢光減弱至消失(圖(I)B)(需說明的是:因AFP-Cre的AFP啟動子活性弱於CMV-eGFP的CMV啟動子，該過程表現為GFP螢光減弱至消失，而非GFP不表達)；若為非肝癌細胞，則AFP-Cre不能表達，GFP螢光不減弱(圖(I)C)。本發明還提供了上述的肝癌組織特異性RNA幹擾系統的建立方法，其特徵在於，具體步驟為:步驟1:構建AFP-Cre載體:步驟1.1:取pDRIVE-SV40-hAFP之AFP啟動子序列，根據其序列改造設計並人工合成新的AFP啟動子片段(540bp)(具體序列見說明書末尾)，以NheI和EcoRI限制性內切酶酶切pUC57質粒，T4連接酶連接，將AFP啟動子片段克隆入pUC57質粒，形成含有AFP啟動子片段的重組質粒PUC57-AFP，轉化感受態細胞DH5 α，擴增，抽提質粒；步驟1.2:以pUC57-AFP為模板，以Gecp-1，2為引物(引物序列見表I)，常規PCR擴增獲得AFP啟動子片段；WpCAG-Cre為模板，以Gecp-3，4(表I)為引物，常規PCR擴增獲得Cre片段(1070bp);然後以AFP啟動子片段和Cre片段為模板，以Gecp-1，4為引物(表I)，行PCR拼接獲得全長目的基因片段(AFP-Cre)；步驟1.3:用Spe I和Xba I限制性內切酶對pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro質粒進行酶切，酶切產物電泳後回收7.0kb的載體片段(P⑶H-CMV-MCS-EF 1-Puio酶切片段)；步驟L 4:將目的基因片段AFP-Cre以同源重組法與pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro酶切片段重組，構建成AFP-Cre重組質粒；步驟1.5:轉化感受態細胞DH5ci，挑取轉化子行菌落PCR鑑定陽性克隆，接種陽性克隆，保種並分裝送測序。測序沒有問題的，再接種抽提質粒；
步驟1.6:表達載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293T細胞鋪板，將AFP-Cre重組質粒與包裝質粒psPAX2和pMD2.G和CaCl2溶液混合後加入培養皿中常規培養；轉染24小時後收取上清病毒液，高速離心濃縮病毒後以PCR法檢測病毒拷貝數，於293T細胞測定滴度；最終形成的AFP-Cre慢病毒顆粒即為AFP-Cre載體；步驟2:構建 LoxP-ShRNA 載體:步驟2.1:以pSil02質粒為模板，以Gecp-5和Gecp-6為引物(表I)，採用常規PCR擴增獲得片段A ；以pSil02質粒為模板，以Gecp-7和Gecp-8為引物(表I)，採用常規PCR擴增獲得片段B ；以pSil04質粒為模板，以Gecp-9，Gecp-10, Gecp-1l和Gecp-12為引物(表I)，採用常規PCR擴增獲得片段C ;以Gecp-5和Gecp-8為引物(表I)，以片段A、B、C為模板，行PCR獲得片段D，即為U6-LoXP-CMV-eGFP-U6結構片段；步驟2.2:以XhoI和EcoRI限制性內切酶分別酶切片段D和pSil02質粒，T4連接酶連接，將片段D克隆入pSil02質粒形成LoxP-shRNA重組質粒；步驟2.3:轉化感受態細胞，擴增，測序鑑定陽性克隆，接種陽性克隆後擴增，進行質粒抽提；步驟2.4:表達載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293T細胞鋪板，將LoxP-shRNA重組質粒與無內毒素包裝質粒psPAX2和pMD2.G和CaCl2溶液混合後加入培養皿中常規培養；轉染24小時後收取上清病毒液，高速離心濃縮病毒後以PCR法檢測病毒拷貝數，於293T細胞測定滴度；；最終形成的LoxP-shRNA慢病毒顆粒即為LoxP-shRNA 載體；步驟3:形成肝癌組織特異性RNA幹擾系統:將AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體以1-5:1比例混合溶於Opt1-MEM液中，形成肝癌組織特異性RNA幹擾系統(AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統)。優選地，所述的步驟2.2還包括將LoxP-shRNA重組質粒以AgeI和EcoRI限制性內切酶酶切回收載體片段，取可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將針對靶基因的shRNA克隆入LoxP-shRNA質粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質粒；所得的針對靶基因的LoxP-shRNA重組質粒繼續進行後續步驟。本發明還提供了上述肝癌組織特異性RNA幹擾系統的體外應用方法，其特徵在於，具體步驟為:步驟1:構建針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統:取LoxP-shRNA質粒，以AgeI和EcoRI限制性內切酶酶切回收載體片段，取驗證有效的可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將shRNA克隆入LoxP-shRNA質粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質粒，轉化，鑑定、測序無誤後接種抽提質粒，再慢病毒包裝，形成LoxP-shRNA載體，將LoxP-shRNA載體與AFP-Cre載體按照1_5: I混合形成針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統；步驟2:使用AFP-Cre/LoxP-shRNA系統感染細胞:常規培養細胞(通常為混合培養細胞)，根據待作用的靶細胞之細胞量，取感染複數為10-20 (Μ0Ι = 10-20)，計算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA系統的量，將AFP-Cre/LoxP-shRNA系統加入細胞培養液內，同時加入polybrene至終濃度2ug/ml,混勻後作用於對象細胞,感染24h後換液；步驟3:檢測:①GFP指示檢測:螢光顯微鏡下觀察GFP有無減弱和消失，若GFP螢光減弱/消失，表明肝癌組織特異性RNA幹擾系統工作靶基因mRNA和蛋白檢測:以定量PCR(Q-PCR)和western blot檢測靶基因mRNA和蛋白表達抑制與否。本發明還提供了上述肝癌組織特異性RNA幹擾系統的體內應用方法，其特徵在於，具體步驟為:步驟1:構建針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統:取LoxP-shRNA質粒，以AgeI和EcoRI限制性內切酶酶切回收載體片段，取驗證有效的可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將shRNA克隆入LoxP-shRNA質粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質粒，轉化，鑑定、測序無誤後接種抽提質粒，再慢病毒包裝，形成LoxP-shRNA載體，將LoxP-shRNA載體與AFP-Cre載體按照1_5: I混合形成針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統；步驟2:根據瘤體估算細胞量，根據細胞量，取感染複數為10-20 (Μ0Ι = 10-20)，計算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA系統的量；以Iml胰島素注射器瘤內注射或者靜脈注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系統；步驟3:檢測:①GFP指示檢測:使用帶有螢光探頭的活體動物成像儀，檢測腫瘤細胞組織螢光顯色，根據腫瘤細胞螢光顯色有無減弱，判斷是否工作靶基因mRNA和蛋白檢測:體內實驗完畢後，切取腫瘤，以定量PCR(Q-PCR)和western blot檢測靶基因mRNA和蛋白表達抑制與否。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:(I)本發明創造性地實現了肝癌組織特異性RNA幹擾，首次實現了肝癌組織特異性靶基因沉默，為RNA幹擾治療肝癌提供了有力工具，由於RNA作用具備肝癌組織特異性，對肝癌周圍組織細胞無作用，理論上預期可以避免RNA幹擾治療所致的副作用。本發明克服了現有技術的組織特異性 缺陷，是現有技術所不具備的。因為實現了肝癌組織特異性RNA幹擾，本發明所述的肝癌組織特異性RNA幹擾系統(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統)對於肝癌的臨床治療和基礎研究具有顯著的效果:在臨床治療方面，它使得靶向幹擾治療肝癌成為可能。在基礎研究方面，其大大拓展了基礎研究範圍，使許多之前不能實現的研究成為可倉泛;(2)本發明較之現有技術，實現了其無法實現的高效與長效。本發明因採用慢病毒作為基礎載體，憑藉慢病毒的強大感染能力和逆轉錄能力等，克服了目前現有技術所用的siRNA的細胞導入效率低和作用時間短等不足，實現了高效感染導入，長期作用，具有轉染效率高、表達穩定高效、作用時間長，操作簡便，細胞毒性小等優點；(3)本發明較之現有技術，具備其所不具備的指示功能。本發明所述系統帶有指示結構，由於具有良好的GFP指示功能，為實際應用觀察提供了極大的便利，體外可藉助螢光顯微鏡，體外可藉助活體成像，觀察非常方便；本發明的應用價值:本發明可廣泛應用於肝癌靶向治療的臨床應用和基礎研究，具有廣闊的應用前景和潛在的社會與經濟價值。包括:(1)肝癌的靶向治療臨床應用:對於研究已明確在肝癌中起重要作用、臨床價值確切之癌基因，應用本系統肝癌組織特異性地靶向抑制其表達治療肝癌；(2)肝癌的靶向治療研究:肝癌動物模型研究中，應用本發明體內特異性地幹擾靶基因，確認靶基因是否具有治療作用，探討其臨床價值；(3)基礎研究:例如用於腫瘤微環境在肝癌發生發展中的作用的相關研究，體外肝癌細胞和間質細胞共培養是研究腫瘤微環境的重要手段，應用現有技術，加入無組織特異性幹擾物後會同時攻擊非肝癌細胞，應用本發明可特異性幹擾其中的肝癌細胞而不會干擾間質細胞的靶基因，得到確切可靠的研究結果；(4)本發明中採用的Cre/LoxP-shRNA結構可改造通用於其他組織特異性啟動子驅動實現其他組織特異性RNA幹擾。例如利用前列腺癌PSA啟動子替代AFP啟動子，改造後可以實現前列腺癌組織特異性RNA幹擾。
圖(I)為肝癌組織特異性RNA幹擾系統(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統)的結構和工作示意圖=(A)AFP-Cre和LoxP-shRNA載體圖；(B，C)系統工作示意圖:(B)系統在肝癌細胞組織中，AFP-Cre和LoxP-shRNA均表達，系統二工作，shRNA表達，RNA幹擾起效；(C)系統在非肝癌細胞組織中，LoxP-shRNA表達而AFP-Cre不表達，系統不工作，shRNA不表達，無RNA幹擾作用；圖(2)為體外實驗驗證AFP-Cre/LoxP-shRNA系統的有效性及組織特異性圖:AFP-Cre/LoxP-shRNA系統感染肝癌細胞(以HCCLM3肝癌細胞為例)和非肝癌細胞(以正常肝細胞L-02為例)，Q-PCR(左側線圖)和Westernblot檢測(右側條帶圖)結果顯示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統可以組織特異性地幹擾抑制肝癌細胞的靶基因(Beclin I)的mRNA和蛋白表達，而對非肝癌細胞無作用(HCCLM3細胞受抑制，而L-02無抑制);圖(3)為肝癌組織特異性RNA幹擾系統(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統)的螢光指示功能檢測圖:AFP-Cre/LoxP-shRNA系統感染肝癌細胞(以HCCLM3、H印G2和H印3B肝癌細胞為例)和非肝癌細胞(以正常肝細胞L-02、宮頸癌細胞Hela和結腸癌細胞SWl116為例)，兩周後螢光顯微鏡下拍照，系統在肝癌細胞內穩定工作，螢光減弱至消失，而在非肝癌細胞內不工作，螢光不減弱不消失；圖(4)為體內實驗驗證AFP-Cre/LoxP-shRNA系統的功能:(A)瘤內注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系統(以MHCC97L肝癌細胞皮下瘤為例)兩周後，Q-PCR和Western blot檢測表明靶基因(Beclin l)mRNA和蛋白表達被有效幹擾抑制；(B)螢光指示檢測顯示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統螢光指示功能良好，系統注入非肝癌細胞(宮頸癌Hela細胞)皮下瘤兩周後活體動物成像GFP螢光不減弱，而系統注入肝癌細胞(MHCC97L)皮下瘤兩周後螢光減弱至消失，指示系統工作起效；圖(5)應用本發明之AFP-Cre/LoxP-shRNA系統抑制Atg5基因輔助治療增強Sorafenib 藥效:(A) Q-PCR 和 Western blot 檢測表明應用 AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統作用肝癌細胞組織後無論體外(上圖)或體內(下圖)均有效幹擾抑制靶基因Atg5基因及蛋白表達(以MHCC97L為例，下同);(B)應用AFP-Cre/LoxP-shRNA系統抑制肝癌細胞Atg5基因可輔助增強Sorafenib誘導細胞凋亡作用；(C)皮下瘤成瘤實驗:瘤內注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系統抑制Atg5基因可輔助增強Sorafenib抑制腫瘤成瘤作用。
具體實施例方式為使本發明更明顯易懂，茲以優選實施例，並配合附圖作詳細說明如下。實施例1本實施例用以說明肝癌組織特異性RNA幹擾系統AFP-Cre/LoxP-shRNA的構建過程，以及應用該系統特異性抑制靶基因(Beclin I)；一種肝癌組織特異性RNA幹擾系統(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統)由AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體組成(如圖1 (A)所示)，AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體均由慢病毒載體構建而成，其中，AFP-Cre載體含有一個AFP啟動子和位於其下遊的Cre重組酶基因(稱為AFP-Cre結構)，LoxP-shRNA載體含有一個經過改造的U6啟動子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)和位於其下遊的針對靶基因的shRNA序列(稱為LoxP-shRNA結構)，LoxP-shRNA載體中所含的經過改造的U6啟動子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP_U6)為在U6啟動子157bp處插入一個LoxP-CMV-eGFP-LoxP結構的U6啟動子。(一 )肝癌組織特異性RNA幹擾系統(AFP-Cre/LoxP-shRNA系統)的構建過程:(I)AFP-Cre載體構建:使用pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro作為母載體構建,將AFP啟動子和CRE重組酶基因接在一起，替換pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro上的CMV啟動子，具體步驟為:①取pDRIVE-SV40_hAFP (購自InvivoGen公司)之AFP啟動子序列，根據其序列改造設計並人工合成新的AFP啟動子片段(540bp)(具體序列見說明書末尾)。以NheI和EcoRI限制性內切酶(購自Genescript公司)酶切pUC57質粒(購自Genescript公司),T4連接酶(購自Genescript公司)連接，將AFP啟動子片段克隆入pUC57質粒，形成含有AFP啟動子片段的重組質粒pUC57-AFP，轉化感受態細胞DH5 α (購自閃晶公司)，擴增，抽提質粒(Qiagen質粒抽提試劑盒購自Qiagen公司)(相關操作參照《分子克隆實驗指南(第3版)》及各產品說明書進行，以下同)；@以？此57^ 重組質粒為模板，以6況 -1，2為引物(引物序列見表1)，進行卩0 法擴增AFP啟動子片段(PCR反應體系見附1，下同)；以pCAG-Cre質粒(購自Addgene)為模板，以Gecp-3，4 (表I)為引物，以PCR法擴增獲得1070bp的Cre片段；然後以AFP啟動子片段和Cre片段為模板，以 Gecp-1，4為引物，PCR法拼接獲得全長目的基因片段(AFP-Cre)(1605bp)；
③用Spe I和Xba I限制性內切酶(購自Genescript公司)對P⑶H-CMV-MCS-EF1-Puro質粒(購自SBI公司)進行酶切，酶切產物電泳後回收7.0kb的載體片段(pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 酶切片段);④將目的基因片段AFP-Cre以同源重組法(Clontech公司，同源重組反應體系見附2)與pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro酶切片段重組，構建成AFP-Cre重組質粒(圖1A); ⑤轉化感受態細胞DH5 α (購自閃晶公司)，挑取轉化子行菌落PCR鑑定(菌落PCR反應體系見附3)陽性克隆，接種陽性克隆，保種並分裝送測序(Invitrogen公司)。測序沒有問題的，再接種抽提質粒。；⑥表達載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293Τ細胞(購自中國科學院細胞庫)鋪板，細胞密度為3X IO6細胞/皿。將AFP-Cre重組質粒與無內毒素包裝質粒psPAX2和pMD2.G (購自Trono Lab)及CaCl2溶液混合後逐滴加入等體積的2 X HBS中，加入混合溶液輕輕加入培養皿中並混勻後常規培養(具體操作參照Trono Lab慢病毒包裝說明進行)。轉染約8小時後用完全培養基進行換液；換液後24小時，在生物安全櫃中收取上清病毒液，並加入含2% FBS的低血清培養基，24h後第二次收取上清病毒液後，丟掉細胞。振蕩混勻後4°C以10，OOOg高速離心30min，吸乾上清後加入適量OMEM溶解沉澱。濃縮病毒後以PCR法檢測每基因組整合的病毒拷貝數，於293T細胞測定滴度，病毒凍存於-80度冰箱備用。⑦最終形成的AFP-Cre慢病毒顆粒即為AFP-Cre載體。(2) LoxP-shRNA 載體構建:①以pSil02質粒(購自Micr oSCI公司)為模板，以Gecp-5,6為引物(表I)，進行PCR擴增獲得片段A ;以pSil02質粒為模板，以Gecp-7，8(表I)為引物，進行PCR擴增獲得片段B ;以pSil04質粒(購自MicroSCI公司)為模板，以Gecp-9，10，11，12 (表I)為引物，進行PCR擴增獲得片段C ；②以片段A、B、C為模板，以Gecp-5，8(表I)為引物，PCR擴增獲得片段D (U6-LoxP-CMV-eGFP-U6)；③以XhoI和EcoRI限制性內切酶(購自Genescript公司)酶切片段D和pSi 102質粒，T4連結酶連結，將片段D克隆入pSil02質粒形成LoxP-shRNA重組質粒(圖1 (A))；④轉化感受態細胞DH5 α (購自閃晶公司)，挑取轉化子行菌落PCR鑑定(菌落PCR反應體系見附3)陽性克隆，接種陽性克隆，保種並分裝送測序(Invitrogen公司)。測序沒有問題的，再接種抽提質粒；⑤表達載體(慢病毒)包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293Τ細胞(購自中國科學院細胞庫)鋪板，細胞密度為3X IO6細胞/皿。將LoxP-shRNA重組質粒與無內毒素包裝質粒psPAX2和pMD2.G(購自Trono Lab)及CaCl2溶液混合後逐滴加入等體積的2XHBS中，加入混合溶液輕輕加入培養皿中並混勻後常規培養(具體操作參照Trono Lab慢病毒包裝說明進行)。轉染約8小時後用完全培養基進行換液；換液後24小時，在生物安全櫃中收取上清病毒液，並加入含2% FBS的低血清培養基，24h後第二次收取上清病毒液後，丟掉細胞。振蕩混勻後4°C以10，OOOg高速離心30min，吸乾上清後加入適量OMEM溶解沉澱。濃縮病毒後以PCR法檢測每基因組整合的病毒拷貝數，於293T細胞測定滴度，病毒凍存於-80度冰箱備用；
⑥最終形成的LoxP-shRNA慢病毒顆粒即為LoxP-shRNA載體；(3)形成 AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統:將 AFP-Cre 載體和 LoxP-shRNA 載體以 1:1比例混合溶於Opt1-MEM液(購自Invitrogen公司)中，形成肝癌組織特異性RNA幹擾系統(AFP-Cre/LoxP-shRNA 系統)。附1:PCR反應體系(Takara試劑盒，購自寶生物公司):
權利要求
1.種肝癌組織特異性RNA幹擾系統，其特徵在於，由AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體組成，AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體均由慢病毒載體構建而成，其中，AFP-Cre載體含有一個AFP啟動子和位於其下遊的Cre重組酶基因，LoxP-shRNA載體含有一個經過改造的U6啟動子和位於其下遊的shRNA序列，LoxP-shRNA載體中所含的經過改造的U6啟動子為在U6啟動子中插入一個可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統是否工作的結構的U6啟動子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統是否工作的結構為LoxP-CMV_eGFP-LoxP。
2.權利要求1所述的肝癌組織特異性RNA幹擾系統，其特徵在於，所述的shRNA序列為針對靶基因的shRNA序列。
3.利要求1所述的肝癌組織特異性RNA幹擾系統的建立方法，其特徵在於，具體步驟為: 步驟1:構建AFP-Cre載體: 步驟1.1:取pDRIVE-SV40-hAFP之AFP啟動子序列，根據其序列改造設計並人工合成新的AFP啟動子片段，以NheI和EcoRI限制性內切酶酶切pUC57質粒，T4連接酶連接，將AFP啟動子片段克隆入pUC57質粒，形成含有AFP啟動子片段的pUC57_AFP重組質粒，轉化感受態細胞DH5 α，擴增，抽提質粒； 步驟1.2:以pUC57-AFP重組質粒為模板，以Gecp-1，2為引物，常規PCR擴增獲得AFP啟動子片段；以pCAG-Cre為模板，以Gecp-3，4為引物，常規PCR擴增獲得Cre片段；然後以AFP啟動子片段和Cre片段為模板，以Gecp-1，4為引物，行PCR拼接獲得全長目的基因片段 AFP-Cre ；步驟1.3:用Spe I和Xba I限制性內切酶對pCDH-CMV-MCS-EFl_Puro質粒進行酶切，酶切產物電泳後回收7.0kb的載體片段，即為P⑶Η-CMV-MCS-EFl-Puro酶切片段； 步驟1.4:將步驟1.2獲得的目的基因片段AFP-Cre以同源重組法與步驟1.3獲得的pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro酶切片段重組，構建成AFP-Cre重組質粒； 步驟1.5:轉化感受態細胞DH5a，挑取轉化子行菌落PCR鑑定陽性克隆，接種陽性克隆，保種並分裝送測序，測序沒有問題的，再接種抽提質粒； 步驟1.6:表達載體包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293T細胞鋪板，將AFP-Cre重組質粒與包裝質粒psPAX2和pMD2.G和CaC12溶液混合後加入培養皿中常規培養；轉染24小時後收取上清病毒液，高速離心濃縮病毒後以PCR法檢測病毒拷貝數，於293T細胞測定滴度；最終形成的AFP-Cre慢病毒顆粒即為AFP-Cre載體； 步驟2:構建LoxP-shRNA載體: 步驟2.1:以pSil02質粒為模板，以Gecp-5和Gecp-6為引物，採用常規PCR擴增獲得片段A ;以pSil02質粒為模板，以Gecp-7和Gecp-8為引物，採用常規PCR擴增獲得片段B ；以pSil04質粒為模板，以Gecp-9，Gecp-10, Gecp-1l和Gecp-12為引物，採用常規PCR擴增獲得片段C ；以Gecp-5和Gecp-8為引物，以片段A、B、C為模板，行PCR獲得片段D，即為U6-LoxP-CMV-eGFP-U6 結構片段； 步驟2.2:以XhoI和EcoRI限制性內切酶分別酶切片段D和pSil02質粒，T4連接酶連接，將片段D克隆入pSil02質粒形成LoxP-shRNA重組質粒； 步驟2.3:轉化感受態細胞，擴增，測序鑑定陽性克隆，接種陽性克隆後擴增，進行質粒抽提；步驟2.4:表達載體包裝、濃縮及滴度測定:選擇生長旺盛期293T細胞鋪板，將LoxP-shRNA重組質粒與無內毒素包裝質粒psPAX2和pMD2.G和CaC12溶液混合後加入培養皿中常規培養；轉染24小時後收取上清病毒液，高速離心濃縮病毒後以PCR法檢測病毒拷貝數，於293T細胞測定滴度；最終形成的LoxP-shRNA慢病毒顆粒即為LoxP-shRNA載體； 步驟3:形成肝癌組織特異性RNA幹擾系統:將AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體以1-5: I比例混合溶於Opt1-MEM液中，形成肝癌組織特異性RNA幹擾系統。
4.權利要求3所述的肝癌組織特異性RNA幹擾系統的建立方法，其特徵在於，所述的步驟2.2還包括將LoxP-shRNA重組質粒以AgeI和EcoRI限制性內切酶酶切回收載體片段，取可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將shRNA克隆入LoxP-shRNA質粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質粒；所得的針對靶基因的LoxP-shRNA重組質粒繼續進行後續步驟。
5.利要求1所述的肝癌組織特異性RNA幹擾系統的體外應用方法，其特徵在於，具體步驟為: 步驟1:構建針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統:取LoxP-shRNA質粒，以AgeI和EcoRI限制性內切酶酶切回收載體片段，取驗證有效的可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將shRNA克隆入LoxP-shRNA質粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質粒，轉化，鑑定、測序無誤後接種抽提質粒，再慢病毒包裝，形成LoxP-shRNA載體，將LoxP-shRNA載體與AFP-Cre載體按照1_5: I混合形成針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統； 步驟2:使用AFP-Cre/LoxP-shRNA系統感染細胞:常規培養細胞，根據待作用的靶細胞之細胞量，取感染複數為10-20，計算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA系統的量，將AFP-Cre/LoxP-shRNA系統加入 細胞培養液內，同時加入polybrene至終濃度2ug/ml,混勻後作用於對象細胞，感染24h後換液； 步驟3:檢測:螢光顯微鏡下觀察GFP有無減弱和消失，若GFP螢光減弱和消失，表明AFP-Cre/LoxP-shRNA系統工作起效；以定量PCR和western blot檢測靶基因mRNA和蛋白表達抑制與否。
6.利要求1所述的肝癌組織特異性RNA幹擾系統的體內應用方法，其特徵在於，具體步驟為: 步驟1:構建針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統:取LoxP-shRNA質粒，以AgeI和EcoRI限制性內切酶酶切回收載體片段，取驗證有效的可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4連接酶連接，將shRNA克隆入LoxP-shRNA質粒，形成針對靶基因的LoxP-shRNA重組質粒，轉化，鑑定、測序無誤後接種抽提質粒，再慢病毒包裝，形成LoxP-shRNA載體，將LoxP-shRNA載體與AFP-Cre載體按照1_5: I混合形成針對靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系統； 步驟2:根據瘤體估算細胞量，根據細胞量，取感染複數為10-20，計算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA系統的量；以Iml胰島素注射器瘤內注射或者靜脈注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系統； 步驟3:檢測:使用帶有螢光探頭的活體成像儀進行活體動物成像，根據腫瘤螢光顯色有無減弱，判斷AFP-Cre/LoxP-shRNA系統是否工作起效；體內實驗完畢後，以定量PCR和western blot檢測 腫瘤祀基因mRNA和蛋白表達抑制與否。
全文摘要
本發明提供了一種肝癌組織特異性RNA幹擾系統及其建立和應用方法。所述的肝癌組織特異性RNA幹擾系統由AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體組成，AFP-Cre載體和LoxP-shRNA載體均由慢病毒載體構建而成，其中，AFP-Cre載體含有一個AFP啟動子和位於其下遊的Cre重組酶基因，LoxP-shRNA載體含有一個經過改造的U6啟動子和位於其下遊的shRNA序列，LoxP-shRNA載體中所含的經過改造的U6啟動子為在U6啟動子中插入一個可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統是否工作的結構的U6啟動子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系統是否工作的結構為LoxP-CMV-eGFP-LoxP。應用本發明獲得的RNA幹擾作用具有肝癌組織特異性高、作用長效、高效、指示良好、操作簡便等特點。本發明使肝癌RNA幹擾靶向治療成為可能，並極大地方便了相關研究分析，可廣泛應用於肝癌治療及基礎研究。
文檔編號C12N15/867GK103088064SQ20121055685
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者樊嘉, 史穎弘, 彭遠飛, 丁振斌 申請人:復旦大學附屬中山醫院